JP2012036151A - Method for producing artificial lymph node - Google Patents
Method for producing artificial lymph node Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012036151A JP2012036151A JP2010179889A JP2010179889A JP2012036151A JP 2012036151 A JP2012036151 A JP 2012036151A JP 2010179889 A JP2010179889 A JP 2010179889A JP 2010179889 A JP2010179889 A JP 2010179889A JP 2012036151 A JP2012036151 A JP 2012036151A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lymph node
- polymer carrier
- node tissue
- ccl19
- artificial lymph
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Abstract
Description
本発明は、無細胞系で人工リンパ節組織を形成する方法及び人工リンパ節組織形成用高分子担体に関する。具体的には、ストローマ細胞や樹状細胞を特に使用することなく、特定のケモカインを含浸させてなる人工リンパ節組織形成用高分子担体を哺乳動物に移植することによって、例えばマウスの系統や動物種に関わりなく、人工リンパ節組織を形成する方法に関するものである。 The present invention relates to a method for forming an artificial lymph node tissue in a cell-free system and a polymer carrier for artificial lymph node tissue formation. Specifically, without using stromal cells or dendritic cells in particular, by transplanting a polymer carrier for artificial lymph node tissue formation impregnated with a specific chemokine into a mammal, for example, mouse strains and animals The present invention relates to a method for forming an artificial lymph node tissue regardless of species.
リンパ節は、リンパ球が抗原提示細胞から抗原情報を受け取り、抗原特異的な獲得免疫反応を惹起するための重要な場所であり、病原微生物や癌細胞を排除して生体を防御するために必須の組織である。さらに、一度その脅威に遭遇するとその情報は免疫学的に記憶され、二度目の同じ脅威に対して速やかに強力な免疫反応が誘導されるが、リンパ節はこのような免疫メモリーの形成や二次反応の中心的な場にもなっている。 Lymph nodes are an important place for lymphocytes to receive antigen information from antigen-presenting cells and elicit antigen-specific acquired immune responses, and are essential for protecting pathogens and cancer cells by eliminating pathogenic microorganisms and cancer cells Organization. In addition, once the threat is encountered, the information is memorized immunologically and a strong immune response is quickly induced against the same second threat. It is also a central place for the next reaction.
このようなリンパ節の機能やメカニズムを解明する方法の１つとして、三次元的に構成された人工の免疫組織の構築について検討され、本発明者らの一部は、先に、サイトカインを産生するストローマ細胞や樹状細胞を含浸させたコラーゲンスポンジをマウスの腎皮膜下に移植して人工的にリンパ節組織を形成する方法を報告している（非特許文献１、特許文献１）。 As one method for elucidating the function and mechanism of such lymph nodes, the construction of a three-dimensional artificial immune system has been studied, and some of the inventors have previously produced cytokines. A method of artificially forming lymph node tissue by transplanting collagen sponge impregnated with stromal cells or dendritic cells under the kidney capsule of mice has been reported (Non-patent Document 1, Patent Document 1).
人工リンパ節の構築と応用に関し、マウスリンホトキシンアルファ（LTα）又はCCL21、CXCL13及びCCL19の遺伝子を含む発現ベクターを組み込んだストローマ細胞（TEL-2細胞）と樹状細胞を含浸させたコラーゲンスポンジを、マウスの腎皮膜下に移植することによりリンパ節組織が形成されたこと、当該リンパ節を免疫を受けていないマウスに移植し、抗原刺激すると、抗原特異的なＩｇＧ抗体が誘導されることが記載されている（非特許文献１−３）。 Collagen sponge impregnated with stromal cells (TEL-2 cells) and dendritic cells incorporating mouse lymphotoxin alpha (LTα) or expression vectors containing CCL21, CXCL13 and CCL19 genes for the construction and application of artificial lymph nodes Transplanted under the renal capsule of mice, lymph node tissue was formed, and when the lymph nodes were transplanted into non-immunized mice and stimulated with antigen, antigen-specific IgG antibodies were induced. Is described (Non-Patent Documents 1-3).
リンホトキシン、CCL21、CCL19、CXCL13、IL-7及びLTβからなるサイトカインを産生することができるストローマ細胞及びコラーゲンスポンジ、さらに樹状細胞を含む人工リンパ節が開示されている（特許文献１）。 An artificial lymph node including stromal cells and collagen sponges capable of producing cytokines composed of lymphotoxin, CCL21, CCL19, CXCL13, IL-7 and LTβ, and dendritic cells has been disclosed (Patent Document 1).
抗原で非ヒト動物を免疫し、当該動物に、サイトカインを産生することができるストローマ細胞を含むコラーゲンスポンジを移植して、抗原特異的な抗体及び抗原特異的Ｔ細胞を産生する人工リンパ節を形成することが記載されている（特許文献２）。 Immunize non-human animals with antigens, transplant collagen sponges containing stromal cells capable of producing cytokines to form artificial lymph nodes that produce antigen-specific antibodies and antigen-specific T cells (Patent Document 2).
抗原で非ヒト動物を免疫し、当該動物に、サイトカインを産生することができるストローマ細胞を含むコラーゲンスポンジを移植して人工リンパ節を形成する。次いで、当該人工リンパ節を免疫不全非ヒト動物に移植し前記抗原で免疫した後、脾臓を取り出し、当該細胞をミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを形成することが記載されている（特許文献３）。 A non-human animal is immunized with an antigen, and a collagen sponge containing stromal cells capable of producing cytokines is transplanted into the animal to form an artificial lymph node. Next, it is described that the artificial lymph node is transplanted into an immunodeficient non-human animal and immunized with the antigen, and then the spleen is removed and the cell is fused with a myeloma cell to form an antibody-producing hybridoma (Patent Document). 3).
しかしながら、これらいずれの先行文献に記載の人工リンパ節もその構成としてストローマ細胞を含むことを要件としている。従来、ストローマ細胞はリンパ節形成の支持細胞となることから、使用することが必須であると考えられていた（非特許文献３、特許文献１）。ストローマ細胞を使用する場合、使用するストローマ細胞によってリンパ節を形成させるためのマウスの系統や動物種が制限されるが、リンパ節を形成させるためのマウスの系統や動物種において適切に使用できるようなストローマ細胞を取得するのは困難である。先行技術文献には、無細胞系で人工リンパ節が形成できることについての記載も示唆もない。 However, the artificial lymph nodes described in any of these prior documents are required to contain stromal cells as a constitution. Conventionally, stromal cells have been considered to be indispensable because they serve as supporting cells for lymph node formation (Non-patent Document 3, Patent Document 1). When stromal cells are used, mouse strains and animal species for forming lymph nodes are limited by the stromal cells used, but it can be used appropriately in mouse strains and animal species for forming lymph nodes. It is difficult to obtain stromal cells. The prior art documents neither describe nor suggest that artificial lymph nodes can be formed in a cell-free system.
ストローマ細胞を使用する場合、使用するストローマ細胞によってリンパ節を形成させるためのマウスの系統や動物種が制限されるが、リンパ節を形成させるためのマウスの系統や動物種において適切に使用できるようなストローマ細胞を取得するのは困難である。そこで、本発明はこのような制限のない、汎用的に適用できる人工リンパ節の形成方法を提供することを課題とする。 When stromal cells are used, mouse strains and animal species for forming lymph nodes are limited by the stromal cells used, but it can be used appropriately in mouse strains and animal species for forming lymph nodes. It is difficult to obtain stromal cells. Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for forming an artificial lymph node that can be applied universally without such limitations.
少なくとも特定の３種のケモカインを、三次元構造を有する高分子担体に含浸させ、当該ケモカインを含浸させてなる人工リンパ節組織形成用高分子担体及びそれを非ヒト動物に移植して、人工リンパ節組織を形成する方法による。 At least three kinds of specific chemokines are impregnated in a polymer carrier having a three-dimensional structure, and a polymer carrier for artificial lymph node tissue formation impregnated with the chemokine and transplanted into a non-human animal, artificial lymph Depends on how the nodal tissue is formed.
即ち本発明は、以下よりなる。
１．（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインが、三次元構造を有する高分子担体に含浸されてなり、かつストローマ細胞を含まない人工リンパ節組織形成用高分子担体を、非ヒト動物に移植して、人工リンパ節組織を形成する方法。
２．人工リンパ節組織形成用高分子担体が、さらにVEGFA又はVEGFCを含浸している、請求項１記載の方法。
３．ケモカインが、CXCL12、CXCL13及びCCL19の少なくとも３種の組み合わせからなる、請求項１又は２記載の方法。
４．ケモカインが、CXCL12、CCL21及びCCL19の少なくとも３種の組み合わせから成る、請求項１又は２記載の方法。
５．三次元構造を有する高分子担体が、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリグリコール酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ナイロン、ポリエステル、ポリウレタン及びエチレンビニルアセテートから選択される１種又は複数種の組み合わせからなる高分子担体である請求項１〜４のいずれか１記載の方法。
６．三次元構造を有する高分子担体が、コラーゲンスポンジである、請求項１〜４のいずれか１記載の方法。
７．（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインが含浸された三次元構造を有する高分子担体からなり、ストローマ細胞を含まないことを特徴とする、人工リンパ節組織形成用高分子担体。
８．（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインに加え、さらにVEGFA又はVEGFCが含浸された三次元構造を有する高分子担体からなり、ストローマ細胞を含まないことを特徴とする、人工リンパ節組織形成用高分子担体。
９．三次元構造を有する高分子担体が、コラーゲンスポンジである、請求項７〜８記載の人工リンパ節組織形成用高分子担体。
That is, this invention consists of the following.
1. (1) CXCL12, CXCL13 and CCL19, or (2) A chemokine consisting of at least three combinations of CXCL12, CCL19 and CCL21 is impregnated in a polymer carrier having a three-dimensional structure and does not contain stromal cells. A method of forming an artificial lymph node tissue by transplanting a polymer carrier for forming an artificial lymph node tissue into a non-human animal.
2. The method according to claim 1, wherein the polymer carrier for artificial lymph node tissue formation is further impregnated with VEGFA or VEGFC.
3. The method according to claim 1 or 2, wherein the chemokine comprises a combination of at least three of CXCL12, CXCL13, and CCL19.
4). The method according to claim 1 or 2, wherein the chemokine comprises a combination of at least three of CXCL12, CCL21 and CCL19.
5. A polymer carrier having a three-dimensional structure is composed of one or a plurality of combinations selected from collagen, glycosaminoglycan, polyglycolic acid, poly-L-lactic acid, nylon, polyester, polyurethane and ethylene vinyl acetate. The method according to any one of claims 1 to 4, which is a molecular carrier.
6). The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the polymer carrier having a three-dimensional structure is a collagen sponge.
7). (1) CXCL12, CXCL13 and CCL19, or (2) A polymer carrier having a three-dimensional structure impregnated with a chemokine consisting of at least three combinations of CXCL12, CCL19 and CCL21, and not containing stromal cells. A polymer carrier for forming an artificial lymph node tissue, which is characterized.
8). (1) CXCL12, CXCL13 and CCL19, or (2) In addition to a chemokine comprising at least three combinations of CXCL12, CCL19 and CCL21, and further comprising a polymer carrier having a three-dimensional structure impregnated with VEGFA or VEGC, A polymer carrier for forming an artificial lymph node tissue, characterized by not containing stromal cells.
9. The polymeric carrier for artificial lymph node tissue formation according to claim 7 to 8, wherein the polymeric carrier having a three-dimensional structure is a collagen sponge.
本発明の方法によれば、ストローマ細胞を使用しなくとも人工リンパ節組織を形成することができ、レシピエントであるマウスの系統や動物種に関係なく、人工リンパ節組織を形成することができる。本発明の人工リンパ節組織は、リンパ節組織形成に関わる細胞やメカニズムの解明に有用である。また、本発明の人工リンパ節組織を使用すれば、様々な抗原に対する特異的抗体やエフェクターＴ細胞を効率よく作製することが可能となる。また、本発明の人工リンパ節組織を免疫力の著しく低下した重症感染症等の個体に一定期間装着し、免疫活性を高めて当該疾患を治癒することなどへの適用が可能となる。 According to the method of the present invention, an artificial lymph node tissue can be formed without using stromal cells, and an artificial lymph node tissue can be formed regardless of the strain or animal species of the recipient mouse. . The artificial lymph node tissue of the present invention is useful for elucidating cells and mechanisms involved in lymph node tissue formation. Moreover, if the artificial lymph node tissue of the present invention is used, specific antibodies against various antigens and effector T cells can be efficiently produced. In addition, the artificial lymph node tissue of the present invention can be applied to an individual such as a severe infectious disease whose immunity is remarkably reduced for a certain period of time to enhance the immune activity and cure the disease.
本発明は、無細胞系で人工リンパ節組織を形成する方法及び人工リンパ節組織形成用高分子担体に関する。本発明において、人工リンパ節組織形成用高分子担体は、その材料としての三次元構造を有する高分子担体とは区別して使用される。材料としての高分子担体は、単に高分子担体という場合がある。 The present invention relates to a method for forming an artificial lymph node tissue in a cell-free system and a polymer carrier for artificial lymph node tissue formation. In the present invention, the polymer carrier for artificial lymph node tissue formation is used separately from the polymer carrier having a three-dimensional structure as the material. A polymer carrier as a material may be simply referred to as a polymer carrier.
リンパ節とは、リンパ系組織（リンパ球が非リンパ系細胞と相互作用する組織）であって、リンパ球系の細胞の成熟や適応免疫応答に重要な役割を果たす組織器官である。本発明の人工リンパ節組織は、三次元構造を有する高分子担体周辺に、B細胞及びT細胞のリンパ球が集積して形成される細胞塊であり、当該細胞塊ではB細胞領域とT細胞領域が分かれて分布している。 A lymph node is a lymphoid tissue (a tissue in which lymphocytes interact with non-lymphoid cells), and is a tissue organ that plays an important role in the maturation of lymphoid cells and the adaptive immune response. The artificial lymph node tissue of the present invention is a cell mass formed by accumulation of lymphocytes of B cells and T cells around a polymer carrier having a three-dimensional structure. In the cell mass, the B cell region and the T cell The area is divided and distributed.
本発明の汎用的に適用できる人工リンパ節組織形成用高分子担体は、三次元構造を有する高分子担体に、（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインを含浸させてなり、かつストローマ細胞を含まないものをいう。本発明の人工リンパ節組織は、当該人工リンパ節組織形成用高分子担体を動物に移植して、リンパ節組織を形成する方法による。 The polymer carrier for artificial lymph node tissue formation applicable to the present invention can be applied to a polymer carrier having a three-dimensional structure, (1) CXCL12, CXCL13 and CCL19, or (2) CXCL12, CCL19 and CCL21. It is impregnated with a chemokine consisting of three combinations and does not contain stromal cells. The artificial lymph node tissue of the present invention is based on a method of forming a lymph node tissue by transplanting the polymer carrier for artificial lymph node tissue formation into an animal.
本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体には、上述の少なくとも３種の組み合わせからなるケモカインのほか、さらにVEGFA (Vascular Endothelial Growth Factor(血管内皮増殖因子）A）又はVEGFC (Vascular Endothelial Growth Factor C)を含んでいても良い。ストローマ細胞は、リンパ節組織を作製しようとするマウスの系統や動物種において適切に使用できるようなものを使用しなければならない。しかしながら、それぞれのマウスの系統や動物種に対して適切に使用できるようなストローマ細胞をそれぞれ取得するのは困難である。そのため、ストローマ細胞を使用する場合、使用するストローマ細胞によってリンパ節を形成させるためのマウスの系統や動物種が制限される。そこで、本発明では、マウスの系統や動物種において制限のない、汎用的に適用できる人工リンパ節組織形成方法を提供するものである。 The polymer carrier for forming an artificial lymph node tissue of the present invention includes, in addition to the chemokine consisting of at least three kinds of the above-mentioned combinations, VEGFA (Vascular Endothelial Growth Factor) A) or VEGFC (Vascular Endothelial Growth Factor). C) may be included. The stromal cells must be used so that they can be used appropriately in the mouse strain and animal species for which lymph node tissue is to be produced. However, it is difficult to obtain stromal cells that can be used appropriately for each mouse strain and animal species. Therefore, when stromal cells are used, mouse strains and animal species for forming lymph nodes are limited by the stromal cells used. Therefore, the present invention provides a method for forming an artificial lymph node tissue that can be applied universally without limitation in mouse strains and animal species.
本発明においてストローマ細胞とは、腺あるいは器官に特異的な固有の機能を持つ様々な細胞（実質細胞）を取り巻く微小環境を構成する細胞の総称であり、「支質細胞」ともいう。この「支質細胞」は、文字どおり実質の細胞を物理的に支持するとともに、細胞同士の相互作用により相手の細胞に何らかの作用を及ぼすという意味での支持機能も果たしていると考えられている。ストローマ細胞は、「支持細胞」のほか、「間質細胞」ともいう。 In the present invention, stromal cells are a general term for cells constituting a microenvironment surrounding various cells (parenchymal cells) having specific functions specific to glands or organs, and are also referred to as “stromal cells”. This “stromal cell” literally supports physical cells as well as literally, and is also considered to have a support function in the sense that it exerts some action on the other cell by the interaction between the cells. Stromal cells are also called “stromal cells” in addition to “supporting cells”.
ケモカイン (Chemokine) とは、Ｇタンパク質共役受容体を介してその作用を発現する塩基性タンパク質であり、サイトカインの一群である。白血球などの遊走を引き起こし炎症の形成に関与する。ケモカインは構造上の違いからCCケモカイン、CXCケモカイン、Cケモカイン及びCX3Cケモカインに分類される。これまでに50種類以上のケモカインが同定されている。CCケモカインは、１次構造においてN末端側の2つのシステイン残基(C)が連続していることからこのように称される。また、CXCケモカインは、N末端側の２つのシステイン残基の間にその他のアミノ酸が１つ存在するという配列を有する(CXCモチーフ)。 Chemokine is a basic protein that expresses its action through a G protein-coupled receptor, and is a group of cytokines. Involves in the formation of inflammation by causing migration of leukocytes. Chemokines are classified into CC chemokines, CXC chemokines, C chemokines and CX3C chemokines based on structural differences. To date, over 50 chemokines have been identified. The CC chemokine is referred to as such because two N-terminal cysteine residues (C) are continuous in the primary structure. The CXC chemokine has a sequence in which one other amino acid exists between two cysteine residues on the N-terminal side (CXC motif).
本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体に含まれるケモカインとしては、CXCL13、CCL21、CCL19及びCXCL12が挙げられる。これらの起源は特に特定の生物種に限定されるものではないが、リンパ節組織を作製しようとする動物種に応じて選ぶのが好ましい。ヒト又はマウス由来のものとしては、CXCL13（Gunn, M. et al.,1998, Nature 391:788-803，Gunn, M.D. et al., 1998, Nature 391:799-803）、CCL21（Hedrick, J.A. and A. Zlotnik, 1997, J. Immunol. 159:1589-1593，Hedrick, J.A. and A. Zlotnik, 1997, J. Immunol. 159:1589-1593）、CCL19（Rossi, D. L. et al.,1997, J. Immunol. 158:1033-1036，Ngo, V.N. et al., 1998, J. Exp. Med. 188:181-191）及びCXCL12（UniProtKB/Swiss-Prot P48061(SDF1 HUMAN) Last modified May 18,2010. Version 111，Nagasawa, T.et al., 1994, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 91:2305-2309; Tashiro, K et l., 1993, Science 261:600-603）が挙げられる。ヒト又はマウス由来のCXCL13、CCL21、CCL19及びCXCL12は、R&Dシステムズ社（それぞれ、カタログ番号801-CX、470-BC、366-6C、457-6C、361-MI、440-M3、350-NS、460-SD）から購入することもできる。 Examples of the chemokine contained in the polymer carrier for artificial lymph node tissue formation of the present invention include CXCL13, CCL21, CCL19 and CXCL12. These sources are not particularly limited to specific species, but are preferably selected according to the animal species for which lymph node tissue is to be produced. Examples derived from human or mouse include CXCL13 (Gunn, M. et al., 1998, Nature 391: 788-803, Gunn, MD et al., 1998, Nature 391: 799-803), CCL21 (Hedrick, JA and A. Zlotnik, 1997, J. Immunol. 159: 1589-1593, Hedrick, JA and A. Zlotnik, 1997, J. Immunol. 159: 1589-1593), CCL19 (Rossi, DL et al., 1997, J Immunol. 158: 1033-1036, Ngo, VN et al., 1998, J. Exp. Med. 188: 181-191) and CXCL12 (UniProtKB / Swiss-Prot P48061 (SDF1 HUMAN) Last modified May 18,2010. Version 111, Nagasawa, T. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2305-2309; Tashiro, K et l., 1993, Science 261: 600-603). CXCL13, CCL21, CCL19 and CXCL12 derived from human or mouse are R & D Systems (catalog numbers 801-CX, 470-BC, 366-6C, 457-6C, 361-MI, 440-M3, 350-NS, respectively) 460-SD).
本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体は、少なくとも３種のケモカイン、具体的には、（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも3種の組み合わせからなるケモカインの適当量、具体的には例えば、各々１ｎｇ〜０．１μｇ、好ましくは、各々２ｎｇ〜５０ｎｇ、特に好ましくは各々４ｎｇ〜１０ｎｇの範囲の量を生理食塩液や、ＰＢＳ等の緩衝液に溶解し、当該ケモカインを溶解した溶液を、上記三次元構造を有する高分子担体に滴下し、含浸させることにより、構築することができる。三次元構造を有する高分子担体の体積に対して１〜２倍量程度であれば、三次元構造を有する高分子担体に含浸させることができる。本発明においては、特に（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19の組み合わせが好適である。また、本発明においては、上記（１）又は（２）の少なくとも3種の組み合わせからなるケモカインに加えて、VEGFA又はVEGFCを上記ケモカインと同量程度含んでいるのがより好適である。VEGFA及びVEGFCの起源は特に特定の生物種に限定されるものではないが、例えば、ヒト由来VEGFCとして、UniProtKB/Swiss-Prot P49767(VEGFC HUMAN)Last modified June 15,2010. Version 98、マウス由来VEGFCとして、UniProtKB/Swiss-Prot P97953(VEGFC MOUSE)Last modified July 13,2010. Version 88が挙げられる。また、ヒト由来VEGFAとして、GenBank:AAH11177.2(NCBI Entrez Browser 2010年7月29日検索)、マウス由来VEGFAとして、GenBank:EDL23467.1(NCBI Entrez Browser 2010年7月29日検索)が挙げられる。 The polymer carrier for artificial lymph node tissue formation of the present invention is at least three chemokines, specifically, (1) CXCL12, CXCL13 and CCL19, or (2) at least three combinations of CXCL12, CCL19 and CCL21. Appropriate amounts of chemokines consisting of, for example, 1 ng to 0.1 μg each, preferably 2 ng to 50 ng each, particularly preferably 4 ng to 10 ng each in physiological saline or a buffer solution such as PBS. It can be constructed by dissolving the chemokine in the solution and dropping the solution into the polymer carrier having the above three-dimensional structure and impregnating it. If the amount is about 1 to 2 times the volume of the polymer carrier having a three-dimensional structure, the polymer carrier having a three-dimensional structure can be impregnated. In the present invention, (1) a combination of CXCL12, CXCL13 and CCL19 is particularly preferable. In addition, in the present invention, it is more preferable that VEGFA or VEGFC is contained in the same amount as the chemokine in addition to the chemokine consisting of at least three combinations of (1) or (2). The origin of VEGFA and VEGFC is not particularly limited to a specific species. For example, as human-derived VEGFC, UniProtKB / Swiss-Prot P49767 (VEGFC HUMAN) Last modified June 15,2010. Version 98, mouse-derived VEGFC UniProtKB / Swiss-Prot P97953 (VEGFC MOUSE) Last modified July 13, 2010. Version 88. In addition, as a human-derived VEGFA, GenBank: AAH11177.2 (NCBI Entrez Browser searched on July 29, 2010), and as a mouse-derived VEGFA, GenBank: EDL23467.1 (NCBI Entrez Browser searched on July 29, 2010) can be mentioned .
また、本発明において使用される三次元構造を有する高分子担体としては、高分子生体材料が挙げられ、より詳しくは、生体適合性高分子材料を利用することができる。本発明において「三次元構造」とはリンパ球や樹状細胞などのリンパ節構成細胞を、三次元的に組織化させるための足場（scaffold）を意味する。また、「生体適合性高分子材料」とは、「生体に何らかの方法で適用した時、生体が異物としてそれを排除しようとする反応を極力低く抑えるようにされた、様々な高分子から構成される材料」のことを意味する。 In addition, examples of the polymer carrier having a three-dimensional structure used in the present invention include polymer biomaterials. More specifically, biocompatible polymer materials can be used. In the present invention, “three-dimensional structure” means a scaffold for organizing lymph node constituent cells such as lymphocytes and dendritic cells in a three-dimensional manner. In addition, “biocompatible polymer material” is composed of various polymers that are designed to minimize the reaction of the living body trying to eliminate it as a foreign substance when applied to the living body in some way. Means "material".
このような高分子担体としては、例えば、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリグリコール酸、ポリ−Ｌ−乳酸などが挙げられる。また、ナイロン、ポリエステル、ポリウレタンまたはエチレンビニルアセテートなどの非生体分解性の材料も、単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。 Examples of such a polymer carrier include collagen, glycosaminoglycan, polyglycolic acid, poly-L-lactic acid and the like. In addition, non-biodegradable materials such as nylon, polyester, polyurethane, and ethylene vinyl acetate can be used alone or in appropriate combination.
本発明の三次元構造を有する高分子担体は、それが生体分解性であっても、非生体分解性であってもよく、生体へ移植した際に、それ自身の抗原性による免疫反応および／または物理的刺激による炎症反応を起こしにくい素材である限り、任意の素材を用いることができる。ただし、本発明において使用される三次元構造を有する高分子担体が、人工リンパ節として機能するためには、人工リンパ節の構築に適した孔径（ポアサイズ）の多孔性の高分子担体、即ちスポンジ状であるのが好適である。このようなスポンジ状の高分子担体の孔径は、当業者により適宜決定され得る。 The polymer carrier having a three-dimensional structure of the present invention may be biodegradable or non-biodegradable, and when transplanted into a living body, the immune reaction and / or its own antigenicity. Alternatively, any material can be used as long as it does not easily cause an inflammatory reaction due to physical stimulation. However, in order for the polymer carrier having a three-dimensional structure used in the present invention to function as an artificial lymph node, a porous polymer carrier having a pore size suitable for construction of the artificial lymph node, that is, a sponge. It is preferred that the The pore size of such a sponge-like polymer carrier can be appropriately determined by those skilled in the art.
コラーゲンは、生体の構成成分であり、炎症反応や免疫反応を低く抑えられる点で、本発明の高分子担体として好ましい。また、「コラーゲンスポンジ」とは、コラーゲンを含むスポンジ構造を有する多孔性高分子担体を意味する。例えば、ウシアキレス腱の不溶性コラーゲンを凍結乾燥することにより、多孔性のスポンジ状にしたコラーゲンスポンジが得られ、本発明に利用可能である。 Collagen is a constituent of the living body and is preferable as the polymer carrier of the present invention in that the inflammatory reaction and the immune reaction can be kept low. “Collagen sponge” means a porous polymer carrier having a sponge structure containing collagen. For example, a collagen sponge in the form of a porous sponge can be obtained by freeze-drying insoluble collagen of Usiachiles tendon and can be used in the present invention.
本発明は、人工リンパ節組織形成用高分子担体にも及ぶ。ここで、本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体とは、上記説明したように、（１）CXCL12、CXCL13及びCCL19、又は、（２）CXCL12、CCL19及びCCL21の少なくとも3種の組み合わせからなるケモカインが含浸されてなる三次元構造を有する高分子担体からなり、ストローマ細胞を含まないことを特徴とする。当該人工リンパ節組織形成用高分子担体は、ストローマ細胞を含まないことから、レシピエントとして、非ヒト動物、例えばマウス、ラットなど種を問わずに使用することができる。また、ストローマ細胞を含まないことから、ヒトについてもレシピエントとすることができる。 The present invention also extends to a polymer carrier for artificial lymph node tissue formation. Here, as described above, the polymer carrier for forming an artificial lymph node tissue of the present invention includes (1) CXCL12, CXCL13 and CCL19, or (2) a combination of at least three of CXCL12, CCL19 and CCL21. It comprises a polymer carrier having a three-dimensional structure impregnated with a chemokine and does not contain stromal cells. Since the polymer carrier for artificial lymph node tissue formation does not contain stromal cells, it can be used as a recipient regardless of species such as non-human animals such as mice and rats. Moreover, since a stromal cell is not included, it can also be made into a recipient also about a human.
また、本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体の大きさは、レシピエントとしての動物の種類や移植部位により、適宜決定することができる。例えば、レシピエントがマウスであり、移植部位が腎被膜下の場合は、当該人工リンパ節組織形成用高分子担体の大きさは、１〜５ｍｍ×１〜５ｍｍ×１〜５ｍｍ、好ましくは、約３ｍｍ角とすることができる。 Moreover, the size of the polymer carrier for artificial lymph node tissue formation of the present invention can be appropriately determined depending on the type of animal as a recipient and the transplant site. For example, when the recipient is a mouse and the transplant site is under the kidney capsule, the size of the polymer carrier for artificial lymph node tissue formation is 1-5 mm × 1-5 mm × 1-5 mm, preferably about It can be 3 mm square.
上記本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体を、レシピエントとしての動物に移植して、人工リンパ節を形成する。
本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体が移植される部位としては、用途目的に応じて異なるが、例えばマウスやラットにおいて実験動物構築のため、人工リンパ節モデル動物を構築しようとする場合には、腎被膜下、鼠径部又は腋窩の皮下、フットパット（肉球）などに移植することができる。また、例えば、ワクチン等による免疫治療の補助等のためにヒトに移植する場合には、上下肢の皮下へ埋め込み移植することができる。
The artificial lymph node tissue-forming polymer carrier of the present invention is transplanted into an animal as a recipient to form an artificial lymph node.
The site to which the polymeric carrier for artificial lymph node tissue formation of the present invention is transplanted varies depending on the purpose of use, but for example, when constructing an artificial lymph node model animal for the construction of a laboratory animal in a mouse or rat Can be transplanted under the kidney capsule, subcutaneously in the groin or axilla, foot pad (meatball) and the like. In addition, for example, when transplanted into a human for assisting immunotherapy with a vaccine or the like, it can be implanted under the skin of the upper and lower limbs.
本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体の移植から約３週間後には、レシピエントの生体内で本発明の人工リンパ節組織が構築され得る。このようにして構築された人工リンパ節組織は、生体から回収され、さらに別の動物に再移植して二次免疫されるか、in vitro培養に供されるか、免疫不全症の個体に治療のために用いられるか、または、適切な保存剤（例えば、１０％ＤＭＳＯ）を添加した培養液中で−８０℃以下の低温にて保存して、使用前に調製して用いることができる。 About 3 weeks after the transplantation of the polymer carrier for forming an artificial lymph node tissue of the present invention, the artificial lymph node tissue of the present invention can be constructed in the recipient's living body. Artificial lymph node tissue constructed in this way is recovered from the living body and re-implanted into another animal for secondary immunization, in vitro culture, or treated for immunocompromised individuals Or stored at a low temperature of −80 ° C. or lower in a culture medium supplemented with an appropriate preservative (eg, 10% DMSO), and prepared and used before use.
以下、本発明の理解を深めるために、以下に実施例を示してより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではないことはいうまでもない。 Hereinafter, in order to deepen the understanding of the present invention, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, it is needless to say that the present invention is not limited thereto.
（実施例１）人工リンパ節組織形成用高分子担体による人工リンパ節組織形成の検討
Ａ．人工リンパ節組織形成用高分子担体の移植
三次元構造を有する高分子担体としてのコラーゲンスポンジ（株式会社高研社製、CS-35）を約３ｍｍ角（３×３×３ｍｍ）に切断した。このコラーゲンスポンジ切片に、表１に示したケモカイン、VEGFCを１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に、最終濃度が０．５μｇ／ｍｌとなるように溶解した溶液１０μｌを滴下して含浸させ、本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体を作製した。
(Example 1) Examination of artificial lymph node tissue formation by polymer carrier for artificial lymph node tissue formation Implantation of Polymer Carrier for Artificial Lymph Node Tissue Formation A collagen sponge (CS-35, manufactured by Koken Co., Ltd.) as a polymer carrier having a three-dimensional structure was cut into about 3 mm square (3 × 3 × 3 mm). To this collagen sponge slice, 10 μl of a solution in which the chemokine shown in Table 1 and VEC were dissolved in PBS (pH 7.4) containing 1% BSA (bovine serum albumin) to a final concentration of 0.5 μg / ml was dropped. The polymer carrier for forming an artificial lymph node tissue of the present invention was prepared by impregnation.
吸引麻酔（イソフルラン）下、外科的処置により８〜１２周齢のBalb/cマウスの腎皮膜の下で腎臓との間に、上記本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体を移植した。移植は２つの腎臓に、それぞれ腎上極付近と下極付近の２ケ所、合計４ケ所に移植した。 Under the suction anesthesia (isoflurane), the above-mentioned polymer carrier for artificial lymph node tissue formation of the present invention was transplanted between the kidney under the renal capsule of 8-12 weeks old Balb / c mice by surgical treatment. The transplantation was carried out in two kidneys, two in the vicinity of the upper and lower poles of the kidney, for a total of four.
Ｂ． 人工リンパ節組織の免疫組織学的解析
移植３週間後に、人工リンパ節組織形成用高分子担体による移植組織を取り出し、免疫組織染色法によりＴ細胞及びＢ細胞の集積の検討を行った。すなわち、取り出した移植組織をOCT Compound4583（Sakura Finetek社製）を用いて包埋し、液体窒素により凍結ブロックを作製した。次いで、厚さ５μｍの凍結切片を作製してＡＰＳ（アミノシラン）コートしたスライドガラスに貼り付け、風乾後、−２０℃の冷アセトンで１０分間固定し、FITG-抗B220抗体（Ｂ細胞マーカー、BD Biosciences社製）及びPE-抗Thy1.2抗体（Ｔ細胞マーカー、BD Biosciences社製）を使用し、定法に従って免疫組織染色を行った。
B. Immunohistochemical analysis of artificial lymph node tissue Three weeks after the transplantation, the transplanted tissue with a polymer carrier for artificial lymph node tissue formation was taken out, and the accumulation of T cells and B cells was examined by immunohistochemical staining. That is, the removed transplanted tissue was embedded using OCT Compound4583 (manufactured by Sakura Finetek), and a frozen block was prepared using liquid nitrogen. Next, a frozen section having a thickness of 5 μm was prepared and attached to a glass slide coated with APS (aminosilane), air-dried, fixed with -20 ° C. cold acetone for 10 minutes, and FITG-anti-B220 antibody (B cell marker, BD Biosciences) and PE-anti-Thy1.2 antibody (T cell marker, BD Biosciences) were used, and immunohistochemical staining was performed according to a conventional method.
その結果、CXCL12、CXCL13及びCCL19の組み合わせ、又は、CXCL12、CCL19及びCCL21の組み合わせでケモカインを用いた場合に、Ｂ細胞及びＴ細胞の集積とクラスターの形成が認められ（表１、図１）、人工リンパ節組織が形成されたことが明らかとなった。また、表1の実験番号１−１０及び１−１２において、VEGFCの代わりにVEGFAを使用しても同様の結果が得られた。 As a result, when chemokines were used in the combination of CXCL12, CXCL13 and CCL19, or in the combination of CXCL12, CCL19 and CCL21, accumulation of B cells and T cells and formation of clusters were observed (Table 1, FIG. 1). It was revealed that an artificial lymph node tissue was formed. In addition, in Experiment Nos. 1-10 and 1-12 in Table 1, the same results were obtained even when VEGFA was used instead of VEGC.
（実施例２）抗原特異的抗体産生能の検討
Ａ 人工リンパ節組織形成用高分子担体の移植
５〜６周齢のBalb/cマウスに、胸腺依存性抗原である４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセチル−オブアルブミン（NP-OVA、Biosearch Technologies社製）をマウス１頭当たり１００μｇ腹腔内投与した。３〜４週間後に、実施例１と同様にして表２に示したケモカイン、VEGFCをコラーゲンスポンジ切片に含浸させ、作製した本発明の人工リンパ節組織形成用高分子担体を、免疫処理した上記マウスの腎皮膜下へ、実施例１と同様に移植した。
(Example 2) Examination of antigen-specific antibody-producing ability A Transplantation of polymer carrier for formation of artificial lymph node tissue 5-6 weeks old Balb / c mice were treated with 4-hydroxy-3-nitro, a thymus-dependent antigen. Phenylacetyl-ovalbumin (NP-OVA, manufactured by Biosearch Technologies) was administered intraperitoneally at 100 μg per mouse. Three to four weeks later, the mice were immunized with the polymer carrier for artificial lymph node tissue formation of the present invention prepared by impregnating collagen sponge sections with the chemokines and VECC shown in Table 2 in the same manner as in Example 1. Were transplanted in the same manner as in Example 1.
Ｂ．抗原特異的抗体産生能の測定
人工リンパ節組織形成用高分子担体を移植してから３週間後に、マウス１頭当たり１００μｇ／ｍｌのNP-OVAを静脈投与により再度免疫処理を行った。さらに５日間経過後に移植組織（人工リンパ節組織）を取り出し、すり潰して細胞を回収した。得られた細胞数を表２に示した。次に、得られた細胞１×１０５個を用いて、Nature Biotechnology, 22, 1539-1545, 2004に記載された方法に準じてELISPOT/FACSアッセイを行い、抗体を産生しているＢ細胞の数を測定した。
B. Measurement of antigen-specific antibody production ability Three weeks after transplantation of the polymer carrier for forming an artificial lymph node tissue, immunization was again performed by intravenous administration of 100 μg / ml NP-OVA per mouse. Further, after 5 days, the transplanted tissue (artificial lymph node tissue) was taken out and ground to recover the cells. The obtained cell number is shown in Table 2. Next, ELISPOT / FACS assay was performed on the obtained 1 × 10 5 cells according to the method described in Nature Biotechnology, 22, 1539-1545, 2004, and B cells producing antibodies were detected. Number was measured.
その結果、８個の移植組織から回収された全細胞数は、いずれの条件の場合でもコントロール（２−５）と比べてあまり差を認めなかった（表２）。一方、実験番号（２−１）〜（２−４）の各種ケモカインを含む人工リンパ節組織形成用高分子担体を移植した場合は、実験番号（２−５）のコントロールに比べてＩｇＭ抗体産生細胞の増加が顕著に認められた（図２）。このことから、移植片（人工リンパ節組織）へのＢ細胞の移入が起こっていることが分かる。また、抗原低親和性ＩｇＧ産生細胞（ＮＰ３０）のみならず、高親和性ＩｇＧ産生細胞（ＮＰ３）の増加も見られた。 As a result, the total number of cells recovered from the 8 transplanted tissues was not significantly different from the control (2-5) under any condition (Table 2). On the other hand, when a polymer carrier for artificial lymph node tissue formation containing various chemokines of Experiment Nos. (2-1) to (2-4) was transplanted, IgM antibody production was produced compared to the control of Experiment No. (2-5). The increase of the cell was recognized notably (FIG. 2). This shows that the transfer of B cells to the graft (artificial lymph node tissue) has occurred. In addition, not only antigen low affinity IgG producing cells (NP30) but also high affinity IgG producing cells (NP3) were increased.
以上詳述したように、本発明の方法によれば、特にストローマ細胞を使用しなくとも人工リンパ節組織を形成することができ、レシピエントであるマウスの系統や動物種に関係なく、人工リンパ節組織を形成することができる。本発明の人工リンパ節組織は、リンパ節組織形成に関わる細胞やメカニズムの解明に有用である。また、本発明の人工リンパ節組織を使用すれば、様々な抗原に対する特異的抗体やエフェクターＴ細胞を効率よく作製することが可能となる。 As described in detail above, according to the method of the present invention, an artificial lymph node tissue can be formed without particularly using stromal cells, and the artificial lymph node can be formed regardless of the strain or animal species of the recipient mouse. A nodal tissue can be formed. The artificial lymph node tissue of the present invention is useful for elucidating cells and mechanisms involved in lymph node tissue formation. Moreover, if the artificial lymph node tissue of the present invention is used, specific antibodies against various antigens and effector T cells can be efficiently produced.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010179889A JP2012036151A (en) | 2010-08-11 | 2010-08-11 | Method for producing artificial lymph node |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010179889A JP2012036151A (en) | 2010-08-11 | 2010-08-11 | Method for producing artificial lymph node |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012036151A true JP2012036151A (en) | 2012-02-23 |
Family
ID=45848548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010179889A Withdrawn JP2012036151A (en) | 2010-08-11 | 2010-08-11 | Method for producing artificial lymph node |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2012036151A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019069224A1 (en) * | 2017-10-02 | 2019-04-11 | Khalifa University of Science and Technology | Microfluidic device for generating an in vitro lymph node |
| US11071618B2 (en) | 2014-11-24 | 2021-07-27 | James Edward Moore, Jr. | Lymph node replacement construct |
-
2010
- 2010-08-11 JP JP2010179889A patent/JP2012036151A/en not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11071618B2 (en) | 2014-11-24 | 2021-07-27 | James Edward Moore, Jr. | Lymph node replacement construct |
| EP4046596A1 (en) | 2014-11-24 | 2022-08-24 | James Moore | Lymph node replacement construct |
| WO2019069224A1 (en) * | 2017-10-02 | 2019-04-11 | Khalifa University of Science and Technology | Microfluidic device for generating an in vitro lymph node |
| CN111246941A (en) * | 2017-10-02 | 2020-06-05 | 哈利法科学技术大学 | Microfluidic device for generating lymph nodes in vitro |
| US11478798B2 (en) | 2017-10-02 | 2022-10-25 | Khalifa University of Science and Technology | Microfluidic device for generating an in vitro lymph node |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Koltsova et al. | Dynamic T cell–APC interactions sustain chronic inflammation in atherosclerosis | |
| Turnquist et al. | IL-33 expands suppressive CD11b+ Gr-1int and regulatory T cells, including ST2L+ Foxp3+ cells, and mediates regulatory T cell-dependent promotion of cardiac allograft survival | |
| Walch et al. | Cognate antigen directs CD8+ T cell migration to vascularized transplants | |
| Safinia et al. | T-cell alloimmunity and chronic allograft dysfunction | |
| Anderson | Biocompatibility and bioresponse to biomaterials | |
| JP2023166584A (en) | Immune cell trapping devices and methods for making and using the same | |
| CN109069539A (en) | Combined immunization therapy use for cancer treatment and cell factor control therapy | |
| JPWO2007069755A1 (en) | Efficient method for producing antigen-specific hybridomas using artificial lymph nodes | |
| JP4854670B2 (en) | Structural skeletal engineering | |
| JP2008538587A (en) | Materials and methods for modifying an immune response against exogenous and endogenous immunogens, including syngeneic or non-syngeneic cells, tissues or organs | |
| Chhabra et al. | Germinal center alloantibody responses mediate progression of chronic allograft injury | |
| Li et al. | Lymph node fibroblastic reticular cells deposit fibrosis-associated collagen following organ transplantation | |
| Reed et al. | An autologous endothelial cell: peripheral blood mononuclear cell assay that detects cytokine storm responses to biologics | |
| JP5526441B2 (en) | Artificial lymph nodes for cancer treatment | |
| JP2012036151A (en) | Method for producing artificial lymph node | |
| JP2019509269A (en) | Suppression of transplant rejection by using modified grafts first | |
| Li et al. | Anti-CCL25 antibody prolongs skin allograft survival by blocking CCR9 expression and impairing splenic T-cell function | |
| US20130259837A1 (en) | Compositions and Methods of Using Living and Non-Living Bioactive Devices with Components Derived From Self-Renewing Colony Forming Cells Cultured and Expanded In Vitro | |
| JP4097544B2 (en) | Artificial lymph node | |
| Vigneswaran et al. | This paper is the winner of an SFB Award in the Hospital Intern, Residency category: Peptide biomaterials raising adaptive immune responses in wound healing contexts. | |
| CN113330110A (en) | Hybrid thymus, preparation method and use method for inducing tolerance of xenograft, and recovering immunocompetence and thymus function | |
| JP2006129839A (en) | Artificial lymph node producing antigen-specific antibody | |
| Wang et al. | Rapid Generation of Hpsc‐Derived High Endothelial Venule Organoids with In Vivo Ectopic Lymphoid Tissue Capabilities | |
| Lim et al. | Host cell in vivo production of the synthetic drug anti–CD25/IL‐10 using minicircle vector | |
| Vigneswaran et al. | Winner of the Student Award in the Hospital Intern Category, 10th World Biomaterials Congress, May 17–22, 2016, Montreal QC, Canada: Peptide biomaterials raising adaptive immune responses in wound healing contexts |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20131105 |