JP2012036151A - 人工リンパ節の作製方法 - Google Patents
人工リンパ節の作製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012036151A JP2012036151A JP2010179889A JP2010179889A JP2012036151A JP 2012036151 A JP2012036151 A JP 2012036151A JP 2010179889 A JP2010179889 A JP 2010179889A JP 2010179889 A JP2010179889 A JP 2010179889A JP 2012036151 A JP2012036151 A JP 2012036151A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lymph node
- polymer carrier
- node tissue
- ccl19
- artificial lymph
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 title claims abstract description 96
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 67
- 101000713106 Homo sapiens C-C motif chemokine 19 Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102100036842 C-C motif chemokine 19 Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 102100025277 C-X-C motif chemokine 13 Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 101000858064 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 13 Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102100036846 C-C motif chemokine 21 Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 101000713085 Homo sapiens C-C motif chemokine 21 Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 claims description 27
- 239000000515 collagen sponge Substances 0.000 claims description 14
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 6
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 3
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 claims description 3
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 claims description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001432 poly(L-lactide) Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 claims description 3
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 claims description 3
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 claims 2
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 claims 2
- 101000742596 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor C Proteins 0.000 claims 1
- 102100038232 Vascular endothelial growth factor C Human genes 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 26
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 19
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 18
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 18
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 5
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000001902 CC Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010040471 CC Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 108050006947 CXC Chemokine Proteins 0.000 description 2
- 102000019388 CXC chemokine Human genes 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 2
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108050005711 C Chemokine Proteins 0.000 description 1
- 102000017483 C chemokine Human genes 0.000 description 1
- 102000004325 CX3C Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010081635 CX3C Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101001057127 Homo sapiens Transcription factor ETV7 Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101000764297 Mus musculus Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 102100027263 Transcription factor ETV7 Human genes 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000001099 axilla Anatomy 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N silanamine Chemical compound [SiH3]N FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
【課題】ストローマ細胞を用いることなく、汎用的に適用できる人工リンパ節組織の形成方法を提供する。
【解決手段】（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインを、三次元構造を有する高分子担体に含浸させ、ストローマ細胞を含まないで、当該ケモカインを含浸させてなる人工リンパ節組織形成用高分子担体を、非ヒト動物に移植して、リンパ節組織を形成する方法による。
【選択図】図１
【解決手段】（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインを、三次元構造を有する高分子担体に含浸させ、ストローマ細胞を含まないで、当該ケモカインを含浸させてなる人工リンパ節組織形成用高分子担体を、非ヒト動物に移植して、リンパ節組織を形成する方法による。
【選択図】図１
Description
本発明は、無細胞系で人工リンパ節組織を形成する方法及び人工リンパ節組織形成用高分子担体に関する。具体的には、ストローマ細胞や樹状細胞を特に使用することなく、特定のケモカインを含浸させてなる人工リンパ節組織形成用高分子担体を哺乳動物に移植することによって、例えばマウスの系統や動物種に関わりなく、人工リンパ節組織を形成する方法に関するものである。
リンパ節は、リンパ球が抗原提示細胞から抗原情報を受け取り、抗原特異的な獲得免疫反応を惹起するための重要な場所であり、病原微生物や癌細胞を排除して生体を防御するために必須の組織である。さらに、一度その脅威に遭遇するとその情報は免疫学的に記憶され、二度目の同じ脅威に対して速やかに強力な免疫反応が誘導されるが、リンパ節はこのような免疫メモリーの形成や二次反応の中心的な場にもなっている。
このようなリンパ節の機能やメカニズムを解明する方法の１つとして、三次元的に構成された人工の免疫組織の構築について検討され、本発明者らの一部は、先に、サイトカインを産生するストローマ細胞や樹状細胞を含浸させたコラーゲンスポンジをマウスの腎皮膜下に移植して人工的にリンパ節組織を形成する方法を報告している（非特許文献１、特許文献１）。
人工リンパ節の構築と応用に関し、マウスリンホトキシンアルファ（LTα）又はCCL21、CXCL13及びCCL19の遺伝子を含む発現ベクターを組み込んだストローマ細胞（TEL-2細胞）と樹状細胞を含浸させたコラーゲンスポンジを、マウスの腎皮膜下に移植することによりリンパ節組織が形成されたこと、当該リンパ節を免疫を受けていないマウスに移植し、抗原刺激すると、抗原特異的なＩｇＧ抗体が誘導されることが記載されている（非特許文献１−３）。
リンホトキシン、CCL21、CCL19、CXCL13、IL-7及びLTβからなるサイトカインを産生することができるストローマ細胞及びコラーゲンスポンジ、さらに樹状細胞を含む人工リンパ節が開示されている（特許文献１）。
抗原で非ヒト動物を免疫し、当該動物に、サイトカインを産生することができるストローマ細胞を含むコラーゲンスポンジを移植して、抗原特異的な抗体及び抗原特異的Ｔ細胞を産生する人工リンパ節を形成することが記載されている（特許文献２）。
抗原で非ヒト動物を免疫し、当該動物に、サイトカインを産生することができるストローマ細胞を含むコラーゲンスポンジを移植して人工リンパ節を形成する。次いで、当該人工リンパ節を免疫不全非ヒト動物に移植し前記抗原で免疫した後、脾臓を取り出し、当該細胞をミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを形成することが記載されている（特許文献３）。
しかしながら、これらいずれの先行文献に記載の人工リンパ節もその構成としてストローマ細胞を含むことを要件としている。従来、ストローマ細胞はリンパ節形成の支持細胞となることから、使用することが必須であると考えられていた（非特許文献３、特許文献１）。ストローマ細胞を使用する場合、使用するストローマ細胞によってリンパ節を形成させるためのマウスの系統や動物種が制限されるが、リンパ節を形成させるためのマウスの系統や動物種において適切に使用できるようなストローマ細胞を取得するのは困難である。先行技術文献には、無細胞系で人工リンパ節が形成できることについての記載も示唆もない。
Nature Biotechnology, 22, 1539-1545, 2004
The Journal of Clinical Investigation, 117, 997-1007, 2007
医学のあゆみ227巻5号407-412頁2008年
ストローマ細胞を使用する場合、使用するストローマ細胞によってリンパ節を形成させるためのマウスの系統や動物種が制限されるが、リンパ節を形成させるためのマウスの系統や動物種において適切に使用できるようなストローマ細胞を取得するのは困難である。そこで、本発明はこのような制限のない、汎用的に適用できる人工リンパ節の形成方法を提供することを課題とする。
少なくとも特定の３種のケモカインを、三次元構造を有する高分子担体に含浸させ、当該ケモカインを含浸させてなる人工リンパ節組織形成用高分子担体及びそれを非ヒト動物に移植して、人工リンパ節組織を形成する方法による。
即ち本発明は、以下よりなる。
１．（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインが、三次元構造を有する高分子担体に含浸されてなり、かつストローマ細胞を含まない人工リンパ節組織形成用高分子担体を、非ヒト動物に移植して、人工リンパ節組織を形成する方法。
２．人工リンパ節組織形成用高分子担体が、さらにVEGFA又はVEGFCを含浸している、請求項１記載の方法。
３．ケモカインが、CXCL12、CXCL13及びCCL19の少なくとも３種の組み合わせからなる、請求項１又は２記載の方法。
４．ケモカインが、CXCL12、CCL21及びCCL19の少なくとも３種の組み合わせから成る、請求項１又は２記載の方法。
５．三次元構造を有する高分子担体が、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリグリコール酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ナイロン、ポリエステル、ポリウレタン及びエチレンビニルアセテートから選択される１種又は複数種の組み合わせからなる高分子担体である請求項１〜４のいずれか１記載の方法。
６．三次元構造を有する高分子担体が、コラーゲンスポンジである、請求項１〜４のいずれか１記載の方法。
７．（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインが含浸された三次元構造を有する高分子担体からなり、ストローマ細胞を含まないことを特徴とする、人工リンパ節組織形成用高分子担体。
８．（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインに加え、さらにVEGFA又はVEGFCが含浸された三次元構造を有する高分子担体からなり、ストローマ細胞を含まないことを特徴とする、人工リンパ節組織形成用高分子担体。
９．三次元構造を有する高分子担体が、コラーゲンスポンジである、請求項７〜８記載の人工リンパ節組織形成用高分子担体。
１．（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインが、三次元構造を有する高分子担体に含浸されてなり、かつストローマ細胞を含まない人工リンパ節組織形成用高分子担体を、非ヒト動物に移植して、人工リンパ節組織を形成する方法。
２．人工リンパ節組織形成用高分子担体が、さらにVEGFA又はVEGFCを含浸している、請求項１記載の方法。
３．ケモカインが、CXCL12、CXCL13及びCCL19の少なくとも３種の組み合わせからなる、請求項１又は２記載の方法。
４．ケモカインが、CXCL12、CCL21及びCCL19の少なくとも３種の組み合わせから成る、請求項１又は２記載の方法。
５．三次元構造を有する高分子担体が、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリグリコール酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ナイロン、ポリエステル、ポリウレタン及びエチレンビニルアセテートから選択される１種又は複数種の組み合わせからなる高分子担体である請求項１〜４のいずれか１記載の方法。
６．三次元構造を有する高分子担体が、コラーゲンスポンジである、請求項１〜４のいずれか１記載の方法。
７．（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインが含浸された三次元構造を有する高分子担体からなり、ストローマ細胞を含まないことを特徴とする、人工リンパ節組織形成用高分子担体。
８．（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインに加え、さらにVEGFA又はVEGFCが含浸された三次元構造を有する高分子担体からなり、ストローマ細胞を含まないことを特徴とする、人工リンパ節組織形成用高分子担体。
９．三次元構造を有する高分子担体が、コラーゲンスポンジである、請求項７〜８記載の人工リンパ節組織形成用高分子担体。
本発明の方法によれば、ストローマ細胞を使用しなくとも人工リンパ節組織を形成することができ、レシピエントであるマウスの系統や動物種に関係なく、人工リンパ節組織を形成することができる。本発明の人工リンパ節組織は、リンパ節組織形成に関わる細胞やメカニズムの解明に有用である。また、本発明の人工リンパ節組織を使用すれば、様々な抗原に対する特異的抗体やエフェクターＴ細胞を効率よく作製することが可能となる。また、本発明の人工リンパ節組織を免疫力の著しく低下した重症感染症等の個体に一定期間装着し、免疫活性を高めて当該疾患を治癒することなどへの適用が可能となる。
本発明は、無細胞系で人工リンパ節組織を形成する方法及び人工リンパ節組織形成用高分子担体に関する。本発明において、人工リンパ節組織形成用高分子担体は、その材料としての三次元構造を有する高分子担体とは区別して使用される。材料としての高分子担体は、単に高分子担体という場合がある。
リンパ節とは、リンパ系組織（リンパ球が非リンパ系細胞と相互作用する組織）であって、リンパ球系の細胞の成熟や適応免疫応答に重要な役割を果たす組織器官である。本発明の人工リンパ節組織は、三次元構造を有する高分子担体周辺に、B細胞及びT細胞のリンパ球が集積して形成される細胞塊であり、当該細胞塊ではB細胞領域とT細胞領域が分かれて分布している。
本発明の汎用的に適用できる人工リンパ節組織形成用高分子担体は、三次元構造を有する高分子担体に、（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインを含浸させてなり、かつストローマ細胞を含まないものをいう。本発明の人工リンパ節組織は、当該人工リンパ節組織形成用高分子担体を動物に移植して、リンパ節組織を形成する方法による。
本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体には、上述の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインのほか、さらにVEGFA (Vascular Endothelial Growth Factor(血管内皮増殖因子）A）又はVEGFC (Vascular Endothelial Growth Factor C)を含んでいても良い。ストローマ細胞は、リンパ節組織を作製しようとするマウスの系統や動物種において適切に使用できるようなものを使用しなければならない。しかしながら、それぞれのマウスの系統や動物種に対して適切に使用できるようなストローマ細胞をそれぞれ取得するのは困難である。そのため、ストローマ細胞を使用する場合、使用するストローマ細胞によってリンパ節を形成させるためのマウスの系統や動物種が制限される。そこで、本発明では、マウスの系統や動物種において制限のない、汎用的に適用できる人工リンパ節組織形成方法を提供するものである。
本発明においてストローマ細胞とは、腺あるいは器官に特異的な固有の機能を持つ様々な細胞（実質細胞）を取り巻く微小環境を構成する細胞の総称であり、「支質細胞」ともいう。この「支質細胞」は、文字どおり実質の細胞を物理的に支持するとともに、細胞同士の相互作用により相手の細胞に何らかの作用を及ぼすという意味での支持機能も果たしていると考えられている。ストローマ細胞は、「支持細胞」のほか、「間質細胞」ともいう。
ケモカイン (Chemokine) とは、Ｇタンパク質共役受容体を介してその作用を発現する塩基性タンパク質であり、サイトカインの一群である。白血球などの遊走を引き起こし炎症の形成に関与する。ケモカインは構造上の違いからCCケモカイン、CXCケモカイン、Cケモカイン及びCX3Cケモカインに分類される。これまでに50種類以上のケモカインが同定されている。CCケモカインは、１次構造においてN末端側の2つのシステイン残基(C)が連続していることからこのように称される。また、CXCケモカインは、N末端側の２つのシステイン残基の間にその他のアミノ酸が１つ存在するという配列を有する(CXCモチーフ)。
本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体に含まれるケモカインとしては、CXCL13、CCL21、CCL19及びCXCL12が挙げられる。これらの起源は特に特定の生物種に限定されるものではないが、リンパ節組織を作製しようとする動物種に応じて選ぶのが好ましい。ヒト又はマウス由来のものとしては、CXCL13（Gunn, M. et al.,1998, Nature 391:788-803，Gunn, M.D. et al., 1998, Nature 391:799-803）、CCL21（Hedrick, J.A. and A. Zlotnik, 1997, J. Immunol. 159:1589-1593，Hedrick, J.A. and A. Zlotnik, 1997, J. Immunol. 159:1589-1593）、CCL19（Rossi, D. L. et al.,1997, J. Immunol. 158:1033-1036，Ngo, V.N. et al., 1998, J. Exp. Med. 188:181-191）及びCXCL12（UniProtKB/Swiss-Prot P48061(SDF1 HUMAN) Last modified May 18,2010. Version 111，Nagasawa, T.et al., 1994, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 91:2305-2309; Tashiro, K et l., 1993, Science 261:600-603）が挙げられる。ヒト又はマウス由来のCXCL13、CCL21、CCL19及びCXCL12は、R&Dシステムズ社（それぞれ、カタログ番号801-CX、470-BC、366-6C、457-6C、361-MI、440-M3、350-NS、460-SD）から購入することもできる。
本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体は、少なくとも３種のケモカイン、具体的には、（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも3種の組み合わせからなるケモカインの適当量、具体的には例えば、各々１ｎｇ〜０．１μｇ、好ましくは、各々２ｎｇ〜５０ｎｇ、特に好ましくは各々４ｎｇ〜１０ｎｇの範囲の量を生理食塩液や、ＰＢＳ等の緩衝液に溶解し、当該ケモカインを溶解した溶液を、上記三次元構造を有する高分子担体に滴下し、含浸させることにより、構築することができる。三次元構造を有する高分子担体の体積に対して１〜２倍量程度であれば、三次元構造を有する高分子担体に含浸させることができる。本発明においては、特に（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19の組み合わせが好適である。また、本発明においては、上記（１）又は（２）の少なくとも3種の組み合わせからなるケモカインに加えて、VEGFA又はVEGFCを上記ケモカインと同量程度含んでいるのがより好適である。VEGFA及びVEGFCの起源は特に特定の生物種に限定されるものではないが、例えば、ヒト由来VEGFCとして、UniProtKB/Swiss-Prot P49767(VEGFC HUMAN)Last modified June 15,2010. Version 98、マウス由来VEGFCとして、UniProtKB/Swiss-Prot P97953(VEGFC MOUSE)Last modified July 13,2010. Version 88が挙げられる。また、ヒト由来VEGFAとして、GenBank:AAH11177.2(NCBI Entrez Browser 2010年7月29日検索)、マウス由来VEGFAとして、GenBank:EDL23467.1(NCBI Entrez Browser 2010年7月29日検索)が挙げられる。
また、本発明において使用される三次元構造を有する高分子担体としては、高分子生体材料が挙げられ、より詳しくは、生体適合性高分子材料を利用することができる。本発明において「三次元構造」とはリンパ球や樹状細胞などのリンパ節構成細胞を、三次元的に組織化させるための足場（scaffold）を意味する。また、「生体適合性高分子材料」とは、「生体に何らかの方法で適用した時、生体が異物としてそれを排除しようとする反応を極力低く抑えるようにされた、様々な高分子から構成される材料」のことを意味する。
このような高分子担体としては、例えば、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリグリコール酸、ポリ−Ｌ−乳酸などが挙げられる。また、ナイロン、ポリエステル、ポリウレタンまたはエチレンビニルアセテートなどの非生体分解性の材料も、単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。
本発明の三次元構造を有する高分子担体は、それが生体分解性であっても、非生体分解性であってもよく、生体へ移植した際に、それ自身の抗原性による免疫反応および／または物理的刺激による炎症反応を起こしにくい素材である限り、任意の素材を用いることができる。ただし、本発明において使用される三次元構造を有する高分子担体が、人工リンパ節として機能するためには、人工リンパ節の構築に適した孔径（ポアサイズ）の多孔性の高分子担体、即ちスポンジ状であるのが好適である。このようなスポンジ状の高分子担体の孔径は、当業者により適宜決定され得る。
コラーゲンは、生体の構成成分であり、炎症反応や免疫反応を低く抑えられる点で、本発明の高分子担体として好ましい。また、「コラーゲンスポンジ」とは、コラーゲンを含むスポンジ構造を有する多孔性高分子担体を意味する。例えば、ウシアキレス腱の不溶性コラーゲンを凍結乾燥することにより、多孔性のスポンジ状にしたコラーゲンスポンジが得られ、本発明に利用可能である。
本発明は、人工リンパ節組織形成用高分子担体にも及ぶ。ここで、本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体とは、上記説明したように、（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも3種の組み合わせからなるケモカインが含浸されてなる三次元構造を有する高分子担体からなり、ストローマ細胞を含まないことを特徴とする。当該人工リンパ節組織形成用高分子担体は、ストローマ細胞を含まないことから、レシピエントとして、非ヒト動物、例えばマウス、ラットなど種を問わずに使用することができる。また、ストローマ細胞を含まないことから、ヒトについてもレシピエントとすることができる。
また、本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体の大きさは、レシピエントとしての動物の種類や移植部位により、適宜決定することができる。例えば、レシピエントがマウスであり、移植部位が腎被膜下の場合は、当該人工リンパ節組織形成用高分子担体の大きさは、１〜５ｍｍ×１〜５ｍｍ×１〜５ｍｍ、好ましくは、約３ｍｍ角とすることができる。
上記本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体を、レシピエントとしての動物に移植して、人工リンパ節を形成する。
本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体が移植される部位としては、用途目的に応じて異なるが、例えばマウスやラットにおいて実験動物構築のため、人工リンパ節モデル動物を構築しようとする場合には、腎被膜下、鼠径部又は腋窩の皮下、フットパット（肉球）などに移植することができる。また、例えば、ワクチン等による免疫治療の補助等のためにヒトに移植する場合には、上下肢の皮下へ埋め込み移植することができる。
本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体が移植される部位としては、用途目的に応じて異なるが、例えばマウスやラットにおいて実験動物構築のため、人工リンパ節モデル動物を構築しようとする場合には、腎被膜下、鼠径部又は腋窩の皮下、フットパット（肉球）などに移植することができる。また、例えば、ワクチン等による免疫治療の補助等のためにヒトに移植する場合には、上下肢の皮下へ埋め込み移植することができる。
本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体の移植から約３週間後には、レシピエントの生体内で本発明の人工リンパ節組織が構築され得る。このようにして構築された人工リンパ節組織は、生体から回収され、さらに別の動物に再移植して二次免疫されるか、in vitro培養に供されるか、免疫不全症の個体に治療のために用いられるか、または、適切な保存剤（例えば、１０％ＤＭＳＯ）を添加した培養液中で−８０℃以下の低温にて保存して、使用前に調製して用いることができる。
以下、本発明の理解を深めるために、以下に実施例を示してより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではないことはいうまでもない。
（実施例１）人工リンパ節組織形成用高分子担体による人工リンパ節組織形成の検討
Ａ．人工リンパ節組織形成用高分子担体の移植
三次元構造を有する高分子担体としてのコラーゲンスポンジ（株式会社高研社製、CS-35）を約３ｍｍ角（３×３×３ｍｍ）に切断した。このコラーゲンスポンジ切片に、表１に示したケモカイン、VEGFCを１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に、最終濃度が０．５μｇ／ｍｌとなるように溶解した溶液１０μｌを滴下して含浸させ、本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体を作製した。
Ａ．人工リンパ節組織形成用高分子担体の移植
三次元構造を有する高分子担体としてのコラーゲンスポンジ（株式会社高研社製、CS-35）を約３ｍｍ角（３×３×３ｍｍ）に切断した。このコラーゲンスポンジ切片に、表１に示したケモカイン、VEGFCを１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に、最終濃度が０．５μｇ／ｍｌとなるように溶解した溶液１０μｌを滴下して含浸させ、本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体を作製した。
吸引麻酔（イソフルラン）下、外科的処置により８〜１２周齢のBalb/cマウスの腎皮膜の下で腎臓との間に、上記本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体を移植した。移植は２つの腎臓に、それぞれ腎上極付近と下極付近の２ケ所、合計４ケ所に移植した。
Ｂ． 人工リンパ節組織の免疫組織学的解析
移植３週間後に、人工リンパ節組織形成用高分子担体による移植組織を取り出し、免疫組織染色法によりＴ細胞及びＢ細胞の集積の検討を行った。すなわち、取り出した移植組織をOCT Compound4583（Sakura Finetek社製）を用いて包埋し、液体窒素により凍結ブロックを作製した。次いで、厚さ５μｍの凍結切片を作製してＡＰＳ（アミノシラン）コートしたスライドガラスに貼り付け、風乾後、−２０℃の冷アセトンで１０分間固定し、FITG-抗B220抗体（Ｂ細胞マーカー、BD Biosciences社製）及びPE-抗Thy1.2抗体（Ｔ細胞マーカー、BD Biosciences社製）を使用し、定法に従って免疫組織染色を行った。
移植３週間後に、人工リンパ節組織形成用高分子担体による移植組織を取り出し、免疫組織染色法によりＴ細胞及びＢ細胞の集積の検討を行った。すなわち、取り出した移植組織をOCT Compound4583（Sakura Finetek社製）を用いて包埋し、液体窒素により凍結ブロックを作製した。次いで、厚さ５μｍの凍結切片を作製してＡＰＳ（アミノシラン）コートしたスライドガラスに貼り付け、風乾後、−２０℃の冷アセトンで１０分間固定し、FITG-抗B220抗体（Ｂ細胞マーカー、BD Biosciences社製）及びPE-抗Thy1.2抗体（Ｔ細胞マーカー、BD Biosciences社製）を使用し、定法に従って免疫組織染色を行った。
その結果、CXCL12、CXCL13及びCCL19の組み合わせ、又は、CXCL12、CCL19及びCCL21の組み合わせでケモカインを用いた場合に、Ｂ細胞及びＴ細胞の集積とクラスターの形成が認められ（表１、図１）、人工リンパ節組織が形成されたことが明らかとなった。また、表1の実験番号１−１０及び１−１２において、VEGFCの代わりにVEGFAを使用しても同様の結果が得られた。
（実施例２）抗原特異的抗体産生能の検討
Ａ 人工リンパ節組織形成用高分子担体の移植
５〜６周齢のBalb/cマウスに、胸腺依存性抗原である４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセチル−オブアルブミン（NP-OVA、Biosearch Technologies社製）をマウス１頭当たり１００μｇ腹腔内投与した。３〜４週間後に、実施例１と同様にして表２に示したケモカイン、VEGFCをコラーゲンスポンジ切片に含浸させ、作製した本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体を、免疫処理した上記マウスの腎皮膜下へ、実施例１と同様に移植した。
Ａ 人工リンパ節組織形成用高分子担体の移植
５〜６周齢のBalb/cマウスに、胸腺依存性抗原である４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセチル−オブアルブミン（NP-OVA、Biosearch Technologies社製）をマウス１頭当たり１００μｇ腹腔内投与した。３〜４週間後に、実施例１と同様にして表２に示したケモカイン、VEGFCをコラーゲンスポンジ切片に含浸させ、作製した本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体を、免疫処理した上記マウスの腎皮膜下へ、実施例１と同様に移植した。
Ｂ．抗原特異的抗体産生能の測定
人工リンパ節組織形成用高分子担体を移植してから３週間後に、マウス１頭当たり１００μｇ／ｍｌのNP-OVAを静脈投与により再度免疫処理を行った。さらに５日間経過後に移植組織（人工リンパ節組織）を取り出し、すり潰して細胞を回収した。得られた細胞数を表２に示した。次に、得られた細胞１×１０５個を用いて、Nature Biotechnology, 22, 1539-1545, 2004に記載された方法に準じてELISPOT/FACSアッセイを行い、抗体を産生しているＢ細胞の数を測定した。
人工リンパ節組織形成用高分子担体を移植してから３週間後に、マウス１頭当たり１００μｇ／ｍｌのNP-OVAを静脈投与により再度免疫処理を行った。さらに５日間経過後に移植組織（人工リンパ節組織）を取り出し、すり潰して細胞を回収した。得られた細胞数を表２に示した。次に、得られた細胞１×１０５個を用いて、Nature Biotechnology, 22, 1539-1545, 2004に記載された方法に準じてELISPOT/FACSアッセイを行い、抗体を産生しているＢ細胞の数を測定した。
その結果、８個の移植組織から回収された全細胞数は、いずれの条件の場合でもコントロール（２−５）と比べてあまり差を認めなかった（表２）。一方、実験番号（２−１）〜（２−４）の各種ケモカインを含む人工リンパ節組織形成用高分子担体を移植した場合は、実験番号（２−５）のコントロールに比べてＩｇＭ抗体産生細胞の増加が顕著に認められた（図２）。このことから、移植片（人工リンパ節組織）へのＢ細胞の移入が起こっていることが分かる。また、抗原低親和性ＩｇＧ産生細胞（ＮＰ３０）のみならず、高親和性ＩｇＧ産生細胞（ＮＰ３）の増加も見られた。
以上詳述したように、本発明の方法によれば、特にストローマ細胞を使用しなくとも人工リンパ節組織を形成することができ、レシピエントであるマウスの系統や動物種に関係なく、人工リンパ節組織を形成することができる。本発明の人工リンパ節組織は、リンパ節組織形成に関わる細胞やメカニズムの解明に有用である。また、本発明の人工リンパ節組織を使用すれば、様々な抗原に対する特異的抗体やエフェクターＴ細胞を効率よく作製することが可能となる。
Claims (9)
- （１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインが、三次元構造を有する高分子担体に含浸されてなり、かつストローマ細胞を含まない人工リンパ節組織形成用高分子担体を、非ヒト動物に移植して、人工リンパ節組織を形成する方法。
- 人工リンパ節組織形成用高分子担体が、さらにVEGFA又はVEGFCを含浸している、請求項１記載の方法。
- ケモカインが、CXCL12、CXCL13及びCCL19の少なくとも３種の組み合わせからなる、請求項１又は２記載の方法。
- ケモカインが、CXCL12、CCL21及びCCL19の少なくとも３種の組み合わせから成る、請求項１又は２記載の方法。
- 三次元構造を有する高分子担体が、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリグリコール酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ナイロン、ポリエステル、ポリウレタン及びエチレンビニルアセテートから選択される１種又は複数種の組み合わせからなる高分子担体である請求項１〜４のいずれか１記載の方法。
- 三次元構造を有する高分子担体が、コラーゲンスポンジである、請求項１〜４のいずれか１記載の方法。
- （１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインが含浸された三次元構造を有する高分子担体からなり、ストローマ細胞を含まないことを特徴とする、人工リンパ節組織形成用高分子担体。
- （１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインに加え、さらにVEGFA又はVEGFCが含浸された三次元構造を有する高分子担体からなり、ストローマ細胞を含まないことを特徴とする、人工リンパ節組織形成用高分子担体。
- 三次元構造を有する高分子担体が、コラーゲンスポンジである、請求項７〜８記載の人工リンパ節組織形成用高分子担体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010179889A JP2012036151A (ja) | 2010-08-11 | 2010-08-11 | 人工リンパ節の作製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010179889A JP2012036151A (ja) | 2010-08-11 | 2010-08-11 | 人工リンパ節の作製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012036151A true JP2012036151A (ja) | 2012-02-23 |
Family
ID=45848548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010179889A Withdrawn JP2012036151A (ja) | 2010-08-11 | 2010-08-11 | 人工リンパ節の作製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2012036151A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019069224A1 (en) * | 2017-10-02 | 2019-04-11 | Khalifa University of Science and Technology | MICROFLUIDIC DEVICE FOR GENERATING IN VITRO LYMPHATIC GANGLION |
| US11071618B2 (en) | 2014-11-24 | 2021-07-27 | James Edward Moore, Jr. | Lymph node replacement construct |
-
2010
- 2010-08-11 JP JP2010179889A patent/JP2012036151A/ja not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11071618B2 (en) | 2014-11-24 | 2021-07-27 | James Edward Moore, Jr. | Lymph node replacement construct |
| EP4046596A1 (en) | 2014-11-24 | 2022-08-24 | James Moore | Lymph node replacement construct |
| WO2019069224A1 (en) * | 2017-10-02 | 2019-04-11 | Khalifa University of Science and Technology | MICROFLUIDIC DEVICE FOR GENERATING IN VITRO LYMPHATIC GANGLION |
| CN111246941A (zh) * | 2017-10-02 | 2020-06-05 | 哈利法科学技术大学 | 用于产生体外淋巴结的微流体装置 |
| US11478798B2 (en) | 2017-10-02 | 2022-10-25 | Khalifa University of Science and Technology | Microfluidic device for generating an in vitro lymph node |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Koltsova et al. | Dynamic T cell–APC interactions sustain chronic inflammation in atherosclerosis | |
| Anderson | Biocompatibility and bioresponse to biomaterials | |
| Walch et al. | Cognate antigen directs CD8+ T cell migration to vascularized transplants | |
| Safinia et al. | T-cell alloimmunity and chronic allograft dysfunction | |
| JP2023166584A (ja) | 免疫細胞捕捉デバイスおよびその製造および使用方法 | |
| CN109069539A (zh) | 用于癌症治疗的联合免疫疗法和细胞因子控制疗法 | |
| JPWO2007069755A1 (ja) | 人工リンパ節を用いた効率的な抗原特異的ハイブリドーマの作成法 | |
| JP4854670B2 (ja) | 構造骨格工学 | |
| JP2009504151A (ja) | 記憶Ｔリンパ球の視覚化、単離および遺伝子改変のための共通γ鎖サイトカインの使用 | |
| JP2008538587A (ja) | 同系または非同系の細胞、組織または器官を含む、外因性免疫原および内因性免疫原に対する免疫応答を改変するための材料および方法 | |
| Zhang et al. | Chemokine treatment rescues profound T-lineage progenitor homing defect after bone marrow transplant conditioning in mice | |
| Chhabra et al. | Germinal center alloantibody responses mediate progression of chronic allograft injury | |
| Li et al. | Lymph node fibroblastic reticular cells deposit fibrosis-associated collagen following organ transplantation | |
| Reed et al. | An autologous endothelial cell: peripheral blood mononuclear cell assay that detects cytokine storm responses to biologics | |
| JP6346602B2 (ja) | ヒトリンパ器官由来の抑制性ストローマ細胞の単離および使用 | |
| Wang et al. | Rapid Generation of hPSC‐Derived High Endothelial Venule Organoids with In Vivo Ectopic Lymphoid Tissue Capabilities | |
| JP5526441B2 (ja) | 癌治療用人工リンパ節 | |
| JP2012036151A (ja) | 人工リンパ節の作製方法 | |
| Li et al. | Anti-CCL25 antibody prolongs skin allograft survival by blocking CCR9 expression and impairing splenic T-cell function | |
| CN103124492A (zh) | 使用具有来源于体外培养和扩增的自我更新集落形成细胞的组分的有生命的和无生命的生物反应装置的组合物和方法 | |
| Vigneswaran et al. | This paper is the winner of an SFB Award in the Hospital Intern, Residency category: Peptide biomaterials raising adaptive immune responses in wound healing contexts. | |
| JP4097544B2 (ja) | 人工リンパ節 | |
| CN113330110A (zh) | 杂交胸腺、制备方法及诱导异种移植物耐受性、恢复免疫能力和胸腺功能的使用方法 | |
| JP2006129839A (ja) | 抗原特異的な抗体を産生する人工リンパ節 | |
| Baum | The Role of Interleukin-21 in the Chronic Rejection of Transplant Allografts and the Development of Type 1 Diabetes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20131105 |