JP2012183071A - 花虫類に由来する発色団/蛍光体、およびそれらの使用法 - Google Patents
花虫類に由来する発色団/蛍光体、およびそれらの使用法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】対象の特異的なタンパク質は、以下の特定の花虫類種に由来する色素/蛍光タンパク質を含む:アネモニア・マジャノ(Anemonia majano)、ハナヅタ(Clavularia)種、ゾアンサス(Zoanthus)種、ディスコソマ・ストリアタ(Discosoma striata)、ディスコソマ(Discosoma)種「赤色」、アネモニア・スルカタ(Anemonia sulcata)、ディスコソマ(Discosoma)種「緑色」、ディスコソマ(Discosoma)種「深紅色」、およびそれらの変異体。対象タンパク質の断片と、それらをコードする核酸と同様に、対象タンパク質に対する抗体、およびトランスジェニック細胞および生物。対象タンパク質を含むような応用に使用されるキット。
【選択図】図6
Description
本出願は、以下の出願の一部継続出願である:
1999年10月14日に出願された特許出願第09/418,529号;
1999年10月15日に出願された特許出願第09/418,917号;
1999年10月15日に出願された特許出願第09/418,922号;
1999年11月19日に出願された特許出願第09/444,338号;
1999年11月19日に出願された特許出願第09/444,341号;
1999年12月9日に出願された特許出願第09/457,556号;
1999年12月9日に出願された特許出願第09/458,477号;
1999年12月9日に出願された特許出願第09/458,144号;
1999年12月9日に出願された特許出願第09/457,898号;ならびに
2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,627号;
2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,687号;
2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,609号;
2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,626号;
2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,880号;
2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,607号;
2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,766号;
2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,888号;および
2000年6月14日に出願された特許出願第60/212/070号;以上の出願の開示は参照として本明細書に組み入れられる。本出願はまた1999年12月10日に出願された国際出願PCT/US99/29405号に対して優先権を主張する
発明の分野
本発明の分野は色素タンパク質、特に蛍光タンパク質である。
標識付け(labeling)は、対象となるタンパク質、細胞、または関心対象の生物に印を付ける手段であり、多くの生化学的、分子生物学的、および医学的な診断の応用に重要な役割を果たす。放射性標識、色素標識、蛍光標識、化学発光標識などを含む多種多様な標識が現在まで開発されてきた一方で、新たな標識の開発には引き続き関心が寄せられている。なかでも色素タンパク質および蛍光タンパク質の標識を含む新たなタンパク質の標識の開発に特に関心が寄せられている。
関心対象となる米国特許は、以下を含む:第6,066,476号(特許文献1);第6,020,192号(特許文献2);第5,985,577号(特許文献3);第5,976,796号(特許文献4);第5,968,750号(特許文献5);第5,968,738号(特許文献6);第5,958,713号(特許文献7);第5,919,445号(特許文献8)および第5,874,304号(特許文献9)。以下も関心対象である:マッツ(Matz)、M.V.ら(1999)Nature Biotechnol.、17:969〜973(非特許文献1);「生体色の赤色蛍光タンパク質(Living Colors Red Fluolescent Protein)」(1999年10月) CLONTECHniques XIV(4):2〜6(非特許文献2);「生体色はGFPベクターを増強した(Living Colors Enhanced GFP Vectors)」(1996年4月)CLONTECHniques XI(2):2-3(非特許文献3);ハース(Haas)、J.ら(1996)Curr. Biol. 6:315〜324(非特許文献4);リッツート(Rizzuto)、R.ら(1996)Curr. Biol. 6:183〜188(非特許文献5);およびコザク(Kozak)、M.(1987)Nucleic Acids Res. 15:8125〜8148(非特許文献6);ルキヤノフ(Lukyanov)、K.ら(2000)J. Biol. Chemistry 275(34):25879〜25882(非特許文献7)。
花虫類に由来する色素/蛍光タンパク質およびそれらの変異体だけでなく、それらをコードする核酸組成物が提供される。関心対象の特異的なタンパク質には、以下の特定の花虫類種に由来する色素/蛍光タンパク質が含まれる:アネモニア・マジャノ(Anemonia majano)、ハナヅタ(Clavularia)種、ゾアンサス(Zoanthus)種、ディスコソマ・ストリアタ(Discosoma striata)、ディスコソマ(Discosoma)種「赤色」、アネモニア・スルカタ(Anemonia sulcata)、ディスコソマ(Discosoma)種「緑色」、ディスコソマ(Discosoma)種「深紅色」、およびそれらの変異体。対象タンパク質の断片およびそれらをコードする核酸だけでなく、対象タンパク質に対する抗体およびトランスジェニック細胞および生物も提供される。対象タンパク質および核酸組成物は、多種多様な応用で使用される。最後に、対象タンパク質を含むような応用で使用されるキットが提供される。
本発明に従って、当技術分野における従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術の知見を用いることができる。これらの技術は文献で詳しく説明されている。例えば以下の文献を参照されたい:マニアティス(Maniatis)、フリッツ(Fritsch)およびサンブルック(Sambrook)、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」(1982);「DNAクローニング:実践的アプローチ(DNA Cloning A Practical Approach)」、第I巻および第II巻(D.N. Glover編、1985);「オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)」(M.J. Gait編、1984);「核酸ハイブリダイゼーション(Nucleic Acid Hybridization)」(B.D. HamesおよびS.J. Higgins編(1985));「転写および翻訳(Transcription and Translation)」(B.D. HamesおよびS.J. Higgins編、(1984));「動物細胞の培養(Animal Cell Culture)」(R.I. Freshney編、(1986));「固定化された細胞および酵素(Immobilized Cells and Enzymes)」(IRL Press、(1986));B. Perbal、「分子クローニングの実践的手引書(A Practical Guide To Molecular Cloning)」(1984)。
花虫類に由来する色素/蛍光タンパク質およびそれらの変異体だけでなく、それらをコードする核酸組成物が提供される。関心対象の特異的なタンパク質には、以下の特定の花虫類種に由来する色素/蛍光タンパク質が含まれる:アネモニア・マジャノ(Anemonia majano)、ハナヅタ(Clavularia)種、ゾアンサス(Zoanthus)種、ディスコソマ・ストリアタ(Discosoma striata)、ディスコソマ(Discosoma)種「赤色」、アネモニア・スルカタ(Anemonia sulcata)、ディスコソマ(Discosoma)種「緑色」、ディスコソマ(Discosoma)種「深紅色」、およびそれらの変異体。対象タンパク質の断片およびそれらをコードする核酸だけでなく、対象タンパク質に対する抗体およびトランスジェニック細胞および生物も提供される。対象タンパク質および核酸組成物は、多種多様な応用で使用される。最後に、対象タンパク質を含むような応用で使用されるキットが提供される。本発明をさらに詳しく説明するために、対象となる核酸組成物を最初に説明し、次に対象タンパク質組成物、抗体組成物、およびトランスジェニック細胞/生物について討論する。その次に、対象タンパク質が使用される代表的な方法を概説する。
上述した通り、本発明は花虫類の色素タンパク質および蛍光タンパク質、ならびにそれらの変異体と同様に、それらのタンパク質の断片および相同体をコードする核酸組成物を提供する。核酸組成物とは、本発明の花虫類の色素/蛍光ポリペプチドをコードする読み枠(open reading frame)(すなわち花虫類の色素/蛍光タンパク質遺伝子)を有するDNA配列を含む組成物を意味し、適切な条件では、本発明の花虫類の色素/蛍光タンパク質として発現される能力がある。またこの用語には、本発明のタンパク質をコードする核酸と相同であり、実質的に同様または同一である核酸が含まれる。したがって本発明は、本発明のタンパク質と同様にそれらの相同体をコードする遺伝子およびそのコード配列を提供する。対象核酸は分離され、例えば天然の環境以外で存在する。
これらの態様において、核酸組成物はゾアンサリア(Zoantharia)亜綱、多くはアクチニアリア(Actiniaria)目、さらに多くはエンドミアリア(Endomyaria)亜目、一般的にはアクチニイダエ(Actiniidae)科であることが多く、さらに一般的にはアネモニア(Anemonia)属由来の生物に見出される核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来し、多くの態様においてこの生物はアネモニア・マジャノ(Anemonia majano)であり、アネモニア・マジャノに由来する特異的な関心対象のタンパク質はamFP486(すなわちNFP-1)であり、その相同体/変異体(例えばMut15、Mut32)は多くの態様において特に関心対象である。amFP486の野生型cDNAコード配列を配列番号:01に示す。
これらの態様において、核酸はアルシオナリア(Alcyonaria)、多くは亜綱(根生類(Stolonifera)目、さらに多くはクラブラリデ(Clavulariidae)科由来の生物に見出される核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来し、生物は一般的にはハナヅタ(Clavularia)属に由来し、特定の態様においては、生物はハナヅタ(Clavularia)種であり、ハナヅタ(Clavularia)種に由来する特異的な蛍光タンパク質はcFP484(別名NFP-2)であり、かつその相同体/変異体(例えばΔ19 cFP484およびΔ38 cFP484)は多くの態様において特に関心対象である。cFP484の野生型のcDNAコード配列を配列番号:03に示す。
これらの態様において、核酸はゾアンサリア(Zoantharia)亜綱、多くはゾアンシデア(Zoanthidea)目、さらに多くはブラチクネミア(Brachycnemia)亜目、一般的にはゾアンシデア(Zoanthidae)科、より一般的にはゾアンサス(Zoanthus)属の生物に見出される核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来し、ある態様においては、この生物はゾアンサス(Zoanthus)種であり、特異的な蛍光タンパク質はzFP506(別名NFP-3)、およびその相同体/変異体(例えばzFP506のN65M異型)であり、多くの態様において特に関心対象である。zFP506の野生型のcDNAコード配列を配列番号:05に示す。
これらの態様において、核酸はゾアンサリア(Zoantharia)亜綱、多くはゾアンシデア(Zoanthidea)目、さらに多くはブラチクネミア(Brachycnemia)亜目、一般的はゾアンシデア(Zoanthidae)科、より一般的にはゾアンサス(Zoanthus)属の生物に見出される核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来する。ある態様においては、この生物はゾアンサス(Zoanthus)種であり、特異的な蛍光タンパク質はzFP538(NFP-4)、およびその相同体/変異体(例えばzFP538のM128異型)であり、多くの態様において特に関心対象である。zFP538の野生型のcDNAコード配列を配列番号:07に示す。
これらの態様において核酸はゾアンサリア(Zoantharia)亜綱、多くはコラリモファリア(Corallimopharia)目、さらに多くはディスコソマティダエ(Discosomatidae)科、一般的にはディスコソマ(Discosoma)属の生物に見出される核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来し、ある態様においては、この生物はディスコソマ・ストリアタ(Discosoma striata)であり、特異的な蛍光タンパク質はdsFP483(NFP-5)であって、その相同体/変異体は多くの態様において特に関心対象である。dsFP483の野生型のcDNAコード配列を配列番号:09に示す。
これらの態様において、核酸は、ゾアンサリア(Zoantharia)亜綱、多くはコラリモファリア(Corallimopharia)目、さらに多くはディスコソマティダエ(Discosomatidae)科、一般的にはディスコソマ(Discosoma)属)の生物に見出される核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来し、ある態様においては、この生物はディスコソマ(Discosoma)種「赤色」であり、特異的な蛍光タンパク質はdrFP583(NFP-6であって)、その相同体/変異体(例えばE5、E8、E5up、E5down、E57、AG4、AG4H)であり、多くの態様において特に関心対象である。drFP583の野生型のcDNAコード配列を配列番号:11に示す。
これらの態様において、核酸は、ゾアンサリア(Zoantharia)亜綱、多くはイソギンチャク(Actiniaria)目、さらに多くはエンドミアリア(Endomyaria)亜目、一般的にはアクチニイダエ(Actiniidae)科であり、またさらに一般的にはアネモニア(Anemonia)属の生物の核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来し、例えばある態様においてこの生物はアネモニア・スルカタ(Anemonia sulcata)であり、特異的な蛍光タンパク質asFP600(NFP-7)、およびその相同体/変異体(例えばMut1)は多くの態様において関心対象である。asFP600の野生型のcDNAコード配列を配列番号:14に示す。
これらの態様において、核酸は、ゾアンサリア(Zoantharia)亜綱、多くはコラリモファリア(Corallimopharia)目、さらに多くはディスコソマティダエ(Discosomatidae)科、一般的にはディスコソマ(Discosoma)属の生物に見出される核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来し、ある態様においては、この生物はディスコソマ(Discosoma)種「緑色」であり、特異的な蛍光タンパク質はdmFP592(NFP-8)であり、その相同体/変異体は多くの態様において特に関心対象である。dgFP512の野生型のcDNAコード配列を配列番号:15に示す。
これらの態様において、核酸は、ゾアンサリア(Zoantharia)亜綱、多くはコラリモファリア(Corallimopharia)目、さらに多くはディスコソマティダエ(Discosomatidae)科、一般的にはディスコソマ(Discosoma)属の生物に見出される核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来し、ある態様においては、この生物はディスコソマ(Discosoma)種「深紅色」であり、特異的な蛍光タンパク質はdmFP592(NFP-9)であり、その相同体/変異体は多くの態様において特に関心対象である。dmFP592の野生型のcDNAコード配列を配列番号:17に示す。
細菌を用いた発現系は以下の文献で説明されたものを含む:チャン(Chang)ら、Nature(1978)275:615;ゴーデル(Goeddel)ら、Nature(1979)281:544;ゴーデルら、Nucleic Acids Res.(1980)8:4057;欧州特許第0 036,776号;米国特許第4,551,433号;デボア(DeBoer)ら、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)(1983)80:21〜25;およびシーベンリスト(Siebenlist)ら、Cell(1980)20:269。
酵母を用いた発現系は以下の文献に記載されたものを含む:ヒネン(Hinnen)ら、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)(1978)75:1929;イトウ(Ito)ら、J. Bacteriol.(1983)153:163;カーツ(Kurtz)ら、Mol. Cell Biol.(1986)6:142;クンゼ(Kunze)ら、J. Basic Microbial.(1985)25:141;グリーソン(Gleeson)ら、J. Gen. Microbial.(1986)132:3459;ローゲンカンプ(Roggenkamp)ら、Mol. Gen. Genet.(1986)202:302;ダス(Das)ら、J. Bacteriol.(1984)158:1165;デ・ルーベンコート(De Louvencourt)ら、J. Bacterial.(1983)154:737;ファン・デン・バーグ(Van den Berg)ら、Bio/Technology (1990)8:135;クンゼ(Kunze)ら、J. Basic Microbial.(1985)25:141;クレッグ(Cregg)ら、Mol. Cell. Biol. (1985)5:3376;米国特許第4,837,148号および第4,929,555号;ビーチ(Beach)およびナース(Nurse)、Nature(1981)300:706;ダビドウ(Davidow)ら、Curr. Genet.(1985)10:380;ガイジャーディン(Gaillardin)ら、Curr. Genet.(1985)10:49;バランス(Ballance)ら、Biochem. Biophys. Res. Commun.(1983) 112:284〜289;ティルバーン(Tilburn)ら、Gene(1983)26:205〜221;イェルトン(Yelton)ら、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)(1984)81:1470〜1474;ケリー(Kelly)およびハインズ(Hynes)、EMBO J.(1985)4:475〜479;欧州特許第0 244,234号;および国際公開公報第91/00357号。
昆虫における異種遺伝子の発現は以下の文献に記載されたようになされる:米国特許第4,745,051号;フリーセン(Friesen)ら、「バキュロウイルス遺伝子発現の調節(The Regulation of Baculovirus Gene Expression)」「バキュロウイルスの分子生物学(The Molecular Biology Of Baculoviruses)」(1986)(W. Doerfler編));欧州特許第0 127,839号;欧州特許第0 155,476号;およびブラク(Vlak)ら、J. Gen. Virol.(1988)69:765〜776;ミラー(Miller)ら、Ann. Rev. Microbiol.(1988)42:177;カーボネル(Carbonell)ら、Gene(1988)73:409;マエダ(Maeda)ら、Nature(1985)315:592〜594;レバック-ベルヘイデン(Lebacq-Verheyden)ら、Mol.Cell.Biol.(1988)8:3129;スミス(Smith)ら、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)(1985)82:8844;ミヤジマ(Miyajima)ら、Gene(1987)58:273;およびマーティン(Martin)ら、DNA(1988)7:99。数多くのバキュロウイルス株および異型ならびに宿主に由来する対応する許容昆虫宿主細胞は、ルコウ(Luckow)ら、Bio/Technology(1988)6:47〜55、ミラー(Miller)ら、Generic Engineering(1986)8:277〜279、およびマエダ(Maeda)ら、Nature(1985)315:592〜594に記載されている。
哺乳類における発現は以下の文献に記載されるようになされる:ディケマ(Dijkema)ら、EMBO J.(1985)4:761、ゴルマン(Gorman)ら、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)(1982)79:6777、ボシャート(Boshart)ら、Cell (1985)41:521、および米国特許第4,399,216号。哺乳類における発現の他の特徴は、以下の文献に記載されるように促進される:ハム(Ham)およびウォレス(Wallace)、Meth. Enz.(1979)58:44、バーンズ(Barnes)およびサトウ(Sato)、Anal. Biochem.(1980)102:255、米国特許第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号、国際公開公報第90/103430号、国際公開公報第87/00195号、および米国再発行特許第30,985号。
本発明では、花虫類の色素タンパク質および蛍光タンパク質ならびにそれらの変異体と同様に、それらに関連するポリペプチド組成物も提供される。対象タンパク質は色素タンパク質であるので、色の付いたタンパク質であり、蛍光性を有する場合があるほか、低蛍光性、または非蛍光性である場合もある。本明細書で使用する色素タンパク質および蛍光タンパク質という用語は、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼなどのルシフェラーゼを含まない。本明細書で使用するポリペプチド組成物という用語は、完全長のタンパク質、ならびにその一部分または断片の両方を意味する。また、この用語には天然タンパク質の変化も含まれる。このような変化は、天然のタンパク質と相同的、または実質的に同様であり、かつ詳しく後述するように天然のタンパク質の変異体である。対象となるポリペプチドは天然の環境以外に存在する。
この態様のタンパク質の吸収極大は約250 nm〜650 nmの範囲にあり、一般的には約400 nm〜500 nmの範囲にあり、さらに一般的には約440 nm〜480 nmの範囲にある。また放射極大は典型的には約270 nm〜670 nmの範囲にあり、一般的には約420 nm〜520 nmの範囲にあり、さらに一般的には約460 nm〜500 nmの範囲にある。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約200アミノ酸残基〜250アミノ酸残基であり、一般的には約210アミノ酸残基〜240アミノ酸残基である。分子量の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には約22.50 kDa〜27.50 kDaである。多くの態様の中で特に関心対象であるのは、配列番号:02に示すアミノ酸配列を有するamFP486(NFP-1)である。また、この配列の変異型(例えばMut15やMut32など)も関心対象である。
この態様のタンパク質の吸収極大は典型的には約250 nm〜650 nmの範囲にあり、一般的には約400 nm〜500 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約440 nm〜480 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約270 nm〜670 nmの範囲にあり、一般的には約420 nm〜520 nmの範囲にあり、さらに一般的には約460 nm〜500 nmの範囲にある。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約225アミノ酸〜300アミノ酸であり、一般的には約250アミノ酸残基〜275アミノ酸残基である。分子量の範囲は通常約25 kDa〜35 kDaであり、一般的には約27.50 kDa〜32.50 kDaである。特に関心対象であるのは、配列番号:04に示す配列を有するcFP484タンパク質ならびにその変異体(例えばΔ19 cFP484およびΔ38 cFP484(NFP-2)など)である。
この態様のタンパク質の吸収極大は典型的には約300 nm〜700 nmの範囲にあり、一般的には約450 nm〜550 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約480 nm〜510 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約320 nm〜720 nmの範囲にあり、一般的には約470 nm〜570 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約500 nm〜530 nmの範囲にある。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約200アミノ酸残基〜250アミノ酸残基であり、一般的には約220アミノ酸残基〜240アミノ酸残基である。分子量の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には約22.50 kDa〜27.50 kDaである。特に関心対象であるのは、配列番号:06に示すアミノ酸残基を有するタンパク質zFP506(NFP-3)ならびにこのタンパク質の変異体(例えばN65M異型など)である。
この態様のタンパク質の励起極大は典型的には約300 nm〜650 nmの範囲にあり、一般的には約475 nm〜575 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約500 nm〜550 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約310 nm〜660 nmの範囲にあり、一般的には約485 nm〜585 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約510 nm〜560 nmの範囲にある。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約200アミノ酸残基〜250アミノ酸残基であり、一般的には約220アミノ酸残基〜240アミノ酸残基である。分子量の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には約22.50 kDa〜27.50 kDaである。特に関心対象であるのは、配列番号:08に示すアミノ酸配列を有するタンパク質sFP538(NFP-4)ならびにその変異体(例えばM128異型など)である。
この態様のタンパク質の励起極大は典型的には約240 nm〜640 nmの範囲にあり、一般的には約500 nm〜600 nmの範囲にあり、さらに一般的には約530 nm〜560 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約280 nm〜680 nmの範囲にあり、一般的には約540 nm〜640 nmにあり、またさらに一般的には約570 nm〜600 nmの範囲にある。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約200アミノ酸残基〜250アミノ酸残基であり、一般的には約220アミノ酸残基〜240アミノ酸残基である。分子量の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には約22.50 kDa〜27.50 kDaである。多くの態様において特に関心対象であるのは、配列番号:10に示すアミノ酸配列を有するタンパク質dsFP483(NFP-5)ならびにその変異体である。
この態様のタンパク質の吸収極大は典型的には約250 nm〜750 nmの範囲にあり、一般的には約500 nm〜600 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約540 nm〜580 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約275 nm〜775 nmの範囲にあり、一般的には約525 nm〜625 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約565 nm〜605 nmの範囲にある。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約200アミノ酸残基〜250アミノ酸残基であり、一般的には約220アミノ酸残基〜240アミノ酸残基である。分子量の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には約22.50 kDa〜27.50 kDaである。特に関心対象であるのは、配列番号:12に示すアミノ酸配列を有するdrFP583(NFP-6)タンパク質ならびにその変異体(例えばE5、E8、E5up、E5down、E57、AG4、AG4Hなど)である。
この態様のタンパク質の吸収極大は典型的には約370 nm〜770 nmの範囲にあり、一般的には約520 nm〜620 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約560 nm〜580 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約395 nm〜795 nmの範囲にあり、一般的には約545 nm〜645 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約585 nm〜605 nmの範囲にある。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約200アミノ酸残基〜250アミノ酸残基であり、一般的には約220アミノ酸残基〜240アミノ酸残基である。分子量の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には22.50 kDa〜27.50 kDaである。特に関心対象であるのは、配列番号:14に示すアミノ酸配列を有するasFP600(NFP-7)タンパク質ならびにその変異体(例えばMut1など)である。
この態様のタンパク質の吸収極大は典型的には約300 nm〜700 nmの範囲にあり、一般的には約450 nm〜650 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約490 nm〜510 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約310 nm〜710 nmの範囲にあり、一般的には約460 nm〜660 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約500 nm〜520 nmの範囲にある。対象タンパク質の長さはの範囲は典型的には約200アミノ酸残基〜250アミノ酸残基であり、一般的には220アミノ酸残基〜240アミノ酸残基である。分子量の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には約22.50 kDa〜27.50 kDdである。特に関心対象であるのは、配列番号:16に示すアミノ酸配列を有するdgFP512タンパク質(NFP-8)ならびにその変異体である。
この態様のタンパク質の吸収極大は典型的には約375 nm〜775 nmの範囲にあり、一般的には約525 nm〜625 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約560 nm〜590 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約395 nm〜795 nmの範囲にあり、一般的には約545 nm〜645 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約580 nm〜610 nmである。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約200アミノ酸残基〜250アミノ酸残基であり、一般的には約220アミノ酸残基〜240アミノ酸残基である。分子量の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には約22.50 kDa〜27.50 kDaである。特に関心対象であるのは、配列番号:18に示すアミノ酸配列を有するdmFP592(NFP-9)タンパク質ならびにその変異体である。
対象蛍光タンパク質に特異的に結合する抗体も提供する。適切な抗体は、対象タンパク質のすべてまたは一部を含むペプチドで宿主動物を免疫化することで得られる。適切な宿主には、マウス、ラット、ヤギ、ハムスター、ウサギなどが含まれる。タンパク質の免疫原の起源は通常、花虫類種である。宿主動物は一般に、免疫原とは異なる種である(例えばマウスなど)。
対象となる核酸を使用して、トランスジェニックの非ヒト植物または動物を作製することができるほか、または細胞系列内で部位特異的な遺伝子修飾を導入することができる。本発明のトランスジェニック細胞には、導入遺伝子として存在する、本発明の一つまたは複数の核酸が含まれる。この定義には、導入遺伝子を含むように形質転換された親細胞およびその子孫が含まれる。多くの態様におけるトランスジェニック細胞は、本発明の核酸を通常含まない細胞である。トランスジェニック細胞が天然の状態で対象核酸を含む態様においては、この核酸は細胞内において天然の位置とは異なる場所に存在する。すなわち細胞ゲノム上の天然とは異なる場所に組み込まれる。トランスジェニック動物は相同組換えを介して作製することができる。この場合、内在性の座位は変化する。あるいは核酸構築物は、ゲノム上に無作為に組み込まれる。安定に組み込まれるベクターには、プラスミド、レトロウイルス、および他の動物のウイルス、YACなどがある。
対象となる色素タンパク質およびその蛍光変異体は多種多様な応用で使用される。応用は、対象タンパク質が色素タンパク質かまたは蛍光タンパク質かのいずれかによって必然的に変わる。個々の種類のタンパク質の代表的な用途を以下に説明する。記載した用途はあくまで代表的なものであり、対象タンパク質の用途を以下の記述に制限する意図はない。
本発明で対象となる色素タンパク質は多種多様な応用で使用される。対象となる一つの応用は、対象タンパク質を、特定の組成物に色を付けたりまたは色素を加えることができる着色剤として使用することである。ある態様において特に関心対象であるのは毒性のない色素タンパク質である。対象となる色素タンパク質は多種多様な組成物に取り込ませることができる。代表的な組成物には、食品成分、医薬品、化粧品、生物(例えば動物や植物)などがある。着色剤または色素として使用する場合は、十分量の色素タンパク質を組成物に取り込ませて、所望の色または色素を付ける。色素タンパク質は、任意の簡便なプロトコルを用いて組成物に取り込ませることができる。使用する特定のプロトコルは、少なくとも部分的には着色対象組成物の性質に必然的に依存する。使用するプロトコルには、混合(blending)、拡散(diffusion)、摩擦(friction)、吹きつけ(spraying)、注入(injection)、入れ墨(tattooing)など含まれるがこれらに限定されない。
本発明の対象となる蛍光タンパク質(ならびに上記の本発明の他の組成物)は、多種多様な応用で使用される。応用には以下のものが含まれるがこれらに限定されない。対象となる最初の応用では、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)への応用で対象タンパク質を使用する。この応用では、対象タンパク質は、第2の蛍光タンパク質または色素(例えばMatzら、Nature Biotechnology(1999年10月)17:969〜973に記載された蛍光タンパク質)、オワンクラゲ(Aequoria victoria)の緑色蛍光タンパク質またはその蛍光変異体(例えば参照として開示が本明細書に組み入れられる米国特許第6,066,476号;第6,020,192号;第5,985,577号;第5,976,796号;第5,968,750号;第5,968,738号;第5,958,713号;第5,919,445号;第5,874,304号に記載)、他の蛍光色素(例えばクマリンおよびその誘導体(例えば7-アミノ-4-メチルクマリン、アミノクマリン)、ボディピー(Bodipy) FLなどのボディピー色素、カスケードブルー、フルオレセイン、およびその誘導体(例えばフルオレセインイソチオシアナート)、オレゴングリーン、ローダミン色素(例えばテキサスレッド、テトラメチルローダミン、エオシン、およびエリトロシン)、シアニド色素(例えばCy3およびCy5)、ランタノイドイオンの大環状キレート(例えば量子色素など)、化学発光色素(例えばルシフェラーゼ、参照として開示が本明細書に組み入れられる米国特許第5,843,746号;第5,700,673号;第5,674,713号;第5,618,722号;第5,418,155号;第5,330,906号;第5,229,285号;第5,221,623号;第5,182,202号に記載されたものを含む))と組み合わせて供与体および/または受容体としてはたらく。使用される可能性のある対象蛍光タンパク質を使用するFRETアッセイ法の特定の例は、以下の例を含むがこれらに限定されない:タンパク質-タンパク質相互作用の検出(例として、多種多様な事象に対するバイオセンサーとしてはたらく、哺乳類のツーハイブリッド(two-hybrid)系、転写因子の二量体化、膜タンパク質の多量体化、多タンパク質複合体の形成など。この場合、ペプチドまたはタンパク質は、対象蛍光タンパク質および連結用のペプチドまたはタンパク質を含むFRET蛍光コンビネーションと共有結合するし、例としてタンパク質分解酵素に特異的な基質、例としてカスパーゼによる切断では、FRETを上昇または下降させるシグナル受けて立体構造の変化を受けるリンカー、例としてPKA調節領域(cAMPセンサー)、リン酸化(例えばリンカー内にリン酸化部位があるか、またはリンカーに別のタンパク質のリン酸化/脱リン酸化された領域に対する結合特異性があるか、またはリンカーにCa2+結合領域がある)。対象タンパク質を使用する代表的な蛍光共鳴エネルギー移動すなわちFRETの応用は、以下のものを含むがこれらに限定されない:米国特許第6,008,373号;第5,998,146号;第5,981,200号;第5,945,526号;第5,945,283号;第5,911,952号;第5,869,255号;第5,866,336号;第5,863,727号;第5,728,528号;第5,707,804号;第5,688,648号;第5,439,797号、これらは参照として開示が本明細書に組み入れられる)。
本発明では、一つまたは複数の上述の応用を実施する際に使用されるキットも提供する。この場合、対象となるキットは、対象となる方法に用いる色素タンパク質または蛍光タンパク質を含むほか、タンパク質(例えば対象タンパク質のコード領域を含むベクターを含む構築物)を作製する方法を含む。したがってタンパク質または構築物は、適切な保存用溶媒(例えば緩衝液)中に、典型的には適切な容器内に存在する。対象キットには提供されるタンパク質に対する抗体が存在する場合もある。ある態様においては、キットは複数の異なるベクターを含み、各ベクターは対象タンパク質をコードする。この場合ベクターは、異なる環境および/または異なる条件で発現するように設計される。例えばベクターが、哺乳類細胞における強力な発現プロモーターを含む場合は構成的に発現する。このほかに使用者が任意のプロモーターを挿入して意図した発現を行うことができる、マルチクローニングサイトがあってプロモーターのないベクターを含む場合もある。
I.野生型の花虫類タンパク質
下表に、本発明の9種の特定の野生型花虫類タンパク質の特性をまとめた:
*相対量子収量は、オワンクラゲ(A. victoria)のGFPの量子収量と比較して決定した。
**相対輝度は、吸光係数に量子収量を乗じた値を、オワンクラゲ(A. victoria)のGFPに関する同値で割った値である。
A.amFP486変異体の構築
amFP486の2種の変異体(Mut15およびMut32)を作製した。野生型であるamFP486と比較して、Mut15には以下の点突然変異がある:101位におけるA→G(番号はATGを開始点とする);129位におけるT→C;202位〜204位におけるAAA→TTG;240位におけるC→T。Mut32には野生型に対して2か所のアミノ酸の置換(Asn-34→Ser;およびLys-68→met)がある。表2にMut15およびMut32のスペクトル特性を示す。
Mut32のDNAをPCRで増幅し、EGFP-N1を主鎖とするベクターのBamHIおよびNotI制限酵素切断部位に再構築した。このベクターのマルチクローニングサイトはEGFP-N1のマルチクローニングサイトと同じである。
3種の不安定化されたamFP486ベクターを、d1、d2、およびd376などの異なるマウスODC分解領域を野生型amFP486のC末端に融合させて構築した。このベクターはEGFP-N1を主鎖として構築した。
不安定化されたamFP486の機能に関する試験を、293細胞に一過的にトランスフェクトすることで行った。24時間発現させた後に、蛍光強度はd2、d1、d376の順に低下した。これは、異なるマウスODC分解領域と融合させたためである。タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドで4時間処理しても、d2の蛍光強度はそれほど変化しなかったが、d1の蛍光強度は元の強度に比べてさらに50%低下した。d1の半減期はおよそ4時間である。
哺乳類における発現は極めて広く用いられている手段であるので、哺乳類細胞で良好に発現させるためには、ヒトに適したコドンを採用した変形が必要である。ヒト化されたMut32を作製するために、最初にMut32の配列をヒトで使用されることの多いコドンに変えて、23のオリゴ(12Fおよび11R)を設計した。次に各回が20サイクルからなるPCR増幅を4回にわたって行った。PCRのサイクルは以下のように設定した:94℃で1分間;94℃で1分間;40℃で1分間、また72℃で1分間。この4回の内訳は以下の通りであった:第1回では2 μlの4種の各オリゴ(60 bp)、5 μlの緩衝液、1 μlのpfu、1 μlのdNTPを混合して総容量50 μlとした。20サイクルのPCRを行った後に、5セットの150 bp、および1セットの90 bpの4 ラスト(last)オリゴ産物を得た。第2回では各10 μlの新たな粗PCR産物、5 μlの緩衝液、1 μlのpfu、1 μlのdNTPを混合して総容量50 μlとした。20サイクルのPCRを行った後に、2セットの270 bpおよび1セットの210 bpのPCR産物を得た。第3回では新たな粗PCR産物を混合した。20サイクルのPCRを行った後に、1セットの510 bpおよび1セットの450 bpの産物を得た。第4回では、新たな粗産物を混合した。20サイクルのPCRを行った後に最終PCR産物(690 bp)を得た。1Fおよび11Rのプライマーを用いてさらにPCR増幅を行った。結果としてヒト化されたMut32が得られた。このヒト化されたMut32をEGFP-N1を主鎖とするベクターに挿入した。
元のプラスミドamFP486 DNA(野生型、pQE30上のMut15およびMut32)を用いて、上述したN1型のamFP486野生型、Mut15、およびMut32を構築した。このDNAを大腸菌DH5αに導入した。カルシウムリン酸法(Clontech製品番号K2051-1)で3種のN1構築物をHEK293細胞に移した。
Mut15-mdm2融合体を以下の手順で作製した:第1にヒトのMarathon cDNAライブラリー(Burke'sリンパ腫)を以下のプライマーを用いて増幅することでmdm2 DNAを得た:
(配列番号:19)および
(配列番号:20);第2に、精製後のPCR産物を以下のプライマー:
(配列番号:21)および
(配列番号:22)
で増幅することで、コザック(Kozac)配列および制限酵素切断部位を導入した;第3に、工程2で得た精製後のPCR産物をEcoRIとSmaIで切断し、それをNFP1Mut15-N1ベクターのEcoRIおよびSmaIに挿入した(このベクターはpEGFP-N1主鎖のBamHI部位およびNotI部位を用いて作製した)。生じたMut15-mdm2融合体を次にHEK293細胞中で発現させた。
PQE30 amFP486野生型、Mut15、およびMut32でDH5αを形質転換した。この細菌を1 mMのIPTGの存在下で一晩生育させてタンパク質の発現を誘導した。細胞を100 mMのトリス、pH 8.0中で超音波処理を行い溶解した。室温で3000 rpmで15分間遠心して細胞溶解物を回収した。タンパク質をTALONメタル親和性樹脂(Metal Affinity Resin)を用いて精製した。手短に説明すると、タンパク質を樹脂に吸着させた後にビーズを段階的に洗浄(1回目の洗浄を行った後に1回目の溶出(50 mMのイミダゾール)を行う)した後に、100 mMのTris-HCl、pH 8.0中で2回目の溶出(200 mMのイミダゾール)を行った。タンパク質は、大部分が2回目の工程の溶出液中にあることがわかる。Mut32の細菌発現レベルが最も高く、Mut15が最も低いことがわかった。
A.変異体の作製
2通りの個別のPCR反応で2種の欠失変異体を作製した:一つはΔ19 cFP484でありcFP484のN末端の先頭の19アミノ酸を欠き、もうひとつはΔ38 cFP484でありcFP484のN末端の先頭の38アミノ酸を欠く。蛍光タンパク質Δ19 cFP484またはΔ38 cFP484をコードするDNAを含む哺乳類用の発現ベクターを作製し、それぞれpΔ19 NFP2-N1とpΔ38 NFP2-N1と命名する。
HeLa細胞に、蛍光タンパク質Δ19 cFP484をコードするDNAを含む哺乳類用発現ベクターpA19 NFP2-N1を一過的にトランスフェクトした。トランスフェクション後に細胞を37℃で48時間インキュベートした後に、3.7%のホルムアルデヒド中に固定した。細胞をマウンティング培地にマウントして蛍光顕微鏡で観察した。モノクロームの冷却CCDカメラ(Roper Scientific)でメタモルフ(MetaMorph)ソフトウェア(Universal Imaging Corp.)を用いてデジタル画像を得た。フィルターセットXF 114(Omega Optical)を用いて、Δ19 cFP484から放出される蛍光を画像化した。画像は擬似的に着色した。Δ38 cFP484はHeLa細胞で発現させても蛍光を発した。
A.変異体の作製
zFP506の変異体、N65Mを作製した。野生型であるzFP506と比べてN65Mには「AAC」から「ATG」への変異がある。この変異により65位における対応アミノ酸がアスパラギン(N)からメチオニン(M)に変わる。N65Mのスペクトル特性を表5に示す。
ヒト化されていないzFP506 DNAをPCRで増幅し、EGFP-N1を主鎖とするベクター中に再構築した。このベクターのマルチクローニングサイトはEGFP-N1のマルチクローニングサイトと同じである。作製したベクターの機能に関する試験を、293細胞に一過的にトランスフェクトすることで行った。トランスフェクトしてから24時間後にzFP506の発現を蛍光顕微鏡で調べた。zFP506の蛍光強度は良好で、EGFP-N1と同等であることがわかった。
zFP506は極めて安定なため、タンパク質の速い代謝回転を観察するためには、zFP506の不安定化変形を作製する必要がある。不安定化されたEGFPと同じ手法を用いて、マウスのODC分解領域をzFP506のC末端に融合させることで2種の不安定化されたzFP506ベクターを構築した。d2型と比べて、不安定化されたzFP506のd1型には3か所のEからAへの変異がMODC分解領域中にあるので、MODC分解領域を融合させたタンパク質の半減期は短くなる。不安定化されたd1zFP506およびd2zFP506は、EGFP-N1を主鎖とするベクター中に構築した。
野生型のd1zFP506を293細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後にCHXを添加してタンパク質合成を停止させた。この処理から4時間後に蛍光顕微鏡で細胞を調べた。MODC領域をzFP506に融合させると、蛍光強度がzFP506そのものと比べて若干低下することがわかる。処理から4時間後に蛍光強度は50%低下する。
不安定化されたd1zFP506をpCRE-d1GNFPベクターとpNF-κB-d1GNFPベクター中に構築した。その発現は、それぞれcAMP応答配列(CRE)またはNF-κB応答配列下で調節した。これらのベクターを293細胞に一過的にトランスフェクトし、トランスフェクションの24時間後にd1GNFPの発現をフォルスコリンまたはTNF-αで誘導した。誘導の6時間後に培養物をFACSで分析した。CRE-d1GNFPの蛍光強度が7倍誘導され、NF-κB-d1GNFPでは4倍誘導されたことが明らかとなった(データは示していない)。これは、不安定な状態のGNFPが転写レポーターとして利用できることを意味する。
哺乳類における発現は極めて広く用いられている手段であるので、哺乳類細胞で良好に発現させるためには、ヒトに適するコドンを採用した変形が必要である。ヒトで使用される頻度の高いコドンのオリゴの各ピースを連結して、完全長の野生型および/または変異型のzFP506を作製した(hGNFP-zFP506とhGNFP-N65M)。このヒト化されたzFP506をEGFP-N1を主鎖とするベクター中に構築した。
zFP538の一つの変異体、M128 を作製した。M128Vは、65位における部位特異的変異導入法で、正しくないヌクレオチドをPCRの過程で導入して作製した。明るい黄色を示した1個のコロニーを回収し、このクローンの配列を決定した。このクローンは65位に野生型のアミノ酸リジン(K)を含むが、128位においてメチオニン(M)がバリン(V)で置換されていることがわかった(番号はGFPを基準とする)。
野生型(wt)および変異型zFP538のDNAをともにPCRで増幅し、EGFP-N1を主鎖とするベクター中に再構築した。このベクターのマルチクローニングサイトはEGFP-N1のマルチクローニングサイトと同じである。pYNFPwtもpYNFPW128VもEGFP-N1と同じマルチクローニングサイトをもつ。作製したベクターの機能試験を293細胞に一過的にトランスフェクトして行った。24時間発現させた後に、pYNFPwt、pYNFPM12V、およびEYFPを並べて比較したところ、pYNFPwtの蛍光強度がEYFPの蛍光強度よりも弱いことがわかった(データは示していない)。しかしpYNFPM128Vの蛍光強度はEYFPと同程度であることが蛍光顕微鏡による観察で明らかとなった。
不安定化されたEGFPと同じ方法で、不安定化されたzFP538ベクターをd1やd2などの異なるマウスODC分解領域をzFP538のC末端に融合させることで構築した。不安定化されたYNFPのd1型にはd2型と比べて3か所のEからAへの変異がMODC分解領域中にある。pYNFPM128V-MODCd1とpYNFPM128V-MODCd2の両ベクターをEGFP-N1を主鎖とするベクター中に構築した。
不安定化されたzFP538の機能試験を293細胞に一過的にトランスフェクトすることで行った。24時間発現させた後に、蛍光強度はd2、d1の順に低下した。これは異なるマウスODC分解領域と融合させたためである。タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドで4時間処理してもd2の蛍光強度はそれほど変化しなかったが、d1の蛍光強度は元の強度に比べてさらに50%低下した。d1の半減期はおよそ4時間である。
ヒト化されたM128Vを作製して、pEGFP-N1を主鎖とするベクター中に配置した。このベクターのマルチクローニングサイトは、pEGFP-N1のマルチクローニングサイトと同じである。C1およびpEGFPの構築は進行中である。
A.哺乳類細胞における発現
HeLa細胞に、プラスミドpDsRed1-N1(drFP583をコードするDNAを含むベクター)またはプラスミドpEGFP-C1(オワンクラゲ(Aequorea victoria)のEGFPをコードする)のいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクション直後に細胞を混合してカバーガラス上にプレーティングした。細胞を37℃で48時間インキュベートした後に3.7%のホルムアルデヒド中に固定した。細胞をマウンティング培地にマウントして蛍光顕微鏡で観察した。EGFPにはクロマ(Chroma)フィルターセット31001を用い、かつ、drFP583にはフィルターセット31002を用いて、冷却CCDカメラ(Roper Scientific)とメタモルフ(MetaMorph)ソフトウェア(Universal Imaging)で同視野から画像を撮影した。画像を擬似的に着色してオーバーレイ処理を行った。同視野から位相差を撮影してオーバーレイ処理を行った。
哺乳類における発現は極めて広く用いられている手段であるので、哺乳類細胞で良好に発現させるためには、ヒトに適するコドンを採用した変形が必要である。したがって、蛍光タンパク質を発現するようにコドンを最適化するために、野生型のdrFP583のヌクレオチド配列を変えてヒト化されたdrFP583を作製した。
HeLa細胞に、プラスミドpECFP-Nuc、pEYFP-Tub、およびpDsRed1-Mito(ヒト化されたdrFP583)を一過的に同時にトランスフェクトした。トランスフェクション後に細胞を37℃で48時間インキュベートした後に3.7%のホルムアルデヒド中に固定した。細胞をマウンティング培地にマウントして蛍光顕微鏡で観察した。3種すべての蛍光タンパク質を同時に発現する1個の細胞の画像を、DsRed1-Mitoについてはオメガ(Omega)フィルターセットXF35を用い、EYFP-TubについてはXF104を用い、かつECFP-NucについてはXF114を用いて冷却CCDカメラ(Roper Scientific)およびメタモルフ(MetaMorph)ソフトウェア(Universal Imaging)で撮影した。各画像を擬似的に着色してオーバーレイ処理を行い、3種すべてのシグナルを一つの画像として表した。タンパク質DsRed1-Mitoはミトコンドリアに局在し、EYFP-Tubは微小管網に局在し、またECFP-Nucは核に局在する。
ヒト化されたdrFP583の変異体を誤りの多い(error prone)PCR法(Clontech)で作製した。アミノ酸の42位、71位、105位、120位、161位、および197位(番号付けの開始点は最初のメチオニン)に変異が生じた。表7に生じた変異体およびその特性を示す。
E5(V105A、S197T)の蛍光は、インビボでもインビトロでも、大腸菌および哺乳類細胞で経時的に緑から赤に変化している。またE5は大腸菌および哺乳類細胞の両方で野生型のdrFP583より速く折りたたまれる。
E8(N42H)にはあらゆる時間軸で緑と赤2か所の蛍光極大があり、drFP583と比べて極めて速く折りたたまれる(表7)。
drFP583およびdmFP592のヒト化されていない野生型コード領域の断片を、1 ngの対応する細菌発現プラスミド(drFP583またはdmFP592の各挿入片をもつpQE-30誘導体)をテンプレートとしてPCRで増幅した(22サイクル、95℃15秒、68℃1分20秒)。
drFP583/dmFP592ハイブリッドタンパク質の放射スペクトルおよび励起スペクトルはdmFP592と基本的に同じである。表8にdrFP583/dmFP592ハイブリッドタンパク質のスペクトル特性を示す。
*相対量子収量は、オワンクラゲ(A. victoria)のGFPの量子収量と比較して決定した。
**相対輝度は、吸光係数に量子収量を乗じた値を、オワンクラゲ(A. victoria)のGFPに関する同値で割った値である。
drFP583/dmFP592ハイブリッドをヒト化した。ヒト化されたdrFP583/dmFP592を基にさらに、drFP583/dmFP592-2GおよびdrFP583/dmFP592-Q3の2種の変異体を作製した。drFP583/dmFP592-2Gには、K15QおよびT217Sの2か所の置換が含まれる。この変異体は、ヒト化されたdrFP583/dmFP592ハイブリッド遺伝子から、対応プロトコルにしたがった多様性 PCR 変異誘発キット(Clontech)による無作為変異導入法で得た。drFP583/dmFP592-Q3には、K15Q、K83M、およびT217Sの3か所の置換が含まれる。drFP583/dmFP592-Q3変異体は、drFP583/dmFP592-2G変異体から、対応プロトコルにしたがった多様性 PCR 変異誘発キット(Clontech)による無作為変異導入法で得た。
drFP583/dmFP592-Q3は、蛍光タンパク質drFP583またはdmFP592と似ているので、タンパク質の発現、輸送、およびインビボにおけるタンパク質相互作用、プロモーター活性のモニタリングの手段として、また転写レポーターまたは融合タグとして使用することができる。さらにdrFP583/dmFP592-Q3は、放射極大の強固な長波長シフト、およびスペクトルのある程度の重複とバックグ回の蛍光を除いて、スペクトルの緑色部分の励起が実際的にないことを元に、2種またはそれ以上のタンパク質の発現をインビボで同時に検出する2種/3種の色素標識アッセイ法において、既存の緑色蛍光タンパク質の異型の一つに対する最も簡便な相手として選択することができる。
A.変異体の作製
asFP600の変異体Mut1を作製した。野生型のasFP600と比較してMut1には以下の置換がある:70位におけるTからA(番号はGFPを基準とする)、および148位におけるAからS。標的置換であるA148Sは、変異をもつプライマーを用いたPCRで部位特異的変異導入法で作製した。この変異導入の過程で、誤ったヌクレオチドがPCR中に導入されて、無作為な置換であるT70Aが生じた。置換T70Aは必ずしも蛍光に必要ではなく、また実際上、蛍光に影響を及ぼさない。表9にMut1のスペクトル特性を示す。asFP600の別の変異体には、184位におけるアラニンからセリンへの置換がある。
ヒト化されていない変異体asFP600(RNFP)のDNAをPCRで増幅し、EGFP-N1を主鎖とするベクター中に再構築した。このベクター(pRNFP-N1)のマルチクローニングサイトは、EGFP-N1のマルチクローニングサイトと同じである。
asFP600が核に局在することは、このタンパク質の転写レポーターまたはpHセンサーとしてのいくつかの応用を制限したので、こうした目的ではasFP600が細胞質で発現する必要があると考えられた。ヒトで使用されるコドンに基づく核外輸送配列をasFP600のN末端に融合させ、EGFP-N1ベクターに導入してpNE-RNFPを得た。
asFP600は極めて安定なため、タンパク質の速い代謝回転を観察するためには、asFP600の不安定化された変形を作製する必要がある。不安定化されたEGFPと同じ手法を用いて、マウスのODC分解領域をNE-RNFPのC末端に融合させることで2種の不安定化されたNE-RNFPベクターを構築した。d2型と比べて、不安定化されたRNFPのd1型には3か所のEからAへの変異がMODC分解領域中にあるので、MODC分解領域を融合させたタンパク質の半減期は短くなる。不安定化されたd1RNFPおよびd2RNFPは、EGFP-N1を主鎖とするベクター中に構築した。
ヒト化されていないasFP600のd2型を293細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの1日後にCHXを添加してタンパク質合成を阻害した。処理から3時間後に細胞を蛍光顕微鏡で調べた。蛍光強度が〜50%低下していることが判明した。
ヒト化したMut1を作製して、pEGFP-N1を主鎖とするベクター中に配置した。このベクターのマルチクローニングサイトは、pEGFP-N1のマルチクローニングサイトと同じである。C1およびpEGFPの構築は現在進行中である。
Claims (30)
- 天然の環境以外で存在する花虫類の色素タンパク質または蛍光タンパク質。
- タンパク質が、約300 nmから700 nmの範囲の吸収極大(absorbance maximum)を有する、請求項1記載のタンパク質。
- タンパク質が、約350 nmから650 nmの範囲の吸収極大を有する、請求項2記載のタンパク質。
- タンパク質が、約400 nmから600 nmの範囲の吸収極大を有する、請求項3記載のタンパク質。
- タンパク質が、約300 nmから700 nmの範囲の励起(excitation)スペクトルおよび約400 nmから800 nmの範囲の放射(emission)スペクトルを有する、請求項1から4のいずれか一項記載のタンパク質。
- タンパク質が、約350 nmから650 nmの範囲の励起スペクトルおよび約425 nmから775 nmの範囲の放射スペクトルを有する、請求項5記載のタンパク質。
- タンパク質が、約400 nmから600 nmの範囲の励起スペクトルおよび約450 nmから750 nmの範囲の放射スペクトルを有する、請求項6記載のタンパク質。
- タンパク質が、配列番号:02、04、06、08、10、12、14、16、18の配列と実質的に同様または同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1から7のいずれか一項記載のタンパク質。
- タンパク質が、配列番号:02、04、06、08、10、12、14、16、18からなる群より選択される配列と少なくとも約60%の配列同一性を有する、請求項8記載のタンパク質。
- タンパク質が、配列番号:02、04、06、08、10、12、14、16、18からなる群より選択される配列と少なくとも約75%の配列同一性を有する、請求項9記載のタンパク質。
- 請求項1から10のいずれか一項記載のタンパク質の断片。
- 請求項1から10のいずれか一項記載の花虫類の色素タンパク質もしくは蛍光タンパク質、または請求項11記載の断片をコードするヌクレオチド配列を有する、天然の環境以外で存在する核酸。
- 配列番号:01、03、05、07、09、11、13、15、17のヌクレオチド配列と実質的に同様または同一である核酸配列を有する、請求項12記載の核酸。
- 配列番号:01、03、05、07、09、11、13、15、17からなる群より選択される配列と少なくとも約60%の配列類似性を有する、請求項13記載の核酸。
- 配列番号:01、03、05、07、09、11、13、15、17からなる群より選択される配列と少なくとも約75%の配列類似性を有する、請求項14記載の核酸。
- 請求項12から15のいずれか一項記載の核酸の断片。
- 請求項12から16のいずれか一項記載の核酸またはその相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する、単離された核酸またはその模倣物(mimetic)。
- 請求項12から17のいずれか一項記載のベクターおよび核酸を含む構築物。
- 発現宿主において機能的な転写開始領域、転写開始領域の転写調節下にある請求項12から17のいずれか一項記載の核酸において見出されるヌクレオチド配列を有する核酸および該発現宿主において機能的な転写終結領域を含む、発現カセット。
- 発現カセットを宿主細胞へ導入した結果として、染色体外要素の一部としての、または宿主細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項19記載の発現カセットを含む、細胞またはその子孫。
- 以下の段階を含む、請求項1から10のいずれか一項記載のタンパク質を作製する方法:
それによりタンパク質が発現され、請求項20記載の細胞を成長させる段階;および実質的に他のタンパク質を含まない、該タンパク質を単離する段階。 - 請求項1から10のいずれか一項記載のタンパク質または請求項11記載の断片に、特異的に結合する抗体。
- ポリクローナル抗体である、請求項22記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項22記載の抗体。
- 請求項12から17のいずれか一項記載の核酸からなる群より選択される導入遺伝子(transgene)を含む、トランスジェニック細胞またはその子孫。
- 請求項1から10のいずれか一項記載のタンパク質を発現する能力があるトランスジェニック生物。
- 請求項1から10のいずれか一項記載のタンパク質を使用する段階を含む、色素タンパク質または蛍光タンパク質を用いる応用における改善。
- 請求項12から17のいずれか一項記載の核酸を使用する段階を含む、色素タンパク質または蛍光タンパク質をコードする核酸を用いる応用における改善。
- 請求項1から10のいずれか一項記載のタンパク質またはそれを作製する手段を含むキット。
- 請求項12から17のいずれか一項記載の核酸を含むキット。
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