JP2012213402A - 抗原特異的t細胞、核酸、ベクター、pbmc、及び製薬組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】抗原特異的T細胞は、患者由来MHC分子をエンコードする核酸、及び、抗原もしくは前記抗原をエンコードする核酸を準備する工程、これらの両方の化合物を、健康なドナーに由来する抗原提示細胞(APC)中にコトランスフェクションするか、または導入する工程、健康なドナーに由来する末梢血リンパ球(PBL)を、前記APCで初回抗原刺激する工程、及びMHC−抗原リガンドに特異的なT細胞を選択する工程を含む方法によって提供される。
【選択図】なし
Description
1)第一に、本発明者らは、同種異系MHC分子、例えばHLA−A2をエンコードするRNAが、HLA−A2陰性ドナーの細胞中に転移された時に、HLA−A2分子が、HLA−A2特異的モノクローナル抗体での染色後、フローサイトメトリーを用いて検出されるように、細胞表面に発現されることを実証した。さらには、これらの細胞は、HLA−A2アロ特異的T細胞クローン(JB4細胞)を活性化して、サイトカイン(IFN−ガンマ)を分泌することができ、これらの機能的能力を実証している。転移および発現は、DCならびに他の細胞、例えばK562細胞において達成されることができる。
第一の態様によれば、本発明は、抗原特異的T細胞の生成方法であって、
a)患者由来MHC分子をエンコードする核酸および抗原、または前記抗原をエンコードする核酸を準備する工程、
b)工程a)において規定されているような両方の化合物を、健康なドナーに由来する抗原提示細胞(APC)、好ましくは樹状細胞中にコトランスフェクションするか、または導入する工程、
c)健康なドナーに由来する末梢血リンパ球(PBL)を、前記APCで初回抗原刺激する工程、
d)MHC−抗原リガンドに特異的なT細胞を選択する工程、
を含む方法を提供する。
前記T細胞は好ましくは、エフェクター細胞特徴を有するT細胞、より好ましくはサイトカイン生産T細胞、細胞傷害性T細胞、または調節T細胞、好ましくはCD4+もしくはCD8+T細胞である。
追加の態様は、トランスジェニックTCRについてコードする核酸を含んでいるベクターを目的とする。このベクターは好ましくは、本発明による核酸、および1またはそれ以上の調節核酸配列を含有する発現ベクターである。好ましくはこのベクターは、プラスミドまたはレトロウイルスベクターである。
さらなる態様において、本発明は、上に説明されているようなT細胞もしくはPBMC、および製薬的に許容可能な担体を含んでいる製薬組成物を提供する。
製薬組成物は、活性成分の活性を強化するか、または治療を補足する追加成分を含有することができる。このような追加成分および/または因子は、相乗効果を得るため、または副作用もしくは望まれない作用を最小限にするためにこの製薬組成物の一部であってもよい。
さらなる態様によれば、本発明は、養子細胞療法のため、および特に血液悪性腫瘍もしくは充実性腫瘍および急性もしくは慢性感染の治療のための薬剤の製造について上で説明されているような抗原特異的T細胞もしくはPBMCの使用を目的とする(同様に上記参照)。
図1.樹状細胞の未成熟および成熟段階
樹状細胞(DC)は、抗原に遭遇したことがないT細胞(ナイーブT細胞)を活性化するこれらの能力のために、抗原提示細胞(APC)のうち最も「プロフェッショナル」であると考えられる。これは、DCについて既に発見されているいくつかの因子に応じており、同様に依然として同定されるべき特徴に依存することがある。DCの様々な形態が存在し、これらの独特の特徴は、継続的に調査中である。臨床研究のために最も普通に用いられているDCの型は、CD14−陽性血液単球から区別することができる骨髄DCである。サイトカイン、顆粒球−単球コロニー刺激因子(GM−CSF)、およびインターロイキン−4(IL−4)の存在下におけるこのような単球の試験管内培養を通して、その周囲から(異種抗原を含む)材料を取り上げるその高い能力を特徴とする未成熟骨髄DCが生成される。未成熟DCが、この段階の間に適切なシグナルを受け取る時、これは活性化されて、リンパ管を通って二次リンパ節へ移動する。この移動の間、およびリンパ節に達した時、これはさらなる変化を受け、これが完全成熟段階に導く。成熟段階において、DCは、高いレベルのMHCクラスIおよびクラスII分子を発現し、これらによってこれは、細胞内タンパク質に由来するペプチドの形態における抗原を、それぞれCD8−陽性およびCD−4陽性T細胞へ提示することが可能にされる。MHC分子の両方の型によって提示され、DCの表面上に示された抗原は、抗原プロセシングおよび提示の様々な工程を含む、複雑な細胞プロセスにおいてDC中に生成される。MHCクラスI分子中のDC細胞表面において提示されたペプチド(すなわち抗原−断片)の場合、APCが抗原プロセシング関連輸送体(TAP)遺伝子、TAP1およびTAP2によってエンコードされた分子を発現する必要がある。
腫瘍細胞または他の細胞、例えば病原体で感染された細胞上でMHC−ペプチドリガンドを認識するより良好な能力を有するT細胞を得るために、同種異系MHC分子を介して、選択された1または複数の抗原に由来するペプチドを提示することによって、健康な個人からのT細胞の非選択レパートリーを選ぶ(tap)ことができる。例えば、HLA−A2でない健康なドナーAからのT細胞は、胸腺においてHLA−A2−ペプチド複合体へ暴露されたことはなく、したがって、高い結合活性を有するHLA−A2−ペプチド複合体と相互作用することができるTCRを発現するこのような個人の末梢血単核細胞(PBMC)のうちで利用可能なT細胞が存在する。このような所望のTCRを担っているナイーブT細胞を刺激するために、前記ドナーAのDCは単球から生成され、次いで修飾されて、同種異系MHCクラスIもしくはクラスII分子を発現する。ここで、HLA−A2についての一例が与えられる。この分子は、HLA−A2でないドナーAのT細胞についての同種異系MHC分子である。HLA−A2エンコードRNAをドナーAのDC中に導入することによって、HLA−A2分子をその細胞表面において発現するDCの集団を作製することが可能である。これによって、DCは依然として、ドナーAの染色体MHC遺伝子によってエンコードされた自己−MHC分子のその正常な組を発現するが、これに加えてそれは、導入されたRNAから翻訳された同種異系MHC分子を発現する。同時にDCは、ペプチドがDCによって処理され、細胞表面において同種異系HLA−A2分子によって提示され得るタンパク質抗原をエンコードするRNAが供給されることができる。このような同種異系MHC−ペプチドリガンドをその細胞表面において発現するDCが、ナイーブT細胞を刺激するためにAPCとして用いられる時、これらは、所望の同種異系MHC−ペプチドリガンドと相互作用するTCRを有するT細胞を活性化することができる。同種異系MHC分子を認識するすべてのT細胞が、所望のペプチド特異性を有するわけではないであろう。したがって所望のTCRを有するこれらの細胞は、活性化されたT細胞の全部の集団から選択されなければならない。この選択を得るための、免疫学者に周知のいくつかの手順がある。例えば活性化されたT細胞は、個々の細胞としてクローンすることができ、拡張後にこれらのT細胞クローンは、これらのMHC−ペプチド特異性について分析することができ、所望の特異性を有するものが、さらなる使用のために選択されることができる。あるいはまた、様々な形態の可溶性MHC−ペプチドリガンド、例えばテトラマーは、蛍光ラベルでマークすることができ、活性化されたT細胞でインキュベーションされることができる。これらのテトラマーと相互作用するTCRを担っているこれらのT細胞は、次いでフローサイトメトリーによって検出されることができ、これらの蛍光に基づいてソートされることができる。
この戦略の実行可能性を実証するための第一実験方法として、本発明者らは、RNA転移後の同種異系HLA−A2MHC分子の発現のために、受容者細胞株としてK562細胞株を用いた。この細胞株はエリスロミエロイド白血病(erythromyeloid
leukaemia)に由来し、細胞免疫学者には周知である。これは腫瘍系であるので、多数になるまで成長させることができ、実験的な取扱いが容易である。これはさらに、その細胞表面上にMHCクラスI分子をまったく発現させず、従って、同種異系MHC分子の発現は、MHCクラスI分子をエンコードする核酸の導入後、K562の細胞表面において容易に検出することができる。
HLA−A2 mRNAのエレクトロポレーション後にDC上のHLA−A2分子の表面発現を評価するため、およびJB4細胞からのサイトカイン分泌を刺激するこれらの能力を評価するために、同様な実験方法が、図3に記載されているように用いられた。ここで、24マイクログラムの量のHLA−A2 mRNAが全体を通して用いられたが、mRNAの3つの異なる源が比較された。これらは、RNA発現をDC内部で安定させる意図で、ヒトアルファ−グロブリン遺伝子の3’UTRがHLA−A2遺伝子構成体へ添加されている試験管内転写RNAの商業源を含んでいた。このRNAは、アンビオン(Ambion)からの商業的手順およびキットを用いて生成されたポリアデニル化HLA−A2 RNA対キュアヴァック(CureVac)からの商業的手順およびキットを用いて生成された同様なRNAと比較された。アンビオン手順を用いて生成され、HLA−A2陰性ドナーから培養されたDC中にエレクトロポレーションによって導入されたポリアデニル化mRNAが、最良の結果を示した。このmRNAの場合にHLA−A2陽性細胞の最高パーセンテージが見られ、DCの表面におけるHLA−A2分子の出現は、より早く(6時間の時点で)検出され、DC中の発現は、このmRNA源を用いて、なおも120時間の時点で見られた。従って、すべてのさらなる実験は、このmRNA源を利用した。
RNAは、アンビオン手順を用い、抗原チロシナーゼに対して特異的に生成された。これはK562−A2細胞中にエレクトロポレーションされ、HLA−A2の表面発現が、HLA−A2分子に特異的なモノクローナル抗体を用いて測定された。緑の曲線はイソタイプ対照抗体での染色を表わし、青色の曲線はHLA−A2−特異的抗体での染色を表わす。ここで、HLA−A2表面発現がすべての時点で見られたが、それは、K562−A2細胞が、HLA−A2遺伝子を構成的に発現するからである。HLA−A2の発現の減少は、12時間の時点で注目され、これは、エレクトロポレーションの結果としてのストレス誘発された衝撃と関連付けることができる。これらの細胞は、その後HLA−A2分子の高い発現を回復した。チロシナーゼのタンパク質発現は、チロシナーゼに特異的なモノクローナル抗体を用いて、タンパク質の細胞内検出後に測定された。オレンジ色の曲線は模擬対照の染色を表わし、青色の曲線は、これらの細胞内部のチロシナーゼタンパク質を表わす。染色におけるわずかなシフトを、いくつかの時点で見ることができ、タンパク質が、チロシナーゼRNAの導入後に作製されつつあることを示している。
チロシナーゼRNAが、K562−A2細胞中にエレクトロポレーションされ、陽性細胞のパーセンテージ、ならびに平均蛍光強度(MFI)と呼ばれる染色強度が様々な時点で決定された(左上部分)。赤い棒はK562−A2細胞上の構成的HLA−A2発現を示しており、ここでもまた、11〜24時間のレベルにおける低下およびその後の回復をともなう。青い棒は、6時間の時点でピークがあるチロシナーゼタンパク質の細胞内染色を示している。6時間の時点での染色のシフトは、右下部分に図解され、ここでは模擬対照染色がオレンジ色の曲線によって示され、チロシナーゼ染色は青色の曲線によって示されている。模擬対照と比較した、経時的な発現の倍数増加(fold increase)は左下部分に示され、11時間の時点で最大を生じる。HLA−A2分子によって提示されたチロシナーゼ由来ペプチドが分かるT細胞クローンTyr−F8のインターフェロン−ガンマ分泌が右上部分に示されている。K562−A2細胞は、Tyr−F8T細胞によるインターフェロン−ガンマ選択を誘発しないが、これらは、チロシナーゼRNAでのエレクトロポレーション後に可能である。これらのT細胞は単独でサイトカインを分泌しないが、これらはまた、チロシナーゼからの合成ペプチドが負荷されたK562−A2細胞によって、またはチロシナーゼおよびHLA−A2を共発現する黒色腫細胞(MEL−IL2細胞)によって刺激されることができる。
同様な一組の実験が、図6に記載されている実験のように行なわれたが、HLA−A2陽性ドナーからのDCがK562−A2細胞の代わりに用いられた。細胞内チロシナーゼタンパク質の発現が、RNAのエレクトロポレーション後の様々な時点でDC中に検出された(上の図)。模擬対照全体における最高の平均倍数発現が、DC中で3時間の時点で見られた。DC単独ではTyrF8細胞によるサイトカイン分泌を刺激することはできなかったが、これらは、チロシナーゼRNAでのエレクトロポレーション後では可能であった。エレクトロポレーションの12時間後または24時間後に用いられたDCは、Tyr−F8T細胞を活性化して、インターフェロン−ガンマを分泌させる能力を有していた。
HLA分子をまったく発現しないK562細胞が、HLA−A2およびチロシナーゼについてのRNAでエレクトロポレーションされた。RNAの各種が個々に導入されるか、または両方が組み合わされて導入された。右上図は、異なる時点におけるHLA−A2単独(最も左側の一組の棒)、チロシナーゼ単独のタンパク質発現、次いでHLA−A2およびチロシナーゼRNAの両方でエレクトロポレーションされた細胞におけるHLA−A2染色、およびRNAの両方の種を受け取っている細胞におけるチロシナーゼ染色を要約している。RNAの両方の種でエレクトロポレーションされた細胞中の両方のタンパク質の最適発現が、24時間の時点で見られた。両方のRNAを共発現するK562細胞は、エレクトロポレーションの12時間後および24時間後にTyrF8細胞からのインターフェロン−ガンマ分泌を刺激することができた。
HLA−A2陰性ドナーから調製されたDCにおけるHLA−A2タンパク質およびチロシナーゼタンパク質の共発現が、図8に記載されているように分析された。両方のタンパク質の共発現が、様々な時点においてDC中に見られた。HLA−A2発現のレベルは、チロシナーゼRNAの存在下に低下されるように思われた。それにもかかわらず、両方のRNAを共発現するDCは、TyrF8細胞によるインターフェロン−ガンマの有意レベルを、T細胞単独のもの、またはRNAの単独種でエレクトロポレーションされたDCでのインキュベーション後のもの以上に刺激することができた。
DCがTyrF8細胞からのサイトカイン分泌を刺激する能力が、様々な量のHLA−A2およびチロシナーゼRNAでトランスフェクションされたHLA−A2陰性ドナーから調製されたDCを用いて分析された。模擬対照DC(最も左側の棒)が、サイトカイン放出のバックグラウンドレベルのみを誘発した。T細胞単独ではサイトカインを分泌しないが、これらはまた、チロシナーゼおよびHLA−A2を共発現する黒色腫細胞(MEL−IL2細胞)によっても刺激されることができる。
RNA負荷されたDCがナイーブT細胞を初回抗原刺激して腫瘍特異的リンパ球になる能力を分析するために、3相初回抗原刺激プロトコルが開発された。初回抗原刺激の開始に先立つ8日前(−8日目)、単球が、記載されているようにHLA−A2陽性ドナーおよびHLA−A2陰性ドナーからプラスチック接着によって調製された。これらの精製された単球集団が未成熟DCを調製するために用いられ、これらは、次いで記載されているように成熟させられた。T細胞初回抗原刺激プロトコルの最初の日(0日目)に、DCは、記載されているようにエレクトロポレーションを介してRNAが負荷された。HLA−A2陽性ドナーに由来するDCに、モデル腫瘍抗原として24μgのチロシナーゼRNAが負荷された。これらのDCにおけるRNAから翻訳されたチロシナーゼタンパク質は、DC表面において自己−エンコードされたHLA−A2分子と関連してペプチドとして処理され、提示されるべきである。HLA−A2陰性ドナーに由来するDCは、HLA−A2(48μg)およびチロシナーゼ(24μg)をエンコードするRNAが負荷された。ここで、転移RNAによってエンコードされたHLA−A2分子は、同種異系MHC分子を表わす。チロシナーゼタンパク質に由来するペプチドは、DCへ転移されたHLA−A2エンコードRNAから翻訳されたHLA−A2分子によって処理および提示されるべきである。これらのペプチド−MHC複合体は、アロ制限−ペプチドリガンドを表す。初回抗原刺激プロトコルの0日目に、各ドナーからの自家CD8+Tリンパ球が、商業的キットおよび製造業者の指示(CD8+T細胞単離キットII(ヒト)、ドイツ国ベルギッシュ・グラードバッハのミルテニ(Miltenyi,Bergisch Gladbach))を用いて負の選択を介して>80%純度まで単離された。これらの手のつけられていない自家CD8+T細胞が、エレクトロポレーションの9時間後に、IL−7(10ng/mL)を含有するエイム(Aim)V培地(ドイツ国カールスルーエのギブコ社(Gibco BRL,Karlsruhe))中に10:1の比で、成熟RNA−パルスされたDCへ添加された。IL−2(20IU/mL)が2日後に、ついでその後3日目毎に添加された。第一回刺激の7日後(7日目)、初回抗原刺激培養物の第二回刺激が、第一回刺激についてと同じ方法で調製されたRNA−パルスされたDCを用い、初回抗原刺激の0日目に用いられたのと同じ培養条件を用いて実施された。さらに7日後(14日目)、HLA−A2制限チロシナーゼ特異的T細胞が、フィコエリトリン(PE)−標識されたHLA−A*0201/htyr369−377ペプチド/ヒトβ2mテトラマー(Wolflら、2004年;ドイツ国ミュンヘン、技術大学の医学微生物学、免疫学、および衛生研究所、(Institute of Medical Microbiology,Immunology and Hygiene,Technical University,Munich)のProf.D.Buschによって提供された)の助けを借りてソートされた。正の選択をされたT細胞のいくつかは、96ウエルV底プレート(スイス国トラサディンゲン(Trasadingen)のTPP)において、1細胞/ウエルで培養された。これらのウエルに、3日毎に50IU/mL IL−2(ドイツ国マールブルクのヒロン・ベーリンク(Chiron Behring,Marburg))を含有するエイムV培地、および7日毎に5ng/mL IL−7(ドイツ国ハイデルベルクのプロモキネ(Promokine))および10ng/mL IL−15(米国ニュージャージー州のペプロ・テック社(Pepro Tech Inc.))が供給された。選択されたクローン、および残りのテトラマー選択された非クローンT細胞が、IL−2、IL−7、IL−15で上記のようにエイムV培地中の培養に維持され、支持細胞が供給された。これらの細胞は、50Gyが照射された5ドナーのプールに由来する末梢血単核細胞からなっていた。これらのT細胞は、2週間毎に抗−CD3抗体(0.1μg/mL;ドイツ国ミュンヘンの分子免疫学研究所(Institute of Molecular Immunology,GSF)のDr.Elisabeth Kremmerから提供された)で非特異的に刺激された。
T細胞初回抗原刺激のために用いられたDCが、予想されたMHC−ペプチドリガンドを発現することを実証するために、細胞表面におけるHLA−A2分子および細胞内チロシナーゼタンパク質の発現が、既に記載されているフローサイトメトリーを用いて決定された。HLA−A2分子およびチロシナーゼタンパク質の共発現は、両方のドナーに由来するDCにおいて高レベルで検出された。細胞内チロシナーゼタンパク質のレベルは、HLA−A2陽性およびHLA−A2陰性の両方のドナーから調製されたDCにおいて匹敵しうるものであった。大部分の細胞上のHLA−A2表面発現のレベルは、HLA−A2陽性ドナーから調製されたDCにおいて、より高かった。この場合、これらは内因性遺伝子によってエンコードされている。一方、トランスジェニックHLA−A2分子のレベルは、HLA−A2陰性ドナーから調製されたDC上で、より変わりやすい。
初回抗原刺激されたT細胞培養物の中に存在するHLA−A2−チロシナーゼペプチドリガンドについて特異的なT細胞受容体を担っているT細胞を選択するために、これらのT細胞は、HLA−A*0201/htyr369−377/Hβ2mテトラマーで染色
され、フローサイトメトリーによって分析された。テトラマー結合を示した2つの異なる初回抗原刺激培養物の各々からの細胞がゲートされ(黒い四角、□)、MoFlo(商標)高性能細胞ショーター(米国コロラド州フォートコリンズのダコ(Dako,Fort Collins,CO))において単離された。HLA−A2陽性ドナーのCD8+テトラマー+T細胞集団は、低い強度においてのみテトラマー結合を示したが、一方で、HLA−A2陰性ドナーからのCD8+テトラマー+細胞は、より高い強度において染色された。これらのソートされたテトラマー+T細胞は、単一細胞として培養され、残りの細胞は、非クローンバルク培養物として培養中に保持された。
バルク培養物として保持された、ソートされた細胞は、8日後テトラマー染色について再分析された。予想されたように、ソートされた細胞の大部分は、初回抗原刺激培養物の両方に由来する、ソートされたバルク培養物中のCD8+であった。テトラマー+T細胞は、HLA−A2陽性DCを用いて初回抗原刺激された培養物中に約8%の頻度で存在した。これらの細胞は、テトラマー結合の中間的強度(MFI=127.49)を有したが、一方で、HLA−A2陰性ドナーからのバルク培養T細胞の80%が、はるかに高い強度(MFI=3248.77)を有するテトラマーを結合させた。テトラマー結合の強度は、特定のMHC−ペプチドリガンドについてのT細胞受容体(TCR)結合活性を評価するために用いられる1つのパラメーターである(Yeeら、1999年)。テトラマー結合のより高い強度は、このリガンドとTCRとのより良い相互作用を示している。TCR結合活性の第二パラメーターは、テトラマーオフレート(off−rate)である(Palermoら、2005年)。T細胞は、テトラマーでインキュベーションされ、次いで洗浄され、テトラマーの不存在下、およびHLA−A2分子について特異的な抗体の存在下にインキュベーションされる。この抗体の存在は、これらのT細胞の表面から落ちたテトラマーが、細胞表面へ再結合するのを防ぐ。これらのT細胞上のテトラマー染色の強度は、洗浄後の様々な時点:0時間、1時間、2時間の時点で決定される。テトラマー染色が急速に失われるならば、このことは、TCRが、テトラマーのMHC−ペプチドリガンドに対して低い結合活性しか有していないことを示している。テトラマー結合が経時的により安定であるならば、このことは、MHC−ペプチドリガンドに対してのより高いTCR結合活性を示す。これら2つのバルク培養物の比較において、もとのテトラマー−結合細胞(1.7%対8.3%)の20%のみが、HLA−A2陽性ドナーに由来する細胞において2時間後に依然としてテトラマー+であることが発見された。これに対して、これらの細胞の75%が、HLA−A2陰性ドナーに由来するT細胞において2時間後に依然としてテトラマー+であった(60.5%対80.6%)。
単一細胞培養実験から、2つのクローンがさらなる特徴決定のために選択された。1つのクローン(PS P4D11)がHLA−A2陽性ドナーに由来し、1つのクローン(SW P12B10)がHLA−A2陰性ドナーに由来した。
接着性腫瘍細胞株、Mel A375、Mel IL−2、Mel 624.38、およびSK Mel 28
これらのヒト黒色腫細胞株が、12%ウシ胎児血清、1×非必須アミノ酸、2mM L−グルタミン、および1mMナトリウムピルベートが補足されたRPMI 1640培地中で培養された。中程度のサイズの培養フラスコ中の培地の容積は、10mLであった。ほぼ3〜4日毎に、細胞は密集成長した。個々の細胞株の成長率に応じて、これらは1:2〜1:10に分けられた。培地が除去され、細胞はPBSで一回洗浄され、ついで2mLトリプシン/EDTA2×で3分間、室温でインキュベーションされた。脱離細胞が、新鮮なRPMI 1640培地+補足物中に再縣濁された。
T細胞クローンがまず、標準的再刺激培養物中で拡張された。大きい保存材料(stock)がアリコートされて冷凍された。実験に必要とされる度に、T細胞は保存材料から取られて解凍され、24−ウエルプレートのウエル中に入れられ、標準化されたプロトコルにしたがって再刺激された。
T2、K562、およびK562−A2が、12%FBS、1×MEM、2mM L−グルタミン、および1mMナトリウムピルベートが補足されたRPMI 1640培地中で培養された。中程度のサイズの培養フラスコにおいてこの培地の容積は10mLであった。ほぼ4日毎に、この細胞縣濁液の3/4が除去され、同じ容積の新鮮な培地が添加された。K562−A2細胞について、この培地は、1mg/mLの選択抗生物質G418が補足された。
ドナーからのPBMCが、フィコール密度勾配遠心分離によって単離された。PBMCは、T75培養フラスコ1あたり7.5×106細胞で1%自家血漿が補足されたRPMI 1640培地中に再縣濁された。これらのフラスコは37℃および5%CO2で1時間インキュベーションされた。非接着性細胞が注意深く洗い流された。接着性単球が、1%自家血漿、800U/mL GM−CSF、および800U/mL IL−4が補足された樹状細胞培地の1フラスコあたり10mL中に培養された。3日間の培養後、800U/mL GM−CSFおよび800U/mL IL−4が再び添加された。培養の6日目に、800U/mL GM−CSF、500U/mL IL−4、5ng/mL IL−1β、9ng/mL IL−6、9ng/mL TNF−α、および1mLあたり2μM PGE2が、成熟を誘発するために未成熟DCへ添加された。成熟DCが、培養の8日目に収穫された。
選択された分子の細胞発現を測定するために、フローサイトメトリーが用いられた。これらの分子は、蛍光染料へ付着されたモノクローナル抗体で特異的に染色される。フローサイトメトリー分析は、蛍光−活性化細胞ソーター(FACS(商標))において実施された。FACSCalibur(商標)において、染色された細胞の縣濁液がノズルを強制的に通され、1つずつ間隔をあけて配置された細胞を含有する液体の細い流れを生じた。各細胞がレーザービームを通過する時、これはレーザー光を散乱させ、この細胞と関連した蛍光分子が励起された。感受性光電倍増管が、細胞のサイズおよび粒度についての情報を与える両方の散乱光、および標識されたモノクローナル抗体の結合、および従って各細胞による標的分子の発現についての情報を与える蛍光発光を検出した。該細胞のソートのために、MoFlo(商標)高性能細胞ソーター(米国コロラド州フォートコリンズのダコ)が、25,000事象(events)/sおよび最大1psiで用いられた。
表面上のHLA−A2分子の発現を測定するために、ハイブリドーマ上澄み液HB82(メリーランド州ベセスダ(Bethesda)のATCC)、およびPE(フィコエリトリン)と共役された二次ヤギ抗マウス抗体が、細胞表面上の直接染色のために用いられた。約1×105DC、K562、またはK562−A2細胞が、1回洗浄された。各洗浄工程は、600μLのFACS(商標)緩衝液中の細胞の再縣濁、300×gで4分間の遠心分離、および上澄み液の廃棄を包含していた。洗浄後、50μLのHB82がこれらのペレットへ別々に添加された。氷上の30分のインキュベーション時間後、細胞は1回洗浄された。ついで0.5μLの二次抗体(1/100希釈;50μLのFACS(商標)緩衝液中の0.5μL抗体)が、これらのペレットへ別々に添加された。氷上および暗室での30分のインキュベーション時間後、細胞は1回洗浄された。最後に、細胞は200μLのFACS(商標)緩衝液中に再縣濁され、フローサイトメトリー分析が実施された。
RNA−トランスフェクションされたDCの内部のチロシナーゼの発現を測定するために、FACS(商標)緩衝液中の1%パラホルムアルデヒドを用いて、細胞がまず固定された。固定後、これらの細胞は、FACS(商標)緩衝液中の0.1%および0.25%サポニン(Saponin)を用いて透過性化(permeabilise)された。簡単に言えば、約3×105細胞が1回洗浄された。各洗浄工程は、500μLのFACS(商標)緩衝液中、またはFACS(商標)緩衝液中の0.1%サポニン中の細胞の再縣濁、300×gで4分間の遠心分離、および上澄み液の廃棄を包含していた。洗浄後、FACS(商標)緩衝液(固定培地)中の500μLの1%パラホルムアルデヒドがこれらのペレットへ添加され、静かに混合された。氷上の30分のインキュベーション時間後、細胞は、FACS(商標)緩衝液で2回洗浄された。これらの細胞を500μLのFACS(商標)緩衝液中に4℃で7日まで保存することが可能であった。これらのペレットは、FACS(商標)緩衝液中500μLの0.1%サポニンで1回洗浄された。その後、FACS(商標)緩衝液(透過性化培地)中の50μLの0.25%サポニン、および5μLのチロシナーゼ特異的一次抗体が、ペレットへ添加され、静かに混合された。室温で1時間のインキュベーション後、細胞は、FACS(商標)緩衝液中の0.1%サポニンで1回洗浄され、ついでFACS(商標)緩衝液中の50μLの0.25%サポニン中一
次抗体(1/100希釈)について特異的なCy5−共役二次抗体0.5μLが、ペレットへ添加され、静かに混合された。室温および暗室での30分のインキュベーション後、これらの細胞は、FACS(商標)緩衝液中の500μLの0.1%サポニンで洗浄された。最後に、ペレット化された細胞が、FACS(商標)緩衝液中の200μLの0.1%サポニン中に再縣濁され、フローサイトメトリー分析が実施された。
HLA−A2−制限チロシナーゼ特異的CD8+T細胞の結合活性を評価するため、およびMoFlo(商標)高性能細胞ソーター(米国コロラド州フォートコリンズのダコ)でのソートを実施するために、これらのT細胞が、PE−標識A*0201/htyr3
69−377/Hβ2mテトラマー(Prof.D.Buschによって供給された)で染色された。これらの細胞は2回洗浄された。各洗浄工程は、冷PBS+0.5%ヒト血清中の細胞の再縣濁、300×gで5分間の遠心分離、および上澄み液の廃棄を包含していた。インキュベーション容積は細胞数に依存している。106までの細胞が、50μL中25分、PE−標識テトラマーで、氷上で暗室においてインキュベーションされた(1/25希釈、50μLPBS+0.5%ヒト血清中の2μLテトラマー)。HLA−A2−制限チロシナーゼ特異的CD8+T細胞のソートのために、5×106細胞までが、100μLPBS+0.5%ヒト血清中の6μL A2/ペプチドテトラマーでインキュベーションされた。次いで、さらに25分間、1/50の比においてCD8−APC抗体(米国フランクリンレイクスのBDファーミンゲン(Pharmingen,Franklin Lakes))が添加された。染色後、これらの細胞は2回洗浄され、最後にFACS(商標)緩衝液中の1%パラホルムアルデヒドで固定され、フローサイトメトリーFACSCalibur(カリフォルニア州マウンテンビューのベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson))によって分析されるか、またはMoFlo(商標)高性能細胞ソーター(米国コロラド州フォートコリンズのダコ)においてテトラマー+CD8+T細胞のソートのためにPBS+0.5%ヒト血清中に希釈された。
ここではcRNAと呼ばれる、単一種試験管内転写RNAの生産は、4つの工程を含んでいた。すなわち、cDNA挿入断片を含有するプラスミドの線形化、プロモーター配列および線形化されたプラスミド中のcDNAテンプレートに基づく試験管内転写、合成cRNAのポリアデニル化、およびcRNA精製である。実質量のcDNAテンプレート、すなわちプラスミドDNA(pDNA)が試験管内転写反応に必要とされるので、このプラスミドは、コンピテント細菌中で増幅されなければならなかった。
他の基から親切な贈り物(kind gift)として受け取られる、より多量のpDNAを得るために、コンピテント細菌は該pDNAで形質転換されて拡張されなければならなかった。一回大量トップ(One Shot TOP)10F’コンピテント細胞の50μLガラス瓶が、融解しつつある氷上でゆっくりと霜取りされ、小さい容積のpDNAが添加され、静かに栓を抜く(tap)ことによって細菌と混合された。これらの細胞は、氷上で30分間インキュベーションされ、次いで42℃で正確に30秒間加熱され、最後に氷上に載せられて2分間冷却された。コンピテント細胞とともに供給されたリッチなSOC培地が添加され、形質転換された細菌が、適切な選択抗生物質とともにLB培地寒天プレート上に培養された。プレートが細菌インキュベーター中に37℃で一晩入れられた。抗生物質ゼオシンが光感受性であり、その活性は高い塩濃度によって阻害されるので、pZeoSV2+/huTyrで形質転換された細菌用のプレートは低塩LB寒天培地を含有し、暗室に保存された。
抗生物質への耐性をエンコードする、pDNAで形質転換された細菌のみが、寒天培地中の対応抗生物質の存在にもかかわらず、選択プレート上で成長してコロニーを形成することができた。一晩の成長後、コロニーは、滅菌つま楊枝を用いてこれらのプレートから引き出された。各々の個々のコロニーは、15mLファルコン(Falcon)管において、適切な抗生物質を含有する5mLのLB培地中に接種された。予め選択され、凍結された形質転換細菌が拡張されることになるならば、凍結ガラス瓶が、−80℃フリーザーから、融解しつつある氷上へ移された。約5μLの一部解凍された細菌縣濁液が、次いで、適切な抗生物質とともに5mLのLB培地を収容している15mLファルコン管に移された。これらの管は、一晩(約12時間)37℃で激しい振とうをともなって、150rpmで、形質転換された細菌の効率的な成長のためにインキュベーションされた。
細菌は、凍結培地が15%のグリセリンを含有するならば、凍結プロセスによって害されることが最も少ない。したがって400μLの一晩細菌縣濁液が、84μLのオートクレーブされた87%グリセリンへ添加され、渦巻き撹拌され、液体窒素中に急速凍結され、−80℃へ移された。
一晩の培養後、細菌縣濁液が、5300×g、4℃で10分間遠心分離された。細菌細胞からのプラスミドDNA抽出が、QIAwell(登録商標)8ウルトラプラスミドキットを用いて、製造業者の指示に従って実施された。簡単に言えば、ペレット化された細胞が溶解された。溶解物中の塩およびpH条件が、DNAのこの膜への独占的結合を保証したが、一方、分解されたRNAおよび細胞タンパク質は保持されなかった。この膜はついで、あらゆる核酸結合タンパク質およびpDNAからの他の残留汚染物質の除去を可能にする、あらゆるDNA−タンパク質相互作用を乱す緩衝液で洗浄された。追加の洗浄工程は、塩および他の非−DNA成分を除去した。精製pDNAは最終的にトリス緩衝液中に溶出された。抽出pDNAの収率は、プラスミドに応じて、5mLの一晩細菌培養あたり4〜8μgであった。
各プラスミドが、試験管内転写に適したテンプレートを生産するために、適切な制限酵素で線形化された。すべてのプラスミドが、所望のタンパク質をエンコードするcDNAの5’末端においてT7プロモーターを含有するので、転写は、mMESSAGE mMACHINE(商標)T7キットからのT7RNAポリメラーゼを用いて製造業者の指示に従って実施された。RNA分子の安定性、およびタンパク質中への翻訳用テンプレートとしてのその効率的な使用は、その5’末端におけるキャップおよび3’末端におけるポリ(A)テイルの存在に依存している。ポリ(A)テイルは常に、細胞によって合成されたmRNA分子の一部である。従って、上述された全細胞mRNA増幅手順は、試験管内転写反応においてキャップ類似体の添加のみを含んでいた。しかしながら、プラスミド中のcDNAを用いて生産された単一種cRNAは、テイルが構成体においてエンコードされるか否かに応じて、ポリ(A)テイルを含有してもよいし含有しなくてもよい。試験管内転写反応における5’末端でのキャップ類似体の統合に加えて、チロシナーゼ、HLA−A2 cRNAは、ポリ(A)テイリングキットを用いて3’末端においてポリアデニル化された。両方の反応は、製造業者によって提案された条件下で実施された。試験管内転写およびcRNA精製後、cRNAの測定された収率は、100μLのポリアデニル化反応混合物あたり60〜70μgであった。
増幅された全細胞cDNAまたはプラスミド中の単一種cDNAのどちらかをテンプレートとして用いて、試験管内転写反応において得られたcRNAの精製は、RNeasy(登録商標)ミニキットを用いて、製造業者の指示にしたがって実施された。精製のために、この手順は、試験管内転写反応混合物のRNeasy(登録商標)カラム上への転移から開始された。RNAはDEPC水中に溶出され、アリコートが−80℃で保存された。
細胞血漿膜は、細胞の分子内容物をその外部環境から分離するという生命維持機能を果たしている。これらの膜は、高度に絶縁性の二層中に自己集合する両親媒性脂質から大部分なっている。可能な限り多くの抗原を捕獲しようとして、未成熟DCは、RNAを包含する、これらの周囲からの様々な構造(サイズが小さい分子から、アポトーシス体までの範囲のもの)を取り上げることが周知である。これらは、マクロ飲作用およびエンドサイトーシスを通して可能である。RNAとの単純DCコインキュベーションは、T細胞初回抗原刺激を達成することが証明されてはいるが、より攻撃的な方法、例えばリポフェクションおよびエレクトロポレーションは、より良好なトランスフェクション方法であることが証明された。
エレクトロポレーションは、細胞が、強い外部電場の短いパルスへ暴露された時、血漿膜の可逆性透過性を誘発する。親水性細孔の形成は、二層膜中の脂質の再配向の結果である。この現象の分子メカニズムは依然としてよく理解されていない。細孔数およびこれらの直径は、パルス振幅およびパルス持続時間の積とともに増加する。小さい分子が、これらの細孔を通って細胞質中に単純に拡散するが、より大きい分子、例えば核酸は、電気泳動力によって細胞中に駆動される。核酸の存在が細孔形成を促進することも証明されている。細孔は、電場への暴露の1マイクロ秒以内に現われるが、これらが再閉するには数分かかる。
機能的アッセイにおいて、RNA−トランスフェクションされたDCまたはK562細胞、ペプチド−パルスされたDCまたは腫瘍細胞が、促進剤として役立った。抗原特異的CTLクローンが、エフェクターとして役立った。促進剤の刺激能力を測定するために、DCまたは他の細胞がまず、T細胞とともにコインキュベーションされ、これらは収穫され、解凍および再刺激の8〜14日後にコインキュベーション培養において用いられた。活性化されたT細胞によって分泌されたIFN−γの量が、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)において測定された。
T2細胞のCTLとのコインキュベーションのために、より低い細胞数が利用された。外因性ペプチドパルシングのために、1×106T2細胞が、10μg/mL YMDチロシナーゼペプチド(YMDGTMSQV、ミュンヘンLMUのジーンセンター)および10μg/mLヒトβ2−マイクログロブリン(米国サンディエゴのカルビオケム(Calbiochem))でインキュベーションされた。20分毎に細胞縣濁液が振とうされた。37℃、5%CO2での2時間のインキュベーション後、細胞縣濁液が、非結合ペプチドを除去するために1回洗浄された。100μLのペプチド−パルスされたT2縣濁液(12%FCSが補足されたRPMI 1640中の1×104細胞)が、100μLのCTL縣濁液(15%ヒト血清が補足されたCTL培地中の2×103細胞)とコインキュベーションされ、5:1の促進剤対エフェクター比を生じた。
エレクトロポレーションの12時間もしくは24時間後、100μLのT細胞縣濁液(コインキュベーション培地中2×104細胞)が、100μLのトランスフェクションされた細胞縣濁液(2%自家血漿および800U/mL GM−CSFおよび800U/mL IL−4が補足された樹状細胞培地中の2×104または4×104細胞)へ添加され、96ウエルプレートの1ウエルあたり全部で200μL、および1:4、1:2、1:1、2:1、または4:1の促進剤対エフェクター比を生じた。
共培養上澄み液中のIFN−γの測定が、ELISAにおいてOptEIA(商標)ヒトIFN−γセットを用いて、製造業者の指示に従って実施された。簡単に言えば、ELISAプレートは、マウス抗−IFN−γ捕獲抗体でコーティングされ、次いでFBS−含有溶液で遮断された。いくつかの事例では、上澄み液は、コインキュベーション培地中において1:2.5で希釈された。同じ培地が、IFN−γ標準の連続希釈液を作るために用いられた。細胞培養上澄み液または標準溶液からのIFN−γが、これらのプレート中の捕獲抗体へ結合された後、ビオチチニル化マウス抗−IFN−γ検出抗体が、ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼへ共役されたアビジンとともに添加された。捕獲抗体からなる複合体を視覚化するために、IFN−γ、検出抗体、ビオチン、アビジン、およびホースラディッシュ−ペルオキシダーゼ、H2O2(ペルオキシダーゼのための基質)が、テトラメチルベンジジン(基質試薬AおよびBミックス)とともに添加され、溶液の色彩を青色に変えた。酵素反応が、1Mオルト−リン酸で停止された。これによって、溶液の色彩が黄色に変わり、その強度は、処理された基質の量に正比例した。すなわち捕獲されたIFN−γの量に間接的に比例した。反応溶液中の光吸収が、450nmで測定された。不明なIFN−γ濃度が、IFN−γ標準の公知濃度および対応測定吸光度に基づいて描かれた標準曲線の助けを借りて計算された。
それぞれテトラマー+CD8+ソートされたバルク細胞株およびT細胞クローンの細胞溶解活性が、標準4時間クロム放出アッセイにおいて分析された。これら2つのHLA−マッチされた黒色腫細胞株Mel A375(HLA−A2−陽性、チロシナーゼ−陰性)およびMel IL−2(HLA−A2−陽性、チロシナーゼ−陽性)が用いられた。簡単に言えば、106標的黒色腫細胞が、200μCi51Crで1〜1.5時間標識された。51Cr−標識された標的細胞が、V底96ウエル組織培養プレート(ドイツ国ゾリンゲンのグライナー(Greiner,Solingen))において100μL/ウエルの12%のFCSを有するRPMI 1640中でT細胞とともに培養された。CTL−媒介溶解の有効性を評価するために、T細胞は連続的に希釈され、ついで段階的エフェクター細胞対標的細胞(E:T)比を生じるために103標的細胞/ウエルと共培養された。37℃で4時間の共培養後、50μLの上澄み液が収集され、放射能がガンマカウンターで測定された。特異的溶解のパーセンテージは、100×(実験放出−自然放出)/(最大放出−自然放出)として計算された。自然放出は、エフェクター細胞の不存在下に標的細胞をインキュベーションすることによって評価され、一般に14%未満であった。
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Claims (9)
- 抗原特異的T細胞であって、
a)患者由来MHC分子をエンコードする核酸、および、抗原もしくは前記抗原をエンコードする核酸を準備する工程、
b)工程a)において規定される両方の化合物を、健康なドナーに由来する抗原提示細胞(APC)中にコトランスフェクションするか、または導入する工程、
c)健康なドナーに由来する末梢血リンパ球(PBL)を、前記APCで初回抗原刺激する工程、
d)MHC−抗原リガンドに特異的なT細胞を選択する工程
を含む方法によって得られる抗原特異的T細胞。 - エフェクター細胞特徴を有するT細胞、サイトカイン生産T細胞、細胞傷害性T細胞、および調節T細胞からなる群から選択される、請求項1に記載のT細胞。
- 前記調節T細胞は、CD4+もしくはCD8+T細胞である、請求項2に記載のT細胞。
- トランスジェニックTCRをコードする核酸であって、
a)患者由来MHC分子をエンコードする核酸、および、抗原もしくは前記抗原をエンコードする核酸を準備する工程、
b)工程a)において規定される両方の化合物を、健康なドナーに由来する抗原提示細胞(APC)中にコトランスフェクションするか、または導入する工程、
c)健康なドナーに由来する末梢血リンパ球(PBL)を、前記APCで初回抗原刺激する工程、
d)MHC−抗原リガンドに特異的なT細胞を選択する工程、
e)単離T細胞のT細胞受容体(TCR)のクローン工程
を含む方法によって得られる核酸。 - 請求項4に記載の核酸を含むベクター。
- プラスミドまたはレトロウイルスベクターである、請求項5に記載のベクター。
- 請求項5または請求項6に記載のベクターで形質転換されているPBMC。
- 請求項1もしくは請求項2に記載の該T細胞、または請求項7に記載のPBMC、および製薬的に許容可能な担体を含む製薬組成物。
- 注入、注射、またはワクチンである、請求項8に記載の製薬組成物。
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