JP2012212133A - レーザ顕微鏡および観察方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】レーザ光を出射するレーザ光源11と、レーザ光を標本Aに集光する対物レンズ15と、対物レンズ15の光軸に直交する方向にレーザ光を走査させるスキャナ14と、レーザ光の標本A内における集光位置の深さを調節するZコントローラ16と、標本Aからの蛍光を検出する検出器17と、レーザ光源11からのレーザ光の強度を調節するAOTF12と、これらを制御するコントロールユニット19とを備え、標本Aの断面画像を標本Aの表面から深さ方向に順次取得するとともに、過去に取得した標本Aの断面画像における蛍光の強度分布に基づいて、次に取得する標本Aの断面画像におけるレーザ光の強度分布を調節するレーザ顕微鏡1を採用する。
【選択図】図1
Description
本発明の第1の態様は、レーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源から出射されたレーザ光を試料に集光する対物レンズと、該対物レンズの光軸に直交する方向にレーザ光を走査させる走査部と、該走査部により走査されるレーザ光の試料内における集光位置の深さを調節する集光深さ調節部と、前記試料内におけるレーザ光の集光位置から発せられる蛍光を検出する蛍光検出部と、前記レーザ光源からのレーザ光の強度を調節するレーザ光強度調節部と、これらを制御する制御部とを備え、前記制御部が、前記蛍光検出部により検出した蛍光から、試料の断面画像を試料の表面から深さ方向に順次取得するとともに、過去に取得した試料の断面画像における蛍光の強度分布に基づいて、次に取得する試料の断面画像におけるレーザ光の強度分布を調節するレーザ顕微鏡である。
このようにすることで、試料の深さ方向の各断面において、試料の表面からの距離に応じてレーザ光の強度が調節されたテーブル(レーザ光の集光位置とレーザ光の強度とが対応づけられたテーブル)を作成して、レーザ光強度記憶部に記憶することができる。そして、このテーブルに基づいて試料の各断面画像を取得することで、試料の厚さに基づく散乱等の影響を排除して、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。
このようにすることで、蛍光検出部により検出した蛍光の強度が、所定の閾値以上の場合にその際のレーザ光の集光位置に試料が存在するものと判定し、所定の閾値未満の場合にその際のレーザ光の集光位置に試料が存在しないものと判定することができる。これにより、試料の存在する位置にのみレーザ光を集光させることができ、蛍光画像の取得に要する時間および処理を軽減することができる。
このようにすることで、蛍光の強度が変動した領域を標本の存在する領域として判定することができる。これにより、試料の有無判定において蛍光の強度に関する閾値を設定する必要を排除することができ、標本Aの有無判定の精度を向上することができる。そして、標本Aの有る位置にのみレーザ光を集光させることで、蛍光画像の取得に要する時間および処理を軽減することができる。
このようにすることで、蛍光検出部により検出した蛍光の強度が所定値以上の領域(例えば輝度が飽和した領域)に対して、同一断面においてレーザ光の強度を低下させて、試料の各断面画像を取得することができる。これにより、各断面画像における輝度の飽和を防止することができ、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。
このようにすることで、各集光位置のみから発生した蛍光を容易に検出して鮮明な蛍光画像を取得することができる。
本発明の第1の実施形態に係るレーザ顕微鏡1について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡1は、例えば、多光子励起現象を利用するレーザ顕微鏡であって、図1に示されるように、超短パルスレーザ光を出射するレーザ装置10と、超短パルスレーザ光を2次元的に走査させるスキャナ(走査部)14と、走査された超短パルスレーザ光を標本(試料)Aに集光させる一方、標本Aにおいて発生した蛍光を集める対物レンズ15と、対物レンズ15により集められた蛍光を超短パルスレーザ光から分岐するダイクロイックミラー13と、分岐された蛍光を検出する検出器(蛍光検出部)17とを備えている。
図2(a)から図2(h)に示すように、コントロールユニット19は、Zコントローラ16を制御して、標本Aの断面画像を標本Aの表面から深さ方向に順次取得する。具体的には、図2(h)に示すように、コントロールユニット19は、標本Aの表面に近い順、すなわち、第1面、第2面、第3面の順に標本Aの断面画像を取得する。
大まかな流れとしては、まず、標本Aのテスト測定を実施し、標本Aの各断面にレーザ光を照射する。そして、このテスト測定において、前述のように、レーザ光の強度と標本Aの表面からの距離とが対応付けられたテーブルを作成し、該テーブルをメモリ18に記憶する。基本的にテーブルの作成方法は従来技術、特許文献1などに従うが、標本Aの各断面にレーザ光を照射し、断面画像を確認する際、各断面の明るさが適性となるように表面からの距離に対応するレーザ強度のテーブルのパラメータを調節する。この作業を繰り返し、表面からの距離に対応するレーザ強度の適切なテーブルを作成する。その後、テスト測定により作成されてメモリ18に記憶されたテーブルを用いて標本Aの本測定を実施する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡1を用いて標本Aの深さ方向に複数の蛍光画像を取得して行くには、まず、図3に示されるように、コントロールユニット19によりZコントローラ16を制御して、標本Aの断面画像を標本Aの表面から深さ方向、すなわち、断面Z1からZ5の順にその断面画像を順次取得する。そして、標本の断面Z1からZ5のそれぞれにおいて、レーザ光の強度分布が調節された標本Aの断面画像をそれぞれ取得する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡1の第1の変形例として、コントロールユニット19が、検出器17により検出した蛍光の強度に基づいて、レーザ光の集光位置における標本Aの有無を判定することとしてもよい。
このようにすることで、検出器17により検出した蛍光の強度が、所定の閾値以上の場合にその際のレーザ光の集光位置に標本Aが存在するものと判定し、所定の閾値未満の場合にその際のレーザ光の集光位置に標本Aが存在しないものと判定することができる。これにより、標本Aが存在する位置にのみレーザ光を集光させることができ、蛍光画像の取得に要する時間および処理を軽減することができる。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡1の第2の変形例として、標本Aの各断面において、レーザ光の強度を変えて複数回標本Aからの蛍光強度を測定することとしてもよい。この場合において、図6に示すように、蛍光の変動量から、標本Aの有無を認識することができる。すなわち、レーザ光の強度を変えた場合に、蛍光の強度が変動した領域には、標本Aが存在すると判定することができる。一方、レーザ光の強度を変えた場合に、蛍光の強度が変動しない領域には、標本Aが存在しないと判定することができる。
以下に、第2の実施形態に係るレーザ顕微鏡2について、図面を参照して説明する。以降では、本実施形態に係るレーザ顕微鏡について、第1の実施形態に係るレーザ顕微鏡1と共通する点については同一の符号を付して説明を省略し、第1の実施形態に係るレーザ顕微鏡1と異なる点について主に説明する。
図8に示すように、コントロールユニット19は、Zコントローラ16を制御して、標本Aの断面画像を標本Aの表面から深さ方向に順次取得する。具体的には、コントロールユニット19は、標本Aの表面に近い順(第1面、第2面、第3面の順)に標本Aの断面画像を取得する。
以下に、第3の実施形態に係るレーザ顕微鏡3について、図面を参照して説明する。以降では、本実施形態に係るレーザ顕微鏡について、前述の実施形態に係るレーザ顕微鏡1,2と共通する点については同一の符号を付して説明を省略し、前述の実施形態に係るレーザ顕微鏡1,2と異なる点について主に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡3は、標本Aを載置するとともに、対物レンズ15の光軸に直交する方向に移動可能なXYステージ(図示略)を有している。
図9に示すように、コントロールユニット19は、Zコントローラ16を制御して、標本Aの断面画像を標本Aの表面から深さ方向に順次取得する。具体的には、コントロールユニット19は、標本Aの表面に近い順(第1面、第2面、第3面の順)に標本Aの断面画像を取得する。また、コントロールユニット19は、標本Aの各断面(第1面、第2面、第3面)のそれぞれにおいて、XYステージを移動し、異なる場所(ポジション1、ポジション2)の断面画像を取得する。
第1面のポジション1における断面画像を取得する際には、Zコントローラ16およびXYステージを制御して、対物レンズ15の光軸方向の焦点位置が、標本Aの第1面のポジション1における位置となるように、対物レンズ15を光軸方向に移動させるとともに、XYステージを対物レンズ15の光軸に直交する方向に移動させる。この状態において、図9(b)に示すように、標本Aの全体に中程度の強度のレーザ光を照射して標本Aの断面画像を取得する。この場合に取得された標本Aの断面画像が図9(a)に示されている。図9(a)に示される画像において、標本Aの第1面における断面画像が蛍光画像41,42として表わされている。
まず、第1面のポジション2における断面画像を取得する際には、Zコントローラ16およびXYステージを制御して、対物レンズ15の光軸方向の焦点位置が、標本Aの第1面のポジション2における位置となるように、対物レンズ15を光軸方向に移動させるとともに、XYステージを対物レンズ15の光軸に直交する方向に移動させる。この状態において、図9(h)に示すように、標本Aの全体に強いレーザ光を照射して標本Aの断面画像を取得する。この場合に取得された標本Aの断面画像が図9(g)に示されている。図9(g)に示される画像において、標本Aの第1面における断面画像が蛍光画像51,52として表わされている。
1,2,3 レーザ顕微鏡
10 レーザ装置
11 レーザ光源
12 AOTF(レーザ光強度調節部)
13 ダイクロイックミラー
14 スキャナ(走査部)
15 対物レンズ
16 Zコントローラ(集光深さ調節部)
17 検出器(蛍光検出部)
18 メモリ(レーザ光強度記憶部)
19 コントロールユニット(制御部)
20 モニタ
Claims (7)
- レーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源から出射されたレーザ光を試料に集光する対物レンズと、
該対物レンズの光軸に直交する方向にレーザ光を走査させる走査部と、
該走査部により走査されるレーザ光の試料内における集光位置の深さを調節する集光深さ調節部と、
前記試料内におけるレーザ光の集光位置から発せられる蛍光を検出する蛍光検出部と、
前記レーザ光源からのレーザ光の強度を調節するレーザ光強度調節部と、
これらを制御する制御部とを備え、
前記制御部が、前記蛍光検出部により検出した蛍光から、試料の断面画像を試料の表面から深さ方向に順次取得するとともに、過去に取得した試料の断面画像における蛍光の強度分布に基づいて、次に取得する試料の断面画像におけるレーザ光の強度分布を調節するレーザ顕微鏡。 - 前記レーザ光強度調節部により調節されたレーザ光の強度と、前記走査部によるレーザ光の走査位置および前記集光深さ調節部により調節されるレーザ光の集光位置とを対応付けて記憶するレーザ光強度記憶部を備える請求項1に記載のレーザ顕微鏡。
- 前記制御部が、前記蛍光検出部により検出した蛍光の強度に基づいて、レーザ光の集光位置における試料の有無を判定する請求項1に記載のレーザ顕微鏡。
- 前記制御部が、同一断面においてレーザ光の強度を調節して前記試料に複数回レーザ光を照射し、前記蛍光検出部により検出した蛍光の強度の変動値に基づいて、レーザ光の集光位置における試料の有無を判定する請求項1に記載のレーザ顕微鏡。
- 前記レーザ光強度調節部が、前記蛍光検出部により検出した蛍光の強度が所定値以上の領域に対して、同一断面においてレーザ光の強度を低下させる請求項1に記載のレーザ顕微鏡。
- 前記レーザ光源が、超短パルスレーザ光を出射する多光子励起用レーザ光源である請求項1に記載のレーザ顕微鏡。
- 試料に集光させたレーザ光を、その集光位置を深さ方向に変化させつつ、深さ方向に交差する方向に走査させて、各深さ位置における試料の断面画像を取得する観察方法であって、
レーザ光の集光位置から発生した蛍光から、試料の断面画像を試料の表面から深さ方向に順次取得するとともに、過去に取得した試料の断面画像における蛍光の強度分布に基づいて、次に取得する試料の断面画像におけるレーザ光の強度分布を調節し、
蛍光の強度とレーザ光の集光位置とに基づいて試料の2次元的な蛍光画像を取得する観察方法。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103926057A (zh) * | 2013-11-14 | 2014-07-16 | 中国电子科技集团公司第十一研究所 | 一种激光抗损伤测试系统 |
JP2015087533A (ja) * | 2013-10-30 | 2015-05-07 | オリンパス株式会社 | 走査型レーザ顕微鏡装置 |
US9304085B2 (en) | 2013-10-24 | 2016-04-05 | Sony Corporation | Laser scanning microscope system and method of setting laser-light intensity value |
JP2017003865A (ja) * | 2015-06-12 | 2017-01-05 | オリンパス株式会社 | 顕微鏡および顕微鏡画像取得方法 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101922799B1 (ko) * | 2017-03-08 | 2018-11-28 | 한국광기술원 | 형광분석장치의 거리에 따른 광세기 자동 조절 방법 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008292722A (ja) * | 2007-05-24 | 2008-12-04 | Olympus Corp | 走査型光学装置 |
JP2010008082A (ja) * | 2008-06-24 | 2010-01-14 | Olympus Corp | 多光子励起測定装置 |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008292722A (ja) * | 2007-05-24 | 2008-12-04 | Olympus Corp | 走査型光学装置 |
JP2010008082A (ja) * | 2008-06-24 | 2010-01-14 | Olympus Corp | 多光子励起測定装置 |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9304085B2 (en) | 2013-10-24 | 2016-04-05 | Sony Corporation | Laser scanning microscope system and method of setting laser-light intensity value |
US9739715B2 (en) | 2013-10-24 | 2017-08-22 | Sony Corporation | Laser scanning microscope system and method of setting laser-light intensity value |
JP2015087533A (ja) * | 2013-10-30 | 2015-05-07 | オリンパス株式会社 | 走査型レーザ顕微鏡装置 |
US10078203B2 (en) | 2013-10-30 | 2018-09-18 | Olympus Corporation | Laser scanning microscope apparatus and laser scanning method having light-level control at finer resolution than output-power control |
CN103926057A (zh) * | 2013-11-14 | 2014-07-16 | 中国电子科技集团公司第十一研究所 | 一种激光抗损伤测试系统 |
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