JP2012047632A - 非線形顕微鏡及び非線形観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】セクショニング画像を高コントラストに取得する。
【解決手段】本発明の非線形顕微鏡は、観察対象物（１０）中の特定種類の分子に非線形光学過程による特定波長の光を生起させるためのレーザ光を生成する生成手段（１１〜１３）と、前記レーザ光を集光して前記観察対象物の観察対象面上にレーザスポットを形成する集光手段（１８）と、前記レーザスポットを、面内位置のずれた１対のレーザスポットに分離する分離手段（１６１、１６２）と、前記１対のレーザスポットの一方で生起した前記特定波長の光と他方で生起した前記特定波長の光との間の位相ズレを示す信号を生成する検出手段（２１〜２５）と、前記１対のレーザスポットで前記観察対象面上を走査しながら前記信号を繰り返し取り込むことにより、前記観察対象面における前記信号の分布を計測する制御手段（３０）とを備える。
【選択図】 図１

Description

本発明は、非線形顕微鏡及び非線形観察方法に関する。

近年、バイオ産業の勢いはとどまるところを知らず、とりわけ生体試料を観察対象とした３次元分解顕微鏡の需要は高まる一方である。その中でも空間分解能の高い共焦点顕微鏡は、古くから現在に至るまで広く使われている。従来の共焦点顕微鏡は、生体試料に含まれる蛍光分子が照射光の強度に対して線形な強度で発する蛍光（線形光学過程による信号）を観測するものであるが、近年になると、生体試料に含まれる特定種類の分子が照射光の強度に対して非線形な強度で発する光（非線形光学過程による信号）を観測する非線形顕微鏡が注目されつつある。

非線形顕微鏡は、照射光として比較的長い波長の光（例えば近赤外線）を用いるので、試料の深部まで観察することが可能である。また、上述した非線形過程は対物レンズの焦点近傍の微小領域でしか生起しないので、非線形顕微鏡が取得する画像は極めて薄い層の画像（セクショニング画像）となる。このような非線形顕微鏡の１つに、非線形過程としてコヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）を利用したＣＡＲＳ顕微鏡がある（特許文献１等を参照）。

特開２００９−４７４３５号公報

しかしながら従来のＣＡＲＳ顕微鏡では、ＣＡＲＳ過程による信号（ＣＡＲＳ信号）と共に、ＣＡＲＳ信号と同じ波長のノイズ信号も発生するため、セクショニング画像のコントラストが低い（バックグラウンドノイズが大きい）という問題がある。

そこで本発明は、セクショニング画像を高コントラストに取得することのできる非線形顕微鏡及び非線形観察方法を提供することを目的とする。

本発明を例示する非線形顕微鏡の一態様は、観察対象物中の特定種類の分子に非線形光学過程による特定波長の光を生起させるためのレーザ光を生成する生成手段と、前記生成手段が生成した前記レーザ光を集光して前記観察対象物の観察対象面上にレーザスポットを形成する集光手段と、前記観察対象面上に形成される前記レーザスポットを、面内位置のずれた１対のレーザスポットに分離する分離手段と、前記１対のレーザスポットの一方で生起した前記特定波長の光と他方で生起した前記特定波長の光との間の位相ズレを示す信号を生成する検出手段と、前記１対のレーザスポットで前記観察対象面上を走査しながら前記検出手段が生成する信号を繰り返し取り込むことにより、前記観察対象面における前記信号の分布を計測する制御手段とを備える。

また、本発明を例示する非線形観察方法の一態様は、観察対象物中の特定種類の分子に非線形光学過程による特定波長の光を生起させるためのレーザ光を生成する生成手順と、前記生成手順で生成された前記レーザ光を集光して前記観察対象物の観察対象面上にレーザスポットを形成する集光手順と、前記観察対象面上に形成される前記レーザスポットを、面内位置のずれた１対のレーザスポットに分離する分離手順と、前記１対のレーザスポットの一方で生起した前記特定波長の光と他方で生起した前記特定種類の光との間の位相ズレを示す信号を生成する検出手順と、前記１対のレーザスポットで前記観察対象面上を走査しながら前記検出手順で生成される信号を繰り返し取り込むことにより、前記観察対象面における前記信号の分布を計測する制御手順とを含む。

本発明によれば、セクショニング画像を高コントラストに取得することのできる非線形顕微鏡及び非線形観察方法が実現する。

第１実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。 空間光位相変調素子１６１、１６２の機能を説明する図である。 ＣＡＲＳ過程及び非共鳴過程を説明する図である。 点像振幅分布φ１、φ２、φｒを説明する模式図である。 点像Ｓｔ、Ｓｔ’とダブルスリット板２３との関係を説明する図である。 干渉縞Ｓｐとピンホールアレイ板２５との関係を説明する図である。 第２実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。 点像Ｓｔ、Ｓｔ’とピンホール板２２５との関係を説明する図である。 点像Ｓｔ、Ｓｔ’の強度分布を説明する模式図である。 第３実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態を説明する。本実施形態は、ＣＡＲＳ顕微鏡の実施形態である。

図１は、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。図１に示すとおり、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡には、レーザ光源１１と、波長可変の光パラメトリック発振器（ＯＰＯ：optical parametric oscillator）１２と、ビームエキスパンダ１３と、ダイクロイックミラー１４と、全反射ミラー１５１、１５２と、空間光位相変調素子１６１、１６２と、ダイクロイックミラー１７と、第１対物レンズ１８と、透過型の試料ステージ１９と、第２対物レンズ２０と、波長選択フィルタ２１と、集光レンズ２２と、ダブルスリット板２３と、コリメートレンズ２４と、ピンホールアレイ板２５と、光検出器２６と、制御部３０とが備えられる。

試料ステージ１９には、透明な培養容器１０が配置される。培養容器１０には生体細胞を含んだ透明な培養液が収容されており、生体細胞に含まれる特定種類の分子（タンパク質、脂質など）が観察対象となる。以下、観察対象となる特定種類の分子を「観察対象分子」と称す。

レーザ光源１１は、パルスレーザ光を発振するパルスレーザ光源であって、レーザ光源１１が発振するパルスレーザ光のパルス形状は、適切な形状に設定されている。パルス形状の設定により、後述するレーザスポットの中心部分のエネルギー密度は、観察対象分子にＣＡＲＳ信号を発生させるのに適したエネルギー密度となる。

光パラメトリック発振器１２は、レーザ光源１１が発振したパルスレーザ光により、光周波数の互いに異なる（すなわち波長の互いに異なる）２種類のパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２を生成し、それらのパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２を同軸で出射する。なお、この光パラメトリック発振器１２は、外部から与えられた電気信号に応じて、パルスレーザ光Ｌ１の光周波数ω１と、パルスレーザ光Ｌ２の光周波数ω２との組み合わせを変更することができる。よって、光パラメトリック発振器１２は、観察対象分子の変更に対応できる。通常、光パラメトリック発振器１２が出射するパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２の光周波数ω１、ω２の組み合わせは、観察対象分子の固有振動数ωｖに対してωｖ＝ω１−ω２の式を満たすように設定される。

ビームエキスパンダ１３は、光パラメトリック発振器１２から射出したパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２を、径の太い平行光束に変換する。

ダイクロイックミラー１４は、ビームエキスパンダ１３を射出したパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２を互いに分離する。ここでは、ダイクロイックミラー１４の反射／透過波長特性は、パルスレーザ光Ｌ１と同じ光周波数（光周波数ω１）の光を反射し、かつパルスレーザ光Ｌ２と同じ光周波数（光周波数ω２）の光を透過するような特性に設定されているものとする。

ダイクロイックミラー１４を反射したパルスレーザ光Ｌ１は、全反射ミラー１５１及び空間光位相変調素子１６１を介してダイクロイックミラー１７へ入射し、ダイクロイックミラー１４を透過したパルスレーザ光Ｌ２は、全反射ミラー１５２及び空間光位相変調素子１６２を介してダイクロイックミラー１７へ入射する。

空間光位相変調素子１６１、１６２の各々は、光路長分布が非一様な位相板（媒質厚さ分布が非一様な位相板）であって、その光路長分布の非一様性により、入射光束の波面（位相分布）を変形する。ここでは、パルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２の光周波数の組み合わせが可変であるので、空間光位相変調素子１６１、１６２は、外部から与えられた電気信号に応じて光路長分布を変化させることができるものとする。

なお、光路長分布が可変の空間光位相変調素子１６１、１６２の各々としては、例えば、特表２００８−５０４５８３号公報、 特表２００９−５０１９５３号公報、特表２０１０−５０７１１９号公報の何れかに記載されたディジタルレンズが適用可能である。

空間光位相変調素子１６１がパルスレーザ光Ｌ１に与える位相分布は、図２（Ａ）の左側に示すとおりに設定され、空間光位相変調素子１６２がパルスレーザ光Ｌ２に与える位相分布は、図２（Ａ）の右側に示すとおりに設定される。すなわち、空間光位相変調素子１６１は、光軸を含む所定の平面（図２ではＹＺ平面）でパルスレーザ光Ｌ１の波面を空間的に２分割し、かつ、分割波面の一方（プラスＸ側）と他方（マイナスＸ側）との間に位相差πを与える。また、空間光位相変調素子１６２は、前記平面に対応する平面（ＹＺ平面）でパルスレーザ光Ｌ２の波面を空間的に２分割し、分割波面の一方（プラスＸ側）と他方（マイナスＸ側）との間に位相差πを与える。

なお、パルスレーザ光Ｌ１とパルスレーザ光Ｌ２との間では光周波数が異なるので、空間光位相変調素子１６１と空間光位相変調素子１６２との間では、入射光に与える位相分布が互いに等しくとも、光路長分布（プラスＸ側の光路長とマイナスＸ側の光路長との段差）は互いに異なる。

また、図１には示さなかったが、ダイクロイックミラー１４からダイクロイックミラー１７までのパルスレーザ光Ｌ１の光路長と、ダイクロイックミラー１４からダイクロイックミラー１７までのパルスレーザ光Ｌ２の光路長との少なくとも一方は調節可能であって、ダイクロイックミラー１７へパルスレーザ光Ｌ１が入射するタイミングと、ダイクロイックミラー１７へパルスレーザ光Ｌ２が入射するタイミングとは合致しているものとする。これにより、培養容器１０にパルスレーザ光Ｌ１が入射するタイミングと培養容器１０にパルスレーザ光Ｌ２が入射するタイミングとが合致する。

ダイクロイックミラー１７は、空間光位相変調素子１６１を射出したパルスレーザ光Ｌ１と、空間光位相変調素子１６２を射出したパルスレーザ光Ｌ２とを同軸に統合する。このダイクロイックミラー１７の反射／透過波長特性は、パルスレーザ光Ｌ１と同じ光周波数の光を反射し、かつパルスレーザ光Ｌ２と同じ光周波数の光を透過するような特性に設定されている。

第１対物レンズ１８は、ダイクロイックミラー１７で統合されたパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２を、第１対物レンズ１８の焦点面上に集光する。この焦点面は、培養容器１０の深部の特定層に一致しており、この層が観察対象面となる。以下、この観察対象面上でパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２の照射される部分を「レーザスポット」と称す。

ここで、パルスレーザ光Ｌ１の分割波面には図２（Ａ）の左側に示したとおり位相差πが付与されているため、パルスレーザ光Ｌ１のレーザスポットは、図２（Ｂ）の左側に示すとおり１対のレーザスポットＳ１、Ｓ１’に分離している。また、パルスレーザ光Ｌ２の分割波面にも図２（Ａ）の右側に示したとおり位相差πが付与されているため、パルスレーザ光Ｌ２のレーザスポットも、図２（Ｂ）の右側に示すとおり１対のレーザスポットＳ２、Ｓ２’に分離している。１対のレーザスポットＳ１、Ｓ１’の間では位相がπだけずれており、１対のレーザスポットＳ２、Ｓ２’の間では位相がπだけずれている。

なお、１対のレーザスポットＳ１、Ｓ１’の分離方向は、パルスレーザ光Ｌ１の波面の分割方向（Ｘ方向）に対応しており、１対のレーザスポットＳ２、Ｓ２’の分離方向も、パルスレーザ光Ｌ２の波面の分割方向（Ｘ方向）に対応している。また、１対のレーザスポットＳ１、Ｓ１’の横ズレ量は、第１対物レンズ１８の開口数によって決まる微小距離（例えば数百ｎｍ）であり、１対のレーザスポットＳ２、Ｓ２’の横ズレ量も、第１対物レンズ１８の開口数によって決まる微小距離（例えば数百ｎｍ）である。なお、レーザスポットＳ１、Ｓ１’の各々のサイズは、パルスレーザ光Ｌ１の光周波数ω１によって決まり、レーザスポットＳ２、Ｓ２’の各々のサイズは、パルスレーザ光Ｌ２の光周波数ω２によって決まるので、レーザスポットＳ１、Ｓ１’のサイズとレーザスポットＳ２、Ｓ２’のサイズとは若干異なる。しかし、マイナスＸ側に位置するレーザスポットＳ１、Ｓ２同士はほぼ一致し、プラスＸ側に位置するレーザスポットＳ１’、Ｓ２’同士はほぼ一致する。よって、以下では、マイナスＸ側に位置するレーザスポットＳ１、Ｓ２を纏めて「レーザスポットＳ」と称し、プラスＸ側に位置するレーザスポットＳ１’、Ｓ２’を纏めて「レーザスポットＳ’」と称す（図２（Ｃ）参照。）。

ここで、上述したとおり、レーザ光源１１の出射パルス形状は適切に設定されているので、図２（Ｃ）に示すとおり、レーザスポットＳの中央部分Ｓｒのエネルギー密度と、レーザスポットＳ’の中央部分Ｓｒ’のエネルギー密度とは、観察対象分子がＣＡＲＳ信号を発生するのに適したエネルギー密度となる（但し、図２（Ｂ）、（Ｃ）は模式図なので、実際のスポット形状は、図２（Ｂ）、（Ｃ）のとおりになるとは限らない。）。

よって、レーザスポットＳの中央部分Ｓｒに観察対象分子が存在していれば、その部分ＳｒにおいてＣＡＲＳ過程（図３（Ａ））の生起する可能性があり、レーザスポットＳ’の中央部分Ｓｒ’に観察対象分子が存在していれば、その部分Ｓｒ’においてＣＡＲＳ過程（図３（Ａ））の生起する可能性がある。以下、レーザスポットＳのうちＣＡＲＳ信号の発生しうる部分Ｓｒを「高密度スポットＳｒ」と称し、レーザスポットＳ’のうちＣＡＲＳ信号の発生しうる部分Ｓｒ’を「高密度スポットＳｒ’」と称す。なお、前述したとおり、レーザスポットＳ、Ｓ’の横ズレ量は微小（数百ｎｍ）なので、高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’の横ズレ量も微小である。

ここで、ＣＡＲＳ過程（図３（Ａ））は、次のとおり生起する。すなわち、光周波数ω１を有したパルスレーザ光Ｌ１と光周波数ω２を有したパルスレーザ光Ｌ２は、光周波数（ω１−ω２）を有したうなりを発生させるが、観察対象分子の固有振動数ωｖは、そのうなりの光周波数（ω１−ω２）と等しいため、観察対象分子はうなりに共鳴して励起状態へと移行する。そして、励起状態となった観察対象分子に対して光周波数ω１を有したパルスレーザ光Ｌ１が照射されると、観察対象分子は、（ωｖ＋ω１）に相当するエネルギーを有した中間状態へと移行する。その後、中間状態の観察対象分子が基底状態へ移行する際に、光周波数ωｒ＝２ω１−ω２を有したＣＡＲＳ信号が発生する。

因みに、このＣＡＲＳ過程によると、高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’で発生し得るＣＡＲＳ信号の振幅分布φｒ（Ｘ，Ｙ）（＝観察対象分子の密度が一様であるときにＣＡＲＳ信号が観察対象面に形成する点像振幅分布）は、以下の式で表される。

φｒ（Ｘ，Ｙ）＝｛φ１（Ｘ，Ｙ）｝^２×｛φ２（Ｘ，Ｙ）｝^＊
但し、この式におけるφ１（Ｘ，Ｙ）は、レーザスポットＳ１、Ｓ１’の振幅分布（＝パルスレーザ光Ｌ１が観察対象面に形成する点像振幅分布）であり、φ２（Ｘ，Ｙ）は、レーザスポットＳ２、Ｓ２’の振幅分布（＝パルスレーザ光Ｌ２が観察対象面に形成する点像振幅分布）である。

なお、パルスレーザ光Ｌ１の点像振幅分布φ１（Ｘ）は、例えば図４（Ａ）の左側に示すような２つの点像振幅分布を合成したものであり、パルスレーザ光Ｌ２の点像振幅分布φ２（Ｘ）も、例えば図４（Ａ）の右側に示すような２つの点像振幅分布を合成したものであるので、ＣＡＲＳ信号の点像振幅分布φｒ（Ｘ）は、例えば図４（Ｂ）に示すように、互いに分離した２つの点像振幅分布となる（但し、図４は模式図なので、実際の振幅分布が図４のとおりになるとは限らない。）。

ところで、高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’（図２（Ｃ）参照）の各々では、共鳴過程の１種であるＣＡＲＳ過程（図３（Ａ））だけでなく、非共鳴過程（図３（Ｂ））も生起し得る。この非共鳴過程は、培養液中及び細胞中の水分子に起因するものであって、ノイズ信号の原因となる過程である。

ここで、水分子による非共鳴過程（図３（Ｂ））は次のとおり生起する。すなわち、水分子は、光周波数ω１を有したパルスレーザ光Ｌ１によって２光子励起され、２×ω１に相当するエネルギーを有した中間状態へと移行する可能性がある。その後、中間状態の水分子が基底状態へ移行する際に、光周波数ωｒを有した第１の光と、光周波数ω２を有した第２の光とが発生する。

このうち、第２の光は、ＣＡＲＳ信号と光周波数が異なるため波長選択フィルタ２１でカットすることができるが、第１の光は、ＣＡＲＳ信号と光周波数が同じであるため波長選択フィルタ２１でカットすることができない。しかも、第１の光は、ＣＡＲＳ信号と比較して強度が高く、ＣＡＲＳ信号に対してコヒーレントである。この第１の光が、前述したバックグラウンドノイズとなる。以下、この第１の光を「バックグラウンドノイズ」と称す。

しかしながら、非共鳴過程（図３（Ｂ））とＣＡＲＳ過程（図３（Ａ））との相違により、バックグラウンドノイズとＣＡＲＳ信号との間では、位相が必ずπ／２だけずれるという特徴がある。

本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡は、バックグラウンドノイズに関するこれらの特徴（ＣＡＲＳ信号より強度が高く、ＣＡＲＳ信号とは位相がπ／２だけずれるという特徴）を利用して、ＣＡＲＳ信号をバックグラウンドノイズから分離する。前述したとおりレーザスポットを１対のレーザスポットに分離したのも、ＣＡＲＳ信号をバックグラウンドノイズから分離するためである。

図１に戻り、第２対物レンズ２０は、培養容器１０を挟み第１対物レンズ１８に対向する位置に配置されており、第２対物レンズ２０の光軸は第１対物レンズ１８の光軸に一致し、第２対物レンズ２の焦点は第１対物レンズ１８の焦点に一致している。よって、第２対物レンズ２０は、レーザスポットＳ、Ｓ’から射出する光（パルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２、ＣＡＲＳ信号、バックグラウンドノイズ、第２の光）を捉える。

波長選択フィルタ２１は、第２対物レンズ２０の光射出側に配置され、ＣＡＲＳ信号と同じ光周波数の光を透過し、他の光周波数の光をカットするような特性に設定されている。よって、パルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２及び第２の光は波長選択フィルタ２１でカットされるが、ＣＡＲＳ信号及びバックグラウンドノイズは波長選択フィルタ２１を透過する。

集光レンズ２２は、波長選択フィルタ２１の光射出側に配置されており、集光レンズ２２の光軸は第２対物レンズ２０の光軸に一致している。この集光レンズ２２は、波長選択フィルタ２１を透過した光（ＣＡＲＳ信号及びバックグラウンドノイズ）を、所定面上に向けて集光する。この所定面は、集光レンズ２２及び第２対物レンズ２０に関して観察対象面と光学的に共役な面である。よって、この所定面には、図５（Ａ）に示すような１対の点像Ｓｔ、Ｓｔ’が形成される（なお、図５は模式図なので、点像の実際の形状は図５のとおりになるとは限らない。）。

ダブルスリット板２３は、これら１対の点像Ｓｔ、Ｓｔ’の形成面に配置される。ダブルスリット板２３には、図５（Ｂ）に示すとおり、Ｙ方向に延びる２本のスリット２３ａ、２３ａ’がＸ方向に並べて形成されており、一方のスリット２３ａのＸ方向の形成先は、一方の点像Ｓｔのピーク位置（強度がピークとなる位置であって、点像Ｓｔのほぼ中心）であり、他方のスリット２３ａ’のＸ方向の形成先は、他方の点像Ｓｔ’のピーク位置（強度がピークとなる位置であって、点像Ｓｔ’のほぼ中心）である。また、スリット２３ａ、２３ａ’の各々のスリット幅は十分に狭く設定されており、スリット２３ａを透過した光（ＣＡＲＳ信号及びバックグラウンドノイズからなる混合光）のＸ方向の波面形状と、他方のスリット２３ａ’を透過した光（ＣＡＲＳ信号及びバックグラウンドノイズからなる混合光）のＸ方向の波面形状とは、理想的球面状となる。

コリメートレンズ２４は、ダブルスリット板２３の光射出側に配置され、コリメートレンズ２４の光軸は、集光レンズ２２の光軸に一致し、コリメートレンズ２４の焦点は、集光レンズ２２の焦点に一致している。よって、コリメートレンズ２４は、ダブルスリット板２３の像を無限遠方に形成する。この場合、コリメートレンズ２４の光射出側の所定面（ダブルスリット板２３のフーリエ面）にダブルスリット板２３のフーリエ変換像が形成される。このフーリエ変換像は、例えば図６（Ａ）に模式的に示すような干渉縞Ｓｐであって、この干渉縞ＳｐのＸ軸上の強度分布は正弦波状である。

この干渉縞Ｓｐに寄与したのは、一方のスリット２３ａを通過した光と、他方のスリット２３ａ’を通過した光とである。以下、一方のスリット２３ａを通過して干渉縞Ｓｐに寄与する光を「一方の被干渉光」と称し、他方のスリット２３ａ’を通過して干渉縞Ｓｐに寄与する光を「他方の被干渉光」と称す。

この干渉縞Ｓｐの位相（明暗位置）は、一方の被干渉光と他方の被干渉光との間の位相差によって決まる。

ここで、培養容器１０中に観察対象分子が存在せずに培養液のみが収容されているとき（非観察時）の干渉縞Ｓｐを考える。図６（Ａ）〜（Ｃ）が、非観察時の干渉縞Ｓｐを説明する図である（但し、図６は模式図なので、干渉縞Ｓｐの実際のパターンが図６に示すとおりになるとは限らない。）。

先ず、非観察時には、観察対象分子に起因するＣＡＲＳ信号は発生せず、水分子に起因するバックグラウンドノイズは発生する。

よって、非観察時の干渉縞Ｓｐに寄与する一方の被干渉光は、バックグラウンドノイズのみからなり、他方の被干渉光も、バックグラウンドノイズのみからなる。

よって、非観察時には、これら１対の被干渉光の間では、強度はほぼ等しくなり、位相差はπとなるはずである。

なぜなら、培養容器１０中では水分子の密度分布はほぼ一様なので、１対の高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’の間でも水分子の密度は等しくなり、その結果、１対のバックグラウンドノイズの間で強度は等しくなる。また、１対のレーザスポットＳ、Ｓ’の間には位相差πが付与されているので、１対のバックグラウンドノイズの位相差もπとなる。

したがって、図６（Ｂ）に示すとおり、非観察時の干渉縞Ｓｐのコントラストは十分に高くなり、非観察時の干渉縞Ｓｐの位相は所定位相（例えば光軸上に明部が位置するような位相）となる。

図１に戻り、ピンホールアレイ板２５は、前述した所定面（フーリエ面）に配置される。ピンホールアレイ板２５には、図６（Ｃ）に示すとおり、干渉縞Ｓｐの縞ピッチと同じピッチで複数（例えば３以上）のピンホール２５ａがＸ軸上に配列されている。個々のピンホール２５ａの直径は、縞ピッチの１／２倍以下に設定されており、各ピンホール２５ａの形成先は、図６（Ｃ）に示すとおり、非観察時の干渉縞Ｓｐの各暗部に一致している。よって、非観察時にピンホールアレイ板２５を通過する光の光量は、ほぼゼロとなる。

次に、培養容器１０に培養液と共に観察対象分子も収容されているとき（観察時）の干渉縞Ｓｐを考える。図６（Ｄ）〜（Ｆ）が、観察時の干渉縞Ｓｐを説明する図である。

先ず、観察時には、観察対象分子に起因するＣＡＲＳ信号と、水分子に起因するバックグラウンドノイズとの双方が発生する。

よって、観察時の干渉縞Ｓｐに寄与する一方の被干渉光は、バックグラウンドノイズ及びＣＡＲＳ信号の混合光となり、他方の被干渉光も、バックグラウンドノイズ及びＣＡＲＳ信号の混合光となる。

よって、観察時には、これら１対の被干渉光の間では、強度は等しくならない可能性があり、位相差はπからずれる可能性がある。

なぜなら、培養容器１０中では観察対象分子の密度分布は非一様なので、１対の高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’の間で観察対象分子の密度は等しいとは限らず、その結果、１対のＣＡＲＳ信号の間で強度が等しくなるとは限らない。この場合、一方の被干渉光に対して一方のＣＡＲＳ信号が与える影響（位相遅延量及び振幅変化量）と、他方の被干渉光に対してＣＡＲＳ信号が与える影響（位相遅延量及び振幅変化量）とは一致しない可能性がある。

しかも、これら１対の被干渉光の間では、強度バランスの変化よりも位相差の変化の方が顕著である。

なぜなら、ＣＡＲＳ信号の強度はバックグラウンドノイズの強度と比較して低く、ＣＡＲＳ信号の位相はバックグラウンドノイズの位相よりも必ずπ／２だけずれるので、一方のＣＡＲＳ信号が一方の被干渉光に与える影響は主に位相遅延であり、他方のＣＡＲＳ信号は他方の被干渉光に対して与える影響も主に位相遅延である。このため、１対の被干渉光の間でも、強度バランスの変化よりも位相差の変化の方が顕著となる。

よって、図６（Ｄ）〜（Ｅ）に示すとおり、観察時の干渉縞Ｓｐは、大凡、非観察時の干渉縞Ｓｐ（図６（Ａ）〜（Ｆ））の位相をシフトさせたものに相当する。

したがって、非観察時の干渉縞Ｓｐを基準とした、観察時の干渉縞Ｓｐの位相シフト量さえ検知できれば、一方の被干渉光に対して一方のＣＡＲＳ信号が与えた影響と、他方の被干渉光に対して他方のＣＡＲＳ信号が与えた影響との差、すなわち、１対のＣＡＲＳ信号の差分（＝微分ＣＡＲＳ信号）を、既知とすることができる。

実際、本実施形態の顕微鏡では、複数のピンホールアレイ２５ａの形成先が前述したとおり最適化されているので、図６（Ｅ）、（Ｆ）に示すとおり、観察時にピンホールアレイ板２５を通過する光の光量は、観察時の干渉縞Ｓｐの位相シフト量を表す。

光検出器２６は、ピンホールアレイ板２５の光射出側に配置され、ピンホールアレイ板２５を通過した光の光量を電気信号に変換する受光素子、例えばＰＭＴ（フォトマルチプライヤ）である。よって、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡は、観察時における光検出器２６の出力信号を、微分ＣＡＲＳ信号として使用することができる。

観察時、制御部３０は、光軸と垂直な方向（ＸＹ方向）へ試料ステージ１９を走査しながら、各走査位置において、レーザ光源１１を駆動しパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２を培養容器１０へ照射すると共に、検出器２６から出力信号の取り込みを行い、各走査位置で取り込まれた出力信号の値に基づき１フレームの画像を作成し、不図示のモニタへ表示する。この画像は、微分ＣＡＲＳ信号の観察対象面上の分布（微分ＣＡＲＳ画像）を表す。

以上、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、観察対象面上のレーザスポットを１対のレーザスポットＳ、Ｓ’に分離し、それら１対のレーザスポットＳ、Ｓ７の中央（１対の高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’）からＣＡＲＳ信号と同じ波長で射出する１対の光（１対の混合光）の間の位相ズレに応じて信号を生成する。

したがって、非観察時（バックグラウンドノイズしか発生しないとき）の信号強度を基準とすれば、観察時（バックグラウンドノイズとＣＡＲＳ信号とが共に発生するとき）の信号強度を、微分ＣＡＲＳ信号として使用することができる。この微分ＣＡＲＳ信号は、バックグラウンドノイズの影響を受けないので、ＳＮ比が高い。よって、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡が取得する微分ＣＡＲＳ画像は、バックグラウンドノイズが少なくコントラストの高い画像となる。

また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、１対の被干渉光の間の位相ズレを信号化するために、１対の点像Ｓｔ、Ｓｔ’から１対の理想的球面波を生成し、それら１対の理想的球面波による干渉縞Ｓｐの位相をピンホールアレイ板２５により検出している。この場合、１対の被干渉光の間の位相ズレを、光検出器２６の出力信号に対して強く反映させることができるので、微分ＣＡＲＳ信号のＳＮ比は更に高まる。

また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、レーザスポットを分離するために空間光位相変調素子を使用するので、１対のレーザスポットＳ１、Ｓ１’の間で偏光方向が一致し、１対のレーザスポットＳ２、Ｓ２’の間で偏光方向が一致し、その結果、１対のレーザスポットＳ、Ｓ’各々による分子の励起方向を等しくすることができる。よって、前述した微分ＣＡＲＳ信号には、１対の高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’の間における観察対象分子の密度差が正確に反映される。

なお、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、空間光位相変調素子１６１、１６２の各々として、光路長分布が可変の空間光位相変調素子を使用したが、空間光位相変調素子１６１、１６２の少なくとも一方として、光路長分布が不変の空間光位相変調素子（いわゆる位相板）を使用してもよい。但し、光路長分布が不変の空間光位相変調素子を使用する場合、入射光の波長が変更されるときには、その空間光位相変調素子を、光路長分布の異なる他の空間光位相変調素子に交換する必要がある。

また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、点像Ｓｔ、Ｓｔ’の形成面に配置される絞り部材としてダブルスリット板２３を使用したが、ダブルスリット板２３の代わりに、１対のピンホールを有したダブルピンホール板を使用してもよい。このダブルピンホール板における１対のピンホールの形成先は、点像Ｓｔ、Ｓｔ’の各々のピーク位置であり、１対のピンホールの各々の直径は、ピンホールを透過した光の波面形状が理想的球面状となるよう十分に小さく設定される。

また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、複数のピンホール２５ａの形成先を、非観察時の干渉縞Ｓｐの各暗部に一致させたが、非観察時の干渉縞Ｓｐの各明部に一致させてもよい。因みに、複数のピンホール２５ａの形成先を非観察時の干渉縞Ｓｐの各暗部に一致させた場合、微分ＣＡＲＳ画像は暗視野画像（暗い背景の上に微分ＣＡＲＳ像が明るく写る画像）となるが、複数のピンホール２５ａの形成先を非観察時の干渉縞の各明部に一致させた場合、微分ＣＡＲＳ画像は明視野画像（明るい背景の上に微分ＣＡＲＳ像が暗く写る画像）となる。

また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、干渉縞Ｓｐの形成面に配置される絞り部材としてピンホールアレイ板２５を使用したが、ピンホールアレイ板２５の代わりに、Ｙ方向に延びる複数のスリットをＸ方向に配列したスリットアレイ板を使用してもよい。このスリットアレイ板における複数のスリットの形成先は、非観察時の干渉縞Ｓｐの各暗部又は各明部に設定される。

また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、観察時の干渉縞Ｓｐの基準（非観察時の干渉縞Ｓｐ）として、培養容器１０中に観察対象分子が存在しない場合に形成される干渉縞Ｓｐを使用したが、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡で基準として使用すべき干渉縞は、少なくとも、高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’の間で観察対象分子の密度が等しいときに形成される干渉縞であればよい。すなわち、培養容器１０内で観察対象分子の密度が一様である場合に形成される干渉縞や、観察対象分子の密度がゼロ又は一様である領域にビームスポットＳ、Ｓ’を配置したときに形成される干渉縞を、基準として使用してもよい。

［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態を説明する。本実施形態は、第１実施形態の変形例である。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。

図７は、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。図７において、図１に示したものと同じ要素には、図１における符号と同じ符号を付与した。図１、図７を比較すると明らかなとおり、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡は、第１実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡において、ダブルスリット板２３の代わりにピンホール板２２５を配置し、コリメートレンズ２４及びピンホールアレイ板２５を省略したものである。

ピンホール板２２５の配置先は、ダブルスリット板２３の配置先と同様、１対の点像Ｓｔ、Ｓｔ’の形成面である。ピンホール板２２５には、図８に示すとおり、単一のピンホール２２５ａが形成されており、ピンホール２２５ａの形成先は、一方の点像Ｓｔと他方の点像Ｓｔ’との間のバレー位置（強度がバレーとなる位置であって、点像Ｓｔ、Ｓｔ’の中間点）である。また、ピンホール２２５ａの直径は、点像Ｓｔ、Ｓｔ’の横ズレ量以下に設定されている。

ここで、培養容器１０中に観察対象分子が存在せずに培養液のみが収容されているとき（非観察時）の点像Ｓｔ、Ｓｔ’を考える。図９（Ａ）が、被観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’を説明する図である（但し、図９は模式図なので、点像Ｓｔ、Ｓｔ’の強度分布が図９に示すとおりになるとは限らない。）。

先ず、非観察時には、観察対象分子に起因するＣＡＲＳ信号は発生せず、水分子に起因するバックグラウンドノイズは発生する。

よって、非観察時の一方の点像Ｓｔに寄与する光（一方の結像光）は、バックグラウンドノイズのみからなり、他方の点像Ｓｔ’に寄与する光（他方の結像光）も、バックグラウンドノイズのみからなる。

よって、非観察時には、これら１対の結像光の間では、強度はほぼ等しくなり、位相差はπとなるはずである。

なぜなら、培養容器１０中では水分子の密度分布はほぼ一様なので、１対の高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’の間で水分子の密度は等しくなり、その結果、１対のバックグラウンドノイズの間で強度は等しくなる。また、１対のレーザスポットＳ、Ｓ’の間には位相差πが付与されているので、１対のバックグラウンドノイズの位相差もπとなる。

したがって、図９（Ａ）に示すとおり、非観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’の各々のピーク強度は十分に高くなり、非観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔのバレー強度はほぼゼロとなる（点像Ｓｔ、Ｓｔ’のピーク強度もほぼ等しくなる。）。

したがって、ピンホール２２５ａの配置先を前述したとおり最適化しておけば、非観察時にピンホール板２２５を通過する光の光量は、ほぼゼロとなる。

次に、培養容器１０に培養液と共に観察対象分子も収容されているとき（観察時）の点像Ｓｔ、Ｓｔ’を考える。図９（Ｂ）が、観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’を説明する図である。

先ず、観察時には、観察対象分子に起因するＣＡＲＳ信号と、水分子に起因するバックグラウンドノイズとの双方が発生する。

よって、観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’に寄与する一方の結像光は、バックグラウンドノイズ及びＣＡＲＳ信号の混合光となり、他方の結像光も、バックグラウンドノイズ及びＣＡＲＳ信号の混合光となる。

よって、観察時には、これら１対の結像光の間では、強度は等しくならない可能性があり、位相差はπからずれる可能性がある。

なぜなら、培養容器１０中では観察対象分子の密度分布は非一様なので、１対の高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’の間で観察対象分子の密度は等しいとは限らず、その結果、１対のＣＡＲＳ信号の間で強度が等しくなるとは限らない。この場合、一方の結像光に対して一方のＣＡＲＳ信号が与える影響（位相遅延量及び振幅変化量）と、他方の結像光に対して他方のＣＡＲＳ信号が与える影響（位相遅延量及び振幅変化量）とは一致しない可能性がある。

しかも、これら１対の結像光の間では、強度バランスの変化よりも位相差の変化の方が顕著である。

なぜなら、ＣＡＲＳ信号の強度はバックグラウンドノイズの強度と比較して低く、ＣＡＲＳ信号の位相はバックグラウンドノイズの位相よりも必ずπ／２だけずれるので、一方のＣＡＲＳ信号が結像光に対して与える影響は主に位相遅延であり、他方のＣＡＲＳ信号が他方の結像光に対して与える影響も主に位相遅延である。このため、１対の結像光の間でも、強度バランスの変化よりも位相差の変化の方が顕著となる。

よって、図９（Ｂ）に示すとおり、観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’は、大凡、非観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’（図９（Ａ））のコントラスト（ピーク強度とバレー強度の差）を低下させたものに相当する。

したがって、非観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’を基準とした、観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’ のコントラスト低下量さえ検知できれば、一方の結像光に対してＣＡＲＳ信号が与えた影響と、他方の結像光に対してＣＡＲＳ信号が与えた影響との差、すなわち、１対のＣＡＲＳ信号の差分（＝微分ＣＡＲＳ信号）を、既知とすることができる。

実際、本実施形態の顕微鏡では、ピンホール２２５ａの形成先が前述したとおり最適化されているので、図９（Ｂ）に示すとおり、観察時にピンホール板２２５を通過する光の光量は、観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’のコントラスト低下量を表す。

光検出器２６は、ピンホール板２２５の光射出側に配置され、ピンホール板２２５を通過した光の光量を電気信号に変換する。よって、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡は、観察時における光検出器２６の出力信号を、微分ＣＡＲＳ信号として使用することができる。

したがって、本実施形態の制御部３０は、第１実施形態の制御部３０と同様に各部を制御することにより、微分ＣＡＲＳ画像を取得することができる。

以上、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、１対の結像光の間の位相ズレを信号化するために、１対の点像Ｓｔ、Ｓｔ’のコントラスト（ここでは１対の点像Ｓｔ、Ｓｔ’のバレー強度）をピンホール板２２５により検出している。この場合、微分ＣＡＲＳ信号の感度は、第１実施形態のそれほどは高くないものの、微分ＣＡＲＳ信号の生成に要する光学素子の点数が第１実施形態のそれよりも抑えられるという利点がある。

なお、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、点像Ｓｔ、Ｓｔ’の形成面に配置される絞り部材としてピンホール板を使用したが、ピンホール板の代わりに、Ｙ方向に延びるスリットを有したスリット板を使用してもよい。このスリット板におけるスリットの形成先は、点像Ｓｔ、Ｓｔ’のバレー位置である。

［第３実施形態］
以下、本発明の第３実施形態を説明する。本実施形態は、第１実施形態の変形例である。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。

図１０は、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。図１０において、図１に示したものと同じ要素には、図１における符号と同じ符号を付与した。図１、図１０を比較すると明らかなとおり、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡は、第１実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡において、第１対物レンズ１８及び第２対物レンズ２０の代わりに１つの対物レンズ２００を備え、光スキャナ３１９、ダイクロイックミラー２１０、リレー光学系３１を備え、波長選択フィルタ２１を省略したものである。なお、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の照明方式は、落射照明方式であり、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の走査方式は、光走査型である。

図１０において、ダイクロイックミラー１７には、第１実施形態と同様のパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２が到達する。これらのパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２は、ダイクロイックミラー２１０を透過し、光スキャナ３１９へ入射する。なお、光スキャナ３１９は、Ｘスキャン用のガルバノメータとＹスキャン用のガルバノメータとを有している。

光スキャナ３１９を射出したパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２は、リレー光学系３１を介して対物レンズ２００へ入射する。なお、対物レンズ２００は、第１実施形態の第１対物レンズ１８の機能と第２対物レンズ２０の機能とを兼ねる。また、リレー光学系３１には、光スキャナ３１９の配置先を対物レンズ２００の瞳面と共役に結ぶ働きがある。

対物レンズ２００へ入射したパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２は、対物レンズ２００の焦点面（観察対象面）上に第１実施形態と同様のレーザスポットＳ、Ｓ’を形成する。前述した光スキャナ３１９が駆動されると、観察対象面上をレーザスポットＳ、Ｓ’が二次元走査する。但し、その走査範囲は、対物レンズ２００の視野内に収められる。

レーザスポットＳ、Ｓ’から射出する光（ＣＡＲＳ信号、バックグラウンドノイズ、第２の光、パルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２）は、レーザスポットＳ、Ｓ’を形成したレーザ光Ｌ１、Ｌ２と同じ光路を逆に辿り、対物レンズ２００及び光スキャナ３１９を介してダイクロイックミラー２１０へ入射する。

ダイクロイックミラー２１０の特性は、ＣＡＲＳ信号と同じ光周波数の光を反射し、他の光周波数の光を反射する特性に設定されている。よって、光スキャナ３１９からダイクロイックミラー２１０へ入射したＣＡＲＳ信号及びバックグラウンドノイズはダイクロイックミラー２１０を反射し、それ以外の光はダイクロイックミラー２１０を透過する。

ダイクロイックミラー２１０を反射した光（ＣＡＲＳ信号及びバックグラウンドノイズ）は、集光レンズ２２、ダブルスリット板２３、コリメートレンズ２４、ピンホールアレイ板２５を介して光検出器２６へ入射する。なお、集光レンズ２２から光検出器２６までの構成は、第１実施形態のそれと同じである。

よって、本実施形態の制御部３０は、試料ステージ１９を走査する代わりに光スキャナ３１９を駆動するだけで、観察対象面をレーザスポットＳ、Ｓ’で二次元走査することができる。したがって、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡も、第１実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡と同様の効果を得ることができる。

［その他］
なお、第３実施形態は、第１実施形態の変形例であるが、第２実施形態を同様に変形してもよい。

また、上述した何れかの実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、空間光位相変調の対象（スポットの分離対象）を、２種類のパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２の双方としたが、一方のみとしてもよい。

また、上述した何れかの実施形態の非線形顕微鏡は、非線形過程としてＣＡＲＳ過程を利用したが、他の非線形過程を利用してもよい。他の非線形過程とは、例えば、二光子蛍光、第２高調波（ＳＨＧ）、第３高調波（ＴＨＧ）、コヒーレントストークスラマン散乱（ＣＳＲＳ）、４波混合、和周波発生などである。

１１…レーザ光源、１２…光パラメトリック発振器、１３…ビームエキスパンダ、１４…ダイクロイックミラー、１５１、１５２…全反射ミラー、１６１、１６２…空間光位相変調素子、１７…ダイクロイックミラー、１８…第１対物レンズ、１９…透過型の試料ステージ１９、２０…第２対物レンズ、２１…波長選択フィルタ、２２…集光レンズ、２３…ダブルスリット板、２４…コリメートレンズ、２５…ピンホールアレイ板、２６…光検出器、３０…制御部

Claims (6)

1. 観察対象物中の特定種類の分子に非線形光学過程による特定波長の光を生起させるためのレーザ光を生成する生成手段と、
   前記生成手段が生成した前記レーザ光を集光して前記観察対象物の観察対象面上にレーザスポットを形成する集光手段と、
   前記観察対象面上に形成される前記レーザスポットを、面内位置のずれた１対のレーザスポットに分離する分離手段と、
   前記１対のレーザスポットの一方で生起した前記特定波長の光と他方で生起した前記特定波長の光との間の位相ズレを示す信号を生成する検出手段と、
   前記１対のレーザスポットで前記観察対象面上を走査しながら前記検出手段が生成する信号を繰り返し取り込むことにより、前記観察対象面における前記信号の分布を計測する制御手段と、
   を備えることを特徴とする非線形顕微鏡。
2. 請求項１に記載の非線形顕微鏡において、
   前記検出手段は、
   前記１対のレーザスポットで発生した前記特定波長の光により前記１対のレーザスポットの像である１対の点像を形成する形成する結像光学系と、
   前記１対の点像の形成面に配置され、前記１対の点像の各々から理想的球面波を生成する第１絞り部材と、
   前記第１絞り部材が生成した１対の理想的球面波が成す干渉縞の形成面に配置され、前記干渉縞の縞周期と同じ周期で複数の開口部を配列した第２絞り部材と、
   前記第２絞り部材を通過した前記特定波長の光の光量を検出する光検出器と
   を備えることを特徴とする非線形顕微鏡。
3. 請求項１に記載の非線形顕微鏡において、
   前記検出手段は、
   前記１対のレーザスポットで発生した前記特定波長の光により前記１対のレーザスポットの像である１対の点像を形成する結像光学系と、
   前記１対の点像の形成面に配置され、前記１対の点像のバレー位置に開口部を配置した絞り部材と、
   前記絞り部材を通過した前記特定波長の光の光量を検出する光検出器と
   を備えることを特徴とする非線形顕微鏡。
4. 請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の非線形顕微鏡において、
   前記分離手段は、
   前記観察対象面に向かう前記レーザ光の波面を空間的に分割し、分割波面の一方及び他方の間に位相差πを付与する空間光位相変調素子である
   ことを特徴とする非線形顕微鏡。
5. 請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の非線形顕微鏡において、
   前記レーザ光には、波長の異なる２種類のレーザ光が含まれ、
   前記２種類のレーザ光の波長の組み合わせは、前記観察対象物に含まれる特定種類の分子にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光学過程を生起させるための組み合わせに設定される
   ことを特徴とする非線形顕微鏡。
6. 観察対象物中の特定種類の分子に非線形光学過程による特定波長の光を生起させるためのレーザ光を生成する生成手順と、
   前記生成手順で生成された前記レーザ光を集光して前記観察対象物の観察対象面上にレーザスポットを形成する集光手順と、
   前記観察対象面上に形成される前記レーザスポットを、面内位置のずれた１対のレーザスポットに分離する分離手順と、
   前記１対のレーザスポットの一方で生起した前記特定波長の光と他方で生起した前記特定種類の光との間の位相ズレを示す信号を生成する検出手順と、
   前記１対のレーザスポットで前記観察対象面上を走査しながら前記検出手順で生成される信号を繰り返し取り込むことにより、前記観察対象面における前記信号の分布を計測する制御手順と、
   を含むことを特徴とする非線形観察方法。
   

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