JP2012044994A - 血管内皮増殖因子の可溶性インヒビターおよびその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】可溶性ニューロピリン（ｓＮＰ）タンパク質、および該タンパク質をコードするｃＤＮＡの提供。
【解決手段】ＶＥＧＦ165に特異的に結合し、そしてＶＥＧＦ165媒介ＨＵＶＥＣ増殖を減少させる、単離された可溶性ニューロピリン、ＮＰ−１およびＮＰ−２。また、ｓＮＰをコードするポリヌクレオチド、および該ヌクレオチドを有する宿主細胞。更に、該ｓＮＰを含むＶＥＧＦ関連疾患用の薬学的組成物。
【選択図】なし

Description

（連邦政府委託研究に関する陳述）
本明細書に記載される研究は、一部、国立衛生研究所助成金ＣＡ３７３９２およびＣＡ４５５４８により支援された。米国政府は、本発明に対して特定の権利を有する。

（発明の分野）
本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に関する。より詳細には、本発明は、ＶＥＧＦの可溶性インヒビターおよびＶＥＧＦに関連する障害の処置におけるそれらインヒビターの使用に関する。

（発明の背景）
血管は、酸素および栄養分が生組織に供給され、そして老廃物が生組織から除去される手段である。新脈管形成とは、新たな血管を形成するプロセスをいう。例えば、ＦｏｌｋｍａｎおよびＳｈｉｎｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１０９３１−１０９３４（１９９２）、Ｄｖｏｒａｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４、１２７５−１２７８（１９９１）による総説を参照のこと。従って、適切な場合には、新脈管形成は重要な生物学的プロセスである。それは、生殖、発生、および創傷修復に必須である。しかし、不適切な新脈管形成は、重篤なネガティブな結果を有し得る。例えば、多くの固形腫瘍は新脈管形成の結果として血管化されて初めて、それらの腫瘍は、十分な酸素および栄養分の供給を有し、そのことによって腫瘍が急速に増殖しそして転移し得る。新脈管形成の速度の適切な平衡状態での維持は、機能の範囲に対して重要であるから、それは、健康を維持するために慎重に調節されなければならない。新脈管形成プロセスは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のような、マイトジェンにより活性化される内皮細胞（ＥＣ）から分泌されるプロテアーゼによる、基底膜の分解から始まると考えられる。その細胞は、移動しそして増殖し、固形内皮細胞の出芽の形成を支質の空間内へもたらし、次いで血管ループが形成され、そして毛細管が接着結合の形成および新たな基底膜の沈着を伴い発生する。

成体において、内皮細胞の増殖速度は、代表的に、身体の他の細胞型と比べて低い。これらの細胞の代謝回転時間は、１０００日を超え得る。新脈管形成が急速な増殖を生じる生理学的例外は、代表的には、女性の生殖系および創傷治癒の間に見出されるように、緊密な調節下で起こる。

新脈管形成の速度は、微小血管増殖のポジティブレギュレーターとネガティブレギュレーターとの間の局所的な平衡状態での変化を含む。血管新生増殖因子の治療的意味は、２０年以上前に、Ｆｏｌｋｍａｎおよび共同研究者により最初に記載された（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２８５：１１８２−１１８６（１９７１））。体が新脈管形成の少なくともいくつかの制御を失う場合、異常な新脈管形成が起こり、過度または不十分な血管増殖のいずれかを生じる。例えば、潰瘍、発作、および心臓発作のような状態は、自然治癒に正常に必要とされる新脈管形成の欠如から生じ得る。対照的に、過度の血管増殖は、腫瘍増殖、腫瘍拡散、失明、乾癬、および慢性関節リウマチを生じ得る。

従って、より高程度の新脈管形成が望ましい場合の例（血液循環の増加、創傷治癒、および潰瘍治癒）が存在する。例えば、最近の研究では、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ−Ｍｉｗａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７：１４０１−１４０３（１９９２）およびＢａｆｆｏｕｒら、Ｊ Ｖａｓｃ Ｓｕｒｇ、１６：１８１−９１（１９９２））、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）（Ｐｕら、Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ、５４：５７５−８３（１９９３））ならびに、より最近では、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような、心筋虚血および後肢虚血の動物モデルにおける側副動脈の発生を促進および／または増強させるための組換え血管新生増殖因子の使用の可能性が確証された（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９０：２２８−２３４（１９９４）およびＴａｋｅｓｈｉｔａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、９３：６６２−７０（１９９４））。

逆に、新脈管形成の阻害が望ましい場合の例も存在する。例えば、多くの疾患は、制御されない持続的な新脈管形成によりもたらされ、また、それらは時々、「新生血管形成」といわれる。関節炎において、新たな毛細血管は関節に侵入し、そして軟骨を破壊する。糖尿病において、新たな毛細血管は硝子体に侵入し、出血し、失明を引き起こす。眼球の新生血管形成は、失明の最も通常の原因である。腫瘍の増殖および転移は、新脈管形成依存性である。腫瘍は、腫瘍自身が増殖するために、新たな毛細血管の増殖を継続的に刺激しなければならない。

ＶＥＧＦが、新脈管形成の主要なレギュレーターであり得るという、増大する証拠が存在する（Ｆｅｒｒａｒａら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．、１３、１８−３２（１９９２）；Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、３、６９９−７０２（１９９３）；Ｆｅｒｒａｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｊｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１６１、８５１−８５８（１９８９）に総説される）。ＶＥＧＦは、初めに、濾胞星状（ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｓｔｅｌｌａｔｅ）細胞の馴化培地から（Ｆｅｒｒａｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｊｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１６１、８５１−８５８（１９８９）、そして種々の腫瘍細胞株から（Ｍｙｏｋｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５８１９−５８２３（１９９１）；Ｐｌｏｕｅｔら、ＥＭＢＯ．Ｊ．、８：３８０１−３８０６（１９９１））精製された。ＶＥＧＦは、同時にＵ９３７細胞の馴化培地から精製された血管浸透性のレギュレーターである、血管浸透因子と同一であることが見出された（Ｋｅｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１３０９−１３１２（１９８９））。ＶＥＧＦは、インビトロでは内皮細胞（ＥＣ）に対する特異的マイトジェンであり、インビボでは強力な血管新生因子である。ＶＥＧＦの発現は、胚形成および女性の生殖周期の間に血管新生を受ける組織において、上方調節される（Ｂｒｉｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１１４：５２１−５３２（１９９２）；Ｓｈｗｅｉｋｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９１：２２３５−２２４３（１９９３））。高レベルのＶＥＧＦは、正常組織では発現されないが、腫瘍誘導性低酸素に応答して、種々の型の腫瘍で発現される（Ｓｈｗｅｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４３−８４６（１９９２）；Ｄｖｏｒａｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４：１２７５−１２７８（１９９１）；Ｐｌａｔｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５３：５８２２−５８２７；Ｉｋｅａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：１９７６１−１９７６６（１９８６））。ＶＥＧＦに対して指向されるモノクローナル抗体を用いる腫瘍の処置は、腫瘍の新脈管形成の抑制に起因して、腫瘍質量の劇的な減少を生じた（Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３８２：８４１−８４４（１９９３））。ＶＥＧＦは、新生血管形成に関与する多くの病理学的状態およびプロセスにおいて原則的な役割を果すようである。従って、罹患した組織におけるＶＥＧＦ発現の調節は、ＶＥＧＦ誘導性の新生血管形成／新脈管形成の処置または予防において、鍵であり得る。

ＶＥＧＦは、８つのエキソンを含む単一の遺伝子から選択的スプライシングにより産生される多くの異なるアイソフォームで存在している（Ｆｅｒｒａｒａら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．、１３：１８−３２（１９９２）；Ｔｉｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、８０６：１１９４７−１１９５４（１９９１）；Ｆｅｒｒａｒａら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏ Ｍｅｄ．、３：２４４−２５０（１９９３）；Ｐｏｌｔｅｒａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：７１５１−７１５８（１９９７））。ヒトＶＥＧＦアイソフォームは、各々が活性型ホモダイマーを作製し得る、１２１、１４５、１６５、１８９、および２０６アミノ酸のモノマーからなる（Ｐｏｌｔｅｒａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７２：７１５１−７１５８（１９９７）；Ｈｏｕｃｋら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、８：１８０６−１８１４（１９９１））。ＶＥＧＦ₁₂₁およびＶＥＧＦ₁₆₅アイソフォームが、最も豊富である。ＶＥＧＦ₁₂₁は、ヘパリンに結合せず、そして培養培地に完全に分泌される唯一のＶＥＧＦアイソフォームである。ＶＥＧＦ₁₆₅は、それがヘパリンおよび細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合し、そして部分的に培養培地に放出されるのみであるという点で、ＶＥＧＦ₁₂₁と機能的に異なる（Ｈｏｕｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４７：２８０３１−２８０３７（１９９２）；Ｐａｒｋら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４：１３１７−１３２６（１９９３））。残りのアイソフォームは、細胞表面および細胞外マトリックス質ＨＳＰＧに全体的に関与する（Ｈｏｕｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４７：２８０３１−２８０３７（１９９２）；Ｐａｒｋら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４：１３１７−１３２６（１９９３））。

ＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１および／またはＦｌｔ−１は、ほとんどＥＣにより発現される（Ｔｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１８７：１５７９−１５８６（１９９２）；Ｓｈｉｂｕｙａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、５：５１９−５２４（１９９０）；Ｄｅ Ｖｒｉｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５：９８９−９９１（１９９２）；Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８７：６００３−６０９６（１９９２）；Ｊａｋｅｍａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８９：２４４−２５３（１９９２））。分裂促進性、走化性および形態学的変化の誘導のような、ＶＥＧＦ活性は、Ｆｌｔ−１ではなくＫＤＲ／Ｆｌｋ−１により媒介されるようである（たとえ、両方のレセプターが、ＶＥＧＦの結合の際にリン酸化を受けるとしても）（Ｍｉｌｌａｕｅｒら、Ｃｅｌｌ、７２：８３５−８４６（１９９３）；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：２６９８８−２６９９５（１９９４）；Ｓｅｅｔｈａｒａｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１０：１３５−１４７（１９９５）；Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、７：１３１−１３８（１９９６））。最近、Ｓｏｋｅｒらは、ＥＣおよび乳癌由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１（２３１）細胞のような種々の腫瘍由来の細胞株で発現される、新規なＶＥＧＦレセプターを同定した（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：５７６１−５７６７（１９９６））。このレセプターは、ＶＥＧＦアイソフォームがエキソン７にコードされる部分を含むことを必要とする。例えば、ＶＥＧＦ₁₂₁およびＶＥＧＦ₁₆₅の両方は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１およびＦｌｔ−１に結合するが、ＶＥＧＦ₁₆₅のみが、その新規なレセプターに結合する。従って、これは、アイソフォーム特異的レセプターであり、ＶＥＧＦ₁₆₅レセプター（ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ）と名付けられた。それはまた、１８９および２０６アイソフォームに結合する。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒは、約１３０ｋＤａの分子量を有し、そしてそれは、約２×１０^-10ＭのＫｄで、ＶＥＧＦ₁₆₅に結合する（対してＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対しては、約５×１０^-12Ｍで結合する）。構造機能解析において、ＶＥＧＦ₁₆₅は、ＶＥＧＦ₁₂₁に存在しないエキソン７にコードされるドメインを介してＶＥＧＦ₁₆₅Ｒに結合することが直接示された（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：５７６１−５７６７（１９９６））。しかし、そのレセプターの機能は不明であった。

新脈管形成疾患の現在の処置は、不適切である。連続性の新脈管形成を防止する薬剤（例えば、薬物（ＴＮＰ−４７０））、モノクローナル抗体、アンチセンス核酸およびタンパク質（アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）およびエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ））が、現在試験されている。Ｂａｔｔｅｇａｙ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、７３、３３３−３４６（１９９５）；Ｈａｎａｈａｎら、Ｃｅｌｌ、８６、３５３−３６４（１９９６）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３，１７５７−１７６３（１９９５）を参照のこと。抗新脈管形成タンパク質を用いた予備的な結果は有望だが、新規な抗新脈管形成治療の開発のために、新脈管形成に関与するリガンドおよびレセプターをコードする遺伝子を、同定する必要が依然存在する。

（発明の要旨）
本発明者らは、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ遺伝子（配列番号１）をコードするｃＤＮＡを単離し、そしてそのレセプターのアミノ酸配列（配列番号２）を推定した。本発明者らは、この新規なＶＥＧＦレセプターが、Ｆｌｔ−１またはＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に構造的に関係なく、そして内皮細胞だけでなく、非内皮細胞（驚くことに腫瘍細胞を含む）によっても、発現されるということを発見した。
したがって、本発明は以下を提供する。
（１） ＶＥＧＦ₁₆₅に特異的に結合し、そしてＶＥＧＦ₁₆₅媒介ＨＵＶＥＣ増殖を減少させる、単離された可溶性ニューロピリン。
（２） 前記ニューロピリンが、ニューロピリン−１またはニューロピリン−２である、項目１に記載の可溶性ニューロピリン。
（３） 前記ニューロピリンが、ニューロピリン−１であり、そして配列番号２のアミノ酸配列か、またはＶＥＧＦ₁₆₅媒介ＨＵＶＥＣ増殖を減少させるそのフラグメントを包含する、項目２に記載の可溶性ニューロピリン。
（４） 前記ニューロピリンが、ニューロピリン−２であり、そして配列番号４のアミノ酸配列か、またはＶＥＧＦ₁₆₅媒介ＨＵＶＥＣ増殖を減少させるそのフラグメントを包含する、項目２に記載の可溶性ニューロピリン。
（５） 前記ニューロピリンが、ニューロピリン−１であり、そして配列番号６のアミノ酸配列を包含する、項目２に記載の可溶性ニューロピリン。
（６） 前記ニューロピリンが、ニューロピリン−２であり、そして配列番号８のアミノ酸配列を包含する、項目２に記載の可溶性ニューロピリン。
（７） 配列番号２のアミノ酸２２７〜５８７か、あるいはＶＥＧＦ₁₆₅媒介ＨＵＶＥＣ増殖を減少させるそのフラグメントまたは相同体を包含する、単離された可溶性ニューロピリン−１。
（８） 配列番号４のアミノ酸２７７〜５９４か、あるいはＶＥＧＦ₁₆₅媒介ＨＵＶＥＣ増殖を減少させるそのフラグメントまたは相同体を包含する、単離された可溶性ニューロピリン−２。
（９） 項目１〜８に記載の可溶性ニューロピリンおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
（１０） ＶＥＧＦ₁₆₅に特異的に結合し、そしてＶＥＧＦ媒介ＨＵＶＥＣ増殖を減少させる、可溶性ニューロピリンをコードする単離されたポリヌクレオチド。
（１１） 前記ニューロピリンが、ニューロピリン−１またはニューロピリン−２である、項目１０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１２） 前記ニューロピリンが、配列番号２のアミノ酸配列２２７〜５８７か、あるいはＶＥＧＦ₁₆₅媒介ＨＵＶＥＣ増殖を減少させるそのフラグメントまたは相同体を包含する、項目１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１３） 前記ニューロピリンが、配列番号４のアミノ酸配列２７７〜５９４か、あるいはＶＥＧＦ₁₆₅媒介ＨＵＶＥＣ増殖を減少させるそのフラグメントまたは相同体を包含する、項目１２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１４） 前記ニューロピリンが、ニューロピリン−１であり、そして配列番号６のアミノ酸配列を包含する、項目１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１５） 前記ニューロピリンが、ニューロピリン−２であり、そして配列番号８のアミノ酸配列を包含する、項目１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１６） 配列番号５または配列番号７のヌクレオチド配列を有する、項目１０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１７） 項目１０〜１６に記載のポリヌクレオチドを含有する、ベクター。
（１８） 項目１７に記載のベクターを含有する、宿主細胞。
（１９） 前記キャリアが、皮膚への局所的な適用に対して受容可能である、項目９に記載の薬学的組成物。
（２０） 前記キャリアが、眼への適用に対して受容可能である、請求項９に記載の薬学的組成物。
（２１） 前記組成物が、ＶＥＧＦに関連する疾患または障害を有する被験体を処置する方法に使用するものである、項目９に記載の薬学的組成物。
（２２） 前記ＶＥＧＦに関連する疾患または障害が、転移、不適切な新脈管形成、慢性炎症、糖尿病性網膜症、および関節炎からなる群より選択される、項目２１に記載の薬学的組成物。
（２３） 前記疾患または障害が、固形腫瘍である、項目２１に記載の薬学的組成物。
（２４） 前記組成物が、ニューロピリンを発現する腫瘍を処置する方法において使用するためのものである、項目９に記載の薬学的組成物。
（２５） ＶＥＧＦに関連する疾患または障害を処置するための医薬の調製における、項目１０に記載の単離されたポリヌクレオチドの使用。
（２６） ＶＥＧＦに関連する疾患または障害を処置するための医薬の調製における、項目１〜８に記載の単離された可溶性ニューロピリンの使用。

ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒの機能の確認において、本発明者らはさらに、このレセプターが、ニューロン細胞誘導の細胞表面媒介物として同定されたことを発見し、そしてニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）と呼んだ（Ｋｏｌｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ ９０：７５３−７６２（１９９７））。本発明者らは、このレセプターをＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１またはＮＰ−１という。

ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｃＤＮＡの発現クローニングに加え、本発明者らは、その推定アミノ酸配列が、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１のアミノ酸配列と４７％の相同性であり、そして最近クローン化されたラットニューロピリン−２（ＮＰ−２）（Ｋｏｌｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ ９０、７５３−７６２（１９９７））と９０％を超えて相同である、別のヒトｃＤＮＡクローンを単離した。

本発明者らの結果は、これらのニューロピリンが内皮細胞および腫瘍細胞（乳房、前立腺、および黒色腫を含む）の両方により発現されることを示す（図１８）。本発明者らは、ＫＤＲおよびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の両方を発現する内皮細胞が、ＫＤＲのみを発現する内皮細胞と比べた場合、ＶＥＧＦ₁₂₁でなく、ＶＥＧＦ₁₆₅に対して増大された走化性で反応することを示した。理論に縛られることを望まないが、本発明者らは、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１は、内皮細胞において、ＫＤＲに対するコレセプター（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として細胞の運動性を媒介するために機能すると考えている。

本発明者らはまた、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー運動性アッセイにおいて、ＶＥＧＦ₁₆₅が、用量応答様式で、２３１乳癌細胞の運動性を刺激することを示した（図１５Ａ）。ＶＥＧＦ₁₂₁は、これらの細胞の運動性に対する効果を有さなかった（図１５Ｂ）。２３１細胞のような腫瘍細胞は、ＶＥＧＦレセプター、ＫＤＲまたはＦｌｔ−１を発現しないため、理論に縛られることを望まないが、本発明者らは、腫瘍細胞が、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を介してＶＥＧＦ₁₆₅に対して直接的に応答性であると考えている。

本発明者らはまた、Ｄｕｎｎｉｎｇラット前立腺癌細胞の２つの改変体、ＡＴ２．１細胞（低運動性および低転移能のものである）、およびＡＴ３．１細胞（高運動性および高転移性である）を解析した。架橋およびノーザンブロット解析により、ＡＴ３．１細胞が、ＶＥＧＦ₁₆₅に結合可能な、大量のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を発現し、対して、ＡＴ２．１細胞が、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を発現しないことを示す（図１８）。腫瘍切片の免疫染色により、ＡＴ３．１におけるＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の発現は確認されたが、ＡＴ２．１腫瘍においては確認されなかった。さらに、免疫染色により、皮下ＡＴ３．１およびＰＣ３腫瘍において、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を発現する腫瘍細胞が、腫瘍／真皮の境界の侵襲前部で優先的に見出されることが示された。さらに、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を過剰発現するＡＴ２．１細胞の安定なクローンは、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイにおいて運動性を増強した。これらの結果は、ニューロピリンの発現が、新脈管形成および運動性転移性癌細胞に関連し、したがって、抗新脈管形成および抗癌治療に対する重要な標的であることを示す。

本発明者らは、現在、Ｃ末端領域で切断されて可溶性ニューロピリン（ｓＮＰ）外部ドメインを産生する、いくつかのニューロピリンのアイソフォームを同定し、そしてクローン化した（図１９）。ノーザンブロット解析により、いくつかの細胞株および組織が、選択的スプライシングにより明らかに生成された７ｋｂのニューロピリン−１（ＮＰ−１）および７ｋｂのニューロピリン−２（ＮＰ−２）に加えて、類似の転写物を発現することが明らかにされた後に、これらのアイソフォームはクローン化された。インタクトなニューロピリンは、補体成分に相同なａドメイン、凝固因子に相同なｂドメイン、ＭＡＭに相同なｃドメイン、膜貫通ドメイン、および短い４０アミノ酸の細胞質ドメインを有する（Ｋａｗａｋａｍｉ Ａら、（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２９：１−１７）（図１９）。ニューロピリン−１のアイソフォームがクローン化され、それは、ｂドメインのすぐ後でＣ末端が切断されていた。転写の間に、５’スプライス供与体部位の読み過ごしが存在し、そのため、終結に続いてイントロン部分が発現され、その結果、ｃドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、ｂドメインに続く、イントロンの３アミノ酸で置換された。さらに、ニューロピリン−２のアイソフォームがクローン化され、その中では、Ｃ末端部分のｂドメイン、ｃドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインが、そのイントロンの８アミノ酸で置換されていた。切断されたニューロピリン−１のｃＤＮＡは、ＣＯＳ細胞内で発現され、そして馴化培地中のタンパク質を特異的な抗ニューロピリン−１抗体を使用したウエスタンブロットにより解析した（図２０）。切断されたニューロピリン−１ｃＤＮＡのトランスフェクトにより産生された（ベクターコントロールのトランスフェクトでは産生されない）９０ｋＤａのタンパク質は、馴化培地中に見出されたが、溶解産物中では見出されなかった。従って、ニューロピリン−１アイソフォームは、ニューロピリン−１の可溶性形態（ｓＮＰ１）である。

本発明者らはまた、膜近傍ドメインのある部位での切断により、ａ、ｂ、およびｃドメインを含む、操作し切断した可溶化ニューロピリン−１外部ドメインレセプター（ｓＮＰ１ａｂｃと名付けた）を発現させた。

ｓＮＰは、ＶＥＧＦ₁₆₅またはエキソン７（配列番号）を含むＶＥＧＦの任意の形態に結合し得、従って、ニューロピリンとだけでなく、同様にＫＤＲ／Ｆｌｋ−１およびＦｌｋ−１とのＶＥＧＦの相互作用を阻害するために有用である。さらに、ｓＮＰはまた、インタクトなニューロピリンレセプターとの二量体化により細胞内で発現される場合、ドミナントネガティブレセプターとして作用し得る。本発明者らの結果は、ｓＮＰ１タンパク質調製物が、ＰＡＥ／ＮＰ１に対合する¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅結合の、およびＶＥＧＦ媒介性ＨＵＶＥＣ増殖の優れたインヒビターであることを示した（図２１）。

従って、ｓＮＰまたはｓＮＰをコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、ＶＥＧＦおよびＮＰの機能のインヒビターとして有用であり、ＶＥＧＦに関連する疾患，障害、または状態の処置に使用され得る。ｓＮＰはまた、単独で使用され得るか、または例えば、ＶＥＧＦを直接的に拮抗するもの（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、可溶性ＶＥＧＦレセプター細胞外ドメイン）またはＶＥＧＦレセプターに拮抗するもの（例えば、抗ＫＤＲ抗体、ＫＤＲキナーゼインヒビター、ドミナントネガティブなＶＥＧＦレセプター）を含む他の抗ＶＥＧＦ戦略との組合せで使用され得る（Ｐｒｅｓｔａ ＬＧら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）、Ｋｅｎｄａｌｌ ＲＬら、（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２６：３２４−３２８、Ｇｏｌｄｍａｎ ＣＫら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：８７９５−８８００、Ｓｔｒａｗｎ ＬＭら、（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３５４０−３５４５、Ｚｈｕ Ｚら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：３２０９−３２１４、Ｗｉｔｔｅ Ｌら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１７：１５５−１６１）。

ＶＥＧＦに関連する疾患、障害、または状態としては、網膜新生血管形成、血管腫、固形腫瘍増殖、白血病、転移、乾癬、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、子宮内膜病、黄斑変性（ｍｕｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）および未熟児網膜症（ＲＯＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。

さらに、本発明は、選択された組織中の天然に存在する可溶性ニューロピリンの発現についてののスクリーニング方法に関する。発現は、ＲＮＡレベル（イントロン配列に対応する特異的プローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーション）で解析され得るか、またはタンパク質レベル（低分子量のウエスタンブロット検出）で解析され得る。次いで、インタクトで、かつ切断されたニューロピリンアイソフォームの相対的分布が決定され得る。これらの技術は、細胞、組織、および尿のような生物学的液体中のｓＮＰの分布を解析するために使用され得る。ｓＮＰ１およびｓＮＰ２の両方は、インタクトなニューロピリンにおいて存在しないＣ末端のイントロン配列を含む。ｓＮＰ１は、そのｃＤＮＡにおいて、３個のＣ末端イントロンアミノ酸（ＧＩＫ）および２８個のイントロンｂｐを有する。ｓＮＰ２は、そのｃＤＮＡにおいて、８個のＣ末端イントロンアミノ酸（ＶＧＣＳＷＲＰＬ）および１４６個のイントロンｂｐを有する。従って、ｓＮＰ特異的プローブは、インサイチュハイブリダイゼーションのために、そして、インタクトなニューロピリンのバックグラウンドにおける、腫瘍および正常組織中のｓＮＰの分布について分析するために調製され得る。
本発明の他の局面は、以下に開示される。

２３１細胞からのＶＥＧＦ₁₆₅Ｒの精製。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（５ｎｇ／ｍｌ）を２３１細胞のレセプターに結合、かつ、架橋し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した（レーン１）。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒを、Ｃｏｎ ＡおよびＶＥＧＦ₁₆₅アフィニティーカラムクロマトグラフィーで精製し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色で分析した（レーン２）。二本の顕著なバンドが検出され（矢印）、そして別個にＮ末端を配列決定した。これらのＮ末端の１８アミノ酸配列を矢印の右側に示した。公開されたヒトおよびマウスのニューロピリンのＮ末端配列（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、２９、１−１７（１９９５）；ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０、７３９−７５１ １９９７）を以下に示す（配列番号９および１０）。 発現クローニングによるＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ ｃＤＮＡの単離。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅に結合しているＣＯＳ７細胞の顕微鏡写真（暗視野照明）。トランスフェクトされたＣＯＳ７細胞に¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅を結合させ、次いで洗浄、固定し、そして写真乳剤でオーバーレイし、実施例に記載されるようにして現像した。 （２Ａ）ＣＯＳ７細胞を、約３×１０³クローンを示す主要プラスミドプール（２３１細胞ライブラリーの＃５５）でトランスフェクトし、そして第一ラウンドのスクリーニングにおいて、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅に結合している１つのＣＯＳ７細胞を示す。 発現クローニングによるＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ ｃＤＮＡの単離。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅に結合しているＣＯＳ７細胞の顕微鏡写真（暗視野照明）。トランスフェクトされたＣＯＳ７細胞に¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅を結合させ、次いで洗浄、固定し、そして写真乳剤でオーバーレイし、実施例に記載されるようにして現像した。 （２Ｂ）第３ラウンドのスクリーニング後に、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅に結合している、単一の陽性ｃＤＮＡクローン（Ａ２）でトランスフェクトされたいくつかのＣＯＳ７細胞。 ヒトＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の推定アミノ酸配列（配列番号２）。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の読み取り枠（クローンＡ２（６．５ｋｂの完全挿入片サイズ））の推定９２３アミノ酸配列を示す。推定のシグナルペプチド配列（アミノ酸１〜２１）および推定の膜貫通領域（アミノ酸８６０〜８８３）を囲みで示す。Ｎ末端アミノ酸配列決定で得られたアミノ酸配列（図３、アミノ酸２２〜３９）を下線で示す。矢印は、精製したＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１のＮ末端配列とそのｃＤＮＡ配列との比較に基づいて、切断および除去するシグナルペプチドを示している。本明細書で報告したヒトＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の配列は、本発明者らが、Ｇｌｕ₂₆よりもむしろＬｙｓ₂₆、ならびにＧｌｕ₈₅₅よりもむしろＡｓｐ₈₅₅を見い出すという点において、Ｈｅら（ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０、７３９−７５１ １９９７）の報告したものと異なる。しかし、Ｌｙｓ₂₆およびＡｓｐ₈₅₅はマウスおよびラットのＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１において見出される（Ｋｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２９、１〜１７（１９９５）；ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ，Ｃｅｌｌ ９０，７３９〜７５１ １９９７）。 図４Ａおよび４Ｂは、ヒトＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１（配列番号２）およびＮＰ−２（配列番号４）の推定アミノ酸配列の比較を示す。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１およびＮＰ−２の推定した読み取り枠のアミノ酸配列を、ＤＮＡＳＩＳプログラムを使用して並べる。両方の読み取り枠に同一のアミノ酸配列を斜線で示す。２つの配列間の全体の相同性は４３％である。 図４Ａおよび４Ｂは、ヒトＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１（配列番号２）およびＮＰ−２（配列番号４）の推定アミノ酸配列の比較を示す。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１およびＮＰ−２の推定した読み取り枠のアミノ酸配列を、ＤＮＡＳＩＳプログラムを使用して並べる。両方の読み取り枠に同一のアミノ酸配列を斜線で示す。２つの配列間の全体の相同性は４３％である。 ヒトＥＣおよび腫瘍由来細胞株におけるＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１発現のノザンブロット分析。ＨＵＶＥＣ（レーン１）ならびに示されるような腫瘍由来乳ガン、前立腺ガンおよび黒色腫細胞株（レーン２〜８）から調製した全ＲＮＡ試料を、１％アガロースゲルで分離し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎナイロン膜にブロットした。その膜を、³²Ｐ標識したＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｃＤＮＡでプローブし、そしてＸ線フィルムに露光した。ブロットする前にゲルをエチジウムブロマイド染色し、等量のＲＮＡであることを明らかした。約７ｋｂの主要な種のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｍＲＮＡが、いくつかの細胞株で検出された。 成体ヒト組織におけるＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１およびＫＤＲ ｍＲＮＡのノザンブロット分析。多数のヒトｍＲＮＡ試料（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を含む、先に作製したノザンブロット膜を図５に記載したようにして³²Ｐ標識したＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｃＤＮＡでプローブし（上段）、次いで剥がし、そして³²Ｐ標識したＫＤＲ ｃＤＮＡで再プローブした（下段）。 ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１へのＶＥＧＦ₁₆₅結合のスキャッチャード分析。（７Ａ）４８ウェルディッシュ内で、ヒトＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＰＡＥ細胞（ＰＡＥ／ＮＰ−１細胞）のサブコンフルエントの培養物に、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（０．１〜５０ｎｇ／ｍｌ）増加量を加えた。非特異的な結合を、２００倍の過剰の標識されていないＶＥＧＦ₁₆₅との競合により決定した。結合後、細胞を洗浄し、溶解し、そしてγカウンターを使用して細胞に会合する放射活性を決定した。 ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１へのＶＥＧＦ₁₆₅結合のスキャッチャード分析。 （７Ｂ）７Ａに示される結合データを、スキャッチャードの方法によって分析し、そしてＬＩＧＡＮＤプログラム（Ｍｕｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｄｂａｒｄ，１９８０）を用いて最も一致するプロットを得た。ＰＡＥ／ＮＰ−１細胞は、１細胞あたり約３×１０⁵のＶＥＧＦ₁₆₅結合部位を発現し、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅を３．２×１０^-10ＭのＫｄで結合する。 ＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₂₁の、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１および／またはＫＤＲを発現するＰＡＥ細胞への架橋。ＨＵＶＥＣ（レーン１）、ＰＣ３（レーン２）、ＰＡＥ（レーン３および７）、ヒトＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＰＡＥ細胞のクローン（ＰＡＥ／ＮＰ−１）（レーン４および８）、ＫＤＲでトランスフェクトしたＰＡＥ細胞のクローン（ＰＡＥ／ＫＤＲ）（レーン５および９）、およびヒトＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＰＡＥ／ＫＤＲ細胞のクローン（ＰＡＥ／ＫＤＲ／ＮＰ−１）（レーン６および１０）のサブコンフルエント培養物に、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（５ｎｇ／ｍｌ）（レーン１〜６）または¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁（１０ｎｇ／ｍｌ）（レーン７〜１０）を結合させた。この結合は１μｇ／ｍｌのヘパリン存在下で行った。２時間のインキュベートの終了時に、細胞表面に¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦの各アイソフォームを化学的に架橋させた。この細胞を溶解し、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離した。このポリアクリルアミドゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに露光した。実線矢印は¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦおよびＫＤＲを含む放射標識された複合体を示し、白の矢印は¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を含む放射標識された複合体を示す。 ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を一過性に同時発現するＰＡＥ／ＫＤＲ細胞へのＶＥＧＦ₁₆₅の架橋。ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を、「実験手順」に記載したようにｐＣＰｈｙｇｒｏまたはｐＣＰｈｙｇ−ＮＰ−１プラスミドでトランスフェクトし、６ｃｍディッシュ中で３日間増殖させた。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（５ｎｇ／ｍｌ）を、親のＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（レーン１）、ｐＣＰｈｙｇｒｏベクターコントロールでトランスフェクトしたＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（Ｖ）（レーン２）、ｐＣＰｈｙｇ−ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１プラスミドでトランスフェクトしたＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１）（レーン３）、およびＨＵＶＥＣ（レーン４）に結合させ、架橋した。この結合は１μｇ／ｍｌのヘパリン存在下で行った。この細胞を溶解し、図８のようにして６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離した。実線矢印は¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅およびＫＤＲを含む放射標識された複合体を示す。白の矢印は¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を含む放射標識された複合体を示す。 ¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１への結合の阻害は、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＫＤＲへの結合に干渉する。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（５ｎｇ／ｍｌ）を、３５ｍｍのディッシュ中で、ヒトＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＰＡＥ細胞（ＰＡＥ／ＮＰ−１）（レーン１および２）、ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（レーン３および４）、およびヒトＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（ＰＡＥ／ＫＤＲ／ＮＰ−１）（レーン５および１６）のサブコンフルエント培養物に結合させた。この結合は、２５μｇ／ｍｌ ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８の存在下（レーン２、４、および６）、または非存在下（１、３、および５）で行った。ヘパリン（１μｇ／ｍｌ）を各々のディッシュに加えた。２時間のインキュベートの終了時に、細胞表面に¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅を化学的に架橋させた。この細胞を溶解し、図９のようにして６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離した。実線矢印は¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅およびＫＤＲを含む放射標識された複合体を示し、白の矢印は¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を含む放射標識された複合体を示す。 図１１Ａ〜Ｃ。ＶＥＧＦ₁₆₅のＫＤＲへの結合のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１調節に関するモデル。（１１Ａ）ＫＤＲのみを発現する細胞。（１１Ｂ）ＫＤＲおよびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を同時発現する細胞。（１１Ｃ）ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８融合タンパク質存在下でＫＤＲおよびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を同時発現する細胞。 １つのＫＤＲレセプターまたは１つのＫＤＲ−ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１対を上部パネルに示す。いくつかのレセプターを示す拡大図を下部パネルに示す。ＶＥＧＦ₁₆₅は、エキソン４を介してＫＤＲに結合、およびエキソン７を介してＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に結合する（Ｋｅｙｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，５６３８〜５６４６（１９９６ｂ）；Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，５７６１〜５７６７（１９９６））。長方形のＶＥＧＦ₁₆₅分子は、ＫＤＲに効率的に結合しない、最適ではない高次構造を示すが、丸みを帯びたＶＥＧＦ₁₆₅分子は、結合部位により良好に一致する高次構造を示す。ＫＤＲのみを発現する細胞においては、ＶＥＧＦ₁₆₅は最適でない様式でＫＤＲに結合する。ＫＤＲおよびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を同時発現する細胞においては、ＶＥＧＦ₁₆₅のＫＤＲへの結合効率が増強される。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の存在は細胞表面のＶＥＧＦ₁₆₅の濃度を増加し得、その結果、ＫＤＲにより多く増殖因子を提示させ得る。あるいは、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１は、ＫＤＲへのより良好な結合を許容するＶＥＧＦ₁₆₅の高次構造の変化を誘導し得るかまたは、両方が生じ得る。ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８の存在下においては、ＶＥＧＦ₁₆₅のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１への結合は競合的に阻害され、ＶＥＧＦ₁₆₅のＫＤＲへの結合は最適でない様式に戻る。 ヒトＮＰ−２のアミノ酸配列（配列番号４）。 ヒトＮＰ−２のＤＮＡ配列（配列番号３）。 ヒトＮＰ−２のＤＮＡ配列（配列番号３）。 ヒトＮＰ−２のＤＮＡ配列（配列番号３）。 ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）。ドメインが示される。 ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）。ドメインが示される。 ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）。ドメインが示される。 ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）。ドメインが示される。 ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）。ドメインが示される。 ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）。ドメインが示される。 ＭＤＡ ＭＢ ２３１細胞の運動性のＶＥＧＦ₁₆₅刺激。（１５Ａ）ＶＥＧＦ₁₆₅の運動活性の用量応答。（１５Ｂ）ＶＥＧＦ₁₆₅およびｂＦＧＦの両方は運動性を刺激するが、ＶＥＧＦ₁₂₁は刺激しない。 ＭＤＡ ＭＢ ２３１細胞の運動性のＶＥＧＦ₁₆₅刺激。（１５Ａ）ＶＥＧＦ₁₆₅の運動活性の用量応答。（１５Ｂ）ＶＥＧＦ₁₆₅およびｂＦＧＦの両方は運動性を刺激するが、ＶＥＧＦ₁₂₁は刺激しない。 図１６Ａ、１６Ｂ、および１６Ｃは、Ｄｕｎｎｉｎｇラット前立腺癌腫細胞株ＡＴ３．１細胞（高い運動性、高い転移能）およびＡＴ２．１細胞（低い運動性、低い転移能）の運動性およびニューロピリン−１の発現を示している。（図１６Ａ）ＡＴ３．１細胞は、ボイデンチャンバーアッセイにおいてＡＴ２．１細胞よりもより運動性である。（図１６Ｂ）¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅はＡＴ３．１細胞のニューロピリン−１に架橋するが、ＡＴ２．１細胞には架橋しない。（図１６Ｃ）ＡＴ２．１細胞ではなくＡＴ３．１細胞は、ニューロピリン−１を発現するが、両方の細胞型はＶＥＧＦを発現する。 図１６Ａ、１６Ｂ、および１６Ｃは、催促（Ｄｕｎｎｉｎｇ）ラット前立腺癌腫細胞株ＡＴ３．１細胞（高い運動性、高い転移能）およびＡＴ２．１細胞（低い運動性、低い転移能）の運動性およびニューロピリン−１の発現を示している。（図１６Ａ）ＡＴ３．１細胞は、ボイデンチャンバーアッセイにおいてＡＴ２．１細胞よりもより運動性である。（図１６Ｂ）¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅はＡＴ３．１細胞のニューロピリン−１に架橋するが、ＡＴ２．１細胞には架橋しない。（図１６Ｃ）ＡＴ２．１細胞ではなくＡＴ３．１細胞は、ニューロピリン−１を発現するが、両方の細胞型はＶＥＧＦを発現する。 図１６Ａ、１６Ｂ、および１６Ｃは、催促（Ｄｕｎｎｉｎｇ）ラット前立腺癌腫細胞株ＡＴ３．１細胞（高い運動性、高い転移能）およびＡＴ２．１細胞（低い運動性、低い転移能）の運動性およびニューロピリン−１の発現を示している。（図１６Ａ）ＡＴ３．１細胞は、ボイデンチャンバーアッセイにおいてＡＴ２．１細胞よりもより運動性である。（図１６Ｂ）¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅はＡＴ３．１細胞のニューロピリン−１に架橋するが、ＡＴ２．１細胞には架橋しない。（図１６Ｃ）ＡＴ２．１細胞ではなくＡＴ３．１細胞は、ニューロピリン−１を発現するが、両方の細胞型はＶＥＧＦを発現する。 図１７Ａおよび１７Ｂ。ＡＴ２．１細胞におけるニューロピリン−１の過剰発現。（１７Ａ）ウェスタンブロット。（１７Ｂ）運動性活性。３つのＡＴ２．１クローン（レーン４、５、および６）は、親のＡＴ２．１細胞、またはＡＴ２．１ベクター（ＡＴ２．１／Ｖ）コントロール、および類似するＡＴ３．１細胞のニューロピリン−１レベルおよび運動性活性と比較して、ニューロピリン−１タンパク質をより多く発現し、より運動性である。 図１８は、以下のプライマーを用いた逆転写酵素ＰＣＲを使用する、癌細胞株および内皮細胞におけるＮＰ−１、ＮＰ−２、およびβ−アクチンの発現：ヒトＮＰ−１：順方向（３２８〜３５１）： ５’ＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＡＴＡＡＡＴＧＴＧＧＣＧＡＴ３’（配列番号１１）逆方向（７３８〜７１９）： ５’ＴＡＴＣＡＣＴＣＣＡＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧ３’（配列番号１２）ヒトＮＰ−２順方向（５１３〜５３２）： ５’ＣＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＣＣＴＣ３’（配列番号１３）逆方向（１１８１〜１１６２）： ５’ＧＴＡＧＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＣＡＣＴＧＡ３’（配列番号１４）。 図１９は、インタクトのニューロピリン（−１および−２）（上部）、ニューロピリン−１の外部ドメインをコードする新規のクローン化ｃＤＮＡ（中央）、およびニューロピリン−２の外部ドメインをコードする新規のクローン化ｃＤＮＡ（下部）の構造の模式図である。これらの２つの新規のｃＤＮＡは、選択的スプライシングされたアイソフォームを示している。 図２０は、Ｃ末端を切断したニューロピリン−１アイソフォームをコードするｃＤＮＡを、ＣＯＳ細胞にトランスフェクトしたことを示す。可溶性の９０ｋＤａタンパク質（ｓＮＰ１）が、ウェスタンブロットによって、ベクターコントロールではなくｓＮＰ１を発現している細胞の馴化培地において検出された。ＭＤＡ ＭＢ ２３１細胞によって発現されたインタクトの１３０ｋＤａニューロピリン−１を、第１のレーンに示す。 図２１Ａおよび２１Ｂは、可溶性ニューロピリン−１タンパク質の調製物の、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＰＡＥ／ＮＰ細胞への結合の阻害（図２１Ａ）、およびＶＥＧＦ₁₆₅が媒介するＨＵＶＥＣ増殖の阻害（右側）を示す。ｓＡＢＣは、膜近傍領域で切断された、操作された可溶性のニューロピリン−１である。ｓＡＢは、ｃ、ＴＭ、および細胞質ドメインを欠く、天然に存在するニューロピリン−１のアイソフォームである。この実験において、ｓＮＰ１（図２１Ｂ）は、実施例３で産生されたｓＡＢＣである。 図２１Ａおよび２１Ｂは、可溶性ニューロピリン−１タンパク質の調製物の、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＰＡＥ／ＮＰ細胞への結合の阻害（図２１Ａ）、およびＶＥＧＦ₁₆₅が媒介するＨＵＶＥＣ増殖の阻害（右側）を示す。ｓＡＢＣは、膜近傍領域で切断された、操作された可溶性のニューロピリン−１である。ｓＡＢは、ｃ、ＴＭ、および細胞質ドメインを欠く、天然に存在するニューロピリン−１のアイソフォームである。この実験において、ｓＮＰ１（図２１Ｂ）は、実施例３で産生されたｓＡＢＣである。

（発明の詳細な説明）
本発明は、可溶性のニューロピリンタンパク質（ｓＮＰ）をコードするｃＤＮＡに関し、このｃＤＮＡはニューロピリン（ＮＰ）を産生する細胞から単離、またはＮＰをコードするＤＮＡから組換え操作される。ＮＰ−１およびＮＰ−２は、任意のニューロピリンまたはＶＥＧＦレセプター（ＶＥＧＦＲ）以外の好ましいＮＰであり、これらの構成要素は、上記のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１およびＮＰ−２のどちらとも少なくとも約８５％の相同性を有する。より好ましくは、このような構成要素は少なくとも９０％の相同性を有する。さらにより好ましくは、各構成要素は少なくとも９５％の相同性を有する。

相同性は当該分野に周知の手段で測定される。例えば、％相同性は、相同性を比較するために使用される任意の標準的なアルゴリズムにより決定され得る。これらは、ＮＩＨ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｋｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｎｅｗｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌを参照のこと）から入手可能なＢＬＡＳＴ２．０（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０．４およびｉ２．０．５）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７）およびＤＮＡＳＩＳ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｌｔｄ．）を含むが、これらに限定されない。これらのプログラムは、好ましくは、相同性比較のための標準的な初期設定のような自動設定に設定されるべきである。ＮＩＨにより説明されるように、ギャップのある結果は、ギャップのない結果よりもより生物学的な意義を有する傾向にある。

容易な参照のために、この開示は一般に、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１およびＮＰ−２および／またはそれらの相同物について述べているが、全ての教示は上述した相同物に適用可能である。

本発明はさらに、単離および精製したｓＮＰタンパク質に関する。本明細書で使用されるｓＮＰは、エキソン７（配列番号１５）を含む、血管内皮細胞増殖因子に特異的に結合し得るタンパク質（例えばＶＥＧＦ₁₆₅）をいい、例えばＳｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，３１５８２〜３１５８８（１９９７）に記載のようにＶＥＧＦ₁₆₅を使用するヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖アッセイによって決定されるような、ＶＥＧＦアンタゴニスト活性を有する。好ましくは、このｓＮＰは、ＨＵＶＥＣ増殖を少なくとも２５％減少し、より好ましくは５０％減少し、さらにより好ましくは７５％減少し、最も好ましくは９５％減少する。

ｓＮＰのＶＥＧＦアンタゴニスト活性はまた、標識化したＶＥＧＦ₁₆₅のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒへの結合の阻害（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，５７６１〜５７６７（１９９６）に開示される）、または標識化したＶＥＧＦ₁₆₅のＰＡＥ／ＮＰ細胞への結合の阻害（実施例に記載される）によって決定され得る。好ましくは、部分は、結合を少なくとも２５％、より好ましくは５０％、最も好ましくは７５％、阻害する。

用語「単離された」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が、その本来の環境から取り出されることを意味する。例えば、生存する動物中に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系中の共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドもしくはＤＮＡまたはポリぺプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリぺプチドは組成物の一部であり得、そしてなお、このようなベクターまたは組成物はその自然環境の一部ではないように単離され得る。

完全長のＮＰ−１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１および２として配列表に記載される。完全長のＮＰ−２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３および４として配列表に開示される。

ヒトＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１またはＮＰ−２をコードするＤＮＡ、および組換えヒトＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１またはＮＰ−２は、実施例に記載される方法に従って産生され得る。

ＮＰ−１またはＮＰ−２を産生する哺乳動物細胞株は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）、ＰＣ３前立腺癌腫細胞およびヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７３０）を含むが、これらに限定されない。

他の細胞および細胞株もまた、ｓＮＰを単離するための使用に適切であり得る。適切な細胞の選択は、細胞表面上または細胞抽出液もしくは馴化培地中のｓＮＰ結合活性に対するスクリーニング、あるいはＰＣＲまたはハイブリダイゼーションによる遺伝子発現に対するスクリーニングによって実施され得る。可溶性のレセプター活性を検出する方法は、当該分野で周知である（Ｄｕａｎ，Ｄ−Ｓ．Ｒ．ら、（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６、４１３〜４１８頁）。

ヒトＨＵＶＥＣ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７３０）（Ｈｏｓｈｉ，Ｈ．およびＭｃＫｅｅｈａｎ，Ｗ．Ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、（１９８４）８１、６４１３〜６４１７頁）のような完全長のＮＰを産生する細胞は、ＡＴＣＣの推奨培養条件に従って増殖させられる。インタクトなＮＰならびに細胞外領域（ｓＮＰ−１およびｓＮＰ−２）を図８に示す。インタクトなレセプターは、相補成分に相同なａドメイン、凝固因子に相同なｂドメイン、ＭＡＭに相同なｃドメイン、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、および４０アミノ酸の短い細胞質ドメイン（ｃｙｔｏ）を有する。本発明の対象であるこのレセプターの２つの阻害形態もまた図８に示し、そして配列番号６および８として配列表に記載し、そしてこれらはｃドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの全てを欠く。本発明の好ましいｓＮＰはさらにａドメインを欠く。

ニューロピリン−１（配列番号２）のドメインは以下の通りである：ａ１(アミノ酸２２〜１４６）、ａ２(アミノ酸１４７〜２７３）、ｂ１(アミノ酸２７５〜４３０）、ｂ２(アミノ酸４３１〜５８７）、ｃ(アミノ酸６４６〜８０９）、ＴＭ(アミノ酸８５７〜８８４）、ｃｙｔｏ(アミノ酸８８５〜９２３）。

ニューロピリン−２（配列番号４）のドメインは以下の通りである：ａ１(アミノ酸２４〜１４８）、ａ２(アミノ酸１４９〜２７５）、ｂ１(アミノ酸２７７〜４３３）、ｂ２(アミノ酸４３４〜５９４）、ｃ(アミノ酸６４２〜８００）、ＴＭ(アミノ酸８６５〜８９３）、ｃｙｔｏ(アミノ酸８９４〜９３１）。

任意の種々の手順が、ｓＮＰ ｃＤＮＡを分子クローン化するために使用され得る。これらの方法としては、適切な発現ベクター系におけるｓＮＰ含有ｃＤＮＡライブラリーの構築の後の、ｓＮＰ遺伝子の直接的な機能的発現が挙げられるが、これに限定されない。

別の方法は、ｓＮＰの推定アミノ酸配列から設計した標識化したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、バクテリオファージまたはプラスミドのシャトルベクター内に構築されたｓＮＰ含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。１つの方法は、完全長のＮＰタンパク質の少なくとも一部分をコードする、部分的なｃＤＮＡを用いて、バクテリオファージまたはプラスミドのシャトルベクター内に構築されたｓＮＰ含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする工程からなる。この部分的なｃＤＮＡを、完全長のＮＰをコードするＤＮＡの公知の配列からのオリゴヌクレオチドプライマーの設計を介して、ｓＮＰ ＤＮＡフラグメントの特異的なＰＣＲ増幅によって得る。

他の型のライブラリー、ならびに他の細胞または細胞型から構築されたライブラリーが、ｓＮＰをコードするＤＮＡの単離に有用であり得ることは、当業者に容易に明らかである。さらに、適切なｃＤＮＡライブラリーは、ｓＮＰ活性を有する細胞または細胞株から調製され得る。ｓＮＰ ｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの調製に使用する細胞または細胞株の選択は、まず、本明細書に記載される方法を使用して、分泌されたｓＮＰ活性を測定することによって行われ得る。

ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当該分野に周知の標準的な技術により実施され得る。周知のｃＤＮＡライブラリー構築技術は例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．１９８９）に見出され得る。

ｓＮＰをコードするＤＮＡはまた、適切なゲノムＤＮＡライブラリーから単離され得ることもまた、当業者に容易に明らかである。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当該分野に周知の標準的な技術により実施され得る。周知のゲノムＤＮＡライブラリー構築技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に見出し得る。

ｓＮＰ分子を得る別の手段は、ＮＰの部分的または完全なアミノ酸配列（例えば、ＮＰ−１またはＮＰ−２）をコードするＤＮＡからそれらを組換え操作することである。組換えＤＮＡ技術を使用して、有糸分裂誘発を刺激せずに、エキソン７を含むＶＥＧＦに結合し得るＮＰの少なくとも一部分をコードするＤＮＡ分子が構築される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に見出されるような標準的な組換えＤＮＡ技術が使用される。

本発明の好ましい方法の１つを使用して、ｓＮＰをコードするｃＤＮＡクローンは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく技術、およびｃＤＮＡライブラリースクリーニングを利用する２段階アプローチ（ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ ａｐｐｒｏａｃｈ）において単離される。第１のステージにおいては、公知の完全長のＮＰからの細胞外ドメイン配列情報に由来するＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、ｓＮＰ特異的ＤＮＡフラグメントの増幅のための縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。第２のステージにおいては、これらのフラグメントを、ＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７３０）に由来する市販のλｇｔ１０ ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から完全なｓＮＰ ｃＤＮＡを単離するためのプローブとして使用するためにクローン化する。

別の方法を使用して、ｓＮＰをコードするＤＮＡを、ＮＰをコードするＤＮＡ配列から構築する。説明のために、ＮＰ−１をコードするＤＮＡを利用する。レセプターＤＮＡ配列を使用して、レセプターの細胞外ドメイン、すなわちＶＥＧＦ結合ドメインのみをコードするＤＮＡ分子を構築する。制限エンドヌクレアーゼの切断部位は、レセプターＤＮＡ内に同定され、そして細胞外コード部分を切り出すために直接的に利用され得る。さらに、上述したようなＰＣＲ技術を利用して、所望のＤＮＡ部分を産生し得る。当該分野において標準的な他の技術を利用して、上述した技術に類似する様式においてｓＮＰ分子を産生し得ることは当業者に容易に明らかである。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に見出される。

好ましい方法において、ｓＮＰ ｃＤＮＡは、ａドメインのＮ末端内のＨｉｓドメインでタグ化され、そしてｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現プラスミドにサブクローン化される。各プラスミドをＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトし、Ｇ４１８耐性クローンを単離する。馴化培地を回収し、そしてＣｏｎ Ａセファロースカラムに供し、洗浄し、そしてＣｏｎ Ａ結合タンパク質を溶出する。この溶出物をニッケルカラムに供し、洗浄し、そしてＮｉ⁺⁺結合ｓＮＰタンパク質を溶出する。精製したｓＮＰを、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＰＡＥ／ＮＰ細胞への結合ならびにＨＵＶＥＣの増殖および運動性のＶＥＧＦ₁₆₅刺激を阻害する能力についてアッセイする。より小さなフラグメントはＰＣＲにより産生される。

本発明者らの結果は、ＶＥＧＦはニューロピリンのｂドメインに結合し、そしてａおよびｃドメインを必要としないことを示す。図１９を参照のこと。ＮおよびＣ末端のますますより大きなセグメントを欠くｂドメインのより小さな部分が、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲにより調製され得る。次いで、増幅したｃＤＮＡは発現ベクターに連結され、ＣＯＳ細胞内で発現され、そして馴化培地を、図２１ＡでｓＮＰについて示されるようにして¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＰＡＥ／ＮＰ１細胞への結合を阻害する能力について試験される。

膜貫通領域を含む、さらなる短縮形態のＮＰが構築され得る。膜貫通の保持は、標的細胞表面での阻害分子の配向を容易にし得る。膜貫通領域含有分子の構築は、当該分野に公知の標準的な技術（本明細書に記載されるような簡便な制限エンドヌクレアーゼ切断部位またはＰＣＲ技術の利用を含むがこれに限定されない）により行われる。

上述した方法により得られたクローン化ｓＮＰ ｃＤＮＡは、適切なプロモーターおよび適切な他の転写調節エレメントを含む発現ベクターへの分子クローニングによって組換え発現しされ得、そして原核生物または真核生物の宿主細胞に移行され、組換えｓＮＰを産生し得る。このような操作のための技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に十分に記載され、そして当該分野で周知である。

発現ベクターは、適切な宿主内での遺伝子のクローン化コピーの転写、およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列として本明細書に定義される。このようなベクターは、種々の宿主（例えば、細菌、藍藻、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞）において真核生物遺伝子を発現するために使用され得る。

特異的に設計したベクターは、宿主間（例えば、細菌細胞−酵母細胞、または細菌細胞−動物細胞、あるいは細菌細胞−昆虫細胞）でのＤＮＡシャトルを許容する。適切に構築した発現ベクターは以下を含むべきである：宿主細胞内での自律的な複製のための複製起点、選択可能マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高いコピー数に対する潜在能力、および活性プロモーター。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、そしてＲＮＡ合成を開始させるように指向されるＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡを高頻度に開始させるプロモーターである。発現ベクターには、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計したプラスミドまたはウィルスが含まれ得るが、これらに限定されない。

種々の哺乳動物発現ベクターが、哺乳動物細胞において組換えｓＮＰを発現するために使用され得る。組換えｓＶＥＧＦ−Ｒの発現に適し得る、市販の哺乳動物発現ベクターとしては、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）ｐＢＰＶ−Ｉ（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）、およびｇＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）が挙げられるが、これらに限定されない。

ｓＮＰをコードするＤＮＡはまた、組換え宿主細胞内での発現のために、発現ベクター内にクローン化され得る。組換え宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞（ヒト、ウシ、ブタ、サル、およびげっ歯類起源の細胞株を含むが、これらに限定されない）、および昆虫細胞（ショウジョウバエ、ガ、カ、およびアワヨトウの幼虫に由来する細胞株を含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない。適切であり得、かつ市販の哺乳動物種に由来する細胞株としては、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）が挙げられるが、これらに限定されない。適切であり得、かつ市販の昆虫細胞株としては、３Ｍ−Ｓ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８８５１）、ガ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８０）、カ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １９４、および１９５；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６０および１５９１）、およびアワヨトウの幼虫（Ｓｆ９，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）が挙げられるが、これらに限定されない。

発現ベクターは、多数の技術（形質転換、トランスフェクション、リポソームまたはプロトプラスト融合、およびエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない）のうちの任意の１つにより、宿主細胞に導入され得る。発現ベクターを含む細胞はクローン的に増殖され、そして個々に分析されて、その細胞がｓＮＰタンパク質を産生するかどうかを決定する。ｓＮＰ発現宿主細胞クローンの同定は、いくつかの手段（抗ｓＮＰ抗体を用いた免疫学的反応性、放射標識されたＶＥＧＦへの結合、および宿主細胞分泌ｓＮＰ活性の存在を含むが、これらに限定されない）によって実施され得る。

組換え宿主細胞におけるｓＮＰの発現の後、ｓＮＰタンパク質は、有糸分裂誘発を刺激せずにＶＥＧＦに結合し得る活性型のｓＮＰを提供するために回収され得る。いくつかのｓＮＰ精製手順が使用に適している。ｓＮＰは、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヘパリンセファロースクロマトグラフィー、ＶＥＧＦ１６５リガンドアフィニティークロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーの種々の組み合わせ、または個々の適用によって、細胞溶解物および細胞抽出液から、または馴化培養培地から精製され得る。

さらに、組換えｓＮＰは、全長ｓＮＰ、またはｓＮＰのポリペプチドフラグメントに対して特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて作製された免疫親和性カラムを使用することによって他の細胞タンパク質から分離され得る。

好ましくは、ｓＮＰは、ＤＮＡ構築物を含むｓＮＰをＣＯＳ細胞（一過性のトランスフェクション）およびＣＨＯ細胞（安定なトランスフェクタント）にトランスフェクトすることによって精製され得る。この使用される構築物は、例えば、Ｈｉｓタグおよびｍｙｃタグの両方でニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）のＮ末端の近く（ＶＥＧＦ結合に必要とされないドメインにおける）で二重タグ化され得る。レクチンカラムクロマトグラフィーは、ｓＮＰ精製の第１の工程として有用である。この精製における第２の工程は、Ｈｉｓタグ化タンパク質を、必要な場合、抗ｍｙｃ抗体を結合するニッケルカラムを使用することである。本発明者らは、細胞に対するＶＥＧＦ結合を阻害する際に、タグ化ｓＮＰが完全に活性であることを示した（図２１Ａ）。非タグ化ｓＮＰを精製するための、レクチンとＶＥＧＦ親和性クロマトグラフィーとの組み合わせは、インタクトなニューロピリン−１の精製についての実施例において示されるように十分である。

次いで、精製ｓＮＰタンパク質は、ＶＥＧＦ媒介性内皮細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ）遊走および増殖ならびにラットの大動脈環（インビトロ血管新生）からの内皮細胞の遊走における効果について試験され得る。ｓＮＰタンパク質はまた、ニワトリＣＡＭ、およびマウス角膜モデルにおけるＶＥＧＦ媒介性血管新生の阻害についてインビボで試験され得る。ｓＮＰと相互作用するはずのないＦＧＦ−２は、コントロールとして使用され得る。精製ｓＮＰタンパク質およびこのタンパク質をコードするＤＮＡはまた、マウスモデル（特に、ヌードマウスへの皮下または正常位に増殖したＰＣ３腫瘍）で試験され、血管新生、腫瘍増殖および転移の阻害を探し得る。

本発明のインヒビターは、血管新生および腫瘍細胞移動性を含むＶＥＧＦ媒介性活性の阻害に対して使用され得る。このインヒビターは、局所または静脈内のいずれかに使用され得る。局所適用については、この処方物は、約１０ｎｇ〜約１ｍｇ／ｃｍ２／ｄａｙの速度で直接的に適用される。静脈内適用については、このインヒビターは、体重の約１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの速度で使用される。内部使用については、この処方物は、移植された遅放性ポリマー材料からかまたは遅放性ポンプからかあるいは反復注入のいずれかで、処置されるべき領域に直接的に放出され得る。いずれかの場合における放出速度は、約１００ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｄａｙ／ｃｍ３である。

非局所的な適用については、このインヒビターは、標準的な薬学的実務に従って、薬学的組成物中において薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、リン酸緩衝液、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液など）との組み合わせで投与される。局所適用については、種々の薬学的処方物が、本発明の活性化合物の投与のために有用である。このような処方物は、以下を含むがこれらに限定されない：疎水性ワセリンまたはポリエチレングリコール軟膏剤のような軟膏剤；キサンタン（ｘａｎｔｈａｎ）ガムのようなガムを含み得るペースト剤；アルコール性溶液または水性溶液のような溶液；水酸化アルミニウムまたはアルギン酸ナトリウムゲルのようなゲル；ヒトまたは動物アルブミンのようなアルブミン；ヒトまたは動物コラーゲンのようなコラーゲン；アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロースおよびアルキルヒドロキシアルキルセルロースのようなセルロース（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロース）；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ．ＲＴＭ．Ｆ−１２７により例示されるＰｌｕｒｏｎｉｃ．ＲＴＭ．Ｐｏｌｙｏｌのようなポリオキサマー；ｔｅｔｒｏｎｉｃ １５０８のようなｔｅｔｒｏｎｉｃｓ；ならびにアルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸。

本発明のｓＮＰは、血管新生を負に調節する治療的に有効量の別の分子と組み合わされ得、この分子は、ＴＮＰ−４７０、血小板因子４、トロンボスポンジン−１、メタロプロテアーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２）、プロラクチン（１６−Ｋｄフラグメント）、アンジオスタチン（プラスミノゲンの３８−Ｋｄフラグメント）、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性レセプター、トランスフォーミング増殖因子β、インターフェロンα、可溶性ＫＤＲおよびＦＬＴ−１レセプター、ならびに胎盤プロリフェリン（ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）関連タンパク質であり得るがこれらに限定されない。

本発明のｓＮＰはまた、化学療法剤と組み合わされ得る。

本発明のｓＮＰをコードするＤＮＡは、遺伝子治療の型で使用され、そして当業者に公知の任意の方法によって宿主に送達され、ＶＥＧＦに関連する障害を処置し得る。

本発明の好ましい実施態様は、さらなる腫瘍増殖および最終的な転移を予防するために固形腫瘍の血管新生を阻害する方法に関する。この目標のために、遺伝子移入が近づき得る任意の固形腫瘍または腫瘍を囲む領域が、開示された治療適用の標的である。ｓＮＰをコードし、組換えウイルス性または非ウイルス性に基づく遺伝子移入系の中に収容されるＤＮＡは、当該分野で公知である任意の多数の手順によりこの腫瘍の近傍内の標的細胞に指向され得る。この手順は、以下を含むがこれらに限定されない（ａ）腫瘍内部の部位およびこの腫瘍の周囲の部位に有効量のＤＮＡを投与することと組み合わされる外科的手順（可能な場合、腫瘍の一部または全体の最初の除去を含む）；（ｂ）この腫瘍の部位中または近接部位への直接的な遺伝子移入ビヒクルの注入；ならびに、（ｃ）当該分野で公知である技術を使用する遺伝子移入ベクターおよび／または遺伝子産物の局在化送達または全身的な送達。

ＶＥＧＦまたはニューロピリン発現細胞を含む任意の固形腫瘍は、処置のための潜在的な標的である。例えば、決して限定としては列挙しないが、遺伝子治療適用に特に脆弱な固形腫瘍は、以下である；（ａ）神経膠芽細胞、星状細胞腫、神経芽腫、髄膜細胞腫、上衣細胞腫を含むが必ずしもこれらに限定されない中枢神経系の新生物；（ｂ）本来の位置での癌髄様癌、管状腺癌、浸潤（浸潤する）癌および粘液性癌腫を含むがその部位の癌に限定されない前立腺、精巣、子宮、頸、卵巣乳房のような組織でのホルモン依存性癌；（ｃ）皮膚および眼の黒色腫を含むがこれらに限定されない黒色腫；（ｄ）扁平上皮癌、紡錘体癌、小細胞癌、腺癌および大細胞癌を少なくとも含む肺の癌；ならびに（ｅ）少なくとも大腸の腺癌を含む、食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、直腸、および肛門領域のような胃腸管系の癌。

ｓＮＰをコードするＤＮＡフラグメントは、ウイルス性または非ウイルス性に基づく方法によって、全身的にまたは哺乳動物宿主の固形腫瘍の近傍における標的細胞に対してかのいずれかで送達され得る。本発明に利用され得るウイルスベクター系は、以下を含むがこれらに限定されない；（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純疱疹ウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコナウイルスベクター；および（ｉ）ワクシニアウイルスベクター。

本発明のｓＮＰをコードするＤＮＡを含む組換えウイルスまたはベクターは、好ましくは、固形腫瘍および／またはこの固形腫瘍に近接する静止状態の組織（例えば、脂肪組織または筋組織）への直接注入によりこの宿主に投与される。もちろん、腫瘍細胞を標的とされる脂肪組織または筋組織の領域にトランスフェクトすることは、有用である。これらの周囲の細胞におけるｓＮＰの一過性発現は、これらのタンパク質の局所的な細胞外増加を生じ、そしてＶＥＧＦとの結合を促進し、これによりこのレセプターへのＶＥＧＦの結合を阻害する。

また適切である非ウイルス性ベクターは、例えば、リポソーム媒介性またはリガンド／ポリ−Ｌ−リジン結合体（例えば、アシアロ糖蛋白媒介性送達系のようなＤＮＡ脂質複合体を含む（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０〜２５６１；Ｄｅｒｏｓｓｉら、１９９５、Ｒｅｓｔｏｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓ．８：７〜１０；およびＡｂｃａｌｌａｈら、１９９５、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ８５：１〜７を参照のこと）。「裸」のＤＮＡの直接注入もまた、使用され得る。

本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で充填された１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。必要に応じて、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関による規定される形態での通知は、このような容器に付随し得、この通知は、ヒト投与についての製造機関、使用機関、または販売機関による認可を示す。

以上または以下の引用される全ての参考文献は、本明細書中で参考として援用される。

本発明はさらに、以下の実施例を例証する。これらの例示は、本発明の理解を目的に提供され、その限定として解釈されない。

（実施例１）
（実験手順）
（材料）
トランスフェクションのための細胞培養培地、リポフェクチンおよびリポフェクタミン試薬をＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ヒト組換えＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₂₁は、以前に記載されるようにヒトＶＥＧＦ₁₆₅またはＶＥＧＦ₁₂₁のいずれかをコードする組換えバキュロウイルスベクターを用いて感染されたＳｆ−２１昆虫細胞において産生された（Ｃｏｈｅｎら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、７、１３１〜１３８（１９９２）；Ｃｏｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、１１３２２〜１１３２６（１９９５）。ＧＳＴ ＶＥＧＦエキソン７＋８融合タンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて調製し、そして以前に記載されるように精製した（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、５７６１〜５７６７（１９９６））。ヘパリン、ハイグロマイシンＢおよびプロテアーゼインヒビターをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。¹²⁵Ｉ−ナトリウム、³²Ｐ−ｄＣＴＰ、およびＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ−Ｐｌｕｓハイブリダイゼーション転移膜をＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。ジスクシンイミジルスベリン酸（ＤＳＳ）およびＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳをＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入した。Ｃｏｎ ＡセファロースをＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入した。ＲＮＡｚｏｌ−ＢをＴＥＬ−ＴＥＳＴ Ｉｎｃ．（Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＴＸ）から購入した。銀染色キットおよびＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ膜をＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から購入した。複数組織ノザンブロット膜をＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から購入した。ポリＡ Ｔｒａｃｔ ｍＲＮＡ単離キットをＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。ＲｅｄｉＰｒｉｍｅ ＤＮＡ標識キットおよび分子量マーカーをＡｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）から購入した。プラスミド：ｐｃＤＮＡ３．１をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入し、そしてＣＭＶプロモーターを含み、かつハイグロマイシンＢホスホリラーゼをコードするｐＣＰｈｙｇｒｏは、Ｄｒ．Ｕｒｂａｎ Ｄｅｕｔｓｃｈ（Ｍａｘ Ｐｌａｎｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂａｄ Ｎａｕｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって親切に提供された。制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。ＮＴ−Ｂ２写真用エマルジョンおよびＸ線フィルムをＥａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）から購入した。

（細胞培養）
ヒト臍帯静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、そして２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）ならびにグルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン混合物（ＧＰＳ）を含むＭ−１９９培地中でのゼラチンコートディッシュ上で増殖した。塩基性ＦＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）を１日おきに培養培地に添加した。親ブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞およびＫＤＲを発現するＰＡＥ細胞（ＰＡＥ／ＫＤＲ）（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２６９８８〜２６９９５（１９９４））は、Ｄｒ．Ｌｅｎａ Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈにより親切に提供され、そして１０％ＦＣＳおよびＧＰＳを含むＦ１２培地で増殖した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を、ＡＴＣＣから入手し、そして１０％ＦＣＳおよびＧＰＳを含むＤＭＥＭで増殖した。ヒト黒色腫細胞株である、ＲＵ−ｍｅｌ、ＥＰ−ｍｅｌおよびＷＫ−ｍｅｌは、Ｄｒ．Ｒａｎｄｏｌｆ Ｂｙｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から親切に提供され、そして２％ＦＣＳ、８％ウシ血清およびＧＰＳを含むＤＭＥＭで増殖した。ヒト転移性前立腺癌であるＬＮＣａＰ細胞および前立腺癌であるＰＣ３細胞は、Ｄｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｆｒｅｅｍａｎ（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から親切に提供され、そして５％ＦＣＳおよびＧＰＳを含むＲＰＭＩ １６４０で増殖した。

（精製およびタンパク質配列決定）
１５０ｃｍディッシュで増殖された約５×１０⁸ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳで洗浄し、掻き取り、そして５００ｇで５分間遠心分離した。この細胞ペレットを１５０ｍｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ならびに１ｍＭ ＡＥＢＳＦ、５μｇ／ｍｌロイペプチンおよび５μｇ／ｍｌアプロチニンを含むプロテアーゼインヒビターを用いて氷上で３０分間溶解し、そしてこの溶解物を３０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。ＭｎＣｌ₂およびＣａＣｌ₂を、各々１ｍＭの最終濃度を得るように上清に添加した。この溶解物を、Ｃｏｎ Ａセファロースカラム（７ｍｌ）に吸収し、そして結合タンパク質を、１５ｍｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１Ｍ メチル−α−Ｄ−マンノピラノシドを用いて０．２ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。この溶出物を３０分間隔で二度さらに繰り返した。このＣｏｎ Ａカラム溶出物をプールし、そして以前に記載されるように調製された、約１５０μｇのＶＥＧＦ₁₆₅を含む０．５ｍｌのＶＥＧＦ₁₆₅−セファロースビーズとともに４℃で１２時間インキュベートした（ＷｉｌｃｈｅｋおよびＭｉｒｏｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．４、６２９〜６３５．（１９８２））。このＶＥＧＦ₁₆₅−セファロースビーズを、５０ｍｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、０．２Ｍ ＮａＣｌおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、次いで２５ｍｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０を用いて洗浄した。このビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中で煮沸し、結合タンパク質を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。セミドライ電気ブロッター（Ｈｏｅｆｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、タンパク質をＴｒａｎｓＢｌｏｔ ＰＶＤＦ膜に転移し、そしてこのＰＶＤＦ膜を４０％メタノール中の０．１％クマシーブリリアントブルーで染色した。１３０〜１４０ｋＤａダブレットにおける２つの顕著なタンパク質を別々に切り出し、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ施設（Ｃａｍｂｒｉｇｅ、ＭＡ）のＤｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｌａｎｅにより提供されるサービスとしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ４７７Ａ微量配列決定機を使用してＮ末端の配列決定をした。

（発現クローニングおよびＤＮＡ配列決定）
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を５μｇの２３１ｍＲＮＡから合成した。二本鎖ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩアダプターに連結し、そして５〜２０％酢酸カリウム勾配でサイズ分画した。２ｋｂよりも大きいＤＮＡフラグメントを真核生物発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１に連結した。このプラスミドライブラリーをＥ．ｃｏｌｉにトランスフェクトし、約１×１０⁷の個々のクローンの一次ライブラリーを生じた。形質転換された細菌の一部を２４０プールに分割し、これら各々は、約３×１０³の個々のクローンを表す。各プールから調製されたＤＮＡを使用し、製造業者の指示に従いリポフェクチン試薬を使用して１２ウェルディッシュ中に播種されたＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に、この細胞を１μｇ／ｍｌヘパリンの存在下で¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに氷上で２時間インキュベートし、洗浄し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。個々の細胞に結合する¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅は、記載されるように、単層を写真用エマルジョン、ＮＴ−Ｂ２とともに重層し、そして２日後にこのエマルジョンを現像することによって検出された（Ｇｅａｒｉｎｇら、１９８９）。７つの陽性ＤＮＡプールを同定し、この陽性プールのうちの１つからのＤＮＡを使用し、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換した。このＥ．ｃｏｌｉを５０の別々のプールにさらに分割し、各プールが約１００クローンを表す、５０のＬＢアンピシリンディッシュ上に播種した。これらのプールから作製されたＤＮＡをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、上記のように¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅結合についてスクリーニングした。２０の陽性プールをこの工程で検出し、そしてそれらの対応するＤＮＡを使用し、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換した。各プールを別々のＬＢアンピシリンディッシュ上に播種し、ＤＮＡを９６の個々のコロニーから調製し、そして上記のようにトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞に対する¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅結合について９６ウェル二次元格子においてスクリーニングした。７つの単独のクローンをこの工程の陽性として同定した。この７つの陽性プラスミドクローンを増幅し、そしてそれらのＤＮＡを制限酵素消化によって分析した。６つのクローンは、消化の同一消化パターンを示し、そして１つは異なっていた。各々の群からの１つのクローンを自動化ＤＮＡ配列決定に供した。

（ノザン分析）
製造業者の指示に従いＲＮＡｚｏｌを使用して、培養中の細胞から総ＲＮＡを調製した。２０μｇＲＮＡのサンプルを１％ホルムアルデヒド−アガロースゲルで分離し、そしてＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ−Ｐｌｕｓ膜に転写した。この膜を、ＯＲＦ中のヌクレオチド６３〜４５４に対応する、ヒトＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｃＤＮＡの³²Ｐ標識フラグメントを用いて６３℃で１８時間ハイブリダイズした。この膜を洗浄し、そしてＸ線フィルムに１８時間曝露した。市販の複数のヒト成人組織のｍＲＮＡブロット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、２μｇ／レーン）を、同様の様式で、ヒトＮＰ−１についてプローブした。この複数組織ブロットを０．５％ＳＤＳの存在下で煮沸により剥がし、そしてこのＯＲＦのヌクレオチド２８４１〜３２５１に対応するＫＤＲ ｃＤＮＡの³²Ｐ標識フラグメントを用いて再プローブした（Ｔｅｒｍａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６、１６７７〜１６８３（１９９１））。

（ＰＡＥ細胞のトランスフェクション）
親ＰＡＥ細胞およびＫＤＲを発現するＰＡＥ細胞（ＰＡＥ／ＫＤＲ）（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９４）を、Ｌｅｎａ Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ博士から入手した。ヒトＮＰ−１ ｃＤＮＡを、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限酵素を用いて消化し、そしてｐＣＰｈｙｇｒｏの対応する部位にサブクローニングし、ｐＣＰｈｙｇ−ＮＰ−１を産生した。ＰＡＥおよびＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を、６ｃｍディッシュで増殖し、製造業者の指示に従いリポフェクタミンを使用して５μｇのｐＣＰｈｙｇ−ＮＰ−１をトランスフェクトした。細胞をさらに４８時間増殖させ、そしてこの培地を、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含む新鮮な培地と交換した。２週間後、単離されたコロニー（５〜１０×１０³細胞／コロニー）を４８ウェルディッシュの別々のウェルに移し、そして２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢの存在下で増殖した。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１（ＰＡＥ／ＮＰ−１）を発現するか、またはＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１およびＫＤＲを共発現する（ＰＡＥ／ＫＤＲ／ＮＰ−１）安定なＰＡＥ細胞クローンを、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合および架橋によってＶＥＧＦ₁₆₅レセプター発現についてスクリーニングした。一過性のトランスフェクションについては、ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を、上記のようにＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を用いてトランスフェクトし、そして３日後に¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅架橋分析を実行した。

（ＶＥＧＦの放射ヨウ素化、結合および架橋実験）
ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳを使用するＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₂₁の放射ヨウ素化を、以前に記載されるように実行した（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、３１５８２〜３１５８８（１９９７））。この比活性は、４０，０００〜１００，０００ｃｐｍ／ｎｇタンパク質で変動した。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅および¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁を使用する結合および架橋実験を、以前に記載されるように実行した（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、６０９３〜６０９８（１９９２）；Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１〜５７６７（１９９６））。ＶＥＧＦ結合は、γカウンターで細胞に関連する放射活性を測定することによって定量された（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｇａｍｍａ５５００）。カウントは３ウェルの平均を表す。全ての実験を少なくとも３回繰り返し、そして同様の結果を得た。結合実験の結果を、ＬＩＧＡＮＤプログラム（ＭｕｎｓｏｎおよびＲｏｄｂａｒｄ、１９８０）を使用するスキャッチャードの方法によって分析した。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅および¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁の架橋複合体を、６％ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、そしてこのゲルをＸ線フィルムに曝露した。その後、Ｘ線フィルムを、ＩＳ−１０００デジタル画像処理システム（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用することによって走査した。

（ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒの精製）
２３１細胞の細胞表面レセプターに対する¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の架橋は、１６５〜１７５ｋＤａ標識複合体の形成を生じる（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１〜５７６７（１９９６））。これらの細胞は、約１〜２×１０⁵ＶＥＧＦ₁₆₅結合部位／細胞を有する。ＶＥＧＦ₁₆₅とは対照的に、ＶＥＧＦ₁₂₁は、２３１細胞に結合せず、そしてリガンド−レセプター複合体を形成しない（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１〜５７６７（１９９６））。２３１細胞中の相対的に高いＶＥＧＦ₁₆₅Ｒの数および全く検出可能なＫＤＲまたはＦｌｔ−１ ｍＲＮＡが欠乏すること（示さず）は、これらの細胞がＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ精製のために有用な供給源であることを示唆する。予備的な特徴付けは、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒが糖タンパク質であることを示した。従って、約５×１０⁸細胞から調整された２３１細胞溶解物がＣｏｎ Ａセファロースカラムに吸収された。Ｃｏｎ Ａカラムから溶出される結合タンパク質を、ＶＥＧＦ₁₆₅セファロースとともにインキュベートし、そしてこのＶＥＧＦ₁₆₅親和性精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により分析した（図９、レーン２）。約１３０〜１３５ｋＤａの分子量である顕著なダブレットが、検出された。このサイズは、約１３０〜１３５ｋＤａのサイズであるレセプターに結合した４０〜４５ｋＤａのＶＥＧＦ₁₆₅の１６５〜１７５ｋＤａ複合体の形成と一致する（図９、レーン１）。この２つのバンドを別々に切り出し、そしてＮ末端アミノ酸配列決定を実行した（図１、右）。上側および下側のバンドの両方は、同様なＮ末端アミノ酸配列を有しており、この配列は、マウス（Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２９，１〜１７（１９９５））およびヒトニューロピリン−１（ＮＰ−１）（ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０７３９〜７５１（１９９７））のＮ末端領域における推定アミノ酸配列に対して高度な配列相同性を示した。

（２３１細胞由来ｍＲＮＡからのＶＥＧＦ₁₆₅Ｒの発現クローニング）
この精製に伴って、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒを発現クローニングによってクローン化した（ＡｒｕｆｆｏおよびＳｅｅｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４、８５７３〜８５７７（１９８７ａ）；ＡｒｕｆｆｏおよびＳｅｅｄ、ＥＭＢＯ Ｊ．、６、３３１３〜３３１６（１９８７ｂ）；Ｇｅａｒｉｎｇら、ＥＭＢＯ Ｊ．８、３６６７〜３６７６（１９８９））。発現クローニングについて、２３１細胞ｍＲＮＡを使用し、真核細胞発現プラスミド中に約１０⁷クローンのｃＤＮＡライブラリーを調製した。このプラスミドライブラリーで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉをプールに分割した。各々のプールから調製されるＤＮＡを別々のウェルのＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、そして個々の細胞を、写真用エマルジョンで重層された単層のオートラジオグラフィによって検出されるように、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅に結合する能力についてスクリーニングした（図２Ａ）。サブプーリングおよびスクリーニングの３ラウンドの後に、７つの単一陽性ｃＤＮＡクローンを得た。図２Ｂは、これらの単一の陽性クローンのうちの１つ（クローンＡ２）を用いてトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞に対する¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合を示す。

制限酵素分析は、７つの陽性単一クローンのうちの６つが同一の制限消化パターンを有するが、１つのクローンが異なる（示さず）パターンを有することを示した。これらの同様のｃＤＮＡクローンのうちの１つ、クローンＡ２（図３）の配列決定は、それがヒト発現配列タグデータバンク（ｄｂＥＳＴ）由来の配列と同一であることを示した。この配列はまた、マウスニューロピリン、ＮＰ−１（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２９、１〜１７（１９９５））の配列に対して高い割合の相同性を示した。本発明者らが、ヒトＶＥＧＦ₁₆₅Ｒをクローン化した後に、２つのグループがセマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）ＩＩＩのラットおよびヒトレセプターのクローニングを報告し、そしてそれらがＮＰ−１であると同定した（ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ９０、７３９〜７５１（１９９７）；Ｋｏｌｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ ９０、７５３〜７６２（１９９７））。この２３１細胞由来ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ ｃＤＮＡ配列は、ヒトＮＰ−１配列（ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０、７３９〜７５１（１９９７）と実際は同一である（例外についての図説明文３を参照のこと）。きわめて、発現クローニングによって得られる推定アミノ酸配列（図３）は、Ｎ末端配列決定によって決定された、ＮＰ−１としてのＶＥＧＦ₁₆₅Ｒの同定を確認し（図１）、従って、本発明者らは、このＶＥＧＦレセプターをＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１と命名した。

ヒトＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１のｃＤＮＡ配列は、推定シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを表す２つの疎水性領域を有する９２３アミノ酸のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を予測する（図３）。全体的に、この配列は、細胞表面レセプターの構造と一致する外部ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを予測する。図１に示されるように、タンパク質精製を介して得られたこのＮ末端配列は、２１アミノ酸推定疎水性シグナルペプチドドメインの下流であり、従って、このシグナルペプチドドメインが切断され、そして除去されることを直接的に示す。４０アミノ酸の短い細胞質の尾部は、２３１細胞の部分的なトリプシン消化により放出される可溶性ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１がインタクトなＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１と同じサイズであることを実証する結果と一致する（示さず）。

異なる制限酵素プロフィールを有した発現クローニングにより得られた１つのクローンの配列分析は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に対して約４７％の相同性を有する９３１アミノ酸のオープンリーディングフレームを予測した（図４）。このヒトｃＤＮＡは、ラットニューロピリン−２（ＮＰ−２）と９３％の配列相同性を有し、そして最近クローン化されたヒトＮＰ−２と同一である（Ｃｈｅｎら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９、５４７〜５５９（１９９７））。

（成人の細胞株および組織におけるＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の発現）
ＮＰ−１遺伝子発現の報告は、今のところ発達している胚の神経系に限定されている（Ｔａｋａｇｉら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２２、９０〜１００（１９８７）；Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２９、１〜１７（１９９５）；Ｔａｋａｇｉら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７０、２０７〜２２２（１９９５））。しかし、細胞表面ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１は、ＥＣのような非ニューロン性成人細胞型および種々の腫瘍由来細胞と関連する（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１〜５７６７（１９９６））。ノザンブロット分析は、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅架橋された細胞がまた、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｍＲＮＡを合成するか否かを決定するために実行された（図５）。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｍＲＮＡレベルは、２３１細胞およびＰＣ３細胞で最も高かった。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｍＲＮＡは、ＨＵＶＥＣ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、ＥＰ−ｍｅｌ細胞およびＲＵ−ｍｅｌ細胞においてより少ない程度で検出された。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞およびＷＫ−ｍｅｌ細胞中の発現は、あるとしてもほとんど存在しなかった。このＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１遺伝子発現パターンは、ＨＵＶＥＣ細胞、２３１細胞、ＰＣ３細胞、ＬＮＣａＰ細胞、ＥＰ−ｍｅｌ細胞およびＲＵ−ｍｅｌ細胞が、細胞表面ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅を結合させるが、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞およびＷＫ−ｍｅｌ細胞がそうではないこと示す、本発明者らの以前の結果と一致した（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１〜５７６７（１９９６））。

ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１遺伝子発現はまた、種々の成人組織において、ＫＤＲ遺伝子発現と比較するノザンブロットによって分析された（図６）。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｍＲＮＡレベルは成人の心臓および胎盤において比較的高く、そして肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓において比較的中程度であった。比較的低いレベルのＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｍＲＮＡは、成人の脳において検出された。興味深いことに、マウスおよびニワトリ脳におけるＮＰ−１遺伝子発現の以前の分析は、この遺伝子が胚発生の間に主に発現され、そして出生後に大きく減少することを示唆した（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２９、１〜１７（１９９５）；Ｔａｋａｇｉら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７０、２０７〜２２２（１９９５））。ＫＤＲ ｍＲＮＡの組織分布は、心臓で高度に発現しないという例外を伴うがＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１のｍＲＮＡの組織分布と同様であった。これらの結果は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１が、心臓および胎盤のように血管新生が生じる組織を含む、成人の非ニューロン組織において広く発現されることを示す。

（ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に対するＶＥＧＦ₁₆₅結合の特徴付け）
ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の結合性質を特徴付けるために、ブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１のｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされた。このＰＡＥ細胞は、これらの発現研究のために選択された。なぜならば、ＰＡＥ細胞は、ＫＤＲも、Ｆｌｔ−１も（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２６９８８〜２６９９５（１９９４））、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒのいずれも発現していないからである。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１（ＰＡＥ／ＮＰ−１）を合成する安定な細胞株を確立し、そして¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅結合実験を実行した（図７）。ＰＡＥ／ＮＰ−１細胞に対する¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅結合は、用量依存性の様式で増加し、そして約３０ｎｇ／ｍｌで飽和に達した。このことは、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１が特異的ＶＥＧＦ₁₆₅レセプターであることを実証する（図７Ａ）。ＶＥＧＦ₁₆₅結合のスキャッチャード分析は、約３．２×１０^-10ＭのＫ_dを有する１つのクラスのＶＥＧＦ₁₆₅結合部位、および１細胞当たり約３×１０⁵の¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅結合部位を明らかにした（図７Ｂ）。同様のＫ_d値が、いくつかの独立して生成したＰＡＥ／ＮＰ−１クローンについて得られたが、このレセプター数はクローン毎に変動した（示さず）。ＰＡＥ／ＮＰ−１細胞株に対する３×１０^-10ＭのＫ_dは、ＨＵＶＥＣ細胞および２３１細胞によって天然に発現されるＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に対して得られる２〜２．８×１０^-10ＭのＫ_d値と一致する（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、６０９３〜６０９８（１９９２）；Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１〜５７６７（１９９６））。ＰＡＥ／ＮＰ−１細胞に対する¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅結合は、１μｇ／ｍｌヘパリンによって増強され（示さず）、このことは、ヘパリンが、ＨＵＶＥＣ細胞および２３１細胞上のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に対する¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅結合を増強することを示す以前の研究と一致した（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、６０９３〜６０９８（１９９２）；Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１〜５７６７（１９９６））。

（ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を発現している細胞に対するＶＥＧＦのアイソフォーム特異的結合）
ＶＥＧＦ₁₆₅（ＶＥＧＦ₁₂₁ではない）は、ＨＵＶＥＣ細胞および２３１細胞上のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に結合する（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５５１９〜５５２３（１９９２）；Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１〜５７６７（１９９６））。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を用いてトランスフェクトされた細胞が、同一の結合特異性を有するか否かを確認するために、ＰＡＥ／ＮＰ−１細胞を、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅または¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁とともにインキュベートし、その後、架橋した（図８）。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅は親ＰＡＥ細胞に結合しなかったが（図８、レーン３）、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を介してＰＡＥ／ＮＰ−１細胞に結合した（図８、レーン４）。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を用いて形成された放射標識複合体は、ＨＵＶＥＣ細胞（図８、レーン１）およびＰＣ３細胞（図８、レーン２）において形成された複合体と同様のサイズであった。一方、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁は、親ＰＡＥ細胞（図８、レーン７）またはＰＡＥ／ＮＰ−１細胞（図８、レーン８）のいずれに対しても結合しなかった。これらの結果は、内因性ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を発現している細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ細胞、２３１細胞およびＰＣ３細胞）で生じるＶＥＧＦアイソフォーム特異的結合を実証し、これらの結果が、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされる細胞で複製され得、そしてＶＥＧＦ₁₆₅ＲおよびＮＰ−１が同一であるという知見を支持し得る。

（ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１およびＫＤＲの同時発現が、ＫＤＲへのＶＥＧＦ₁₆₅の結合を変化させる）
ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の発現が、ＶＥＧＦ₁₆₅とＫＤＲとの相互作用に何らかの影響を有するかどうかを決定するために、以前にＫＤＲｃＤＮＡでトランスフェクトして安定なＰＡＥ／ＫＤＲ細胞のクローンを産生したＰＡＥ細胞（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２６９８８−２６９９５（１９９４））を、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｃＤＮＡとトランスフェクトし、そして両方のレセプター（ＰＡＥ／ＫＤＲ／ＮＰ−１）を発現する安定なクローンを得た。これらの細胞は、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅をＫＤＲ（図８、レーン６、上部の複合体）およびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１（図８、レーン６、下部複合体）へ結合し、ＨＵＶＥＣ（図８、レーン１）と類似した架橋特性を産生した。一方、ＰＡＥ／ＫＤＲ／ＮＰ−１細胞は、ＶＥＧＦ₁₂₁のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１と結合する能力がないことと一致し、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁に結合して、ＫＤＲとの複合体のみを形成する（図８、レーン９および１０）。

細胞中でＫＤＲおよびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１（図８、レーン６）が同時発現していることが明らかとなり、２４０ｋＤａの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅−ＫＤＲ複合体形成の程度は、親のＰＡＥ／ＫＤＲ細胞と比較して増強された（図８、レーン５）。これらの結果は再現性があり、そして異なるクローンでの２４０ｋＤａの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅−ＫＤＲの複合体形成の程度は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の発現レベルと正の相関関係があった（データ示さず）。しかし、これらの異なるＫＤＲ結合の結果は、おそらくトランスフェクション後のクローンの選択に起因するということを決定的には除外することはできなかった。それゆえ、親のＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｃＤＮＡとトランスフェクトし、そして¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅を、個々のクローンの間のＫＤＲ発現の何らかの多様性を除くために、３日後に細胞に対して結合および架橋させた（図９）。ＫＤＲを含む標識された２４０ｋＤａの複合体が、親のＰＡＥ／ＫＤＲ細胞で形成され（図９、レーン１）、そしてＰＡＥ／ＫＤＲ細胞中に発現ベクターと共にトランスフェクトした（図９、レーン２）。しかし、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅を、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を過渡的に発現しているＰＡＥ／ＫＤＲ細胞と架橋した場合、親のＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（図９、レーン１）および発現ベクターとトランスフェクトしたＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（図９、レーン２）と比較して、約４倍大きいより強烈に標識された２４０ｋＤａの複合体が観察された（図９、レーン３）。これらの結果は、同じ細胞内におけるＫＤＲおよびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１遺伝子の同時発現が、ＶＥＧＦ₁₆₅のＫＤＲへの結合能力を増強することを示唆する。

（ＧＳＴ−ＶＥＧＦエキソン７＋８融合タンパク質は、ＶＥＧＦ₁₆₅のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１およびＫＤＲへの結合を阻害する）
本発明者らは、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅が、そのエキソン７にコードされたドメインを介してＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に結合することを示した（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１−５７６７（１９９６））。さらに、ＶＥＧＦエキソン７＋８にコードされたペプチドを含むＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８）は、２３１細胞およびＨＵＶＥＣに関連したＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１への¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合を完全に阻害する（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１−５７６７（１９９６）；Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、３１５８２−３１５８８（１９９７））。ＰＡＥ／ＮＰ−１細胞を添加した場合、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１への結合を完全に阻害した（図１０、レーン１と比較したレーン２）。一方、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＫＤＲへの結合は、全く阻害されなかった（図１０、レーン３と比較したレーン４）。従って、これらの結果は、ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８が、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１とは直接結合するが、ＫＤＲとは結合しないことを実証する。ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８の効果は異なっているが、細胞内においてＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１およびＫＤＲ（ＰＡＥ／ＫＤＲ／ＮＰ−１）の両方を同時発現する。図８および９の結果と一致して、ＰＡＥ／ＫＤＲ／ＮＰ−１細胞中の¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＫＤＲとの結合の程度（図１０、レーン５）は、親のＰＡＥ／ＫＤＲ細胞よりも大きかった（図１０、レーン３）。興味深いことに、ＰＡＥ／ＫＤＲ／ＮＰ−１細胞において、ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８は、期待したように¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１への結合を完全に阻害するだけでなく、予期しなかったＫＤＲへの結合もまた実質的に阻害した（図１０、レーン５と比較したレーン６）。ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８の存在下において、これらの細胞内での¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＫＤＲへの結合は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を発現していない親のＰＡＥ／ＫＤＲ細胞において見られたレベルに対して減少した（図１０、レーン３および４と比較したレーン６）。融合タンパク質は、ＫＤＲに直接結合しないので、これらの結果は、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１への直接的な結合を阻害することが、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＫＤＲへの間接的な結合を阻害することを示唆する。図８、９および１０の結果を組み合わせると、ＶＥＧＦ₁₆₅とＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１との相互作用が、ＫＤＲとＶＥＧＦの相互作用を増強することを示唆する。

（ニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）は、アイソフォーム−特異的ＶＥＧＦ₁₆₅レセプターである）
最近、本発明者らは、ＶＥＧＦ₁₆₅と結合するがＶＥＧＦ₁₂₁とは結合せず、従って本発明者らがＶＥＧＦ₁₆₅Ｒと名づけた新規な１３０〜１３５ｋＤａのＶＥＧＦ細胞表面レセプターを記載した（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１−５７６７（１９９６））。本発明者らは、現在そのクローニングしたｃＤＮＡを発現するＶＥＧＦ₁₆₅Ｒを精製し、そしてこれがヒトニューロピリン−１（ＮＰ−１）と同一であることを示した（ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０ ７３９−７５１（１９９７））。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒが、ＮＰ−１と同一であることの証拠およびＮＰ−１が、ＶＥＧＦ₁₆₅のレセプターとして機能することの証拠は、以下のようである：ｉ）ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１（２３１）細胞からのＶＥＧＦ₁₆₅Ｒタンパク質の精製は、ＶＥＧＦ親和性を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色法により１３０〜１４０ｋＤａの二重線を得た。両方のタンパク質のＮ末端配列決定から、マウスＮＰ−１との高い相同性が実証された、１８のアミノ酸の同じＮ末端配列が得られた（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２９、１〜１７（１９９５））；ｉｉ）本発明者らは、ヒト２３１細胞からＶＥＧＦ₁₆₅Ｒを精製した後、ヒトＮＰ−１のクローニングを報告し（ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０、７３９−７５１（１９９７））、そしてヒトＶＥＧＦ₁₆₅ＲのＮ末端配列が、ヒトＮＰ−１のＮ末端領域の配列と同一であることを見出した；ｉｉｉ）２３１細胞ｃＤＮＡライブラリーを用いた発現クローニングによりいくつかのｃＤＮＡクローンを単離し、そしてそれらの配列は、ヒトＮＰ−１ｃＤＮＡ配列と同一であった（ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０、７３９−７５１（１９９７））。精製および発現クローニングの組み合わせは、発現クローニングのみを用いた以前の研究よりも、ＮＰ−１タンパク質のＮ末端の明白な同定を可能にする利点を有する（ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０、７３９−７５１（１９９７）；Ｋｏｌｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ ９０、７５３−７６２（１９９７））；ｉｖ）ＮＰ−１遺伝子発現のノザンブロット分析は、以前の¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅架橋実験と一致した（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１−５７６７（１９９６））。ＶＥＧＦ₁₆₅がＶＥＧＦ₁₆₅Ｒに結合した細胞は、比較的多量のＮＰ−１ ｍ ＲＮＡを合成したが、一方、たとえあるにしても非常に少量のＶＥＧＦ₁₆₅結合を示す細胞は、たとえあるにしても大してＮＰ−１ ｍＲＮＡを合成しなかった；ｖ）ＮＰ−１がＰＡＥ細胞において発現された場合、親細胞ではないがトランスフェクトされた細胞が、ＶＥＧＦ₁₂₁とは結合できないが、ＶＥＧＦ₁₆₅と結合し得、このことは、前述のＨＵＶＥＣおよび２３１細胞が示した、アイソフォームの結合特性と一致した（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１−５７６７（１９９６））。さらに、ＮＰ−１を発現するＰＡＥとの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅結合のＫ_dは、約３×１０^-10Ｍであり、以前の２３１細胞およびＨＵＶＥＣの結合Ｋ_d値である２〜２．８×１０^-10Ｍと一致した（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１−５７６７（１９９６））；およびｖｉ）ＶＥＧＦ₁₆₅のＮＰ−１ポスト−トランスフェクションを発現する細胞との結合は、このリガンドのＨＵＶＥＣおよび２３１細胞への結合であるので、ヘパリンの存在下においてより効果的であった（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、６０９３−６０９８（１９９２）；Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１−５７６７（１９９６））。これらの結果を合わせると、ＶＥＧＦ₁₆₅ＲがＮＰ−１と同一であるということだけでなくアイソフォーム特異的な方法によって、ＶＥＧＦ₁₆₅を結合する機能的レセプターであるということを示す。従って、本発明者らは、このＶＥＧＦレセプターをＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１と命名した。

ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｃＤＮＡの発現クローニングに加えて、別のヒトｃＤＮＡクローンを、単離した。これから予測されるアミノ酸配列は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１のアミノ酸配列と４７％相同性であり、そして最近クローニングされた、ラットニューロピリン−２（ＮＰ−２）と９０％を超えて相同であった（Ｋｏｌｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ ９０、７５３−７６２（１９９７））。ＮＰ−２は、コラプシン／セマフォリンファミリーのメンバーを選択的に結合する（Ｃｈｅｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １９、５４７−５５９（１９９７））。

ＮＰ−１が、ＶＥＧＦ₁₆₅のレセプターとして働くという発見は、ＮＰ−１は、以前胚の発達中に神経系とのみ関連すると示されており（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２９、１−１７（１９９５）；Ｔａｋａｇｉら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７０、２０７−２２２（１９９５））、そしてごく最近、コラプシン／セマファリンファミリーのメンバーのレセプターとして働くことが発見された（ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０、７３９−７５１（１９９７）；Ｋｏｌｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ ９０、７５３−７６２（１９９２））ために驚きであった。ＮＰ−１は、初めＸｅｎｏｐｕｓの視覚系の発達において同定された、１３０〜１４０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質である（Ｔａｋａｇｉら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２２、９０−１００（１９８７）；Ｔａｋａｇｉら、Ｎｅｕｒｏｎ ７、２９５−３０７（１９９１））。神経系におけるＮＰ−１の発現は、発達中および特にアクソンが神経網を活発に形成している場合、それらの発達段階に関連して、空間的および時間的に高く制御される（Ｆｕｊｉｓａｗａら、Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７、３４３−３４９（１９９５）；Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２９、１−１７（１９９５）；Ｔａｋａｇｉら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７０、２０７−２２２（１９９５））。ＮＰ−１タンパク質は、ニューロンのアクソンとは関連があるが、小孔とは関連がない（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２９、１−１７（１９９５））。機能的には、ニューロピリンは、インビトロにおいて視覚神経繊維の神経突起成長の促進を示し（Ｈｉｒａｔａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１７、１５９−１６９（１９９３））、そして細胞の接着性の促進を示した（Ｔａｇａｋｉら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７０、２０７−２２２（１９９５））。標的化されたＮＰ−１の破壊によって、末梢神経系の遠心性繊維の軌道に重篤な異常を生じる（Ｋｉｔｓｕｋａｗａら、Ｎｅｕｒｏｎ １９、９９５−１００５（１９９７））。これらの研究にもとづいて、ＮＰ−１が、アクソンの成長およびガイダンスにおいて神経細胞認識分子の役割を果たしていることが示唆された（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２９、１−１７（１９９５）；ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０、７３９−７５１（１９９７）；Ｋｉｔｓｕｋａｗａら、Ｎｅｕｒｏｎ １９、９９５−１００５（１９９７）；Ｋｏｌｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ ９０、７５３−７６２（１９９７））。

本発明者らの結果は、最初、Ｘｅｎｏｐｕｓ、ニワトリ、およびマウスにおいて発現しているＮＰ−１が、発達および初期の出生後段階を制限していることを示した初期の研究（Ｆｕｊｉｓａｗａら、Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７、３４３−３４９（１９９５）；Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２９、１−１７（１９９５）；Ｔａｋａｇｉら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７０、２０７−２２２（１９９５））とは逆に、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１がまた、成体組織においても発現していることを示した。例えば、マウスにおいてＮＰ−１は、発達中の神経系で９日目に背根神経節において発現され始め、１５日目に中断される（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２９、１−１７（１９９５））。本発明者らのヒト成体組織のノーザンブロット分析が、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓において、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｍＲＮＡ転写産物の相対的に高レベルを実証した。興味深いことに、マウス神経系の発現の研究と一致して、成人の脳において非常に少ない相対的な発現がみられる（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２９、１−１７（１９９５））。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１はまた、ＥＣおよび種々の腫瘍由来の細胞を含む培養された多くの非神経細胞株において発現される。これらの細胞におけるＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の考えられる機能は、以下に考察される脈管形成を媒介している可能性がある。

さらに、ＮＰ−１は、ラットＥ１４脊髄および背根神経節（ＤＲＧ）組織から得られたｃＤＮＡライブラリーの発現クローニングによりコラプシン／セマフォリンファミリーのレセプターとして同定された（ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０、７３９−７５１（１９９７）；Ｋｏｌｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ ９０、７５３−７６２（１９９７））。コラプシン／セマフォリン（コラプシン−Ｄ−１／セマＩＩＩ／セムＤ）は、反発的な成長円錐およびアクソンガイダンスにおいて機能する膜貫通および分泌糖タンパク質の大きなファミリーを含む（Ｋｏｌｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ ７５、１３８９−１３９９（１９９３））。ＤＲＧ細胞のセマＩＩＩの反発的な効果は、抗ＮＰ−１抗体によりブロックされた（ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０、７３９−７５１（１９９７）；Ｋｏｌｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ ９０、７５３−７６２（１９９７））。ＮＰ−１に結合しているセマＩＩＩのＫ_dは０．１５〜３．２５×１０^-10Ｍであり（ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０、７３９−７５１（１９９７）；Ｋｏｌｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ ９０、７５３−７６２（１９９７））、これは約３×１０^-10Ｍである、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に結合するＶＥＧＦ₁₆₅の値と類似している。これらの結果は、明らかに異なる生物学的活性を有する２つの構造的に異なるリガンド、一方のＥＣ移動および増殖のＶＥＧＦ誘導刺激、および他方の神経細胞のセマＩＩＩ誘導相反化学斥力が、同じレセプターに結合し、類似した親和力を有することを示す。興味深い疑問は、２つのリガンドがＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の同じ部位に結合するか、または異なった部位に結合するかである。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１は、その外部ドメインに５つの別々のドメインを有し、そしてそれは、ＮＰ−１のタンパク質モジュールのこの多様性は、ＮＰ−１のための複数の結合リガンドの可能性と一致することが示唆されてきた（Ｔａｋａｇｉら、Ｎｅｕｒｏｎ ７、２９５−３０７（１９９１）；Ｆｅｉｎｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ １９ ５３９−５４５（１９９７）；ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０、７３９−７５１（１９９７））。予備的な分析は、セマＩＩＩとＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に結合するＶＥＧＦの原因であるＶＥＧＦエキソン７との間の配列相同性で全く大きな値を示さなかった（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１−５７６７（１９９６））。しかし、それらは、２つのリガンド間においていくつかの３次元構造が類似し得る。神経および血管の両方が、分岐および方向性移動を示すので、ＶＥＧＦ₁₆₅が、いくらかの神経ガイダンス活性を示すのかどうか、およびセマＩＩＩが、いくらかのＥＣ成長因子活性を有するのかどうかという疑問がまた生じる。これらの可能性は、いまだ調べられていなかった。しかし、ＶＥＧＦは、最適なＥＣ成長因子活性のために２つのレセプター、ＫＤＲおよびＮＰ−１を必要とし得（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、３１５８２−３１５８８（１９９７））、そしてセマＩＩＩは、ＮＰ−１およびまだ決定されていない最適な化学斥力活性のための高親和性レセプターを必要とし得（Ｆｅｉｎｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ １９、５３９−５４５（１９９７）；ＨｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ ９０、７３９−７５１（１９９７）；Ｋｉｔｓｕｋａｗａら、Ｎｅｕｒｏｎ １９、９９５−１００５（１９９７））、その結果、ＮＰ−１単独での存在は、これらのリガンドの新規な生物学的活性を示すために十分ではあり得ない。さらなる研究は、神経発生を制御するメカニズムと脈管形成を制御するメカニズムとの間にいくらかの関係があるのかどうかについて決定する。

（脈管形成におけるＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の役割）
ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１は、ＶＥＧＦ₁₆₅のＫＤＲへの結合を制御し、マウスでのＫＤＲノックアウト実験によって確かめられた脈管形成の重要なレギュレーターであるＲＴＫとの高い親和性を示す（Ｓｈａｌａｂｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３７６、６２−６６（１９９５））。ＫＤＲのＶＥＧＦ₁₆₅に対する親和性は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に対する親和性よりも約５０倍高い（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７、６００３−６０９６（１９９２）；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２６９８８−２６９９５（１９９４））。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１およびＫＤＲが、同時発現する場合、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＫＤＲへの結合は、ＫＤＲ単独を発現する細胞発現と比較して約４倍まで増強される。結合の増強は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１およびＫＤＲを同時発現する安定したクローン（ＰＡＥ／ＫＤＲ／ＮＰ−１細胞）においてそしてまた、過渡的にＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１クローンの選択が起こらないｃＤＮＡとトランスフェクトしたＰＡＥ／ＫＤＲ細胞において実証され得る。逆に、ＰＡＥ／ＫＤＲ／ＮＰ−１細胞における¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１への結合が、ＶＥＧＦエキソン７＋８（ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８）を含むＧＳＴ融合タンパク質によって、完全に阻害される場合、ＫＤＲへの結合は、実質的に阻害され、ＫＤＲ単独を発現する細胞において観察されるレベルに低下する。融合タンパク質は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に直接結合するが、ＫＤＲには直接結合することができない（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、３１５８２−３１５８８（１９９７））。理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、ＶＥＧＦ₁₆₅は、エキソン７にコードされたドメインを介してＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に結合し、そしてＶＥＧＦ₁₆₅は、エキソン４にコードされたドメインを介してＫＤＲとの結合を促進すると考えている（図１１）。その比較的高いレセプター／細胞数（約０．２〜２×１０⁵）を有するＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７、６００３−６０９６（１９９２）；Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１−５７６７（１９９６））は、細胞表面上のＶＥＧＦ₁₆₅を濃縮する役割を果たし、それゆえ、ＫＤＲとＶＥＧＦ₁₆₅のより強い接近を提供するようである。あるいは、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１との結合により、ＶＥＧＦ₁₆₅は、ＫＤＲとの結合を増強する構造変化をうける。最終的な結果は、ＫＤＲシグナル伝達の上昇、およびＶＥＧＦ活性の増加であった。本発明者らは、ＫＤＲとの結合の増強を実証し得るが、現在までのところ、本発明者らは、ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞と比較した、ＰＡＥ／ＫＤＲ／ＮＰ−１細胞に対するＶＥＧＦの分裂促進性の増強は実証し得なかった。理由の１つは、これらの細胞株が、ＨＵＶＥＣが行なう場合のように、ＶＥＧＦに応答して容易に増殖しないことである（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２６９８８−２６９９５（１９９４））。それにもかかわらず、本発明者らは、ＫＤＲおよびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の両方に結合するＶＥＧＦ₁₆₅が、ＫＤＲにのみ結合するＶＥＧＦ₁₂₁よりも、ＨＵＶＥＣのよりよい分裂促進因子であることを見出した（Ｋｅｙｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５６３８−５６４６（１９９６ｂ）；Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、３１５８２−３１５８８（１９９７））。さらに、ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８によるＨＵＶＥＣにおいてのＶＥＧＦ₁₆₅のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１への結合阻害は、ＫＤＲへの結合を阻害し、そしてまた、ＶＥＧＦ₁₆₅により誘導されたＨＵＶＥＣ増殖を阻害し、ＶＥＧＦ₁₂₁により誘導されたレベルよりも低くする（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、３１５８２−３１５８８（１９９７））。これらの結果を組み合わせると、ＶＥＧＦ₁₆₅の媒介におけるＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の役割が示唆されるが、ＶＥＧＦ₁₂₁の分裂促進因子活性における役割は示唆しない。二重レセプターが、成長因子の結合および活性を制御するという概念は、以前ＴＧＦ−β、ｂＦＧＦおよびＮＧＦにおいて実証されている（Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｓｉｌｌａｓら、Ｃｅｌｌ ６７、７８５−７９５（１９９１）；Ｙａｙｏｎら、Ｃｅｌｌ ６４、８４１−８４８（１９９１）；Ｂａｒｂａｃｉｄ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７、１４８−１５５（１９９５））。

ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１と脈管形成との間の別の関連は、ＮＰ−１が、トランスジェニックマウスで局所的に過剰発現したという研究から明らかになる（Ｋｉｔｓｕｓｋａｗａら、Ｄｅｖｅｌｏｐ．１２１、４３０９−４３１８（１９９５））。ＮＰ−１の過剰発現は、子宮内において、胎齢１５．５日以前に胚の致死およびマウスの死を引き起こし、そしてそのうち最も良く生き残ったものは、ＮＰ−１が、低レベルで発現していた。ＮＰ−１を過剰発現するマウスは、血管、心臓、および手足のような数の限られた非神経組織において形態学的な異常を示した。ＮＰ−１は、ＥＣおよびＥＣの周囲の間葉細胞の両方において発現した。胚は、正常な対応物と比較して、過剰なそして異常な毛細血管および血管を有し、そしていくらかの場合において拡張した血管も同様に有していた。いくつかのキメラマウスが、主に頭部や首に出血を示した。これらの結果は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１の局所的な過剰発現が、ＶＥＧＦ₁₆₅の不適切な活性を引き起こし、その結果、脈管形成の増強および／または異常を媒介する可能性と一致する。ＮＰ−１と脈管形成との間の関連についての証拠の別の一部は、ＮＰ−１遺伝子の破壊を標的化されたマウスにおいて胚が、末梢神経系の重篤な異常を有したが、子宮内で１０．５から１２．５胎齢で死亡したのは、ほとんどがおそらく心臓血管系における異常のためであるということを示す最近の報告に起因する（Ｋｉｔｓｕｋａｗａら、Ｎｅｕｒｏｎ １９、９９５−１００５（１９９７））。

（ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１は、腫瘍由来細胞と関連している） 本発明者らが今までに検出した最も高い程度のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１発現は、ＨＵＶＥＣにおいて生じるよりもさらに、２３１乳癌細胞およびＰＣ３前立腺癌細胞のような腫瘍由来細胞において生じた。この腫瘍細胞は、大量なレベルのＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１ ｍＲＮＡおよび約２００，０００のＶＥＧＦ₁₆₅レセプター／細胞を発現する（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１−５７６７（１９９６））。一方、これらの腫瘍細胞は、ＫＤＲまたはＦｌｔ−１を発現せず、その結果、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１は、これらの細胞と関連する唯一のＶＥＧＦレセプターである。それゆえ、この腫瘍細胞は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１が、ＫＤＲのバックグラウンドの欠如におけるＶＥＧＦ₁₆₅の機能的なレセプターかどうかを試験するために有用である。現在までのところ、本発明者らは、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１が、レセプターチロシンのリン酸化により測定された腫瘍由来細胞におけるＶＥＧＦ₁₆₅シグナルを媒介することを示し得ない。それにもかかわらず、ＶＥＧＦ₁₆₅は、生存、分化または、運動性の増加のようなまだ活性を決定していないが、腫瘍細胞でいくらかの誘導による効果を有し得る。最近の報告で、神経膠腫細胞が、ＶＥＧＦ₁₆₅に結合するが、ＶＥＧＦ₁₂₁には十分に結合しない１９０ｋＤａのタンパク質を発現することを実証した（Ｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、２３３１７−２３３２２（１９９７））。チロシンリン酸化の刺激のないことは、このレセプターへのＶＥＧＦ₁₆₅の結合において実証され得る。１９０ｋＤａのアイソフォーム特異的レセプターが、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１と関連があるかどうかについては、まだ知られていない。

ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１は、ＶＥＧＦ₁₆₅のための保存機能および隔絶機能を有し得る。ＶＥＧＦ₁₆₅が、腫瘍細胞により産生され、そしてエキソン７にコードされるドメインを介して細胞上のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に結合することが想定され得る（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５７６１−５７６７（１９９６））。次いで、蓄えられたＶＥＧＦ₁₆₅は、パラクリン様式で放出され腫瘍脈管形成を刺激し得る。あるいは、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１は、ＶＥＧＦ₁₆₅が、エキソン７にコードされたドメインを介した腫瘍細胞上のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１に結合し、そしてまたをエキソン４にコードされたドメインを介して近傍のＥＣ上のＫＤＲに結合するジャクスタクリン効果を媒介し得る（Ｋｅｙｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５６３８−５６４６（１９９６ｂ））。そのようなメカニズムが、ＥＣを誘引する腫瘍細胞のためにより効率的な方法を生じ得、それにより、腫瘍脈管形成を増強する。

要約すると、本発明者らは、独立した精製および発現クローニング方法により、ＶＥＧＦアイソフォーム特異的レセプターであるＶＥＧＦ₁₆₅Ｒが、神経系の胚発生において役割を果たすとして、そしてコラプシン／セマフォリンのレセプターであるとして以前に同定された細胞表面タンパク質である、ＮＰ−１と同一であることを実証した。さらに、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１への結合は、ＶＥＧＦ₁₆₅の、ＥＣおよび腫瘍細胞上のＫＤＲへの結合を増強する。

（実験の理論的根拠）
本発明者らは、腫瘍細胞ニューロピリン−１が、腫瘍細胞の運動性を媒介し、そしてそれにより転移することを発見した。ボイデンチャンバー運動性アッセイにおいて、ＶＥＧＦ₁₆₅（５０ｎｇ／ｍｌ）が、用量応答様式で最大で２倍の刺激で２３１乳癌細胞の運動性を刺激する（図１５Ａ）。一方、ＶＥＧＦ₁₂₁は、これらの細胞の運動性に効果を有さなかった（図１５Ｂ）。２３１細胞は、ＫＤＲまたはＦｌｔ−１を発現しないことから、これらの結果は、腫瘍細胞が、直接ＶＥＧＦ₁₆₅と応答することを示唆し、そしてＶＥＧＦ₁₆₅が、ニューロピリン−１を介したシグナル腫瘍細胞であり得ることを示唆する。癌細胞の運動性を誘導するＶＥＧＦ₁₆₅を媒介するための可能性のある候補は、ＰＩ３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：１５３−１５８）である。２３１細胞は、ＫＤＲまたはＦｌｔ−１を発現しないことから、これらの結果は、腫瘍細胞が直接ＶＥＧＦ₁₆₅と応答することを示唆し、そしてＶＥＧＦ₁₆₅が、ニューロピリン−１を介したシグナル腫瘍細胞であり得ることを示唆する。

他のタイプの証拠は、ニューロピリン−１発現が、腫瘍細胞の運動性と関連し得るということである。本発明者らは、低い運動性および低い潜在的転移性を有するＡＴ２．１細胞、および高い運動性および転移性を有するＡＴ３．１細胞という、ダンニング（Ｄｕｎｎｉｎｇ）ラット前立腺癌細胞の２つの改変体について分析した。架橋分析およびノーザンブロット分析は、ＡＴ２．１細胞は、ニューロピリン−１を発現しないが、ＡＴ３．１細胞は、豊富にニューロピリン−１を発現し、ＶＥＧＦ₁₆₅と結合し得ることを示す（図１６）。腫瘍切片の免疫染色により、ＡＴ３．１におけるニューロピリン−１の発現を確かめたが、ＡＴ２．１腫瘍では、確認できなかった。さらに、免疫染色は、皮下のＡＴ３．１およびＰＣ３腫瘍において、ニューロピリン−１を発現する腫瘍細胞が、腫瘍／真皮の境界の前面に優先的に侵入するのが見出されることを示す。より直接的に、ニューロピリン−１の発現が、運動性の増強と関係しているのかどうかを決定するために、ニューロピリン−１をＡＴ２．１細胞において過剰発現させた（図１７）。ニューロピリン−１を過剰発現する３つの安定なＡＴ２．１クローン細胞が、ボイデンチャンバーアッセイにおいて運動性を増強した。これらの結果は、ＡＴ２．１細胞におけるニューロピリン−１の過剰発現が、それらの運動性を増強することを示す。合わせて考えると、腫瘍細胞上でのニューロピリン−１の発現が、運動性、転移性の表現型に関係しているようである。

（実施例２）
（ＮＰ−１およびｓＮＰ−２の構築）
ニューロピリン−１およびニューロピリン−２の可溶性形態をコードしているｃＤＮＡを、ＰＣ３細胞ｍＲＮＡから合成したオリゴｄＴ−プライマーｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。

（可溶性ニューロピリン−１（ｓＮＰ−１）のｃＤＮＡクローニング）
ｓＮＰ−１のｃＤＮＡは、エキソンとエキソンの境の位置のアミノ酸６４１位の後のｂ２とｃドメインとの間の全長のＮＰ−１ ｃＤＮＡから逸脱する。ｓＮＰ−１クローンの３’末端は、３つの新規なアミノ酸および翻訳終止コドンをコードする２８ｂｐのイントロン配列を有する。

ｂ１ドメイン中から設計された、オリゴヌクレオチド（ＧＡＡＧＴＡＴＡＣＧＧＴＴＧＣＡＡＧＡＴＡ 配列番号１６）を、ｓＮＰ−１ ｃＤＮＡの３’末端をクローニングするために３’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速な増幅）に用いた。ｓＮＰ−１ ｃＤＮＡの全長を、ｓＮＰ−１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’末端（ＧＣＧＴＴＣＣＴＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＣ 配列番号１７）および３’末端（ＣＡＧＧＴＡＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＣ 配列番号１８）のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによりＰＣ３ライブラリーから続いてクローニングした。ｓＮＰ−１ ｃＤＮＡを、ｓＮＰ−１の４３位と４４位との間のアミノ酸のａ１ドメインのＮ末端におけるＨｉｓおよびｃ−ｍｙｃドメイン（アミノ酸 ＨＨＨＨＨＨＱＱＫＬＩＳＱＱＮＬ 配列番号２３）でタグ化した。完全にタグ化したｓＮＰ−１ ｃＤＮＡを、哺乳動物の発現プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングした。ｓＮＰ−１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５および６として配列表に示す。

（可溶性ニューロピリン−２（ｓＮＰ−２）ｃＤＮＡクローニング）
ｓＮＰ−２ ｃＤＮＡが、エキソンとエキソンの境の位置の、アミノ酸５４７位の後のｂ２ドメイン中のＮＰ−２ ｃＤＮＡの全長から逸脱する。ｓＮＰ−２クローンの３’末端が、８つの新規なアミノ酸および翻訳終止コドンをコードする１４６ｂｐのイントロン配列を有する。

ｂ１ドメイン中から設計された、オリゴヌクレオチド（ＧＧＣＴＧＣＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＡＴＧＣ 配列番号２０）を、ｓＮＰ−２ ｃＤＮＡの３’末端をクローニングするために３’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速な増幅）に用いた。ｓＮＰ−２ ｃＤＮＡの全長を、ｓＮＰ−２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’末端（ＡＴＧＧＡＴＡＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＣ 配列番号２１）および３’末端（ＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＴＣＴＧＴＡＡ 配列番号２２）のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによりＰＣ３ライブラリーから続いてクローニングした。ｓＮＰ−２ ｃＤＮＡを、ｓＮＰ−２の３１位と３２位との間のアミノ酸のａ１ドメインのＮ末端におけるＨｉｓおよびｃ−ｍｙｃドメイン（アミノ酸 ＨＨＨＨＨＨＱＱＫＬＩＳＱＱＮＬ 配列番号１９）でタグ化した。完全にタグ化されたｓＮＰ−２ ｃＤＮＡを、哺乳動物の発現プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングした。ｓＮＰ−２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７および８として配列表に示す。

（実施例３）
（可溶性ＮＰ−１の調製（ドメインＡＢおよびＣ））
１．ＢａｍＨＩ部位（１００塩基目）とＸｂａＩ部位（４６８７塩基目）との間のＮＰ−１の配列を、ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌａ ＣＡ）のＢａｍＨＩ部位とＸｂａＩ部位との間にサブクローニングして、ｐＢＳ−ＮＰ１を得た。

２．ＰＣＲを、ＮＰ−１配列において以下のプライマーを用いて行なった：プライマー１（正方向）：ＮＰ−１の２２００塩基目のＮｄｅＩ部位（太字および下線）

プライマー２（逆方向）：６ヒスチジン（ｈｉｓ−ｔａｇ）およびＸｂａＩ部位（太字および下線）を含むＮＰ−１の２８２３塩基目の膜貫通膜ドメインの外

ＰＣＲ ＤＮＡ産物（およそ、６００ｂｐ）を、ＮｄｅＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、そしてアガロースゲルから精製した。プラスミドｐＢＳ−ＮＰ１を、ＮｄｅＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、そしてＮＰ−１の細胞外部位を含む大きなフラグメントを、アガロースゲルから精製し、そしてベクターとして用いた。上述のＰＣＲ産物およびベクターのライゲーションを行ない、そして得られたプラスミドを、ｐＢＳ−ｓＮＰｈｉｓと名づけた。

３．プラスミドｐＢＳ−ｓＮＰｈｉｓを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、そしてＮＰ−１の細胞外部分を含むフラグメント（ｈｉｓ−ｔａｇ含む）を、ｐＣＰｈｙｇｒｏ（上述の実施例およびＳｏｋｅｒら、Ｃｅｌｌ ９２：７３５（１９９８）に記載）のＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位にサブクローニングしてｐＣＰｈｙｇ−ｓＮＰｈｉｓを得た。

４．プラスミドｐＣＰｈｙｇ−ｓＮＰｈｉｓを、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、そしてハイグロマイシン耐性クローンを選択し、そして可溶性ＮＰ−１の発現を試験した。可溶性ＮＰ−１を、ニッケルセファロースビーズを用いて培地より精製した。

５．以下の手法により、クローンにおけるｓＮＰ−１の発現を試験した。培地を、２４時間馴化し、そして馴化した培地を、２４時間レクチンＣｏｎＡと共にインキュベートした。ＣｏｎＡ結合原料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびニューロピリン−１のＡドメインに対する抗体を用いるウェスタンブロッティングによって分析した。

本明細書中を通して引用される参考文献は、本明細書中に参考として援用される。

本発明は、特定の実施態様についての参照とともに記載されている。しかし、この適用は、その添付の請求項の精神および範囲を逸脱せずに、当業者によってなされ得るそれらの変更および置換を包含することが意図される。
（配列表）

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。