JP2012184184A - 抗老化作用を有するヤドリギ抽出物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヤドリギ抽出物からなるKlotho蛋白質の産生促進剤。
【選択図】なし
Description
項1. ヤドリギ抽出物からなるKlotho蛋白質の産生促進剤。
項2. ヤドリギ抽出物が、用量依存的にKlotho遺伝子の産生促進作用を有する、項1に記載のKlotho蛋白質の産生促進剤。
項3. ヤドリギ抽出物が、分子量100kDa以上の分画である、項1又は2に記載のKlotho蛋白質の産生促進剤。
項4. ヤドリギ抽出物が、分子量100kDa〜300kDaの分画である、項1〜3のいずれかに記載のKlotho蛋白質の産生促進剤。
項5. 分子量100kDa以上の分画である、ヤドリギ抽出物。
項6. 分子量100kDa〜300kDaの分画である、項5に記載のヤドリギ抽出物。
項7. ヒト正常肝細胞におけるKlotho産生を促進する項1〜4のいずれかに記載のKlotho蛋白質の産生促進剤または項5〜6のいずれかに記載のヤドリギ抽出物。
項8. 項1〜4のいずれかに記載のKlotho蛋白質の産生促進剤または項5〜6のいずれかに記載のヤドリギ抽出物を含む、抗老化剤。
項9. 項1〜4のいずれかに記載のKlotho蛋白質の産生促進剤または項5〜6のいずれかに記載のヤドリギ抽出物を含む、老化に関連する疾患または障害の予防ないし治療用組成物。
項10. 前記疾患または障害が、老化、骨密度の低下、動脈硬化、歩行障害、皮膚・筋肉の萎縮、肺気腫、下垂体ホルモン分泌低下、認知障害、ミトコンドリア遺伝子発現の低下、聴力障害からなる群から選ばれる、項9に記載の組成物。
項11. 皮膚外用剤または化粧料の形態である、項9または10に記載の組成物。
項12. 経口摂取用の製剤である、項9または10に記載の組成物。
項13. ヤドリギ抽出物を、Klotho蛋白質の産生促進作用に基づき分画することを特徴とする、Klotho蛋白質の産生促進作用を有する分画の調製方法。
項14. ヤドリギ抽出物を分子量により分画し、100kDa以上の分子量の分画を得ることを特徴とする、項13に記載の調製方法。
項15. 前記分画が加熱より変性しない分画である、項13または14に記載の調製方法。
項16. 前記分画がIGF-1の増強作用を有しない、項13〜15のいずれかに記載の調製方法。
項17. ヤドリギ抽出物のKlotho蛋白質の産生促進のための使用。
1)性状 暗かつ色液
2)分子量 100−300KDa
3)溶解性:水(生理食塩水)に可溶、アルコールに不溶。
4)pI: 5.9
5)赤外吸収スペクトル(IR): (KBr/disc; cm-1)3389; 2938; 1620; 1405; 1048; 670
6)1H-NMR(溶媒:CDCl3; δ/ppm): 0.857(m), 1.22(m), 1.26(m), 1.39(t), 1.59(b.s), 1.898(m), 2.04(m), 3.34(s), 3.49(m), 3.74(q), 3.86(m), 4.37(q), 5.13(b.d), 7.26(s)
[製造例1] 本発明の抽出分画液の製造法
セイヨウヤドリギの葉、枝100gを400mlの蒸留水に入れ、100℃にて10時間の抽出を行った。抽出液を集め、2000回転30分間の遠心後、その上清を0.45μmのフィルターを通過させ、凍結乾燥を行った。その抽出乾燥物を100mg/mlの濃度になるよう蒸留水に溶解した。さらに、この抽出液をろ過ユニット-ビバスピン(ザルトリウス社製)を用いて、分子量分画を行った。ビバスピン20の分画分子量5K, 10K, 30K, 50K, 100K, 300Kろ過膜を有する遠心管にて、5K以下、5−10K, 10−30K、30−50K、50−100K、100−300K、300K以上に分画した。
C3H/HeN雌マウス(6週令)からの肝実質細胞をコラゲナーゼ還流法にて単離し、その肝細胞(500個/0.5ml無血清DMEM培養液)を蛋白質吸着性の混合セルロース膜を有するミリセルーHA (孔径0.45μm、直径12mm、ミリポア社製)内に入れ、それを24穴プレート内に置き、外液も無血清DMEM培養液を水面が等しくなるように入れる。ミリセル-HA内にヤドリギ抽出液ならびに各分画液を5μlにて添加し、37℃の培養器内にて、4時間培養後、ELISPOT法にてKlothoおよびIGF-1産生細胞を検出した。すなわち、パスツールピペットにて、ミリセル-HA内の肝細胞を1%tween20(Sigma社製)含有リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて剥離、洗浄し、次に、ミリセル内に2%過酸化水素含有PBS を加え、10分間反応させた後、PBSにて2回洗浄し、0.3mlのprotein-free(PBS)blocking buffer(Thermo社製)を加えて、37℃で1時間反応させて、各穴のミリセル膜をブロックした。その後、ミリセル膜を2回洗浄し、各穴に抗マウスklotho抗体(200倍希釈:サンタクルーズ社製)あるいは抗IGF-1抗体(200倍希釈:サンタクルーズ社製)を0.2ml加えて、4℃にて一晩中放置した後、ミリセル膜をPBSにて2回洗浄した。次に、Histomouse plus kit( Invitrogen社製)のビオチン標識2次抗体を3滴添加し、室温にて30分間反応後、PBSにて2回洗浄し、各穴内に、アビジン標識ペルオキシダーゼ(ABC kit: ベクターラボラトリー社製)を0.2ml加え、30分間反応後、PBSにて2回洗浄し、tetramethylbenzidine(TMB)と過酸化水素を含むTrue Blue液(KPL社製)を0.2ml加え、10分間反応させ、蒸留水にて2回洗浄し、乾燥後、各穴内に形成させた青色スポットを実体顕微鏡下で計測した。形成されたスポット数はKlothoおよびIGF-1を産生している細胞の数に相当する。表1に本試験の結果を示す。表1の結果から、マウス正常肝実質細胞は刺激なしでもKlothoおよびIGF-1を分泌している細胞が存在している。しかし、ヤドリギ抽出液を添加すると、有意にKlotho分泌細胞は増加したが、100−300K分画液はさらに高くklotho分泌細胞を増大させた。しかし、ヤドリギ抽出液および分画液ともIGF-1分泌には影響することはなかった。
1H-NMR(溶媒:CDCl3; δ/ppm): 0.857(m), 1.22(m), 1.26(m), 1.39(t), 1.59(b.s), 1.898(m), 2.04(m), 3.34(s), 3.49(m), 3.74(q), 3.86(m), 4.37(q), 5.13(b.d), 7.26(s)
IR(KBr/disc; cm-1): 3389, 2938, 1620, 1405, 1048, 670
Chang liver細胞を細胞低吸着性Prime surfaceスフェロイド96Uプレート(住友ベークライト社製)にて10%牛胎児血清添加DMEM培養液中に浮遊培養した。そのスフェロイドを形成したChang liver細胞を単離するため、0.1mlのトリプルセレクト分離液(Invitrogen社製)を加えて、37℃で10分間反応させ、0.1mlの無血清DMEM培養液を加え、各穴の細胞浮遊液を15mlの遠心管に移し100xgで5分間遠心分離した後、培養液を捨て、再度DMEM培養液を加え、再懸濁し、遠心を繰り返し、再度DMEM培養液に浮遊させ、500個/0.5mlを実施例1と同様にミリセル内に入れ、ヤドリギ抽出液(5μl)、100-300KDa分画液(5μl)を添加した。コントロールは無添加とした。37℃、4時間培養後、実施例1と同様のELISPOT法にて、Klotho分泌細胞を検出には100倍希釈の抗ヒトKlotho抗体(ABGENT社製)を用い、またIGF-1分泌細胞の検出には100倍希釈抗ヒトIGF-1抗体(Santa Cruz Biotechology社製)を用いた。その結果は表2に示すごとく、ヤドリギ抽出液刺激によりコントロールに比して、約20倍、分画液では約80倍のKlotho分泌細胞が検出しえた。しかし、IGF-1分泌細胞の数は不変であった。
正常ヒト肝細胞(75才、男性:Celsis社より購入)を実施例2と同様にスフェロイド96Uプレート(住友ベークライト社製)を用いて浮遊培養を行い、実施例2と同様にELISPOT法にて、ヤドリギ抽出液および分画液により刺激した正常ヒト肝細胞を用いて検出した。その結果は表4に示すように、ヤドリギ抽出液ではコントロールに比して、約30倍、分画液で約100倍のKlotho分泌細胞が増加したが、IGF-1分泌細胞は増大しなかった。
C3H/HeN雌マウス(6週令)にヤドリギ抽出液(0.1ml), あるいは100-300K分画液(0.1ml)、あるいはコントロールとして蒸留水(0.1ml)を胃管にて経口投与した。各群は4匹づつとして投与した。経口投与して24時間後に、実施例1のごとく、肝臓より肝細胞を単離し、ELISPOT法にてKlothoおよびIGF-1分泌細胞を検出した。その結果は表4に示すごとく、ヤドリギ抽出液投与ではコントロールに比して約3倍、分画液投与では約7倍のKlotho分泌細胞数が増加したが、IGF-1分泌細胞では有意な変化はなかった。
実施例2に従い、ヤドリギ抽出液に代えて下記の表5に示される物質を用いて、KlothoとIGF-1の分泌細胞数をコントロールに対してどの程度増大させるかについて試験した。結果を表5に示す。
実施例1のように、C3H/HeNマウスより単離した肝細胞を50万個/mlの濃度で無添加、または100-300KDa分画液(5μl/ml)を添加し、37℃の培養器内で3時間培養し、培養した肝細胞は遠心後、上清を捨て、回収した肝細胞からTrizol(Invitrogen)によりtotal RNAを回収後、DNase処理し、randam primer (TaKaRa)、M-MLV reverse transcriptase (Promega)を用いてRT反応を行った。
得られたcDNA 0.5ugを、Klotho primer ( Foward: 5’-actaccgcttctcatatcgtg , Revese: 5’-caaaccagcctagcacaaagtc )またはGapdh primer( Foward: 5’-accacagtccatgccatcac , Revese: 5’-tccaccaccctgttgctgta )を用いてPCRを行った(反応条件は、annealing temp: 60℃、cycle numbers: 25)。
得られたPCR産物を1.2% agarose gelで電気泳動した。なお、量的評価に関しては、Free softであるImage Jを用いて算出し、Excelを用いて数値化およびグラフ化を行った。その結果は図1に示すごとく、無添加の肝細胞にてもKlothoのmRNA発現はあるが、分画液によりその発現は増加した。
Claims (17)
- ヤドリギ抽出物からなるKlotho蛋白質の産生促進剤。
- ヤドリギ抽出物が、用量依存的にKlotho蛋白質の産生促進作用を有する、請求項1に記載のKlotho蛋白質の産生促進剤。
- ヤドリギ抽出物が、分子量100kDa以上の分画である、請求項1又は2に記載のKlotho蛋白質の産生促進剤。
- ヤドリギ抽出物が、分子量100kDa〜300kDaの分画である、請求項1〜3のいずれかに記載のKlotho蛋白質の産生促進剤。
- 分子量100kDa以上の分画である、ヤドリギ抽出物。
- 分子量100kDa〜300kDaの分画である、請求項5に記載のヤドリギ抽出物。
- ヒト正常肝細胞におけるKlotho産生を促進する請求項1〜4のいずれかに記載のKlotho蛋白質の産生促進剤または請求項5〜6のいずれかに記載のヤドリギ抽出物。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のKlotho蛋白質の産生促進剤または請求項5〜6のいずれかに記載のヤドリギ抽出物を含む、抗老化剤。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のKlotho蛋白質の産生促進剤または請求項5〜6のいずれかに記載のヤドリギ抽出物を含む、老化に関連する疾患または障害の予防ないし治療用組成物。
- 前記疾患または障害が、老化、骨密度の低下、動脈硬化、歩行障害、皮膚・筋肉の萎縮、肺気腫、下垂体ホルモン分泌低下、認知障害、ミトコンドリア遺伝子発現の低下、聴力障害からなる群から選ばれる、請求項9に記載の組成物。
- 皮膚外用剤または化粧料の形態である、請求項9または10に記載の組成物。
- 経口摂取用の製剤である、請求項9または10に記載の組成物。
- ヤドリギ抽出物を、Klotho蛋白質の産生促進作用に基づき分画することを特徴とする、Klotho蛋白質の産生促進作用を有する分画の調製方法。
- ヤドリギ抽出物を分子量により分画し、100kDa以上の分子量の分画を得ることを特徴とする、請求項13に記載の調製方法。
- 前記分画が加熱より変性しない分画である、請求項13または14に記載の調製方法。
- 前記分画がIGF-1の増強作用を有しない、請求項13〜15のいずれかに記載の調製方法。
- ヤドリギ抽出物のKlotho蛋白質の産生促進のための使用。
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