JP2012187038A - 培養皮膚の細胞間脂質の周期構造を改善する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】角質層を形成している培養皮膚の角質層表面側からリポソーム分散液を投与することにより、細胞間脂質の周期構造を改善させた培養皮膚を作製する。この培養皮膚を用いることにより、より生体に近い条件で経皮吸収性や経皮毒性等の評価を行うことが可能となる。
【選択図】図1
Description
卵黄由来のリン脂質(COATSOME NC−50、日油)4gをクロロホルム40mLに溶かし、減圧下濃縮して脂質の薄膜を形成させた。これに精製水100mLを加えて超音波処理し、孔径0.2μmのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が4重量%であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を、精製水で希釈して適当な濃度として動的光散乱光度計(DLS−7000、大塚電子)で測定した。キュムラント法によって解析した平均粒子径は、250nmであった。
卵黄由来のリン脂質(COATSOME NC−50、日油)0.1gをクロロホルム1mLに溶かし、減圧下濃縮して脂質の薄膜を形成させた。これに精製水100mLを加えて超音波処理し、孔径0.2μmのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が0.1重量%であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を用いて製造例1と同様に処理し、リポソーム分散液の投与によって細胞間脂質の周期構造を改善させ、バリア機能をヒト皮膚に近付けた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
卵黄由来のリン脂質(COATSOME NC−50、日油)0.5gをクロロホルム5mLに溶かし、減圧下濃縮し精製水100mLを加えて超音波処理し、孔径0.2μmのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が0.5重量%であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を用いて製造例1と同様に処理し、リポソーム分散液の投与によって細胞間脂質の周期構造を改善させ、バリア機能をヒト皮膚に近付けた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
大豆由来のリン脂質(SLP−PC92、辻製油)4gをクロロホルム40mLに溶かし、減圧下濃縮して脂質の薄膜を形成させた。これに精製水100mLを加えて超音波処理し、孔径0.2μmのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が4重量%であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を用いて製造例1と同様に処理し、リポソーム分散液の投与によって細胞間脂質の周期構造を改善させ、バリア機能をヒト皮膚に近付けた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
大豆由来のリン脂質(SLP−PC92H、辻製油)4gをクロロホルム40mLに溶かし、減圧下濃縮して脂質の薄膜を形成させた。これに精製水100mLを加えて超音波処理し、孔径0.2μmのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が4重量%であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を用いて製造例1と同様に処理し、リポソーム分散液の投与によって細胞間脂質の周期構造を改善させ、バリア機能をヒト皮膚に近付けた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
角質層が形成されている三次元培養ヒト皮膚モデル(TESTSKIN LSE−high、東洋紡ライフサイエンス)を購入し、培地から取り出してリポソーム分散液非投与の三次元培養ヒト皮膚モデルとした。
リポソーム分散液の代わりに精製水を用い、製造例1と同様に処理して、リポソーム分散液投与の比較対照となる、精製水を投与して細胞間脂質の周期構造とバリア機能がヒトに近付いていない三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
製造例1〜製造例5の三次元培養ヒト皮膚モデルと比較例1の三次元培養ヒト皮膚モデルをそれぞれ0.1%トリプシン溶液に浸して角質層のみを剥離し、脱水後に精製水を加えて水分量が20%になるように調整してキャピラリーチューブ(φ1mm;W.Muller)に詰め測定試料とした。
製造例1の三次元培養ヒト皮膚モデル及び比較例2の三次元培養ヒト皮膚モデルを、レシーバー液としてPBS(−)を満たした拡散セルに挟み込み、レシーバー液を32℃で保温した。角質層表面側からカフェインの2重量%水溶液300μLを適用し、3時間後のレシーバー液を回収し、三次元培養ヒト皮膚モデルを透過したカフェイン量をHPLCにて定量した。
大豆由来のホスファチジルコリン(SLP−PC92、辻製油)0.5gをクロロホルム5mLに溶かし、減圧下濃縮し、カフェインの2重量%水溶液100mLを加えて超音波処理し、孔径0.2μmのフィルターでろ過してカフェインリポソーム製剤を調製した。
(被験物質2)
カフェインリポソーム製剤の比較対照として、カフェインの2重量%水溶液を調製した。
製造例1の三次元培養ヒト皮膚モデルを、レシーバー液としてPBS(−)を満たした縦型拡散セルに挟み込み、レシーバー液を32℃で保温した。被験物質1(カフェインリポソーム製剤)又は被験物質2(カフェインの2重量%水溶液)300μLを適用し、3時間後にレシーバー液を回収し、三次元培養ヒト皮膚モデルを透過したカフェイン量をHPLCにて定量した。
Claims (13)
- 培養皮膚の角質層表面側からリポソーム分散液を投与して、細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
- リポソームが卵黄由来のリン脂質、大豆由来のリン脂質及び該リン脂質の水素添加物から選ばれる一種又は二種以上で形成される、請求項1記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
- リポソームが卵黄由来のリン脂質で形成される、請求項1又は2記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
- リン脂質に含まれるホスファチジルコリン含量が90重量%以上である、請求項1〜3のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
- リン脂質の配合量が0.1〜4重量%の範囲である、請求項1〜4のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
- リン脂質の配合量が0.1〜0.5重量%の範囲である、請求項1〜5のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
- リポソーム分散液の平均粒子径が500nm以下である、請求項1〜6のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
- リポソーム分散液の平均粒子径が90〜200nmの範囲である、請求項1〜6のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
- 培養皮膚が、線維芽細胞を含むコラーゲンゲルの上に表皮角化細胞を播種して培養し、下から基底層、有棘層、顆粒層及び角質層が形成された培養皮膚である、請求項1〜8のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
- リポソーム分散液の投与方法が、拡散セルに挟みこんだ培養皮膚に、リポソーム分散液が角質層を満たすように投与する方法である、請求項1〜9のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
- リポソーム分散液の投与方法が、投与後にリポソーム分散液を取り除く工程を含む方法である、請求項10記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載の方法により作製される培養皮膚。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載の方法を適用した培養皮膚を用いて経皮吸収性試験、経皮毒性試験、代謝試験及び皮膚外用剤の有効性試験を行う方法、並びにそのためのリポソーム分散液調製用キット。
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