JP2012502992A - （Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２の合成方法 - Google Patents

（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２の合成方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、固相Ｆｍｏｃを用いた化学的方法を含む、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）、すなわち、Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号２）のラージスケールでの合成方法に関する。

Description

本発明は、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）、すなわち固相Ｆｍｏｃを用いた化学的方法を含むＨｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号２）のラージスケールでの新規の合成方法に関する。
グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）アミド（ＧＬＰ−１）（配列番号１）は、食事に応答して、腸のＬ細胞でグルカゴン前駆体のプレプログルカゴンの組織特異的な翻訳後プロセシングによって合成され、循環系に放出される。ＧＬＰ−１の１回の皮下投与は、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を有する患者における食後血糖値を完全に正常化することができるという観察から、ＧＬＰ−１の治療上の可能性が示唆されている（Ｇｕｔｎｉａｋ，Ｍ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，１４：１０３９−４４）。この作用は、インスリン放出の上昇とグルカゴン分泌の減少との両方が介在するためと考えられている。しかしながら、ＧＬＰ−１は、インビボでの血漿中半減期がわずか１〜２分であり、代謝的に不安定である。また体外から投与されたＧＬＰ−１は迅速に分解される（Ｄｅａｃｏｎ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４４：１１２６−１１３１）。
ＰＣＴ公報番号ＷＯ００／３４３３１（その内容は、本明細書にその全体が包含される）において、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）は、天然型ＧＬＰ−１よりも活性が高く、および／または、より代謝的に安定であることが開示されている。しかしながら、ＷＯ００／３４３３１の１８〜１９頁で示された（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）に関する合成の詳細は、そこで用いられているＭＢＨＡ（４−メチルベンズヒドリルアミン）樹脂はフッ化水素酸を用いたペプチドの除去を必要とするために、工業的な規模でのペプチド生産に適していない。この極めて腐蝕性の高い材料をラージスケールで用いることの安全性に関する懸念を除けば、その使用を可能にするには特殊な器具が必要であったと思われる。一般的に、フッ化水素酸ベースの切断スキームは、それらが安全であり、かつ工業用スケールに拡張可能であることを確実にするためには、かなりの投資を必要とする。そのようなものとして、効率的でラージスケールでの（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の製造方法を開発する必要がある。
ＰＣＴ公報番号ＷＯ００／３４３３１
Gutniak, M. K., et al., 1994, Diabetes Care, 14:1039-44 Deacon, C. F., et al., 1995, Diabetes, 44:1126-1131
本発明は、新規の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法を提供するものであり、本方法は、段階的な固相Ｆｍｏｃを用いた化学的方法を含む。
一形態において、本発明は、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法を提供するものであり、本方法は、以下の工程：
（ａ）（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（８−３５）−ＮＨ２（配列番号８）のＣ末端からＮ末端へ、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を、側鎖が保護されたＡｒｇ樹脂と連続的にカップリングして、それぞれの連続的なカップリング工程後にＮ末端からＦｍｏｃ基を除去して、側鎖が保護されたＡｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号４）を得る工程；
（ｂ）側鎖が保護されたＢｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨを、側鎖が保護されたＡｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号４）とカップリングして、側鎖が保護されたＢｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号５）を得る工程；
（ｃ）側鎖が保護されたＢｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号５）を切断用カクテルで処理し、それらから側鎖の保護基およびＮ末端の保護基を除去して、未精製の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を得る工程；および、
（ｄ）未精製の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を単離して、精製し、精製した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を得る工程、
を含む。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、以下の工程：
（ａ−１）ペプチドのアミドを生成することができるＦｍｏｃで保護された樹脂を脱保護して、樹脂からＦｍｏｃ基を除去する工程；
（ａ−２）樹脂に側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨを結合させ、側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ樹脂を得る工程；および、
（ａ−３）側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ樹脂からＦｍｏｃ基を除去して、側鎖が保護されたＡｒｇ樹脂を得る工程；
をさらに含み、これらの工程は工程（ａ）の前に行われる。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は：
前記工程（ａ−２）における側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨが、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨであり；
前記側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）樹脂であり；
前記側鎖が保護されたＡｒｇ樹脂が、側鎖が保護されたＡｒｇ（Ｐｂｆ）樹脂であり；
式（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（８−３５）−ＮＨ２（配列番号８）のＣ末端からＮ末端の前記Ｆｍｏｃ−アミノ酸が、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、および、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨであり；
前記側鎖が保護されたＡｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号４）が、Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）樹脂（配列番号６）であり；
前記側鎖が保護されたＢｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨが、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨであり；
前記側鎖が保護されたＢｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号５）が、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）樹脂（配列番号７）であり；および、
前記切断用カクテルが、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／水切断用カクテル、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＣＭ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／水／ＴＩＰＳ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／ＥＤＴ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／１−ドデカンチオール切断用カクテル、ＴＦＡ／ＤＴＴ／水／ＴＩＰＳ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／メタンスルホン酸切断用カクテル、ＴＦＡ／チオアニソール／ＥＤＴ／アニソール切断用カクテル、ＴＦＡ／ＴＥＳ切断用カクテル、ＴＦＡ／水切断用カクテル、ＴＦＡ／ＤＣＭ／インドール切断用カクテル、および、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ切断用カクテルからなる群より選択されることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、前記ペプチドを生成することができる樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＡＭ樹脂、ＰＥＧベースのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂、および、シーバー（Ｓｉｅｂｅｒ）アミド樹脂からなる群より選択されることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は：
前記切断用カクテルが、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／水切断用カクテル、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＣＭ切断用カクテル、および、ＴＦＡ／水カクテルからなる群より選択され；および、
前記ペプチドのアミドを生成することができる樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＡＭ樹脂、および、ＰＥＧベースのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂からなる群より選択されることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、前記ペプチドのアミドを生成することができる樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂であることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、工程（ｄ）が以下の工程：
（ｄ−１）ろ過して樹脂を除去し、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）／切断用カクテルのろ液を得る工程；
（ｄ−２）（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）／切断用カクテルのろ液を濃縮する工程；
（ｄ−３）濃縮した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）／切断用カクテルのろ液から、未精製の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を沈殿させる工程；
（ｄ−４）酢酸アンモニウム緩衝液中で、未精製の沈殿した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）をスラリー化して、Ｎ−Ｏシフトの逆転（Ｎ−Ｏ ｓｈｉｆｔ ｒｅｖｅｒｓａｌ）を行う工程；
（ｄ−５）スラリーのｐＨを調節して、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の溶液を得る工程；および、
（ｄ−６）（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を単離して、精製する工程、
を含むことを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、前記Ｎ−Ｏシフトの逆転が、未精製の沈殿した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）をわずかに塩基性の媒体中で保持し、続いてｐＨを約３〜３．７に下げ戻すことによって行われることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、前記樹脂からのＦｍｏｃ基の除去が、ＤＭＦ中のピペリジンを用いて行われることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、前記ＤＭＦ中のピペリジンの濃度が、約２５％（体積／体積）であることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基は、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＴＢＴＵ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ、ＨＣＴＵ／ＤＩＥＡ、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ、ＤＩＣ／ＨＯＡｔ、ＨＡＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、および、ＨＣＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡからなる群より選択されるカップリング試薬の組み合わせを用いてカップリングされることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は：
Ｃ末端から最初の２９個の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基は、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ、または、ＴＢＴＵ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡのいずれかのカップリング試薬の組み合わせを用いてカップリングされ；および、
Ｎ末端のヒスチジンは、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ、ＨＣＴＵ／ＤＩＥＡ、ＴＢＴＵ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ、ＤＩＣ／ＨＯＡｔ、ＨＡＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、および、ＨＣＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡからなる群より選択されるカップリング試薬の組み合わせを用いてカップリングされることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は：
Ｃ末端から最初の２９個の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基をカップリングするために用いられる前記カップリング試薬の組み合わせが、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔであり；および、
Ｎ末端のヒスチジンをカップリングするために用いられる前記カップリング試薬の組み合わせが、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡであることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は：
Ｃ末端から最初の２９個の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基が、体積が約５倍過量のＤＭＦ中の、約３．０当量の各Ｆｍｏｃ−アミノ酸、約２．９４当量のＴＢＴＵ、約２．９４当量のＨＯＢｔ、および、約４．５当量のＤＩＥＡを用いてカップリングされ；および、
Ｎ末端のヒスチジンが、体積が約５倍過量のＤＭＦ中の、約３．４当量のＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、約４．０８当量のＨＡＴＵ、および、約９．０当量のＤＩＥＡを用いてカップリングされることを特徴とする。
その他の形態において、本発明は、請求項１に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法を提供するものであり、本方法は、以下の工程：
（ａ）（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３５）−ＮＨ２（配列番号９）のＣ末端からＮ末端へ、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を、側鎖が保護されたＡｒｇ樹脂と連続的にカップリングして、それぞれの連続的なカップリング工程後にＮ末端からＦｍｏｃ基を除去して、側鎖が保護されたＨｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号３）を得る工程；
（ｂ）側鎖が保護されたＨｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号３）を切断用カクテルで処理し、それらから側鎖の保護基を除去し、未精製の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を得る工程；および、
（ｃ）未精製の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を単離して、精製し、精製した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を得る工程、
を含む。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、以下の工程：
（ａ−１）ペプチドのアミドを生成することができるＦｍｏｃで保護された樹脂を脱保護して、樹脂からＦｍｏｃ基を除去する工程；
（ａ−２）樹脂に側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨを結合させ、側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ樹脂を得る工程；および、
（ａ−３）側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ樹脂からＦｍｏｃ基を除去して、側鎖が保護されたＡｒｇ樹脂を得る工程；
をさらに含み、これらの工程は工程（ａ）の前に行われる。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は：
前記工程（ａ−２）における側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨが、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨであり；
前記側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、および、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）樹脂であり；
前記側鎖が保護されたＡｒｇ樹脂が、側鎖が保護されたＡｒｇ（Ｐｂｆ）樹脂であり；
式（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３５）−ＮＨ２（配列番号９）のＣ末端からＮ末端の前記Ｆｍｏｃ−アミノ酸が、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、および、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨであり；
前記側鎖が保護されたＨｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号３）が、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）樹脂（配列番号１０）であり；および、
前記切断用カクテルが、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／水切断用カクテル、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＣＭ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／水／ＴＩＰＳ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／ＥＤＴ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／１−ドデカンチオール切断用カクテル、ＴＦＡ／ＤＴＴ／水／ＴＩＰＳ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／メタンスルホン酸切断用カクテル、ＴＦＡ／チオアニソール／ＥＤＴ／アニソール切断用カクテル、ＴＦＡ／ＴＥＳ切断用カクテル、ＴＦＡ／水切断用カクテル、ＴＦＡ／ＤＣＭ／インドール切断用カクテル、および、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ切断用カクテルからなる群より選択されることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、前記ペプチドを生成することができる樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＡＭ樹脂、ＰＥＧベースのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂、および、シーバーアミド樹脂からなる群より選択されることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は：
前記切断用カクテルが、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／水切断用カクテル、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＣＭ切断用カクテル、および、ＴＦＡ／水カクテルからなる群より選択され；および、
前記ペプチドのアミドを生成することができる樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＡＭ樹脂、および、ＰＥＧベースのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂からなる群より選択されることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、前記ペプチドのアミドを生成することができる樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂であることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、工程（ｃ）が以下の工程：
（ｃ−１）ろ過して樹脂を除去し、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）／切断用カクテルのろ液を得る工程；
（ｃ−２）（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）／切断用カクテルのろ液を濃縮する工程；
（ｃ−３）濃縮した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）／切断用カクテルのろ液から、未精製の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を沈殿させる工程；
（ｃ−４）酢酸アンモニウム緩衝液中で、未精製の沈殿した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）をスラリー化して、Ｎ−Ｏシフトの逆転を行う工程；
（ｃ−５）スラリーのｐＨを調節して、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の溶液を得る工程；および、
（ｃ−６）（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を単離して、精製する工程、
を含むことを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、前記工程（ｃ−４）におけるＮ−Ｏシフトの逆転が、未精製の沈殿した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）をわずかに塩基性の媒体中で保持し、続いてｐＨを約３〜３．７に下げ戻すことによって行われることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、前記樹脂からのＦｍｏｃ基の除去が、ＤＭＦ中のピペリジンを用いて行われることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、前記ＤＭＦ中のピペリジンの濃度が、約２５％（体積／体積）であることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基が、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＴＢＴＵ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ、ＨＣＴＵ／ＤＩＥＡ、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ、ＤＩＣ／ＨＯＡｔ、ＨＡＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、および、ＨＣＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡからなる群より選択されるカップリング試薬の組み合わせを用いてカップリングされることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基が、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ、または、ＴＢＴＵ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡのいずれかのカップリング試薬の組み合わせを用いてカップリングされることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基が、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔのカップリング試薬の組み合わせを用いてカップリングされることを特徴とする。
直前に述べた本発明の形態の好ましい実施態様は、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基が、体積が約５倍過量のＤＭＦ中の、約３．０当量の各Ｆｍｏｃ−アミノ酸、約２．９４当量のＴＢＴＵ、約２．９４当量のＨＯＢｔ、および、約４．５当量のＤＩＥＡを用いてカップリングされることを特徴とする。
詳細な説明
本願において、以下の略語が用いられる：
ＡＣＮ アセトニトリル
ＡＭ アミノメチル
Ｂｏｃ ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＩＣ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＥＡ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＴＴ ジチオスレイトール
ＥＤＴ エタンジチオール
Ｆｍｏｃ フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＡＴＵ Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＨＢＴＵ ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＨＯＡｔ １−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ 高圧液体クロマトグラフィー
ＬＯＤ 乾燥減量
ＭＢＨＡ ４−メチルベンズヒドリルアミン
ＭＴＢＥ メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル
ＯｔＢｕ ｔｅｒｔ−ブチルエステル
Ｐｂｆ ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＴＢＴＵ ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラフルオロホウ酸テトラメチルウロニウム
ｔＢｕ ｔｅｒｔ−ブチルエーテル
ＴＥＳ トリエチルシラン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＩＰＳ トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ トリチル。
ＰＥＧベースのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂は、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミドリンカーを有する樹脂であり、この樹脂の構成成分のビーズは、ＰＥＧ部分を含む。ＰＥＧベースのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂のいくつかの例としては、これらに限定されないが、ノヴァペグ（ＮｏｖａＰｅｇ）、ノヴァゲル（ＮｏｖａＧｅｌ）、および、ＡＭシュアー（ＡＭ ＳＵＲＥ）が挙げられる。
本明細書で用いられる用語「切断用カクテル」は、構築されたペプチドを樹脂から除去したり、または、切断したりするのに用いられる試薬の混合物を意味する。加えて切断用カクテルはまた、全ての側鎖の末端保護基、および、Ｎ末端の保護基を除去するのにも役立つ。
本明細書でパラメーターまたは量に関連して用いられる用語「約」は、パラメーターまたは量が、述べられたパラメーターまたは量の±５％以内であることを意味する。本発明の方法を説明するために、以下の実施例を記載するが、本発明をいかなる形であれ限定するものと解釈されないこととする。
・（Ａｉｂ ８，３５ ）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ ２ （配列番号２）の合成
圧縮空気モーターおよびＰＴＦＥかきまぜ機を備えた３５リットルのガラス製反応装置（クォーク（Ｑｕａｒｋ），ヴァインランド，ニュージャージー州，米国）中で、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を合成した。Ｆｍｏｃ ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（メルク・バイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），ダルムシュタット，ドイツ）を０．６３ｍｍｏｌ／ｇの取り込み量で用いた。Ｆｍｏｃ アミノ酸（シンセテック社（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．），オールバニー，オレゴン州，米国）を以下の側鎖の保護と共に用いた：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、および、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ。以下のＦｍｏｃアミノ酸は側鎖の保護を必要としなかった：Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、および、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。
合成を０．６３モルスケール（投入された樹脂は１ｋｇ）で行った。最初の２９個のアミノ酸（全てＮ末端のヒスチジンを除く）を３．０当量のアミノ酸を用いてカップリングし、ＤＭＦ４．５リットル中の２．９４当量のＴＢＴＵ（フルカ（Ｆｌｕｋａ），ゼールツェ，ドイツ）、２．９４当量のＨＯＢｔ（フルカ，ゼールツェ，ドイツ）、および、４．５当量のＤＩＥＡ（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），ジリンガム，英国）で予備的に活性化させた。カップリング時間は、６０分間であった。Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを、ＤＭＦ４．５リットル中の３．４当量のアミノ酸、４．０８当量のＨＡＴＵ（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），フラミンガム，マサチューセッツ州，米国）、および、９当量のＤＩＥＡを用いてカップリングした。最初のカップリングの前およびそれに続く各カップリングの後の樹脂の脱保護は、２×１０リットルのＤＭＦ中の２５％（体積／体積）ピペリジン（ＢＡＳＦ，ドイツ）を用いて行われた。
樹脂へのペプチドのアセンブリが完了したら、樹脂を１０リットルのメタノール（ラボスキャン（Ｌａｂｓｃａｎ），ダブリン，アイルランド）で２回洗浄し、真空オーブン（メーソン・テクノロジー（Ｍａｓｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），ダブリン，アイルランド）中でＬＯＤ（乾燥減量）が１％未満になるまで乾燥させた。反応装置中で樹脂を最初は窒素で乾燥させ、真空オーブン中で、およそ２２℃の周囲温度で、５０ｍｂａｒ未満で最終的な乾燥を行った。全ての乾燥プロセスは３日かかった。４２００ｇのペプチジル樹脂を得た。
樹脂からペプチドを切断し、その側鎖の保護基を、７００ｇのサブロットを６個用いて、サブロットそれぞれに対して８．４リットルのＴＦＡ／ＴＩＰＳ／水（８０／１４．３／５．７％体積／体積）の切断用カクテルを１７０分用いて除去した。樹脂を０．７リットルのＴＦＡで洗浄し、ろ液を合わせた。切断用カクテルを、ロータリーエバポレーター（ビュッヒ（Ｂｕｃｈｉ），フラウィル，スイス）を用いてその元の質量の１４〜３２％になるまで濃縮し、未精製ペプチドを１３．６〜１７．５リットルの撹拌させたＭＴＢＥ（ラボスキャン，ダブリン，アイルランド）中に沈殿させた。未精製ペプチドをさらに１．５〜７．５リットルのＭＴＢＥで洗浄した。
酢酸アンモニウム緩衝液（１０ｇのペプチド／１００ｍｌ、１０％質量／体積、すなわち１０ｇのペプチド／１００ｍｌ緩衝液、ｐＨ８〜９）中で６０分間沈殿させた未精製ペプチドをスラリー化することによって、Ｎ−Ｏシフトの逆転を行った。ｐＨを１４〜１８リットルの氷酢酸で３．３〜３．７にしたところ、透明な未精製ペプチド溶液が得られ、これは、約５０％のＨＰＬＣ純度を示した。このペプチド溶液を、精製の前に０．４５μｍのフィルター（ポール・ゲルマン・サイエンス社（Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．），ニューヨーク，ニューヨーク州，米国）を通過させてろ過した。
ペプチドを、Ｃ１８固定相（エカ・ケミカルズ社（Ｅｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＡＢ），ボーフス（Ｂｏｈｕｓ），スウェーデン）が充填された逆相分取用ＨＰＬＣカラム（ノバセップ（Ｎｏｖａｓｅｐ），ポンペイ，フランス）を用いて精製した。水およびアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを用いた濃度勾配溶出で精製を行った。
酢酸アンモニウムおよび酢酸緩衝液を用いて塩変換クロマトグラフィー工程を行い、酢酸塩を生成した。具体的に言えば、ＨＰＬＣカラムにペプチドをローディングした。このペプチドカラムを酢酸アンモニウム緩衝液を用いて１時間カラム上で洗浄し、続いて酢酸／アセトニトリルの濃度勾配を用いてカラムから溶出させた。
精製したペプチドの純度は、ＨＰＬＣ解析によれば９９％を超えていた。具体的に言えば、ペプチド溶液をロータリーエバポレーター（最大温度４０℃）で濃縮し、得られた溶液を０．４５μｍのフィルター（ポール・ゲルマン・サイエンス社、ニューヨーク，ニューヨーク州，米国）を通過させてろ過し、凍結乾燥した。
最終的なヒスチジンカップリングのためのＨＡＴＵ／ＤＩＥＡシステムは、ＴＢＴＵ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ、ＤＩＣ／ＨＯＡｔまたはＨＡＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡシステムと比較して、より優れた２９ｍｅｒの（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）への変換を引き起こし、従って収量が増加した。
加えて、Ｂｏｃで保護されたヒスチジンの使用は、Ｆｍｏｃで保護されたヒスチジンと比較してより優れた収量が得られ、さらに切断の前にＦｍｏｃの除去が必要ないためにプロセス時間がわずかに短縮された。以下の表に示したように、試薬の比率と反応時間との最適な組み合わせを選択して収量を高めるために、ヒスチジンカップリングと樹脂からの切断との両方に対して実証研究の統計的設計を行った。
一般的に当業界で知られているように、Ｎ−Ｏシフトは、酸性条件に曝露された際に、スレオニンまたはセリン残基を含むペプチド中に形成されるアシルシフトである。それにより収量を減少させる異性体の不純物が生じ、純度を高めることが難しくなる可能性がある。これらのＮ−Ｏシフトは、わずかに塩基性の媒体（例えばｐＨ８〜９）中でペプチドを保持し、続いてｐＨを約３に下げ戻すことによって逆転される。直前に述べたプロセスにより、スラリーとしてＮ−Ｏシフトの逆転を行わせることが可能になり、このようなスラリーを用いることは、完全に溶液をベースとした反転プロセスよりもスケール面での利点がある。
Figure 2012502992
Figure 2012502992
Figure 2012502992
Figure 2012502992
上記の表２および４で示されるように、粗生成物のワークアップ（切断用カクテルの蒸発およびＭＴＢＥ中での沈殿を含む）を、収量に影響を与えることなくラージスケールで沈殿するように最適化した。最終的には、ラージスケールでの合成（１ｋｇの樹脂投入）を行い、これをその後サブロットで切断したところ、全体の合成収量２７％であり、これは、より少ないスケールと比較しておよそ８％の増加を示す。
精製法の開発に関して、材料を９９％を超える純度で得るのに必要な精製の試行数を最小化するために、開始時から用いられるＴＦＡの濃度勾配を改変することに努力を集中させたところ、５０〜６０％の精製収量が得られた。
その他の実施態様
当業者であれば、上記の説明から本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、さらにそれらの本質および範囲から逸脱することなく本発明に様々な変更および改変を施して、本発明を様々な用途および条件に適合させることができる。従って、その他の実施態様も請求項の範囲内である。

Claims (29)

  1. 段階的に固相Ｆｍｏｃを用いた化学的方法を含む、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  2. 以下の工程：
    （ａ）（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（８−３５）−ＮＨ２（配列番号８）のＣ末端からＮ末端へ、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を、側鎖が保護されたＡｒｇ樹脂と連続的にカップリングし、それぞれの連続的なカップリング工程後にＮ末端からＦｍｏｃ基を除去して、側鎖が保護されたＡｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号４）を得る工程；
    （ｂ）側鎖が保護されたＢｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨを、側鎖が保護されたＡｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号４）とカップリングして、側鎖が保護されたＢｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号５）を得る工程；
    （ｃ）側鎖が保護されたＢｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号５）を切断用カクテルで処理し、それらから側鎖の保護基およびＮ末端の保護基を除去して、未精製の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を得る工程；および、
    （ｄ）未精製の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を単離して、精製し、精製した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を得る工程、
    を含む、請求項１に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  3. 以下の工程：
    （ａ−１）ペプチドのアミドを生成することができるＦｍｏｃで保護された樹脂を脱保護して、樹脂からＦｍｏｃ基を除去すること；
    （ａ−２）樹脂に側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨを結合させ、側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ樹脂を得ること；および、
    （ａ−３）側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ樹脂からＦｍｏｃ基を除去して、側鎖が保護されたＡｒｇ樹脂を得ること；
    をさらに含み、これらの工程は工程（ａ）の前に行われる、請求項２に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  4. 前記工程（ａ−２）における側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨが、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨであり；
    前記側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）樹脂であり；
    前記側鎖が保護されたＡｒｇ樹脂が、側鎖が保護されたＡｒｇ（Ｐｂｆ）樹脂であり；
    式（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（８−３５）−ＮＨ２（配列番号８）のＣ末端からＮ末端の前記Ｆｍｏｃ−アミノ酸が、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、および、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨであり；
    前記側鎖が保護されたＡｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号４）が、Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）樹脂（配列番号６）であり；
    前記側鎖が保護されたＢｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨが、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨであり；
    前記側鎖が保護されたＢｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号５）が、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）樹脂（配列番号７）であり；および、
    前記切断用カクテルが、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／水切断用カクテル、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＣＭ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／水／ＴＩＰＳ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／ＥＤＴ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／１−ドデカンチオール切断用カクテル、ＴＦＡ／ＤＴＴ／水／ＴＩＰＳ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／メタンスルホン酸切断用カクテル、ＴＦＡ／チオアニソール／ＥＤＴ／アニソール切断用カクテル、ＴＦＡ／ＴＥＳ切断用カクテル、ＴＦＡ／水切断用カクテル、ＴＦＡ／ＤＣＭ／インドール切断用カクテル、および、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ切断用カクテルからなる群より選択される、請求項３に記載の（Aib８,３５）hGLP-１（７-３６）-NH２ （配列番号２）の合成方法。
  5. 前記ペプチドを生成することができる樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＡＭ樹脂、ＰＥＧベースの Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂、および、シーバーアミド樹脂からなる群より選択される、請求項４に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  6. 前記切断用カクテルが、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／水切断用カクテル、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＣＭ切断用カクテル、および、ＴＦＡ／水カクテルからなる群より選択され；および、
    前記ペプチドのアミドを生成することができる樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＡＭ樹脂、および、ＰＥＧベースのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂からなる群より選択される、請求項５に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  7. 前記ペプチドのアミドを生成することができる樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂である、請求項６に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  8. 前記工程（ｄ）が以下の工程：
    （ｄ−１）ろ過して樹脂を除去し、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）／切断用カクテルのろ液を得る工程；
    （ｄ−２）（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）／切断用カクテルのろ液を濃縮する工程；
    （ｄ−３）濃縮した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）／切断用カクテルのろ液から、未精製の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を沈殿させる工程；
    （ｄ−４）酢酸アンモニウム緩衝液中で、未精製の沈殿した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）をスラリー化して、Ｎ−Ｏシフトの逆転を行う工程；
    （ｄ−５）スラリーのｐＨを調節して、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の溶液を得る工程；および、
    （ｄ−６）（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を単離して、精製する工程、
    を含む、請求項７に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  9. 前記Ｎ−Ｏシフトの逆転が、未精製の沈殿した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）をわずかに塩基性の媒体中で保持し、続いてｐＨを約３〜３．７に下げ戻すことによって行われる、請求項８に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  10. 前記樹脂からのＦｍｏｃ基の除去が、ＤＭＦ中のピペリジンを用いて行われる、請求項９に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  11. 前記ＤＭＦ中のピペリジンの濃度が、約２５％（体積／体積）である、請求項１０に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  12. 前記（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基が、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＴＢＴＵ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ、ＨＣＴＵ／ＤＩＥＡ、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ、ＤＩＣ／ＨＯＡｔ、ＨＡＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、および、ＨＣＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡからなる群より選択されるカップリング試薬の組み合わせを用いてカップリングされる、請求項〜のいずれか一項に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  13. Ｃ末端から最初の２９個の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基は、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ、または、ＴＢＴＵ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡのいずれかのカップリング試薬の組み合わせを用いてカップリングされ；および、
    Ｎ末端のヒスチジンが、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ、ＨＣＴＵ／ＤＩＥＡ、ＴＢＴＵ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ、ＤＩＣ／ＨＯＡｔ、ＨＡＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、および、ＨＣＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡからなる群より選択されるカップリング試薬の組み合わせを用いてカップリングされる、請求項１２に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  14. Ｃ末端から最初の２９個の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基をカップリングするために用いられる前記カップリング試薬の組み合わせが、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔであり；および、
    Ｎ末端のヒスチジンをカップリングするために用いられる前記カップリング試薬の組み合わせが、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡである、請求項１３に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  15. Ｃ末端から最初の２９個の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基が、体積が約５倍過量のＤＭＦ中の、約３．０当量の各Ｆｍｏｃ−アミノ酸、約２．９４当量のＴＢＴＵ、約２．９４当量のＨＯＢｔ、および、約４．５当量のＤＩＥＡを用いてカップリングされ；および、
    Ｎ末端のヒスチジンが、体積が約５倍過量のＤＭＦ中の、約３．４当量のＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、約４．０８当量のＨＡＴＵ、および、約９．０当量のＤＩＥＡを用いてカップリングされる、請求項１４に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  16. 以下の工程：
    （ａ）（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３５）−ＮＨ２（配列番号９）のＣ末端からＮ末端へ、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を、側鎖が保護されたＡｒｇ樹脂と連続的にカップリングして、それぞれの連続的なカップリング工程後にＮ末端からＦｍｏｃ基を除去して、側鎖が保護されたＨｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号３）を得る工程；
    （ｂ）側鎖が保護されたＨｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号３）を切断用カクテルで処理し、それらから側鎖の保護基を除去し、未精製の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を得る工程；および、
    （ｃ）未精製の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を単離して、精製し、精製した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を得る工程、
    を含む、請求項１に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  17. 以下の工程：
    （ａ−１）ペプチドのアミドを生成することができるＦｍｏｃで保護された樹脂を脱保護して、樹脂からＦｍｏｃ基を除去すること；
    （ａ−２）樹脂に側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨを結合させ、側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ樹脂を得ること；および、
    （ａ−３）側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ樹脂からＦｍｏｃ基を除去して、側鎖が保護されたＡｒｇ樹脂を得ること；
    をさらに含み、これらの工程は工程（ａ）の前に行われる、請求項１６に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  18. 前記工程（ａ−２）における側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨが、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨであり；
    前記側鎖が保護されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、および、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）樹脂であり；
    前記側鎖が保護されたＡｒｇ樹脂が、側鎖が保護されたＡｒｇ（Ｐｂｆ）樹脂であり；
    式（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３５）−ＮＨ２（配列番号９）のＣ末端からＮ末端の前記Ｆｍｏｃ−アミノ酸が、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、および、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨであり；
    前記側鎖が保護されたＨｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ樹脂（配列番号３）が、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）樹脂（配列番号１０）であり；および、
    前記切断用カクテルが、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／水切断用カクテル、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＣＭ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／水／ＴＩＰＳ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／ＥＤＴ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／１−ドデカンチオール切断用カクテル、ＴＦＡ／ＤＴＴ／水／ＴＩＰＳ切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール切断用カクテル、ＴＦＡ／フェノール／メタンスルホン酸切断用カクテル、ＴＦＡ／チオアニソール／ＥＤＴ／アニソール切断用カクテル、ＴＦＡ／ＴＥＳ切断用カクテル、ＴＦＡ／水切断用カクテル、ＴＦＡ／ＤＣＭ／インドール切断用カクテル、および、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ切断用カクテルからなる群より選択される、請求項１７に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  19. 前記ペプチドを生成することができる樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＡＭ樹脂、ＰＥＧ−ｂａｓｅｄベースの Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂、および、シーバーアミド樹脂からなる群より選択される、請求項１８に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  20. 前記切断用カクテルが、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／水切断用カクテル、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＣＭ切断用カクテル、および、ＴＦＡ／水カクテルからなる群より選択され；および、
    前記ペプチドのアミドを生成することができる樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＡＭ樹脂、および、ＰＥＧベースのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂からなる群より選択される、請求項１９に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  21. 前記ペプチドのアミドを生成することができる樹脂が、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂である、請求項２０に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  22. 前記工程（ｃ）が以下の工程：
    （ｃ−１）ろ過して樹脂を除去し、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）／切断用カクテルのろ液を得る工程；
    （ｃ−２）（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）／切断用カクテルのろ液を濃縮する工程；
    （ｃ−３）濃縮した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）／切断用カクテルのろ液から、未精製の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を沈殿させる工程；
    （ｃ−４）酢酸アンモニウム緩衝液中で、未精製の沈殿した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）をスラリー化して、Ｎ−Ｏシフトの逆転を行う工程；
    （ｃ−５）スラリーのｐＨを調節して、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の溶液を得る工程；および、
    （ｃ−６）（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）を単離して、精製する工程、
    を含む、請求項２１に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  23. 前記工程（ｃ−４）におけるＮ−Ｏシフトの逆転が、未精製の沈殿した（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）をわずかに塩基性の媒体中で保持し、続いてｐＨを約３〜３．７に下げ戻すことによって行われる、請求項２２に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  24. 前記樹脂からのＦｍｏｃ基の除去が、ＤＭＦ中のピペリジンを用いて行われる、請求項２３に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  25. 前記ＤＭＦ中のピペリジンの濃度が、約２５％（体積／体積）である、請求項２４に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  26. 前記（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基が、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＴＢＴＵ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ、ＨＣＴＵ／ＤＩＥＡ、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ、ＤＩＣ／ＨＯＡｔ、ＨＡＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、および、ＨＣＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡからなる群より選択されるカップリング試薬の組み合わせを用いてカップリングされる、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  27. 前記（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基が、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ、または、ＴＢＴＵ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡのいずれかのカップリング試薬の組み合わせを用いてカップリングされる、請求項２６に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  28. 前記（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基が、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔのカップリング試薬の組み合わせを用いてカップリングされる、請求項２７に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
  29. 前記（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）のアミノ酸残基が、体積が約５倍過量のＤＭＦ中の、約３．０当量の各Ｆｍｏｃ−アミノ酸、約２．９４当量のＴＢＴＵ、約２．９４当量のＨＯＢｔ、および、約４．５当量のＤＩＥＡを用いてカップリングされる、請求項２８に記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２（配列番号２）の合成方法。
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