JP2012029693A - Ｃ反応性タンパク質発現の調節 - Google Patents

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Abstract

【課題】Ｃ反応性タンパク質の発現を調節するためのオリゴ若しくはポリヌクレオチド、組成物および方法を提供する。
【解決手段】Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ１５ないし３０核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子の最低８核酸塩基部分に１００％相補性であり、かつ、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡの発現を阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。組成物はＣ反応性タンパク質をコードする核酸を標的とするオリゴヌクレオチドを含んでなる。Ｃ反応性タンパク質発現の調節、ならびにＣ反応性タンパク質の発現と関連する疾患の診断および処置のためのこれらの化合物の使用方法。
【選択図】なし

Description

本発明はＣ反応性タンパク質の発現を調節するための組成物および方法を提供する。
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰおよびＰＴＸ１としてもまた知られる）は、多様な炎症性サイトカインに応答して肝で生産される不可欠なヒトの急性期反応体である。１９３０年に初めて同定された該タンパク質は高度に保存され、そして感染若しくは炎症状態の初期指標であるとみなされる。血漿Ｃ反応性タンパク質濃度は、感染、虚血、外傷、火傷および炎症状態に応答して１０００倍増大する。Ｃ反応性タンパク質の生物学的半減期は年齢、肝若しくは腎機能または薬物療法により影響されないため、それは、組織破壊、壊死および炎症の信頼できる生化学的マーカーであり、そして、その測定は多様な炎症状態、狭心症、血管傷害、末期腎疾患、慢性関節リウマチ、肥満およびアテローム硬化症をモニターするために広範に使用されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。
Ｃ反応性タンパク質の改良された定量方法は、Ｃ反応性タンパク質が通常上昇している状態すなわち尿路感染症（非特許文献１）、髄膜炎（非特許文献１０）、新生児敗血症、エリスロポエチン耐性（非特許文献１１）、および不顕性菌血症の診断を包含する臨床医学への増大した応用にもたらした。
構造上、Ｃ反応性タンパク質は、環状の五量体構造および半径方向対称性を特徴とするタンパク質のペントラキシンファミリーの１メンバーである。５個の同一の２４ｋＤａのプロトマーは２０６アミノ酸よりなり、そして非共有結合されている（非特許文献１２；非特許文献７）。ヒトＣ反応性タンパク質のゲノムＤＮＡ配列は、該タンパク質の変異体を有するとして（特許文献１）、また、担体として該変異体タンパク質を使用する細胞中への物質の送達方法（特許文献２）が、非特許文献１２により報告されている。免疫調節活性を有するＣ反応性タンパク質のアミノ酸１７４−１８５に対応するポリペプチドが特許文献３を開示されかつ特許請求されている。ヒトＣ反応性タンパク質の位置６２−７１に対応するペプチドもまた、炎症状態の処置のためヒト白血球エラスターゼおよび／若しくはカテプシンＧの活性を阻害するそれらの能力について研究され、そしてこれらは特許文献４に開示されている。
Ｃ反応性タンパク質は、ホスホコリン、フィブロネクチン、クロマチン、ヒストンおよびリボ核タンパク質のような広範な細胞性物質にカルシウム依存性の様式で結合する（非特許文献７）。それは貪食性白血球上の特定の受容体のリガンドであり、単球およびマクロファージ上での活性化反応を媒介し、そして補体を活性化する（非特許文献７）。
Ｃ反応性タンパク質の機能は先天性免疫系でのその役割に関係している。免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇと同様に、それは補体を活性化し、Ｆｃ受容体に結合し、そして多様な病原体のオプソニンとして作用する。Ｃ反応性タンパク質のＦｃ受容体との相互作用は、炎症応答を高める炎症前サイトカインの生成につながる。個別の抗原エピトープを特異的に認識するＩｇＧと異なり、Ｃ反応性タンパク質は、パターン認識に基づき、改変された自己および外来分子を認識する。従って、Ｃ反応性タンパク質は改変された自己およびある種の病原体の監視分子として作用すると考えられる。この認識は早期の防御を提供し、そして炎症前シグナルおよび体液性の適応免疫系の活性化につながる。従って、Ｃ反応性タンパク質分子は、認識機能およびエフェクター機能の双方を有する。
従って、Ｃ反応性タンパク質の活性および／若しくはその発現の薬理学的調節は、病理学的状態における治療的介入の適切な一点である。
タンパク質レベルを標的とすることによるＣ反応性タンパク質機能の調節を目的とした戦略は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害する抗体、ペプチドおよび分子の使用を必要とした。
最近の試験で、酵素ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害剤ロバスタチンが、上昇したＣ反応性タンパク質レベルを伴うがしかし高脂血症を伴わない参加者の急性冠動脈事象のリスクの低減において有効な剤であることが示された。すなわち、ロバスタチンの使用は１年後にＣ反応性タンパク質濃度の中央値の１４．８パーセントの低下をもたらした一方、プラセボ群では変化は観察されなかった（非特許文献１３）。別のスタチン、セリバスタチンもまた、高コレステロール血症を伴う患者でＣ反応性タンパク質濃度を低下させることが示された（非特許文献１４）。
しかしながら、Ｃ反応性タンパク質のレベルおよび機能を効果的に阻害する既知の治療薬は現在存在しない。したがって、Ｃ反応性タンパク質を効果的かつ選択的に阻害することが可能な作用剤に対する長い間の切実な必要性が存続している。
国際特許公開第ＷＯ ９６／０６６２４号明細書 国際特許公開第ＷＯ ００／１１２０７号明細書 米国特許第５，７８３，１７９号明細書 国際特許公開第ＷＯ ９９／００４１８号明細書
ＡｒｉｃｉとＷａｌｌｓ、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、２００１、５９、４０７−４１４ ＧａｂａｙとＫｕｓｈｎｅｒ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９９９、３４０、４４８−４５４ Ｈｉｇｈｔｏｎら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、１９８５、１２、８７１−８７５ Ｈｕｌｔｈｅら、Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）、２００１、１００、３７１−３７８ Ｌａｇｒａｎｄら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９９、１００、６＋９６−１０２ ＭｏｒｒｏｗとＲｉｄｋｅｒ、Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．、２０００、８４、１４９−１６１、ｉｘ Ｓｚａｌａｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ、１９９７、１６、１２７−１３６ ＷｅｓｔｈｕｙｚｅｎとＨｅａｌｙ、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．、２０００、３０、１３３−１４３ Ｙｕｄｋｉｎら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、２０００、１４８、２０９−２１４ Ｒｕｕｓｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、１９８５、１０７、９７−１００ Ｂａｒａｎｙ、Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２００１、１６、２２４−２２７ Ｌｅｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８５、２６０、１３３７７−１３３８３ Ｒｉｄｋｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２００１、３４４、１９５９−１９６５ Ｒｉｄｋｅｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００１、１０３、１１９１−１１９３．
発明の要約
本発明は、Ｃ反応性タンパク質の発現を調節するための組成物および方法を提供する。
本発明は、Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸を標的としかつＣ反応性タンパク質の発現を調節する化合物、とりわけ核酸および核酸様オリゴマーに向けられる。具体的には、本発明は、好ましい態様においてＣ反応性タンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズする化合物、とりわけオリゴヌクレオチド化合物に関する。こうした化合物はＣ反応性タンパク質の発現を調節することが本明細書で示される。
特定の遺伝子産物の有効な発現の低下手段としてアンチセンス技術が出現しており、そしてＣ反応性タンパク質の発現の調節のための多数の治療、診断および研究の応用で独特に有用である。
本発明の化合物を含んでなる製薬学的および他の組成物もまた提供される。Ｃ反応性タンパク質の調節物質のスクリーニング方法、および、細胞、組織若しくは動物を本発明の化合物若しくは組成物の１種若しくはそれ以上と接触させることを含んでなる前記細胞、組織若しくは動物におけるＣ反応性タンパク質の発現の調節方法がさらに提供される。これらの方法において、細胞若しくは組織はイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で接触させうる。あるいは、細胞若しくは組織はエクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で接触させうる。
Ｃ反応性タンパク質の発現と関連する疾患若しくは状態を有する若しくはそれらの傾向があることが疑われる動物、とりわけヒトの処置方法もまた本明細書に示される。こうした方法は、治療上若しくは予防上有効な量の本発明の化合物若しくは組成物の１種若しくはそれ以上を処置の必要な人に投与することを含んでなる。
一局面において、本発明は、本明細書に開示されるいずれかのおよび全部の状態の処置のための医薬品の製造における本発明の化合物若しくは組成物の使用を提供する。
［発明の詳細な記述］
Ａ．本発明の概要
本発明は、Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子の機能若しくは効果の調節での使用のため、化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドおよび類似の種を使用する。これは、Ｃ反応性タンパク質をコードする１種若しくはそれ以上の核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにより達成される。本明細書で使用されるところの「標的核酸」および「Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子」という用語は、Ｃ反応性タンパク質をコードするＤＮＡ、こうしたＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ若しくはそれらの部分を包含する）ならびにまたこうしたＲＮＡ由来のｃＤＮＡも包含するのに便宜上使用する。本発明の化合物のその標的核酸とのハイブリダイゼーションを、一般に「アンチセンス」と称する。その結果、本発明のいくつかの好ましい態様の実施に関与されると考えられる好ましい機構を「アンチセンス阻害」と本明細書で称する。こうしたアンチセンス阻害は、典型的には、最低１本の鎖若しくはセグメントが切断、分解若しくは別の方法で作動不可能にされているようなオリゴヌクレオチドの鎖若しくはセグメントの水素結合に基づくハイブリダイゼーションに基づく。この点
に関して、こうしたアンチセンス阻害のため特定の核酸分子およびそれらの機能を標的とすることが目下のところ好ましい。
妨害されるべきＤＮＡの機能は複製および転写を包含し得る。複製および転写は、例えば、内因性の細胞鋳型、ベクター、プラスミド構築物かそうでないものに由来し得る。妨害されるべきＲＮＡの機能は、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡ合成の部位から離れた細胞内の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１種若しくはそれ以上のＲＮＡ種を生じるためのＲＮＡのスプライシング、および該ＲＮＡに関与しうる（ｅｎｇａｇｅｄ ｉｎ）若しくはそれにより助長されうるＲＮＡを巻き込む触媒活性若しくは複合体形成のような機能を包含し得る。標的核酸の機能のこうした妨害の好ましい一結果はＣ反応性タンパク質の発現の調節である。本発明の文脈上、「調節」および「発現の調節」は、該遺伝子をコードする核酸分子、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡの量若しくはレベルの増大（刺激）若しくは減少（阻害）のいずれかを意味している。阻害はしばしば発現の調節の好ましい形態であり、そしてｍＲＮＡがしばしば好ましい標的核酸である。
本発明の文脈上、「ハイブリダイゼーション」はオリゴマー化合物の相補鎖の対形成を意味している。本発明において、好ましい対形成機構は、オリゴマー化合物の鎖の相補的ヌクレオシド若しくはヌクレオチド塩基（核酸塩基）間のワトソン−クリック、フーグステン若しくは逆フーグステン水素結合形成でありうる水素結合形成を必要とする。例えば、アデニンおよびチミンは水素結合の形成により対形成する相補的核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは変動する環境下で起こり得る。
アンチセンス化合物は、標的核酸への化合物の結合が該標的核酸の正常な機能を妨害して活性の喪失を引き起こし、かつ、特異的結合が望ましい条件下、すなわちｉｎ ｖｉｖｏアッセイ若しくは治療的処置の場合には生理学的条件下、およびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイを実施する条件下での非標的核酸配列への該アンチセンス化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。
本発明において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」若しくは「ストリンジェントな条件」という句は、本発明の化合物が最小の数の他の配列を除いてその標的配列にハイブリダイズすることができる条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存しかつ異なる環境で異なることができ、そして、本発明の文脈上、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、該オリゴマー化合物の性質および組成、ならびにそれらが検討されているアッセイにより決定される。
本明細書で使用されるところの「相補的な」は、あるオリゴマー化合物の２核酸塩基間での正確な対形成の能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチド（オリゴマー化合物）のある一位置の１核酸塩基が標的核酸のある一位置の１核酸塩基と水素結合を形成することが可能であり、前記標的核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはオリゴヌクレオチド分子である場合には、該オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は相補位置であるとみなされる。オリゴヌクレオチドおよびさらなるＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはオリゴヌクレオチド分子は、各分子中の十分な数の相補位置が相互と水素結合形成し得る核酸塩基により占有される場合に相互に相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的な」は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間で安定かつ特異的な結合が起こるような十分な数の核酸塩基にわたる十分な程度の正確な対形成すなわち相補性を示すのに使用される用語である。
アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその標的核酸
のものに１００％相補的であり得るがしかしそうである必要はないことが当該技術分野で理解されている。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在若しくは隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないような１個若しくはそれ以上のセグメント（例えばループ構造若しくはヘアピン構造）にハイブリダイズすることがある。本発明のアンチセンス化合物は、標的核酸内の標的領域に対する最低７０％、若しくは最低７５％、若しくは最低８０％、若しくは最低８５％の配列の相補性を含んでなること、より好ましくは、それらが、それらが標的とする標的核酸配列内の標的領域に対する最低９０％の配列の相補性を含んでなり、そして、なおより好ましくは、最低９５％若しくは最低９９％の配列の相補性を含んでなることが好ましい。例えば、アンチセンス化合物の２０核酸塩基のうち１８個が標的領域に相補的であり、そして従って特異的にハイブリダイズするとみられるアンチセンス化合物は、９０パーセントの相補性を表すとみられる。この例において、残存する非相補的核酸塩基は、相補的核酸塩基と群を形成しても若しくは散在されていてもよく、そして相互に若しくは相補核酸塩基と連続している必要はない。であるから、標的核酸と完全に相補的な２領域により隣接されている４個の非相補的核酸塩基を有する長さ１８核酸塩基であるアンチセンス化合物は、標的核酸との７７．８％の全体的相補性を有するとみられ、そして従って本発明の範囲内にあるとみられる。標的核酸の一領域とのアンチセンス化合物の相補性のパーセントは、当該技術分野で既知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所配列比較検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、２１５、４０３−４１０；ＺｈａｎｇとＭａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９９７、７、６４９−６５６）を使用して、慣例に決定し得る。
相同性、配列の同一性若しくは相補性のパーセントは、例えば、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２、４８２−４８９）のアルゴリズムを使用するデフォルトの設定を使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｄｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、ウィスコンシン州マディソン）により決定し得る。いくつかの態様において、オリゴマーと標的との間の相同性、配列の同一性若しくは相補性は約５０％ないし約６０％の間である。いくつかの態様において、相同性、配列の同一性若しくは相補性は約６０％ないし約７０％の間である。いくつかの態様において、相同性、配列の同一性若しくは相補性は約７０％と約８０％の間である。さらなる態様において、相同性、配列の同一性若しくは相補性は約８０％と約９０％との間である。さらなる態様において、相同性、配列の同一性若しくは相補性は、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％若しくは約１００％である。
Ｂ．本発明の化合物
本発明では、化合物は、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライス体（ｓｐｌｉｃｅｒ）、ならびに標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズする他の短いオリゴマー化合物を包含する。であるから、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状若しくはヘアピンオリゴマー化合物の形態で導入してもよく、また、内部若しくは末端のバルジ若しくはループのような構造要素を含有しうる。系に一旦導入されれば、本発明の化合物は、１種若しくはそれ以上の酵素若しくは構造タンパク質の作用を引き出して標的核酸の改変を遂げうる。
こうした酵素の制限しない一例は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞のエンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＨである。「ＤＮＡ様」である一本鎖アンチセンス化合物がＲＮアーゼＨを引き出すことが当該技術分野で既知である。ＲＮアーゼＨの活性化は、従ってＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド媒介
性の阻害の効率を大きく高める。酵素のＲＮアーゼＩＩＩおよびリボヌクレアーゼＬファミリーのもののような他のリボヌクレアーゼについて、類似の役割が提案されている。
一形態のアンチセンス化合物は一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである一方、多くの種において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子のような二本鎖構造の導入が、遺伝子若しくはその関連する遺伝子産物の機能の強力かつ特異的なアンチセンス媒介性の低下を誘導する。この現象は植物および動物双方で起こり、そしてウイルス防御およびトランスポゾンのサイレンシングと進化上の関係を有すると考えられる。
ｄｓＲＮＡが動物での遺伝子サイレンシングにつながり得るという最初の証拠は線虫ケノルハブディティス エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）での研究から１９９５年に現れた（ＧｕｏとＫｅｍｐｈｅｕｓ、Ｃｅｌｌ、１９９５、８１、６１１−６２０）。ｄｓＲＮＡの主な妨害効果は転写後である（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、１５５０２−１５５０７）。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）への曝露に由来するケノルハブディティス エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）で定義された転写後のアンチセンス機序は、以来、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と称されている。この用語は、内因性の標的ｍＲＮＡのレベルの配列特異的な減少に至るｄｓＲＮＡの導入を伴うアンチセンス媒介性の遺伝子サイレンシングを意味するように一般化された（Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９１、８０６−８１１）。最近、アンチセンスの極性のｄｓＲＮＡの一本鎖ＲＮＡオリゴマーがＲＮＡｉの強力な誘導物質であることが報告された（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９５、６９４−６９７）。
本発明の情況において、「オリゴマー化合物」という用語は、複数の単量体単位を含んでなるポリマー若しくはオリゴマーを指す。本発明の情況において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）若しくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー若しくはポリマー、またはそれらの模倣物、キメラ、アナログおよびホモログを指す。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有ヌクレオシド間（バックボーン）結合から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを包含する。こうした改変若しくは置換オリゴヌクレオチドは、しばしば、例えば高められた細胞取り込み、標的核酸に対する高められた親和性およびヌクレアーゼ存在下での増大した安定性のような所望の特性により天然の形態より好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド位置の１個若しくはそれ以上に異なる塩基が存在する改変オリゴヌクレオチドもまた包含する。例えば、第一のヌクレオチドがアデノシンである場合、この位置にチミジン、グアノシン若しくはシチジンを含有する改変オリゴヌクレオチドを製造しうる。これはオリゴヌクレオチドの位置のいずれでも行いうる。これらのオリゴヌクレオチドをその後、本明細書に記述される方法を使用して試験して、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡの発現を阻害するそれらの能力を決定する。
オリゴヌクレオチドが本発明の化合物の好ましい一形態である一方、本発明は、限定されるものでないが本明細書に記述されるもののようなオリゴヌクレオチドアナログおよび模倣物を挙げることができる化合物の他の一族を同様に包括する。
本発明の化合物は約８から約８０個までの核酸塩基（すなわち約８から約８０個までの結合されたヌクレオシド）を含んでなる。当業者は、本発明が長さ８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８
、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９若しくは８０核酸塩基の化合物を包含することを認識するであろう。
一態様において、本発明の化合物は長さ１２ないし５０核酸塩基である。当業者は、これが長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０核酸塩基の化合物を包含することを認識するであろう。
別の態様において、本発明の化合物は長さ１５ないし３０核酸塩基である。当業者は、これが長さ１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０核酸塩基の化合物を包含することを認識するであろう。
別の態様において、本発明の化合物は約１２から約５０個までの核酸塩基のオリゴヌクレオチドである。さらなる態様は、約１５から約３０個までの核酸塩基を含んでなるものである。
別の態様において、アンチセンス化合物は、本明細書に開示されるアンチセンス化合物の最低８個の連続する核酸塩基を含んでなる。
具体的に説明するアンチセンス化合物内から選択される最低８個の連続する核酸塩基の伸長（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含んでなる長さ８〜８０核酸塩基のアンチセンス化合物が、同様に適するアンチセンス化合物であるとみなされる。
例示的アンチセンス化合物は、具体的に説明する好ましいアンチセンス化合物の１種の５’末端からの最低８個の連続する核酸塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド配列を包含する（残存する核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるアンチセンス化合物の５’末端のすぐ上流で開始しかつ該オリゴヌクレオチドが約８ないし約８０核酸塩基を含有するまで連続する同一オリゴヌクレオチドの連続した伸長である）。同様に好ましいアンチセンス化合物は、具体的に説明される好ましいアンチセンス化合物の１種の３’末端からの最低８個の連続する核酸塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド配列により表される（残存する核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるアンチセンス化合物の３’末端のすぐ下流で開始しかつ該オリゴヌクレオチドが約８ないし約８０核酸塩基を含有するまで連続する同一オリゴヌクレオチドの連続した伸長である）。本発明の例示的化合物は実施例で同定されかつ表１、２および３に列挙されて見出されうる。本明細書に具体的に説明される好ましいアンチセンス化合物を備えた当業者は、過度の実験を伴わずに、さらなる好ましいアンチセンス化合物を同定することが可能であろう。
Ｃ．本発明の標的
本発明の情況において、ある特定の核酸分子をアンチセンス化合物の「標的とすること」は、多段階の過程であり得る。該過程は通常、機能が調節されるべきである標的核酸の同定で開始する。この標的核酸は、例えば、発現が特定の障害若しくは疾患状態と関連する細胞遺伝子（若しくは該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または感染性病原体からの核酸分子でありうる。本発明において、標的核酸はＣ反応性タンパク質をコードする。
ターゲッティング過程は、通常、所望の効果、例えば発現の調節が生じることができるような、アンチセンス相互作用が起こるための標的核酸内の最低１個の標的領域、セグメント若しくは部位の決定もまた包含する。本発明の情況内で、「領域」という用語は、最
低１個の同定可能な構造、機能若しくは特徴を有する標的核酸の一部分と定義する。セグメントは標的核酸の領域内にある。「セグメント」は、標的核酸内の領域のより小さいすなわち下位部分と定義する。本発明で使用されるところの「部位」は標的核酸内の位置と定義する。
当該技術分野で既知であるとおり、翻訳開始コドンは典型的に５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子中で；対応するＤＮＡ分子中では５’−ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンは、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」若しくは「ＡＵＧ開始コドン」ともまた称される。ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ若しくは５’−ＣＵＧ、ならびに５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧをもつ翻訳開始コドンを有する少数派の遺伝子がｉｎ ｖｉｖｏで機能することが示されている。従って、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、それぞれの場合の開始アミノ酸が典型的にメチオニン（真核生物中）若しくはホルミルメチオニン（原核生物中）である場合であっても、多くのコドン配列を包含し得る。真核生物および原核生物遺伝子が２種若しくはそれ以上の代替開始コドンを有することができ、それらのいずれか１種が特定の細胞型若しくは組織中またはある特定の一組の条件下で翻訳開始に優先的に利用されうることもまた当該技術分野で既知である。本発明の情況において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、こうしたコドンの配列（１種若しくは複数）に関係なく、Ｃ反応性タンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するのにｉｎ ｖｉｖｏで使用されるコドン（１種若しくは複数）を指す。遺伝子の翻訳終止コドン（若しくは「終止コドン」）が３種の配列すなわち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列はそれぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡである）の１種を有しうることもまた当該技術分野で既知である。
「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち５’若しくは３’）に約２５から約５０個までの連続したヌクレオチドを包含するこうしたｍＲＮＡ若しくは遺伝子の一部分を指す。同様に、「終止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち５’若しくは３’）に約２５から約５０個までの連続したヌクレオチドを包含するこうしたｍＲＮＡ若しくは遺伝子の一部分を指す。結果、「開始コドン領域」（若しくは「翻訳開始コドン領域」）および「終止コドン領域」（若しくは「翻訳終止コドン領域」）は、本発明のアンチセンス化合物で効果的に標的としうるＣ反応性タンパク質をコードする分子の全領域である。
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を指すことが当該技術分野で既知であるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）若しくは「コーディング領域」もまた、効果的に標的としうるＣ反応性タンパク質をコードする分子の一領域である。本発明の情況内で、好ましい一領域は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始若しくは終止コドンを包含する遺伝子内領域である。
Ｃ反応性タンパク質をコードする分子の他の標的領域は、翻訳開始コドンから５’の方向のｍＲＮＡの部分を指すことが当該技術分野で既知でありかつ従ってｍＲＮＡの５’ｃａｐ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド（若しくは該遺伝子上の対応するヌクレオチド）を包含する５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、および、翻訳終止コドンから３’の方向のｍＲＮＡの部分を指すことが当該技術分野で既知でありかつ従って翻訳終止コドンとｍＲＮＡの３’端との間のヌクレオチド（若しくは該遺伝子上の対応するヌクレオチド）を包含する３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を包含する。ｍＲＮＡの５’ｃａｐ部位は、５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの最も５’の残基に結合されたＮ７−メチル化グアノシン残基を含んでなる。ｍＲＮＡの５’ｃａｐ領域は、５’ｃａｐ構造それ自身ならびにｃａｐ部位に隣接する最初の５０ヌクレオチドを包含するとみなされる。Ｃ反応性
タンパク質をコードする分子の５’ｃａｐ領域を標的とすることもまた好ましい。
従って、本発明は、配列番号４に示されるところのヌクレオチド１−２４８０の一部分を標的とするアンチセンス化合物を提供する。別の態様において、該アンチセンス化合物は、配列番号４に示されるところの５’ＵＴＲを含んでなるヌクレオチド１−５７０の最低８核酸塩基部分を標的とする。別の態様において、該アンチセンス化合物は、配列番号４に示されるところの３’ＵＴＲを含んでなるヌクレオチド１１８３−２４８０の最低８核酸塩基部分を標的とする。別の態様において、該アンチセンス化合物は、配列番号４に示されるところのコーディング領域を含んでなるヌクレオチド５７１−１１８２の最低８核酸塩基部分を標的とする。なお他の態様において、該アンチセンス化合物は、表４に示されるところの「好ましい標的セグメント」（本明細書で定義されるところの）の最低８核酸塩基部分を標的とする。
数種の真核生物ｍＲＮＡ転写物は直接翻訳されるとは言え、多くは転写物が翻訳される前にそれから除去される「イントロン」として知られる１個若しくはそれ以上の領域を含有する。残存する（および従って翻訳される）領域は「エキソン」として知られ、そして一緒にスプライスされて連続的ｍＲＮＡ配列を形成して、エキソンが結合される部位にエキソン−エキソン接合部をもたらす。エキソン−エキソン接合部を標的とすることは、正常なスプライス産物の過剰産生が疾患に関与している、若しくは異常なスプライス産物の過剰産生が疾患に関与している状況で有用であり得る。スプライス部位、すなわちイントロン−エキソン接合部若しくはエキソン−イントロン接合物を標的とすることもまた、異常なスプライシングが疾患に関与している、若しくは特定のスプライス産物の過剰産生が疾患に関与している状況でとりわけ有用でありうる。再配列若しくは欠失による異常な融合接合部もまた好ましい標的部位である。「融合転写物」として知られる異なる遺伝子源からの２種（若しくはそれ以上）のｍＲＮＡのスプライシングの過程を介して産生されるｍＲＮＡ転写物もまた適する標的部位である。例えばＤＮＡ若しくはプレｍＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物を使用して、イントロンを効果的に標的とし得る。
代替のＲＮＡ転写物がＤＮＡの同一ゲノム領域から産生され得る。これらの代替転写物は一般に「バリアント」として知られる。より具体的には、「プレｍＲＮＡバリアント」は、それらの開始若しくは終止いずれかの位置で同一のゲノムＤＮＡから産生される他の転写物と異なりかつイントロンおよびエキソン双方の配列を含有する、同一のゲノムＤＮＡから産生される転写物である。
スプライシングの間の１種若しくはそれ以上のエキソン若しくはイントロン領域またはそれらの部分の除去に際して、プレｍＲＮＡバリアントはより小さな「ｍＲＮＡバリアント」を生じる。結果、ｍＲＮＡバリアントはプロセシングされたプレｍＲＮＡバリアントであり、そして各独特のプレｍＲＮＡバリアントは常にスプライシングの結果として独特な一ｍＲＮＡバリアントを生じるはずである。これらのｍＲＮＡバリアントは「選択的スプライスバリアント」としてもまた知られる。プレｍＲＮＡバリアントのスプライシングが起こらない場合には、プレｍＲＮＡバリアントはｍＲＮＡバリアントと同一である。
バリアントは、転写を開始若しくは終止するための代替シグナルの使用により生じ得る。プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡは１個以上の開始コドン若しくは終止コドンを有し得る。代替の開始コドンを使用するプレｍＲＮＡ若しくはｍＲＮＡから発するバリアントは、そのプレｍＲＮＡ若しくはｍＲＮＡの「代替開始バリアント」として知られる。代替終止コドンを使用する転写物はそのプレｍＲＮＡ若しくはｍＲＮＡの「代替終止バリアント」として知られる。１つの特定の型の代替終止バリアントは、産生される複数の転写物が転写機構により「ポリＡ終止シグナル」の１種の代替選択に由来してそれにより独特のポリＡ部位で終止する転写物を生じさせる「ポリＡバリアント」である。本発明の情況内で、本
明細書に記述されるバリアントの型もまた好ましい標的核酸である。
好ましいアンチセンス化合物がハイブリダイズする標的Ｃ反応性タンパク質核酸上の位置は下で「好ましい標的セグメント」と称される。本明細書で使用されるところの「好ましい標的セグメント」という用語は、活性のアンチセンス化合物が標的とするＣ反応性タンパク質をコードする分子の標的領域の最低８核酸塩基部分と定義する。理論により束縛されることを願わないが、これらの標的セグメントはハイブリダイゼーションのため到達可能である標的核酸の部分を表すものと目下のところ考えられている。
ある種の好ましいＣ反応性タンパク質標的セグメントの特定の配列が本明細書に示されるが、当業者は、これらは本発明の範囲内の特定の態様を具体的に説明しかつ記述するようにはたらくことを認識するであろう。付加的な好ましい標的セグメントは、本明細を鑑みて当業者により同定されうる。
Ｃ反応性タンパク質の具体的に説明する好ましい標的セグメント内から選択された最低８個の連続する核酸塩基の伸長を含んでなる長さ８〜８０核酸塩基の標的セグメントが、同様にターゲッティングに適するとみなされる。
標的セグメントは、具体的に説明する好ましい標的セグメントの１種の５’末端からの最低８個の連続する核酸塩基を含んでなるＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列を包含し得る（残存する核酸塩基は、標的セグメントの５’末端のすぐ上流で開始しかつ該ＤＮＡ若しくはＲＮＡが約８ないし約８０核酸塩基を含有するまで連続する、同一のＤＮＡ若しくはＲＮＡの連続する伸長である）。同様に好ましい標的セグメントは、具体的に説明する好ましい標的セグメントの１種の３’末端からの最低８個の連続する核酸塩基を含んでなるＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列により表される（残存する核酸塩基は、標的セグメントの３’末端のすぐ下流で開始しかつ該ＤＮＡ若しくはＲＮＡが約８ないし約８０核酸塩基を含有するまで連続する、同一のＤＮＡ若しくはＲＮＡの連続する伸長である）。本明細書で具体的に説明される好ましい標的セグメントを備えた当業者は、過度の実験を伴わずに、さらなる好ましい標的セグメントを同定することが可能であろう。
１種若しくはそれ以上の標的領域、セグメント若しくは部位が一旦同定されれば、所望の効果を生じるのに標的に十分に相補的である、すなわち十分に良好にかつ十分な特異性を伴いハイブリダイズするアンチセンス化合物が選ばれる。
一態様において、オリゴマーアンチセンス化合物は、本明細書に開示されるもののような標的核酸塩基配列の領域を標的とし得る。領域が８核酸塩基より大きいか若しくはそれに等しくかつ８０核酸塩基未満であるか若しくはそれに等しい、オリゴマーアンチセンス化合物が標的とし得る核酸塩基配列の全領域が、後に続くとおり記述される：
Ｒ（ｎ，ｎ＋ｍ−１）を標的核酸塩基配列からの１領域と仮定する。式中、「ｎ」は該領域の最も５’の核酸塩基位置であり、「ｎ＋ｍ−１」は該領域の最も３’の核酸塩基位置であり、そして「ｍ」は該領域の長さである。長さ「ｍ」の領域の集合「Ｓ（ｍ）」は、ｎが１からＬ−ｍ＋１までの範囲にわたる領域と定義され、式中Ｌは標的核酸塩基配列の長さでありかつＬ＞ｍである。全部の領域の集合「Ａ」は、ｍが８より大きいか若しくはそれに等しくかつ８０未満であるか若しくはそれに等しい場合からの各長さについての領域の集合の結びである。
領域のこの集合は、以下の数学的表記法を使用して表し得る：
Figure 2012029693
式中、数学的演算子｜は「その結果」を示し、
数学的演算子∈は「集合の１メンバー」を表し（例えば、ｙ∈Ｚは要素ｙが集合Ｚの１メンバーであることを示す）、
ｘは変数であり、
Ｎは正の整数として定義される全部の自然数を示し、
かつ、数学的演算子
Figure 2012029693
は「集合の結び」を示す。
例えば、８、９および８０に等しいｍの領域の集合を以下の様式で構築し得る。標的核酸塩基配列の位置１（ｎ＝１）で開始する長さが１００核酸塩基（Ｌ＝１００）の標的核酸塩基配列中の長さがそれぞれ８核酸塩基の領域の集合（Ｓ（ｍ＝８））は、以下の式：
Figure 2012029693
を使用して創製し得、そして、核酸塩基１−８、２−９、３−１０、４−１１、５−１２、６−１３、７−１４、８−１５、９−１６、１０−１７、１１−１８、１２−１９、１３−２０、１４−２１、１５−２２、１６−２３、１７−２４、１８−２５、１９−２６、２０−２７、２１−２８、２２−２９、２３−３０、２４−３１、２５−３２、２６−３３、２７−３４、２８−３５、２９−３６、３０−３７、３１−３８、３２−３９、３３−４０、３４−４１、３５−４２、３６−４３、３７−４４、３８−４５、３９−４６、４０−４７、４１−４８、４２−４９、４３−５０、４４−５１、４５−５２、４６−５３、４７−５４、４８−５５、４９−５６、５０−５７、５１−５８、５２−５９、５３−６０、５４−６１、５５−６２、５６−６３、５７−６４、５８−６５、５９−６６、６０−６７、６１−６８、６２−６９、６３−７０、６４−７１、６５−７２、６６−７３、６７−７４、６８−７５、６９−７６、７０−７７、７１−７８、７２−７９、７３−８０、７４−８１、７５−８２、７６−８３、７７−８４、７８−８５、７９−８６、８０−８７、８１−８８、８２−８９、８３−９０、８４−９１、８５−９２、８６−９３、８７−９４、８８−９５、８９−９６、９０−９７、９１−９８、９２−９９、９３−１００を含んでなる領域の集合を記述する。
標的核酸塩基配列の位置１で開始する長さが１００核酸塩基の標的配列中の長さが２０
核酸塩基の領域の付加的な集合は、以下の式：
Figure 2012029693
を使用して記述し得、そして、核酸塩基１−２０、２−２１、３−２２、４−２３、５−２４、６−２５、７−２６、８−２７、９−２８、１０−２９、１１−３０、１２−３１、１３−３２、１４−３３、１５−３４、１６−３５、１７−３６、１８−３７、１９−３８、２０−３９、２１−４０、２２−４１、２３−４２、２４−４３、２５−４４、２６−４５、２７−４６、２８−４７、２９−４８、３０−４９、３１−５０、３２−５１、３３−５２、３４−５３、３５−５４、３６−５５、３７−５６、３８−５７、３９−５８、４０−５９、４１−６０、４２−６１、４３−６２、４４−６３、４５−６４、４６−６５、４７−６６、４８−６７、４９−６８、５０−６９、５１−７０、５２−７１、５３−７２、５４−７３、５５−７４、５６−７５、５７−７６、５８−７７、５９−７８、６０−７９、６１−８０、６２−８１、６３−８２、６４−８３、６５−８４、６６−８５、６７−８６、６８−８７、６９−８８、７０−８９、７１−９０、７２−９１、７３−９２、７４−９３、７５−９４、７６−９５、７７−９６、７８−９７、７９−９８、８０−９９、８１−１００を含んでなる領域の集合を記述する。
標的核酸塩基配列の位置１で開始する長さが１００核酸塩基の標的配列中の長さが８０核酸塩基の領域の付加的な集合は、以下の式：
Figure 2012029693
を使用して記述し得、そして、核酸塩基１−８０、２−８１、３−８２、４−８３、５−８４、６−８５、７−８６、８−８７、９−８８、１０−８９、１１−９０、１２−９１、１３−９２、１４−９３、１５−９４、１６−９５、１７−９６、１８−９７、１９−９８、２０−９９、２１−１００を含んでなる領域の集合を記述する。
かように、この例では、Ａは領域１−８、２−９、３−１０・・・９３−１００、１−２０、２−２１、３−２２・・・８１−１００、１−８０、２−８１、３−８２・・・２１−１００を包含することができる。
これらの前述の例の集合ならびに１０から１９までおよび２１ないし７９の長さについての他の集合の結びは、数式：
Figure 2012029693
を使用して記述し得、式中、
Figure 2012029693
は全部の集合の全メンバーを合わせることにより得られる集合の結びを表す。
本明細書に記述される数式は、領域が長さｍのものであり、および、ｍが８核酸塩基より大きいか若しくはそれに等しくかつ８０核酸塩基未満であるか若しくはそれに等しく、ならびにｍがＬ未満でありかつｎがＬ−ｍ＋１未満である、いずれかの長さＬの標的核酸塩基配列中の全部の可能な標的領域を定義する。
一態様において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物はこれらの配列、若しくは上に列挙された配列のそれぞれ内で見出される小配列に１００％相補的である。別の態様において、オリゴヌクレオチド化合物は、これらの標的領域に対し個々の核酸塩基位置で２０個の連続した核酸塩基あたり最低３から若しくは５個の不適合を有する。本発明のなお他の化合物は、Ｃ反応性タンパク質配列の上で同定された部分のオーバーラップ領域を標的とする。
Ｄ．スクリーニングおよび標的の検証
さらなる一態様において、本明細書で同定される「好ましい標的セグメント」を、Ｃ反応性タンパク質の発現を調節する付加的な化合物についてのスクリーニングで使用しうる。「調節物質」は、Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子の発現を減少若しくは増大させかつ好ましい標的セグメントに相補的である最低８核酸塩基部分を含んでなる化合物である。該スクリーニング方法は、Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子の好ましい標的セグメントを１種若しくはそれ以上の候補調節物質と接触させる段階、およびＣ反応性タンパク質をコードする核酸分子の発現を減少若しくは増大させる１種若しくはそれ以上の候補調節物質を選択する段階を含んでなる。候補調節物質（１種若しくは複数）が、Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子の発現を調節（例えば減少若しくは増大のいずれか）することが可能であることが一旦示されれば、該調節物質をその後、Ｃ反応性タンパク質の機能のさらなる調査研究において、または本発明の研究、診断若しくは治療的剤としての使用のために使用しうる。
本発明の好ましい標的セグメントはまた、安定化された二本鎖（二重鎖）オリゴヌクレオチドを形成するために本発明のそれらのそれぞれの相補的アンチセンス化合物とも組合せうる。
こうした二本鎖オリゴヌクレオチド部分は、アンチセンス機序を介して標的発現を調節しかつ翻訳ならびにＲＮＡプロセシングを調節することが当該技術分野で示されている。さらに、二本鎖部分は化学修飾を受けうる（Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９１、８０６−８１１；ＴｉｍｍｏｎｓとＦｉｒｅ、Ｎａｔｕｒｅ １９９８、３９５、８５４；Ｔｉｍｍｏｎｓら、Ｇｅｎｅ、２００１、２６３、１０３−１１２；Ｔａｂａｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８２、４３０−４３１；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、１５５０２−１５５０７；Ｔｕｓｃｈｌら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１９９９、１３、３１９１−３１９７；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２００１、４１１、４９４−４９８；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００１、１５、１８８−２００）。例えば、こうした二本鎖部分は、二重鎖のアンチセンス鎖の標的への古典的ハイブリダイゼーションにより標的を阻害してそれにより標的の酵素分解を誘発することが示されている（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９５、６９４−６９７）。
本発明の化合物は、薬物発見および標的検証の領域でもまた適用し得る。本発明は、Ｃ反応性タンパク質と疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｔｅ）、表現型若しくは状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）との間に存在する関係を解明するための薬物発見の努力における、本明細書で同定される化合物および好ましい標的セグメントの使用を包括する。これらの方法は、サンプル、組織、細胞若しくは生物体を本発明の化合物と接触させること、処置後のいずれかの時点でＣ反応性タンパク質の核酸若しくはタンパク質レベル、および／または関連する表現型若しくは化学的エンドポイントを測定すること、ならびに場合によっては測定された値を未処置サンプル若しくは本発明のさらなる化合物で処置したサンプルと比較することを含んでなる、Ｃ反応性タンパク質を検出若しくは調節することを包含する。これらの方法は、標的検証の過程について未知の遺伝子の機能を決定する、または特定の疾患、状態若しくは表現型の処置若しくは予防の標的としての特定の一遺伝子産物の妥当性を決定するため、他の実験と同時に若しくは組合せでもまた実施し得る。
Ｅ．キット、研究試薬、診断薬および治療薬
本発明の化合物は、診断薬、治療薬、予防薬に、ならびに研究試薬およびキットとして利用される。さらに、最高の特異性で遺伝子発現を阻害することが可能であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば、特定の遺伝子の機能を解明するため、若しくは生物学的経路の多様なメンバーの機能を識別するために当業者により使用される。
キットおよび診断薬での使用のために、単独または他の化合物若しくは治療薬と組合せのいずれかの本発明の化合物を、細胞および組織内で発現される遺伝子の一部分若しくは相補物全体の発現パターンを解明するための示差的および／若しくは組合せ分析においてツールとして使用する。
本明細書で使用されるところの「生物学的系」若しくは「系」という用語は、Ｃ反応性タンパク質をコードする遺伝子の産物を発現するか若しくは発現する能力があるようにされているいずれかの生物体、細胞、細胞培養物若しくは組織と定義する。これらは、限定されるものでないが、ヒト、トランスジェニック動物、細胞、細胞培養物、組織、異種移植片、移植片およびそれらの組合せを挙げることができる。
制限しない一例として、１種若しくはそれ以上のアンチセンス化合物で処理した細胞若しくは組織内の発現パターンを、アンチセンス化合物で処理されない対照細胞若しくは組織と比較し、そして、生じられたパターンを遺伝子発現の示差的レベルについて分析する。例えば検査した遺伝子の疾患関連、シグナル伝達経路、細胞局在化、発現レベル、大きさ、構造若しくは機能にそれらが関係するためである。これらの分析は、刺激若しくは未刺激細胞で、および発現パターンに影響を及ぼす他の化合物の存在若しくは非存在下で実施し得る。
当該技術分野で既知の遺伝子発現分析方法の例は、ＤＮＡアレイ若しくはマイクロアレイ（ＢｒａｚｍａとＶｉｌｏ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、１７−２４；Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、２−１６）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）（Ｍａｄｄｅｎら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、２０００、５、４１５−４２５）、ＲＥＡＤＳ（消化したｃＤＮＡの制限酵素増幅）（ＰｒａｓｈａｒとＷｅｉｓｓｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９９、３０３、２５８−７２）、ＴＯＧＡ（全遺伝子発現分析）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００、９７、１９７６−８１）、タンパク質アレイおよびプロテオミクス（Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、２−１６；Ｊｕｎｇｂｌｕｔら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９９９、２０、２１００−１０）、発現配列タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）（
ＥＳＴ）配列決定（Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、２−１６；Ｌａｒｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０００、８０、１４３−５７）、減算ＲＮＡフィンガープリント法（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ＲＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）（ＳｕＲＦ）（Ｆｕｃｈｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０００、２８６、９１−９８；Ｌａｒｓｓｏｎら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、２０００、４１、２０３−２０８）、減算クローニング、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）（ＪｕｒｅｃｉｃとＢｅｌｍｏｎｔ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０００、３、３１６−２１）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ｃａｒｕｌｌｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．、１９９８、３１、２８６−９６）、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）技術（ＧｏｉｎｇとＧｕｓｔｅｒｓｏｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９９、３５、１８９５−９０４）、および質量分析法（Ｔｏ、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ、２０００、３、２３５−４１）を包含する。
本発明の化合物はＣ反応性タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズするため、これらの化合物は研究および診断薬に有用である。Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子の特異的検出を必要とする方法、およびＣ反応性タンパク質の検出若しくはさらなる研究での使用のための前記核酸分子の増幅において、プライマーおよびプローブが有用である。Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸との本明細書に開示されるプライマーおよびプローブのハイブリダイゼーションは、当該技術分野で既知の手段により検出し得る。こうした手段は、プライマーおよびプローブへの酵素の複合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、プライマーおよびプローブの放射標識、若しくはいずれかの他の適する検出手段を包含しうる。サンプル中のＣ反応性タンパク質のレベルを検出するためにこうした検出手段を使用するキットもまた製造しうる。
本発明はさらに、本明細書に開示されるいずれかのおよび全部の状態の処置のための医薬品の製造における本発明の化合物若しくは組成物の使用を提供する。
本発明のアンチセンス化合物は、閉塞性睡眠時無呼吸、アルツハイマー病、ＡＬＳ、パーキンソン病、多様な運動失調および黄斑変性を包含する神経学的状態の処置、若しくはそれらの処置のための医薬品の製造における使用のため提供される。
本発明のアンチセンス化合物は、肥満、代謝症候群および糖尿病を包含する代謝性状態の処置、若しくはそれらの処置のための医薬品の製造における使用のため提供される。
本発明のアンチセンス化合物は、心突然死、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、不安定狭心症、卒中、選択的ステント留置、血管形成術、アテローム硬化症、経皮経管的血管形成術（ＰＴＣＡ）後、末梢血管疾患後、心筋梗塞（ＭＩ）後、心移植、高血圧、僧帽弁交連切開術、血栓症、深部静脈血栓、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、腎透析、補体活性化、うっ血性心不全、全身血管炎および心肺バイパスを包含する心血管系の状態の処置、若しくはそれらの処置のための医薬品の製造における使用のため提供される。
本発明のアンチセンス化合物は、月経前症候群（ＰＭＳ）および月経困難症を包含する女性の健康状態の処置、若しくはそれらの処置のための医薬品の製造における使用のため提供される。
本発明のアンチセンス化合物は、歯肉炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症および体軸脊椎関節炎を包含する炎症性疾患の処置、若しくはそれらの処置のための医薬品の製造における使用のため提供される。
本発明のアンチセンス化合物は、ＨＩＶ関連リウマチ性障害および細菌感染症を包含する感染性疾患の処置、若しくはそれらの処置のための医薬品の製造における使用のため提供される。
本発明のアンチセンス化合物は、喘息および慢性閉塞性肺疾患を包含する肺の状態の処置、若しくはそれらの処置のための医薬品の製造における使用のため提供される。
本発明のアンチセンス化合物は、腰痛、強度の運動、持久力トレーニングおよび年齢に関連した障害を包含する筋骨格の状態の処置、若しくはそれらの処置のための医薬品の製造における使用のため提供される。
本発明のアンチセンス化合物は、肺癌および結腸癌を包含する癌の処置、若しくはそれらの処置のための医薬品の製造における使用のため提供される。
診断的用途の１つは、炎症の減弱を目的とした処置戦略から利益を得ることができる患者を同定するための、患者でのＣ反応性タンパク質レベルの測定である。診断に適するこうした患者は、例えば心筋梗塞に対する傾向を診断するための冠動脈ステント術を伴う患者、またはＥＳＲＤ若しくは腎障害に関連する他の症状、例えば高血圧、ｄｕｒｅｓｉｓ、腎不全を伴う患者を包含する。
アンチセンスの特異性および感受性もまた治療的用途の当業者により利用される。アンチセンス化合物は、ヒトを包含する動物の疾患状態の処置で治療的部分として使用されている。リボザイムを包含するアンチセンスオリゴヌクレオチド薬物はヒトに安全かつ有効に投与されており、また、多数の臨床試験が現在進行中である。従って、アンチセンス化合物は、細胞、組織および動物、とりわけヒトの処置のための処置レジメンで有用であるように構成し得る有用な治療様式であり得ることが確立されている。
治療薬については、Ｃ反応性タンパク質の発現を調節することにより処置し得る疾患若しくは障害を有することが疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明のアンチセンス化合物を投与することにより処置する。例えば、制限しない一態様において、該方法は、処置の必要な動物に治療上有効な量のＣ反応性タンパク質阻害剤を投与する段階を含んでなる。本発明のＣ反応性タンパク質阻害剤は、Ｃ反応性タンパク質の活性を効果的に阻害するか若しくはＣ反応性タンパク質の発現を阻害する。例えば、Ｃ反応性タンパク質のレベルを低下させるこうした化合物若しくは組成物は、急性冠動脈症候群を伴う被験体の罹病および死亡を予防するのに有用である。こうした組成物は、被験体におけるＣ反応性タンパク質により媒介される炎症を低下させるため、例えば、アテローム硬化症を処置若しくは予防、またはその進行を低下させるため；アテローム硬化性斑の部位若しくは冠動脈の急性の血管損傷を処置若しくは予防、またはその進行を低下させるため；あるいは心筋梗塞に関連する炎症若しくは腎の炎症により引き起こされる損傷を処置若しくは予防、またはその進行を低下させるために有用である。本発明のＣ反応性タンパク質阻害性化合物を使用するなお他の治療若しくは予防方法は、冠動脈ステント術を伴う患者を処置すること；あるいは、ＥＳＲＤ若しくは他の腎疾患または関連する炎症性障害を伴う患者を処置することを包含する。
一態様において、動物におけるＣ反応性タンパク質の活性若しくは発現が約１０％阻害される。好ましくは、動物におけるＣ反応性タンパク質の活性若しくは発現が約３０％阻害される。より好ましくは、動物におけるＣ反応性タンパク質の活性若しくは発現が５０％若しくはそれ以上阻害される。従って、該オリゴマー化合物は、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡの発現を最低１０％、最低２０％、最低２５％、最低３０％、最低４０％、最低５０％、最低６０％、最低７０％、最低７５％、最低８０％、最低８５％、最低９０％、
最低９５％、最低９８％、最低９９％若しくは１００％調節する。
例えば、Ｃ反応性タンパク質の発現の低下は、動物の血清、脂肪組織、肝またはいずれかの他の体液、組織若しくは器官で測定しうる。好ましくは、分析されている前記液体、組織若しくは器官内に含有される細胞は、Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子および／若しくはＣ反応性タンパク質それ自身を含有する。
本発明の化合物は、適する製薬学的に許容できる希釈剤若しくは担体に有効量の化合物を添加することにより、製薬学的組成物中で利用し得る。本発明の化合物および方法の使用は予防的にもまた有用でありうる。
Ｆ．修飾
当該技術分野で既知であるとおり、ヌクレオシドは塩基と糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は通常複素環塩基である。こうした複素環塩基の２種の最も一般的な分類はプリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに包含するヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を包含するヌクレオシドについて、リン酸基は該糖の２’、３’若しくは５’いずれかのヒドロキシル部分に結合され得る。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基が隣接ヌクレオシドを相互に共有結合して直鎖状ポリマー化合物を形成する。順に、この直鎖状ポリマー化合物のそれぞれの端がさらに結合されて環状化合物を形成し得るが、しかしながら、直鎖状化合物が一般に好ましい。加えて、直鎖状化合物は内的な核酸塩基相補性を有することがあり、そして従って完全に若しくは部分的に二本鎖の化合物を生じるような様式でフォールディングすることがある。オリゴヌクレオチド内で、リン酸基は一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成すると称される。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合すなわちバックボーンは、３’から５’へのホスホジエステル結合である。
修飾ヌクレオシド間結合（バックボーン）
本発明で有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例は、修飾バックボーンすなわち非天然のヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドを包含する。本明細で定義されるところの、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドは、バックボーン中にリン原子を保持するものおよびバックボーン中にリン原子を有しないものを包含する。本明細の目的上、および当該技術分野でときに参照されるとおり、それらのヌクレオシド間バックボーン中にリン原子を有しない修飾オリゴヌクレオチドもまたオリゴヌクレオシドであるとみなし得る。
その中にリン原子を含有する好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、例えば、ホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル、および３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートを包含する他のアルキルホスホネートならびにキラルなホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを包含するホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合したアナログ、ならびに１個若しくはそれ以上のヌクレオチド間結合が３’から５’、５’から５’若しくは２’から２’結合である反転した極性を有するものを包含する。反転した極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド間結合で単独の３’から３’結合、すなわち無塩基でありうる単一の反転ヌクレオシド残基（核酸塩基が欠けているか若しくはその場所にヒドロキシル基を有する）を含んでなる。多様な塩、混合塩および遊離酸の形態もまた包含される。
上のリン含有結合の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，１９４，５９９号；同第５，５６５，５５５号；同第５，５２７，８９９号；同第５，７２１，２１８号；同第５，６７２，６９７号および同第５，６２５，０５０号明細書（それらのあるものは本出願と共通に所有されかつそれらのそれぞれは引用することにより本明細書に組込まれる）を挙げることができる。
その中にリン原子を包含しない、好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１種若しくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環ヌクレオシド間結合により形成されるバックボーンを有する。これらは、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；リボアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーンを有するもの；ならびに混合したＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他者を包含する。
上のオリゴヌクレオシドの製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；同第５，７９２，６０８号；同第５，６４６，２６９号および同第５，６７７，４３９号明細書（それらのあるものは本出願と共通に所有されかつそれらのそれぞれは引用することにより本明細書に組込まれる）を挙げることができる。
修飾糖およびヌクレオシド間結合−模倣物
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合（すなわちバックボーン）の双方が新規基で置換されている。該核酸塩基単位は適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのため維持される。１種のこうした化合物すなわち優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物はペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖−バックボーンがアミド含有バックボーン、とりわけアミノエチルグリシンバックボーンで置換されている。該核酸塩基は保持され、そしてバックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接若しくは間接的に結合されている。ＰＮＡ化合物の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７
１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号明細書（それらのそれぞれは引用することにより本明細書に組込まれる）を挙げることができる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７−１５００に見出し得る。
本発明のさらなる態様は、ホスホロチオエートバックボーンをもつオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンをもつオリゴヌクレオシド、ならびにとりわけ、上で参照された米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）すなわちＭＭＩバックボーンとして知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［ここで、天然のホスホジエステルバックボーンは−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、ならびに上で参照された米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミドバックボーンである。上で参照された米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。
修飾糖
修飾オリゴヌクレオチドは１個若しくはそれ以上の置換糖部分もまた含有しうる。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下すなわちＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１種を含んでなり、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換若しくは未置換のＣ１ないしＣ１０アルキル若しくはＣ２ないしＣ１０アルケニルおよびアルキニルでありうる。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（式中ｎおよびｍは１から約１０までである）がとりわけ好ましい。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下すなわちＣ１ないしＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル若しくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基若しくはオリゴヌクレオチドの薬動力学特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基の１種を含んでなる。好ましい修飾は、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）若しくは２’−メトキシエトキシすなわち２’−ＭＯＥとしてもまた知られる）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６−５０４）、すなわちアルコキシアルコキシ基を包含する。さらなる好ましい一修飾は、下の実施例に記述されるところの２’−ＤＭＡＯＥとしてもまた知られる２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および下の実施例でもまた記述される２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルすなわち２’−ＤＭＡＥＯＥとしてもまた当該技術分野で知られる）すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を包含する。
他の修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を包含する。２’修飾はアラビノ（上）位置であってもリボ（下）位置であってもよい。好ましい２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様の修飾をオリゴヌクレオチドの他の位置、とりわけ３’末端ヌクレオチド若しくは２’−５’結合したオリゴヌクレオチドの糖の
３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位でもまた行いうる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖模倣物を有してもまたよい。こうした修飾糖構造の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが米国特許４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；同第５，７９２，７４７号；および同第５，７００，９２０号明細書（それらのあるものは本出願と共通に所有されかつそれらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組込まれる）を挙げることができる。
糖のさらなる一修飾は、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’若しくは４’炭素原子に結合されてそれにより二環性糖部分を形成するロック核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ）（ＬＮＡ）を包含する。該結合は、好ましくは２’の酸素原子および４’の炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、式中ｎは１若しくは２である。ＬＮＡおよびそれらの製造法は国際特許公開第ＷＯ ９８／３９３５２号および同第ＷＯ ９９／１４２２６号明細書に記述されている。
天然および修飾核酸塩基
オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（当該技術分野ではしばしば単純に「塩基」と称される）修飾若しくは置換も包含しうる。本明細書で使用されるところの「未修飾」若しくは「天然の」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を包含する。修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、とりわけ５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンのような他の合成および天然の核酸塩基を包含する。さらなる修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジンのようなＧ−ｃｌａｍｐ（例えば９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドル−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）のような三環性ピリミジンを包含する。修飾核酸塩基は、プリン若しくはピリミジン塩基が他の複素環で置換されているもの、例えば７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンもまた包含しうる。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、Ｔｈｅ
Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８−８５９ページ、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ
．Ｉ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３により開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９−３０２ページ、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．とＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３により開示されるものを包含する。これらの核酸塩基のあるものは本発明の化合物の結合親和性を増大させるのにとりわけ有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを包含するＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを包含する。５−メチルシトシン置換は核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示されており、そして、なおより具体的には２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組合せた場合に現在好ましい塩基置換である。
上で示される修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のあるものの製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、上に示された米国特許第３，６８７，８０８号明細書、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４、６１７号；同第５，６４５，９８５号；同第５，８３０，６５３号；同第５，７６３，５８８号；同第６，００５，０９６号；および同第５，６８１，９４１号明細書（それらのあるものは本出願と共通に所有されかつそれらのそれぞれは引用することにより本明細書に組込まれる）、ならびに米国特許第５，７５０，６９２号明細書（本出願と共通に所有されかつまた引用することにより本明細書に組込まれる）を挙げることができる。
複合物
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、該オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布若しくは細胞の取り込みを高める１種若しくはそれ以上の部分若しくは複合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を該オリゴヌクレオチドに化学的に結合することを伴う。これらの部分若しくは複合物は、一級若しくは二級ヒドロキシル基のような官能基に共有結合された複合物基を包含し得る。本発明の複合物基は、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬動力学特性を高める基、およびオリゴマーの薬物動態特性を高める基を包含する。典型的な複合物基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素を包含する。本発明の情況において薬動力学特性を高める基は、取り込みを向上させる、分解に対する抵抗性を高める、および／若しくは標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を包含する。本発明の情況において薬物動態特性を高める基は、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝若しくは排泄を向上させる基を包含する。代表的な複合物基は、１９９２年１０月２３日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号明細書および米国特許第６，２８７，８６０号明細書（それらの開示全体は引用することにより本明細書に組込まれる）に開示されている。複合物部分は、限定されるものでないが、コレステロール部分、コール酸のような脂質部分、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール若しくはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール若しくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖、若しくはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシ
コレステロール部分を挙げることができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、活性の薬物物質、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、ホリニン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌薬若しくは抗生物質にもまた複合しうる。オリゴヌクレオチド−薬物複合物およびそれらの製造法は、米国特許出願第０９／３３４，１３０号明細書（１９９９年６月１５日出願）（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されている。
こうしたオリゴヌクレオチド複合物の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号明細書（それらのあるものは本出願と共通に所有されかつそれらのそれぞれは引用することにより本明細書に組込まれる）を挙げることができる。
本発明の組成物で使用されるオリゴマー化合物はまた、例えばヌクレアーゼ安定性のような特性を高めるためにオリゴマー化合物の一方若しくは双方の末端に一般に結合される１個若しくはそれ以上の安定化基を有するようにも修飾し得る。ｃａｐ構造は安定化基に包含される。「ｃａｐ構造若しくは末端ｃａｐ部分」により、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組込まれた化学修飾を意味している（例えば国際特許公開第ＷＯ ９７／２６２７０号明細書（引用することにより本明細書に組込まれる）を参照されたい）。これらの末端修飾は、末端核酸分子を有するオリゴマー化合物をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、かつ、細胞内への送達および／若しくは局在化で補助し得る。ｃａｐは５’末端（５’−ｃａｐ）若しくは３’末端（３’−ｃａｐ）に存在し得るか、または双方の末端に存在し得る。制限しない例において、５’−ｃａｐは、反転無塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；ｔｈｒｅｏ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルリウクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分；３’−３’−反転無塩基
部分；３’−２’−反転ヌクレオチド部分；３’−２’−反転無塩基部分；１，４−ブタンジオールリン酸；３’−ホスホルアミデート；ヘキシルリン酸；アミノヘキシルリン酸；３’−リン酸；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋若しくは非架橋メチルホスホネート部分を包含する（さらなる詳細については、Ｗｉｎｃｏｔｔら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ９７／２６２７０号明細書（引用することにより本明細書に組込まれる）を参照されたい）。
本発明のとりわけ好ましい３’−ｃａｐ構造は、例えば、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸、３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；ｔｈｒｅｏ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド部分；５’−５’−反転無塩基部分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋および／若しくは非架橋５’−ホスホルアミデート、ホスホロチオエートおよび／若しくはホスホロジチオエート、架橋若しくは非架橋メチルホスホネート、ならびに５’−メルカプト部分を包含する（さらなる詳細については、ＢｅａｕｃａｇｅとＴｙｅｒ、１９９３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４９、１９２５（引用することにより本明細書に組込まれる）を参照されたい）。
ヌクレアーゼ安定性を与えるためにオリゴマー化合物の一端若しくは双方の端をキャッピングするのに使用し得るさらなる３’および５’安定化基は、２００３年１月１６日公開の第ＷＯ ０３／００４６０２号明細書に開示されるものを包含する。
キメラ化合物
所定の一化合物中の全部の位置が均一に修飾されることは必要でなく、そして、事実、前述の修飾の１種以上を、単一の化合物、若しくは一オリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオチドにさえ組込みうる。
本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も包含する。本発明の情況において、「キメラ」アンチセンス化合物若しくは「キメラ」は、最低１個の単量体単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドからそれぞれ構成される２個若しくはそれ以上の化学的に別個の領域を含有するアンチセンス化合物、とりわけオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に、ヌクレアーゼ分解に対する増大した抵抗性、増大した細胞の取り込み、増大した安定性および／若しくは標的核酸に対する増大した結合親和性を該オリゴヌクレオチドに付与するように該オリゴヌクレオチドが改変されている最低１領域を含有する。該オリゴヌクレオチドの付加的な一領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡ若しくはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素の基質としてはたらきうる。例として、ＲＮアーゼＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞のエンドヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＨの活性化は、従ってＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド媒介性の阻害の効率を大きく高める。ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの切断は、同様の様式で、細胞およびウイルス双方のＲＮＡを切断するＲＮアーゼＬのようなエンドリボヌクレアーゼの作用により達成し得る。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要な場合は当該技術分野で既知の関連した核酸ハイブリダイゼーション技術により慣例に検出し得る。
好ましいキメラオリゴヌクレオチドは本明細書の実施例に開示されるものである。とり
わけ好ましいキメラオリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ １３３７２６、ＩＳＩＳ １３３７１９、ＩＳＩＳ １４０１７７、ＩＳＩＳ １０４１８３、ＩＳＩＳ １４０１８０、ＩＳＩＳ １３３７３１、ＩＳＩＳ １４０１８７、ＩＳＩＳ １３３７１２、ＩＳＩＳ
１４０１９４、ＩＳＩＳ １３３７３０およびＩＳＩＳ １３３７２９と称されるものである。
本発明のキメラアンチセンス化合物は、上述されたところの２種若しくはそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／若しくはオリゴヌクレオチド模倣物の混成構造として形成しうる。キメラアンチセンス化合物は数種の異なる型のものであり得る。これらは、結合されたヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが、結合されたヌクレオシドの５’および３’の「ウィング（ｗｉｎｇ）」セグメントの間に配置されている第一の型、ならびに「ギャップ」セグメントが該オリゴマー化合物の３’若しくは５’いずれかの末端に位置する第二の「開放端（ｏｐｅｎ ｅｎｄ）」型を包含する。第一の型のオリゴヌクレオチドは、「ギャップマー」若しくはギャップトオリゴヌクレオチド（ｇａｐｐｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）として当該技術分野で既知でもまたある。第二の型のオリゴヌクレオチドは「ヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒ）」若しくは「ウィングマー（ｗｉｎｇｍｅｒ）」としてもまた既知である。
こうした化合物はまた当該技術分野でハイブリッドとも称される。長さ２０ヌクレオチドであるギャップマーにおいて、ギャップ若しくはウィングは、長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８ヌクレオチドであり得る。一態様において、２０ヌクレオチドのギャップマーは、長さ６ヌクレオチドのウィングにより５’および３’双方の側で隣接されている長さ８ヌクレオチドのギャップから構成される。別の態様において、２０ヌクレオチドのギャップマーは、長さ５ヌクレオチドのウィングにより５’および３’双方の側で隣接されている長さ１０ヌクレオチドのギャップから構成される。別の態様において、２０ヌクレオチドのギャップマーは、長さ４ヌクレオチドのウィングにより５’および３’双方の側で隣接されている長さ１２ヌクレオチドのギャップから構成される。さらなる一態様において、２０ヌクレオチドのギャップマーは、長さ３ヌクレオチドのウィングにより５’および３’双方の側で隣接されている長さ１４ヌクレオチドのギャップから構成される。別の態様において、２０ヌクレオチドのギャップマーは、長さ２ヌクレオチドのウィングにより５’および３’双方の側で隣接されている長さ１６ヌクレオチドのギャップから構成される。さらなる一態様において、２０ヌクレオチドのギャップマーは、長さ１ヌクレオチドのウィングにより５’および３’双方の端で隣接されている長さ１８ヌクレオチドのギャップから構成される。あるいは、ウィングは異なる長さのものであり、例えば、２０ヌクレオチドのギャップマーは、一方の側（５’若しくは３’）で６ヌクレオチドのウィング、および他方の側（５’若しくは３’）で４ヌクレオチドのウィングにより隣接されている長さ１０ヌクレオチドのギャップから構成されうる。
長さ２０ヌクレオチドのヘミマーすなわち「開放端」キメラアンチセンス化合物において、該オリゴマー化合物の５’若しくは３’いずれかの末端に配置されるギャップセグメントは、長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８若しくは１９ヌクレオチドであり得る。例えば、２０ヌクレオチドのヘミマーは、５’端に１０ヌクレオチドのギャップセグメントおよび３’端に１０ヌクレオチドの第二のセグメントを有し得る。あるいは、２０ヌクレオチドのヘミマーは、３’端に１０ヌクレオチドのギャップセグメントおよび５’端に１０ヌクレオチドの第二のセグメントを有し得る。
こうしたハイブリッド構造の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、米国特許第５，０１３，８３０号；同第５，１４９，７９７号；同第５，２２０
，００７号；同第５，２５６，７７５号；同第５，３６６，８７８号；同第５，４０３，７７１号；同第５，４９１，１３３号；同第５，５６５，３５０号；同第５，６２３，０６５号；同第５，６５２，３５５号；同第５，６５２，３５６号；および同第５，７００，９２２号明細書（それらのあるものは本出願と共通に所有されかつそれらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組込まれる）を挙げることができる。
Ｇ．製剤
本発明の化合物はまた、取り込み、分布および／若しくは吸収において補助するために、例えばリポソーム、受容体を標的とする分子、経口、直腸、局所若しくは他の製剤のとして、他の分子、分子構造若しくは化合物の混合物と混合、それらで被包化、それらと複合物形成若しくは別の方法で会合もさせうる。こうした取り込み、分布および／若しくは吸収を補助する製剤の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが米国特許第５，１０８，９２１号；同第５，３５４，８４４号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４５９，１２７号；同第５，５２１，２９１号；同第５，５４３，１５８号；同第５，５４７，９３２号；同第５，５８３，０２０号；同第５，５９１，７２１号；同第４，４２６，３３０号；同第４，５３４，８９９号；同第５，０１３，５５６号；同第５，１０８，９２１号；同第５，２１３，８０４号；同第５，２２７，１７０号；同第５，２６４，２２１号；同第５，３５６，６３３号；同第５，３９５，６１９号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４１７，９７８号；同第５，４６２，８５４号；同第５，４６９，８５４号；同第５，５１２，２９５号；同第５，５２７，５２８号；同第５，５３４，２５９号；同第５，５４３，１５２号；同第５，５５６，９４８号；同第５，５８０，５７５号；および同第５，５９５，７５６号明細書（それらのそれぞれは引用することにより本明細書に組込まれる）を挙げることができる。
本発明のアンチセンス化合物は、いかなる製薬学的に許容できる塩、エステル、若しくはこうしたエステルの塩、またはヒトを包含する動物への投与に際して生物学的に活性の代謝物若しくはそれらの残留物を（直接若しくは間接的に）提供することが可能であるいかなる他の化合物も包含する。
「製薬学的に許容できる塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的および製薬学的に許容できる塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持しかつそれに望ましくない毒物学的効果を与えない塩を指す。オリゴヌクレオチドについて、製薬学的に許容できる塩およびそれらの用途の好ましい例は、米国特許第６，２８７，８６０号明細書（そっくりそのまま本明細書に組込まれる）にさらに記述されている。
本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を包含する製薬学的組成物および製剤も包含する。本発明の製薬学的組成物は、局所処置が望ましいか全身処置が望ましいか、および処置されるべき領域に依存して多数の方法で投与しうる。投与は、局所（眼ならびに膣および直腸送達を包含する粘膜へを包含する）、例えば、ネブライザーによるを包含する粉末若しくはエアゾルの吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）若しくは吸入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）による肺；気管内、鼻内、表皮および経皮）、経口若しくは非経口でありうる。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）若しくは注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）；または頭蓋内、例えば髄腔内若しくは脳室内投与を包含する。最低１個の２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を伴うオリゴヌクレオチドが経口投与にとりわけ有用であると考えられる。局所投与のための製薬学的組成物および製剤は、経皮貼付剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液体および散剤を包含しうる。慣習的製薬学的担体、水性、粉末若しくは油性基剤、増粘剤などが必要であるかもしくは望ましいことができる。コーティングしたコンドーム、手袋などもまた有用でありうる。
単位投薬形態物で便宜的に提示しうる本発明の製薬学的製剤は、製薬業界で公知の慣習的技術に従って製造しうる。こうした技術は、有効成分を製薬学的担体（１種若しくは複数）または賦形剤（１種若しくは複数）との連合にもたらす段階を包含する。一般に、製剤は、液体担体若しくは微粉化した固体担体または双方と有効成分を均一かつ緊密に連合にもたらすこと、およびその後必要な場合は生成物を造形することにより製造する。
本発明の組成物は、限定されるものでないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐剤および浣腸剤を挙げることができる多くの可能な投薬形態物のいずれにも処方しうる。本発明の組成物は水性、非水性若しくは混合媒体中の懸濁剤としてもまた処方しうる。水性懸濁剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／若しくはデキストランを包含する懸濁剤の粘度を増大させる物質をさらに含有しうる。懸濁剤は安定剤もまた含有しうる。
本発明の製薬学的組成物は、限定されるものでないが、溶液、乳剤、泡状物およびリポソーム含有製剤を挙げることができる。本発明の製薬学的組成物および製剤は、１種若しくはそれ以上の浸透増強剤、担体、賦形剤、または他の有効若しくは不活性成分を含みうる。
乳剤は、典型的に、通常は直径が０．１μｍを超える液滴の形態で別の液体中に分散されている１種の液体の不均質な系である。乳剤は、分散された相に加えての付加的な成分、および水相、油相のいずれか中の溶液として、若しくはそれ自身別個の相として存在しうる有効成分を含有しうる。マイクロエマルジョンが本発明の一態様として包含される。乳剤およびそれらの用途は当該技術分野で公知であり、かつ、米国特許第６，２８７，８６０号明細書（そっくりそのまま本明細書に組込まれる）にさらに記述されている。
本発明の製剤はリポソーム製剤を包含する。本発明で使用されるところの「リポソーム」という用語は、球形の二層（１個若しくは複数）中に配置された両親媒性脂質から構成される小胞を意味している。リポソームは、親油性物質から形成される膜および送達されるべき組成物を含有する水性内部を有する単層若しくは多層小胞である。陽イオン性リポソームは正に荷電したリポソームであり、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成すると考えられる。ｐＨ感受性であるか若しくは負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合体形成するよりもむしろそれを閉じこめると考えられる。陽イオン性および非陽イオン性双方のリポソームがＤＮＡを細胞に送達するのに使用されている。
リポソームは「立体的に安定化された」リポソーム（本明細書で使用されるところの１種若しくはそれ以上の特化した脂質を含んでなるリポソームを指す用語）もまた包含する。リポソーム中に組込まれる場合に、これらの特化した脂質は、こうした特化した脂質を欠くリポソームに関して高められた循環寿命をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例は、該リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が１種若しくはそれ以上の糖脂質を含んでなるかまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような１種若しくはそれ以上の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。リポソームおよびそれらの用途は、米国特許第６，２８７，８６０号明細書（そっくりそのまま本明細書に組込まれる）にさらに記述されている。
本発明の製薬学的製剤および組成物は界面活性剤もまた包含しうる。薬物製品、製剤および乳剤中での界面活性剤の使用は当該技術分野で公知である。界面活性剤およびそれらの用途は米国特許第６，２８７，８６０号明細書（そっくりそのまま本明細書に組込まれる）にさらに記述されている。
一態様において、本発明は核酸、とりわけオリゴヌクレオチドの効率的な送達を遂げる
ために多様な浸透増強剤を使用する。細胞膜を横断する非親油性薬物の拡散を補助することに加え、浸透増強剤は親油性薬物の浸透性もまた高める。浸透増強剤は、５種の広範な範疇、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤およびキレートしない非界面活性剤の１つに属するとして分類しうる。浸透増強剤およびそれらの用途は、米国特許第６，２８７，８６０号明細書（そっくりそのまま本明細書に組込まれる）にさらに記述されている。
当業者は、製剤がそれらの意図される使用すなわち投与経路に従って慣例に設計されることを認識するであろう。
局所投与に好ましい製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤のような局所送達剤との混合状態にあるものを包含する。好ましい脂質およびリポソームは、中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン ＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、負（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロール ＤＭＰＧ）ならびに陽イオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピル ＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン ＤＯＴＭＡ）を包含する。
局所若しくは他の投与のため、本発明のオリゴヌクレオチドをリポソーム内に被包化しうるか、若しくはそれら、とりわけ陽イオン性リポソームと複合体を形成しうる。あるいは、オリゴヌクレオチドは脂質、とりわけ陽イオン性脂質と複合体形成しうる。好ましい脂肪酸およびエステル、それらの製薬学的に許容できる塩、ならびにそれらの用途は、米国特許第６，２８７，８６０号明細書（そっくりそのまま本明細書に組込まれる）にさらに記述されている。局所製剤は、１９９９年５月２０日出願の米国特許出願第０９／３１５，２９８号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組込まれる）に詳細に記述されている。
経口投与のための組成物および製剤は、散剤若しくは顆粒剤、微粒子、ナノ粒子、水若しくは非水性媒体中の懸濁剤若しくは溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、カシェ剤、錠剤若しくはミニ錠剤を包含する。増粘剤、着香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤若しくは結合剤が望ましいことがある。好ましい経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが１種若しくはそれ以上の浸透増強剤界面活性剤およびキレート剤とともに投与されるものである。好ましい界面活性剤は、脂肪酸および／またはそれらのエステル若しくは塩、胆汁酸および／若しくはそれらの塩を包含する。好ましい胆汁酸／塩および脂肪酸ならびにそれらの用途は、米国特許第６，２８７，８６０号明細書（そっくりそのまま本明細書に組込まれる）にさらに記述されている。浸透増強剤の組合せ、例えば胆汁酸／塩と組合せの脂肪酸／塩もまた好ましい。とりわけ好ましい組合せは、ラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを包含する。本発明のオリゴヌクレオチドは、噴霧乾燥した粒子を包含する顆粒の形態で、または微粒子若しくはナノ粒子を形成するよう複合体形成されて経口で送達されうる。オリゴヌクレオチド複合剤およびそれらの用途は、米国特許第６，２８７，８６０号明細書（そっくりそのまま本明細書に組込まれる）にさらに記述されている。オリゴヌクレオチドのための経口製剤およびそれらの製造法は、米国特許公開第２００３／００４０４９７号明細書（２００３年２月２７日）およびその特許出願；米国特許公開第２００３／００２７７８０号明細書（２００３年２月６日）およびその特許出願；ならびに２００２年２月８日出願の米国特許出願第１０／０７１，８２２号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組込まれる）に詳細に記述されている。
非経口、髄腔内若しくは脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤、ならびに限定されるものでないが浸透増強剤、担体化合物および他の製薬学的に許容できる担体若しくは賦形剤を挙げることができる他の適する添加物もまた含有しうる滅菌の水性溶液を包含しうる。
オリゴヌクレオチドは、許容できる投薬形態物で、例えば非経口若しくは非経口以外（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）製剤として、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達のため処方しうる。非経口製剤は、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、硝子体内および筋肉内（ＩＭ）製剤、ならびに肺吸入、鼻内投与、局所投与などを介する送達のための製剤を包含する。非経口以外製剤は、消化管を介する送達、例えば経口投与、直腸投与、空腸内点滴注入などのための製剤を包含する。直腸投与は浣腸剤若しくは坐剤としての投与を包含する。経口投与はカプセル剤、ゲルカプセル剤、丸剤、エリキシル剤などとしての投与を包含する。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは経口投与経路を介して被験体に投与しうる。被験体は動物でもヒト（人間）でもよい。動物被験体は、マウス、ラット、イヌ、モルモット、サル、ヒト以外の霊長類、ネコ若しくはブタのような哺乳動物でありうる。ヒト以外の霊長類はサルおよびチンパンジーを包含する。適する動物被験体は、マウス、ラット、マウス、ラット、イヌ、サル、ヒト以外の霊長類、ネコ若しくはブタのような実験動物でありうる。
いくつかの態様において、被験体はヒトでありうる。ある態様において、被験体は本明細書でより詳細に論考されるところの治療的処置の必要なヒト患者でありうる。ある態様において、被験体は、本明細書でより詳細に論考されるところの１種若しくはそれ以上の遺伝子の発現の調節が必要でありうる。いくつかの特定の態様において、被験体は、本明細書でより詳細に論考されるところの１種若しくはそれ以上の遺伝子の発現の阻害が必要でありうる。特定の態様において、被験体は、本明細書でより詳細に論考される治療の適応を得るために、Ｃ反応性タンパク質の調節、すなわち阻害若しくは増強が必要でありうる。
いくつかの態様において、本発明の非経口以外（例えば経口）オリゴヌクレオチド製剤は、該オリゴヌクレオチドの高められた生物学的利用性をもたらす。この情況において、「生物学的利用性」という用語は、特定の投与様式を使用して薬物を送達する場合に循環系（例えば血液、とりわけ血漿）に達する投与された薬物の部分の測定値を指す。高められた生物学的利用性は、別の投与様式に関して被験体の末梢血漿にオリゴヌクレオチドを送達する特定の一投与様式の能力を指す。例えば、非経口以外の投与様式（例えば経口様式）を使用して薬物を被験体に導入する場合、その投与様式の生物学的利用性を、異なる投与様式、例えばＩＶ投与様式と比較しうる。いくつかの態様において、非経口以外（例えば経口、直腸、空腸内）投与後の化合物の血漿濃度曲線下面積（ＡＵＣ０）を、静脈内（ｉ．ｖ．）投与後の該薬物の血漿濃度曲線下面積（ＡＵＣｉｖ）により除算して、ＩＶ経路に比較して非経口以外経路を介して吸収される化合物の画分を表す無次元の商（相対生物学的利用性、ＲＢ）を提供しうる。ある組成物の生物学的利用性は、第一の組成物の相対生物学的利用性（ＲＢ１）が第二の組成物の相対生物学的利用性（ＲＢ２）より大きい場合に、別の組成物の生物学的利用性と比較して高められたと言われる。
一般に、生物学的利用性は、薬物の最終的な作用部位が細胞内である場合であっても、達成される血中濃度と化合物の治療効果が関係付けられる場合に治療的有効性と相関する（ｖａｎ Ｂｅｒｇｅ−Ｈｅｎｅｇｏｕｗｅｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、１９７７、７３、３００）。生物学的利用性の研究は、１回の経口投与後の薬物の末梢血中濃度の変化を測定することにより薬物の腸吸収の程度を決定するのに使用されている（Ｄｉ
Ｓａｎｔｏ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、１９９０中第７６章、１４５１〜１４５８ページ）。
一般に、経口組成物の生物学的利用性は、その相対生物学的利用性が純粋なオリゴヌクレオチドより実質的になる組成物、すなわち浸透増強剤の非存在下のオリゴヌクレオチドの生物学的利用性より大きい場合に「高められた」と言われる。
器官の生物学的利用性はある器官中の化合物濃度を指す。器官の生物学的利用性は、全身Ｘ線撮影法のような多数の手段により試験被験体で測定しうる。器官の生物学的利用性は、本明細書でより詳細に論考されるとおり、オリゴヌクレオチドへの１種若しくはそれ以上の修飾により、１種若しくはそれ以上の担体化合物若しくは賦形剤の使用により、などで改変、例えば高めうる。一般に、生物学的利用性の増大は器官の生物学的利用性の増大をもたらすことができる。
本発明の経口オリゴヌクレオチド組成物は、「吸収増強剤」若しくは単純に「浸透増強剤」としてもまた知られる１種若しくはそれ以上の「粘膜浸透増強剤」を含みうる。従って、本発明のいくつかの態様は、最低１種の浸透増強剤と組合せの最低１種のオリゴヌクレオチドを含んでなる。一般に、浸透増強剤は、所望の投与様式と関連する粘膜（１種若しくは複数）、例えば腸上皮膜を横断する薬物の輸送を助長する物質である。従って、オリゴヌクレオチドの活性を妨害することなくかつ毒性、刺激若しくはアレルギー応答のような許容できない副作用を伴わずに該オリゴヌクレオチドを動物の身体中に導入し得るような様式でオリゴヌクレオチドの取り込みを助長する、１種若しくはそれ以上の浸透増強剤を選択することが望ましい。
本発明の態様は、１種若しくはそれ以上の製薬学的に許容できる浸透増強剤を含んでなる組成物、および非経口以外の投与様式を介して投与されるオリゴヌクレオチドの向上された生物学的利用性をもたらすこうした組成物の使用方法を提供する。これまで、ある種の浸透増強剤がある種の薬物の生物学的利用性を向上させるために使用されている。Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１およびＬｅｅら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、８、９１を参照されたい。多数の異なる分類の浸透増強剤の使用により、非経口以外の手段により投与される場合でさえ、オリゴヌクレオチド（動物および人間に投与することが困難であることが既知である比較的複雑な分子）の取り込みおよび送達を大きく向上させ得ることが見出されている。
いくつかの態様において、非経口以外の投与のための組成物は、天然に存在するオリゴヌクレオチドからの１種若しくはそれ以上の修飾を包含する（すなわち完全なホスホジエステルデオキシリボシル若しくは完全なホスホジエステルリボシルオリゴヌクレオチド）。こうした修飾は、結合親和性、ヌクレアーゼ安定性、細胞若しくは組織浸透性、組織分布、または他の生物学的若しくは薬物動態特性を増大させうる。修飾は、オリゴヌクレオチド化学に関して本明細書でより詳細に論考されるとおり、一般に塩基、リンカー若しくは糖に対して行いうる。本発明のいくつかの態様において、被験体への投与のための組成物、およびとりわけ動物若しくはヒト被験体への投与のための経口組成物は、親和性、安定性、組織分布若しくは他の生物学的特性を高めるために１種若しくはそれ以上の修飾を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むことができる。
適する修飾リンカーはホスホロチオエートリンカーを包含する。本発明のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは最低１個のホスホロチオエートリンカーを有する。ホスホロチオエートリンカーは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ安定性ならびに血漿タ
ンパク質結合の特徴を提供する。ヌクレアーゼ安定性はオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ寿命を延長するために有用である一方、血漿タンパク質結合は、腎排泄を介するオリゴヌクレオチドの初回通過消失の速度を低下させる。本発明のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは最低２個のホスホロチオエートリンカーを有する。オリゴヌクレオチドが正確にｎ個のヌクレオシドを有するいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは１からｎ−１個までのホスホロチオエート結合を有する。オリゴヌクレオチドが正確にｎ個のヌクレオシドを有するいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはｎ−１個のホスホロチオエート結合を有する。オリゴヌクレオチドが正確にｎ個のヌクレオシドを有し、そしてｎが偶数である他の態様において、オリゴヌクレオチドは１からｎ／２個までのホスホロチオエート結合、若しくは、ｎが奇数である場合は、１から（ｎ−１）／２個までのホスホロチオエート結合を有する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは交替するホスホジエステル（ＰＯ）およびホスホロチオエート（ＰＳ）結合を有する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、２個若しくはそれ以上の連続するＰＯ結合の最低１個の伸長および２個若しくはそれ以上のＰＳ結合の最低１個の伸長を有する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは最低１個のＰＳ結合により中断されているＰＯ結合の最低２個の伸長を有する。
いくつかの態様において、ヌクレオシドの最低１個が、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性若しくはなんらかの他の有益な生物学的特性を糖に与える修飾によりリボシル糖単位上で修飾される。いくつかの場合において、糖の修飾は２’−修飾を包含し、例えばリボシル糖の２’−ＯＨが置き換え（ｒｅｐｌａｃｅｄ）すなわち置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）される。２’−ＯＨの適する置換は２’−Ｆおよび２’−アラビノ−Ｆを包含する。ＯＨの適する置換は、２’−Ｏ−アルキル、例えば２’−Ｏ−メチル、および２’−Ｏ−置換アルキル、例えば２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−アミノプロピルなどを包含する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは最低１個の２’−修飾を含有する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは最低２個の２’−修飾を含有する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは末端のそれぞれに最低１個の２’−修飾を有する（すなわち、３’および５’末端のヌクレオシドがそれぞれ同一若しくは異なる２’−修飾を有する）。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは該オリゴヌクレオチドの各端に最低２個の連続した２’−修飾を有する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは最低１個のデオキシヌクレオシドをさらに含んでなる。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることが可能であるＲＮＡのＲＮア―ゼ（例えばＲＮアーゼＨ）切断を活性化することが可能であるような、デオキシヌクレオシドの伸長を含んでなる。いくつかの態様において、ＲＮＡのＲＮアーゼ媒介性の切断を活性化することが可能なデオキシヌクレオシドの伸長は、約６ないし約１６、例えば約８ないし約１６個の連続するデオキシヌクレオシドを含んでなる。さらなる態様において、オリゴヌクレオチドはｄｓＲＮアーゼ酵素による切断を導き出すことが可能である。
本発明の非経口以外のオリゴヌクレオチド組成物の投与のための経口組成物は、限定されるものでないが錠剤、カプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐剤および浣腸剤を挙げることができる多様な投薬形態物に処方しうる。「消化管送達」という用語は例えば経口、直腸、内視鏡および舌下／頬側投与を包含する。これらの投与様式に共通の一要件は、消化管のなんらかの部分若しくは全部での吸収、およびそのように投与された核酸（１種若しくは複数）の効率的な粘膜浸透に対する必要性である。
頬側および舌下投与の場合でのような口腔粘膜を介する薬物の送達は、多くの例で、経口送達を介するよりも薬物の血漿濃度のより迅速な上昇を包含するいくつかの所望の特徴を有する（Ｈａｒｖｅｙ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ
．、ペンシルバニア州イーストン、１９９０中第３５章、７１１ページ）。
直接消化管の内部部分への薬物送達に内視鏡を使用しうる。例えば、内視鏡的逆行性胆道膵管造影法（ＥＲＣＰ）は広範な胃鏡検査を利用し、そして胆道および膵管への選択的到達を可能にする（Ｈｉｒａｈａｔａら、Ｇａｎ Ｔｏ Ｋａｇａｋｕ Ｒｙｏｈｏ、１９９２、１９（１０ Ｓｕｐｐｌ．）、１５９１）。リポソーム製剤を包含する製薬学的組成物は、内視鏡手段を介して、例えば十二指腸（Ｓｏｍｏｇｙｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１９９５、１２、１４９）若しくは胃粘膜下組織（Ａｋａｍｏら、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９４、８５、６５２）のような消化管の部分に直接送達させ得る。胃洗浄装置（Ｉｎｏｕｅら、Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ、１９９７、２１、２８）および経皮的内視鏡的供給装置（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎら、Ａｉｌｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９９５、９、４７１）もまた製薬学的組成物の直接消化管送達に使用し得る。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド製剤は肛門を通して直腸若しくは下部腸に投与しうる。直腸坐剤、保持浣腸若しくは直腸カテーテルをこの目的上使用し得、そしてそうでなければ患者コンプライアンスを達成することが困難であるとみられる場合（例えば小児および老人の応用で、または患者が嘔吐しているか若しくは意識不明である場合）に好ましいとみられる。直腸投与は経口経路より迅速かつより高い血中濃度をもたらし得る（Ｈａｒｖｅｙ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、１９９０中第３５章、７１１ページ）。直腸から吸収される薬物の約５０％が肝を迂回することができるため、この経路による投与は初回通過代謝の可能性を大きく低下させる（Ｂｅｎｅｔら、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９６中第１章）。
オリゴヌクレオチド組成物の有利な一非経口以外投与方法は経口送達である。いくつかの態様は、粘膜および上皮膜を横断するオリゴヌクレオチドおよび他の核酸の輸送を遂げるために多様な浸透増強剤を使用する。浸透増強剤は、５種の広範な範疇すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、およびキレートしない非界面活性剤の１種に属するとして分類しうる（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、ｐ．９２）。従って、いくつかの態様は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、およびキレートしない非界面活性剤よりなる群の最低１メンバーを含んでなる経口オリゴヌクレオチド組成物を含んでなる。さらなる態様は、最低１種の脂肪酸、例えばカプリン酸若しくはラウリン酸またはそれらの組合せ若しくは塩を含んでなる経口オリゴヌクレオチドを含んでなる。他の態様は、オリゴヌクレオチドおよび最低１種の浸透増強剤を共投与することを含んでなる、オリゴヌクレオチドの経口生物学的利用性を高める方法を含んでなる。
経口オリゴヌクレオチド組成物に添加しうる他の賦形剤は、消化管粘膜および他の上皮膜を通るオリゴヌクレオチドの吸収が高められるという結果を伴い、水性溶液に溶解した場合に、該溶液の表面張力若しくは該水性溶液と別の液体との間の界面張力を低下させる化学的実体である界面活性剤（すなわち「表面活性の剤」）を包含する。胆汁酸塩および脂肪酸に加え、界面活性剤は、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２ページ）；ならびにＦＣ−４３のような全フッ素置換化合物乳剤（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９
８８、４０、２５２）を包含する。
浸透増強剤として作用しかつ本発明の組成物中で使用しうる脂肪酸およびそれらの誘導体は、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンならびにそれらのモノおよびジグリセリドならびに／若しくはそれらの生理学的に許容できる塩（すなわちオレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩など）を包含する（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２ページ；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１；Ｅｌ−Ｈａｒｉｒｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９２、４４、６５１）。
いくつかの態様において、経口送達のためのオリゴヌクレオチド組成物は最低２個の別個の相を含んでなり、それらの相は粒子、カプセル、ゲルカプセル、マイクロスフェアなどを含みうる。各相は１種若しくはそれ以上のオリゴヌクレオチド、浸透増強剤、界面活性剤、生物接着剤、発泡剤、または他の補助物質、賦形剤若しくは希釈剤を含有しうる。いくつかの態様において、一相は最低１種のオリゴヌクレオチドおよび最低１種の浸透増強剤を含んでなる。いくつかの態様において、第一の相は最低１種のオリゴヌクレオチドおよび最低１種の浸透増強剤を含んでなる一方、第二の相は最低１種の浸透増強剤を含んでなる。いくつかの態様において、第一の相は最低１種のオリゴヌクレオチドおよび最低１種の浸透増強剤を含んでなる一方、第二の相は最低１種の浸透増強剤を含んでなりかつオリゴヌクレオチドを実質的に含まない。いくつかの態様において、最低一相が、その相の内容物の放出を遅らせるコーティング若しくはマトリックスのような最低１種の分解遅延剤とともに調合される。いくつかの態様において、第一の相は最低１種のオリゴヌクレオチド、最低１種の浸透増強剤を含んでなる一方、第二の相は最低１種の浸透増強剤および１種の放出遅延剤を含んでなる。特定の態様において、経口オリゴヌクレオチドは、１種のオリゴヌクレオチドおよび１種の浸透増強剤を含有する粒子を含んでなる第一の相、ならびに放出遅延剤で被覆されかつ浸透増強剤を含有する粒子を含んでなる第二の相を含んでなる。
多様な胆汁酸塩もまた、薬物の取り込みおよび生物学的利用性を助長するための浸透増強剤として機能する。胆汁の生理学的役割は、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の助長を包含する（Ｂｒｕｎｔｏｎ、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９６中第３８章、９３４〜９３５ページ）。多様な天然の胆汁酸塩およびそれらの合成誘導体が浸透増強剤として作用する。従って、「胆汁酸塩」という用語は、胆汁の天然に存在する成分のいずれも、ならびにそれらの合成誘導体のいずれも包含する。本発明の胆汁酸塩は、例えばコール酸（若しくはその製薬学的に許容できるナトリウム塩すなわちコール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（グリココール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｃｈｏｌａｔｅ）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ、ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤ
ＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）を包含する（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２ページ；Ｓｗｉｎｙａｒｄ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、１９９０中第３９章、７８２〜７８３ページ；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９２、２６３、２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９０、７９、５７９）。
いくつかの態様において、本発明のいくつかの態様で有用な浸透増強剤は浸透増強化合物の混合物である。１種のこうした浸透増強剤は、カプリン酸および／若しくはラウリン酸またはそれらの塩例えばナトリウムとのＵＤＣＡ（および／若しくはＣＤＣＡ）の混合物である。こうした混合物は、粘膜、とりわけ腸粘膜を横断する生物学的有効成分の送達を高めるのに有用である。他の浸透増強剤混合物は、５〜９５％のカプリン酸および／若しくはラウリン酸とともに約５〜９５％の胆汁酸若しくは塩（１種若しくは複数）ＵＤＣＡおよび／若しくはＣＤＣＡを含んでなる。特定の浸透増強剤は、それぞれ約１：２：２の比のＵＤＣＡ、カプリン酸およびラウリン酸のナトリウム塩の混合物である。別のこうした浸透増強剤は、０．０１：１ないし１：０．０１の比（モル基準）のカプリン酸およびラウリン酸（若しくはそれらの塩）の混合物である。特定の態様において、カプリン酸およびラウリン酸は、例えば約０．１：１ないし約１：０．１、とりわけ約０．５：１ないし約１：０．５のモル比で存在する。
他の賦形剤は、消化管および他の粘膜を通るオリゴヌクレオチドの吸収が高められるという結果を伴うキレート剤、すなわち金属イオンと錯体を形成することにより溶液からそれらを除去する化合物を包含する。本発明における浸透増強剤としてのそれらの使用に関して、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としてもまたはたらくという付加された利点を有する。大部分の特徴づけられたＤＮＡヌクレアーゼは触媒作用に二価の金属イオンを必要とし、そして従ってキレート剤により阻害されるからである（Ｊａｒｒｅｔｔ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１９９３、６１８、３１５）。本発明のキレート剤は、限定されるものでないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えばサリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩およびホモバニリン酸塩）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９ならびにβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）を挙げることができる（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２ページ；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１；Ｂｕｕｒら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．、１９９０、１４、４３）。
本明細書で使用されるところのキレートしない非界面活性剤の浸透増強剤は、キレート剤若しくは界面活性剤としてわずかな活性を示すがしかしにもかかわらず消化管および他の粘膜を通るオリゴヌクレオチドの吸収を高める化合物と定義しうる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１）。この分類の浸透増強剤は、限定されるものでないが、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロアルカノン誘導体（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２ページ）；ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンのような非ステ
ロイド性抗炎症薬（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８７、３９、６２１）を挙げることができる。
細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを高める剤もまた、本発明の製薬学的および他の組成物に添加しうる。例えば、リポフェクチンのような陽イオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、陽イオン性グリセロール誘導体、およびポリリシンのようなポリカチオン分子（Ｌｏｌｌｏら、ＰＣＴ出願第ＷＯ ９７／３０７３１号明細書）を使用し得る。
数種の経口オリゴヌクレオチド組成物は製剤中に担体化合物もまた組込む。本明細書で使用されるところの「担体化合物」若しくは「担体」は、不活性でありうる（すなわちそれ自体生物学的活性を有しない）か、または輸送、認識、若しくは経路の活性化若しくは媒介に必要とされうるか、あるいは例えば生物学的に活性の核酸を分解するか若しくは循環からのその除去を促進することにより生物学的活性を有する核酸の生物学的利用性を低下させるｉｎ ｖｉｖｏ過程により核酸として認識される、核酸若しくはそのアナログを指すことができる。核酸および担体化合物の典型的には後者の物質の過剰を伴う共投与は、おそらく担体化合物と核酸との間の共通の受容体に対する競合により、肝、腎若しくは他の循環外の貯蔵所で回収される核酸の量の実質的減少をもたらし得る。例えば、部分的にホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドの肝組織中での回収は、ポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジン酸若しくは４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸とそれを共投与する場合に低下され得る（Ｍｉｙａｏら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．、１９９５、５、１１５；Ｔａｋａｋｕｒａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．、１９９６、６、１７７）。
「製薬学的担体」若しくは「賦形剤」は、１種若しくはそれ以上の核酸を動物に送達するための製薬学的に許容できる溶媒、懸濁媒体若しくはいずれかの他の薬理学的に不活性のベヒクルでありうる。賦形剤は液体であっても固体であってもよく、そして、計画された投与様式を念頭におきつつ、核酸および所定の製薬学的組成物の他成分と組合せられる場合に所望の嵩、一貫性などを提供するように選択される。典型的な製薬学的担体は、限定されるものでないが、結合剤（例えば糊化済トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば乳糖および他の糖、結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート若しくはリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、エクスプロタブ［ＥＸＰＬＯＴＡＢ］ＴＭ崩壊剤）；および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）を挙げることができる。
経口オリゴヌクレオチド組成物は、製薬学的組成物中で慣習的に見出される他の補助成分を、それらの技術で確立された使用レベルで付加的に含有しうる。従って、例えば、該組成物は、例えば止痒剤（ａｎｔｉｐｕｒｉｔｉｃｓ）、収斂剤、局所麻酔薬若しくは抗炎症薬のような付加的な適合性の製薬学的有効成分を含有しうるか、または、色素、着香料、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定剤のような本発明の組成物の多様な投薬形態物の物理的処方において有用な付加的な物質を含有しうる。しかしながら、こうした物質は、添加される場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性をはなはだしく妨害すべきでない。
本発明のある態様は、１種若しくはそれ以上のオリゴマー化合物、およびアンチセンス
以外の機序により機能する１種若しくはそれ以上の他の化学療法剤を含有する製薬学的組成物を提供する。こうした化学療法剤の例は、限定されるものでないが、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロス尿素、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニソン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロス尿素、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスファミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキセート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）のような癌化学療法剤を挙げることができる。本発明の化合物とともに使用される場合、こうした化学療法剤は、個別に（例えば５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）、連続して（例えば５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチドをある期間、次いでＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド）、または１種若しくはそれ以上の他のこうした化学療法剤と組合せで（例えば５−ＦＵ、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド、若しくは５−ＦＵ、放射線治療およびオリゴヌクレオチド）使用しうる。限定されるものでないが非ステロイド性抗炎症薬およびコルチコステロイドを挙げることができる抗炎症薬、ならびに限定されるものでないがリビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを挙げることができる抗ウイルス薬もまた、本発明の組成物中で組合せうる。アンチセンス化合物および他の非アンチセンス薬物の組合せもまた本発明の範囲内にある。２種若しくはそれ以上の組合せた化合物を一緒に若しくは連続して使用しうる。
別の関連した態様において、本発明の組成物は、第一の核酸を標的とする１種若しくはそれ以上のアンチセンス化合物、とりわけオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的を標的とする１種若しくはそれ以上の付加的なアンチセンス化合物を含有しうる。あるいは、本発明の組成物は、同一の核酸標的の異なる領域を標的とする２種若しくはそれ以上のアンチセンス化合物を含有しうる。アンチセンス化合物の多数の例が当該技術分野で既知である。２種若しくはそれ以上の組合せた化合物を一緒に若しくは連続して使用しうる。
Ｈ．投薬
治療的組成物の処方およびそれらのその後の投与（投薬）は当業者の熟練内にあると考えられる。投薬は、処置されるべき疾患状態の重症度および応答性に依存し、処置クールは数日から数ヶ月まで、または治癒が遂げられるまで若しくは疾患状態の縮小が達成されるまで持続する。至適の投薬スケジュールは、患者の体内の薬物の蓄積の測定値から計算し得る。当業者は、至適の投薬量、投薬の方法論および反復速度を容易に決定し得る。至適の投薬量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して変動することがあり、そして一般にはｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルで有効であることが見出されたＥＣ５０に基づき推定し得る。一般に、投薬量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇまで、体重１ｋｇあたり０．１μｇから１０ｇまで、体重１ｋｇあたり１．０μｇから１ｇまで、体重１ｋｇあたり１０．０μｇから１００ｍｇまで、体重１ｋｇあたり１００μｇから１０ｍｇまで、若しくは体重１ｋｇあたり１ｍｇから５ｍｇまでであり、そして、１日、週、月、若しくは年に１回若しくはそれ以上、または２ないし２０年ごとに１回さえ与えうる。当業者は、測定された滞留時間および体液若しくは組織中の該薬物の濃度に基づき、投薬の反復速度を容易に推定し得る。成功裏の処置後、疾患状態の再発を予防するために患者に維持療法を受けさせることが望ましいかもしれない。維持療
法では、オリゴヌクレオチドを、体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇまでの範囲にわたる維持用量で、１日１回若しくはそれ以上ないし２０年ごとに１回投与する。
治療的組成物を用いる処置の効果を、前記処置を受領する患者若しくは被験体からの組織若しくは液体の収集後に評価し得る。患者若しくは被験体に対する有害な効果をもたらすことなく生検サンプルをある組織から獲得し得ることが当該技術分野で既知である。ある態様において、組織およびその構成細胞は、限定されるものでないが血液（例えばヒト造血前駆細胞、ヒト造血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞ＣＤ４＋細胞のような造血細胞）、リンパ球および他の血液系統の細胞、骨髄、乳房、子宮頚部、結腸、食道、リンパ節、筋、末梢血、口腔粘膜および皮膚を挙げることができる。他の態様において、液体およびその構成細胞は、限定されるものでないが血液、尿、精液、滑液、リンパ液および脳脊髄液を挙げることができる。患者から獲得した組織若しくは液体は、標的ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の発現レベルについて評価し得る。付加的に、特定の疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｔｅ）、状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）若しくは表現型と関連することが既知若しくは疑われる他の遺伝子のｍＲＮＡ若しくはタンパク質の発現レベルを評価し得る。ｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション若しくはＤＮＡアレイ分析により測定若しくは評価し得る。タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡ、イムノブロット、定量的タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ（例えばカスパーゼ活性アッセイ）免疫組織化学若しくは免疫細胞化学により測定若しくは評価し得る。
さらに、処置の効果は、当該技術分野で既知の慣例の臨床的方法により、処置を受領する患者若しくは被験体から収集した前述の組織および液体中の該疾患若しくは状態と関連する生物マーカーを測定することにより評価し得る。これらの生物マーカーは、限定されるものでないが：グルコース、コレステロール、リポタンパク質、トリグリセリド、遊離脂肪酸、ならびにグルコースおよび脂質代謝の他のマーカー；肝トランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、血中尿素窒素、クレアチンならびに腎および肝機能の他のマーカー；インターロイキン、腫瘍壊死因子、細胞内接着分子、Ｃ反応性タンパク質および炎症の他のマーカー；テストステロン、エストロゲンおよび他のホルモン；腫瘍マーカー；ビタミン、ミネラルならびに電解質を挙げることができる。
本発明はその好ましい態様のあるものに従って特異性を伴い記述したが、以下の実施例は本発明を具体的に説明するためにのみはたらき、そしてそれを制限することを意図していない。本出願にて引用される参考文献、ＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）受託番号などのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組込まれる。
［実施例］
ヌクレオシドホスホルアミダイトの合成
アミダイトおよびそれらの中間体を包含する以下の化合物は、米国特許第６，４２６，２２０号明細書および国際特許公開第ＷＯ ０２／３６７４３号明細書に記述されるとおり製造した；５−メチルｄＣアミダイトの５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン中間体、５−メチル−ｄＣアミダイトの５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−５−メチルシチジン中間体、５−メチルｄＣアミダイトの５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジンの最後から２番目の中間体、［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（５−メチルｄＣアミダイト）、２’−フルオロデオキシアデノシン、２’−フルオロデオキシグアノシン、２’−フルオロウリジン、２’−フルオロデオキシシチジン、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト、２’−Ｏ−（２
−メトキシエチル）−５−メチルウリジン中間体、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジンの最後から２番目の中間体、［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（ＭＯＥ Ｔアミダイト）、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルシチジン中間体、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジンの最後から２番目の中間体、［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（ＭＯＥ ５−Ｍｅ−Ｃアミダイト）、［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（ＭＯＥ Ａアミダイト）、［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（ＭＯＥ Ｇアミダイト）、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト、２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（［２−フタルイミドキシ］エチル）−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ（ｆｏｒｍａｄｏｘｉｍｉｎｏｏｘｙ））エチル］−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］、２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エトキシアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト、２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）−エチル）］−５−メチルウリジン、ならびに５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）−エチル）］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト。
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシド合成
本発明により使用されるアンチセンス化合物は、固相合成の公知の技術により便宜的かつ慣例に作成しうる。こうした合成のための機器は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）を包含するいくつかの製造供給元により販売されている。当該技術分野で既知のいかなる他のこうした合成手段も付加的に若しくは代替で使用しうる。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドの類似の製造技術を使用することが公知である。
オリゴヌクレオチド：未置換および置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチ
ドは、ヨウ素による酸化を用いる標準的ホスホルアミダイト化学を使用して自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３９４）で合成する。
ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）は、以下を除いてホスホジエステルオリゴヌクレオチドに類似に合成する。すなわち、チア化（ｔｈｉａｔｉｏｎ）は、亜リン酸塩結合の酸化のためアセトニトリル中３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドの１０％ｗ／ｖ溶液を利用することにより遂げた。チア化（ｔｈｉａｔｉｏｎ）反応段階の時間を１８０秒に増大させ、そして通常のキャッピング段階により先行させた。ＣＰＧカラムからの切断および濃水酸化アンモニウム中５５℃（１２〜１６時間）でのデブロッキング後に、１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ溶液から＞３容量のエタノールで沈殿させることによりオリゴヌクレオチドを回収した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドは米国特許第５，５０８，２７０号明細書（引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されるとおり製造する。
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第４，４６９，８６３号明細書（引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されるとおり製造する。
３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，６１０，２８９号若しくは同第５，６２５，０５０号明細書（引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されるとおり製造する。
ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，２５６，７７５号若しくは米国特許第５，３６６，８７８号明細書（引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されるとおり製造する。
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２号および同第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６号明細書（それぞれ第ＷＯ ９４／１７０９３号および同第ＷＯ ９４／０２４９９号明細書として公開）（引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されるとおり製造する。
３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，４７６，９２５号明細書（引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されるとおり製造する。
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，０２３，２４３号明細書（引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されるとおり製造する。
ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，１３０，３０２号および同第５，１７７，１９８号明細書（双方とも引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されるとおり製造する。
オリゴヌクレオシド：メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド（ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドともまた同定される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド（ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドともまた同定される）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（アミド−３結合オリゴヌクレオシドともまた同定される）、ならびにメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（アミド−４結合オリゴヌクレオシドともまた同定される）、ならびに例えば交替するＭＭＩおよびＰ＝Ｏ若しくはＰ＝Ｓ結合を有する混合バックボーン化合物は、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，３８６，０２３号、同第５，４８９，６７７号、同第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号明細書（それらの全部は引用することにより本明細書に組込まれ
る）に記述されるとおり製造する。
ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号および同第５，２６４，５６４号明細書（引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されるとおり製造する。
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号明細書（引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されるとおり製造する。
ＲＮＡ合成
一般に、ＲＮＡ合成の化学は戦略的中間反応での多様な保護基の選択的組込みに基づく。当業者は有機合成における保護基の使用を理解しているであろうとは言え、有用な一分類の保護基はシリルエーテルを包含する。とりわけ、嵩高いシリルエーテルは、２’−ヒドロキシル上の酸不安定性のオルトエステル保護基とともに５’−ヒドロキシルを保護するのに使用される。保護基のこの組はその場合、標準的な固相合成技術とともに使用する。全部の他の合成段階後に該酸不安定性のオルトエステル保護基を最後に除去することが重要である。さらに、合成の間のシリル保護基の早期の使用は、２’−ヒドロキシルの望ましくない脱保護を伴わずに所望の場合に容易な除去を確実にする。
差別的に除去されかつ差別的に化学的に不安定である保護基による２’−ヒドロキシルの保護とともに５’−ヒドロキシルの連続的保護のためのこの手順に従って、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。
ＲＮＡオリゴヌクレオチドは段階的様式で合成する。各ヌクレオチドは、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに連続的に（３’から５’の方向に）付加する。鎖の３’端の第一のヌクレオシドは固体支持体に共有結合されている。ヌクレオチド前駆体、リボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび活性剤を添加して、第二の塩基を第一のヌクレオシドの５’端に結合させる。支持体を洗浄し、そして、いかなる未反応の５’−ヒドロキシル基も無水酢酸でキャッピングして、５’−アセチル部分を生じる。該結合をその後、より安定かつ最終的に所望のＰ（Ｖ）結合に酸化する。ヌクレオチド付加周期の終了時に、５’−シリル基をフッ化物で切断する。該周期を各その後のヌクレオチドについて反復する。
合成後に、リン酸上のメチル保護基を、ＤＭＦ中１Ｍの二ナトリウム２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオラート三水和物（Ｓ２Ｎａ２）を利用して３０分で切断する。脱保護溶液は水を使用して固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドから洗浄する。支持体をその後、水中４０％メチルアミンで５５℃で１０分間処理する。これがＲＮＡオリゴヌクレオチドを溶液中に放出し、環外アミンを脱保護しかつ２’基を修飾する。該オリゴヌクレオチドをこの段階で陰イオン交換ＨＰＬＣにより分析し得る。
２’−オルトエステル基は除去されるべき最後の保護基である。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（コネチカット州ラファイエット）により開発されたエチレングリコールモノアセテートオルトエステル保護基は、有用なオルトエステル保護基の一例であり、以下の重要な特性を有する。それはヌクレオシドホスホルアミダイト合成およびオリゴヌクレオチド合成の条件に対し安定である。しかしながら、オリゴヌクレオチド合成後にオリゴヌクレオチドをメチルアミンで処理する。メチルアミンは、オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断するのみならず、しかしまたアセチル基をオルトエステルから除去する。オルトエステル上の生じる２−エチル−ヒドロキシル置換基はアセチル化された前駆体よりも少なく電子を吸引する。結果として、修飾オルトエステルは酸で触媒さ
れる加水分解に対しより不安定になる。とりわけ、切断速度はアセチル基が除去された後におよそ１０倍より速くなる。従って、このオルトエステルは、オリゴヌクレオチド合成と適合性であるために十分な安定性を有する。それでもなお、その後修飾される場合に、このオルトエステルは、最終のＲＮＡオリゴヌクレオチド生成物と適合性の比較的穏やかな水性条件下で脱保護が実施されることを可能にする。
加えて、ＲＮＡ合成方法は当該技術分野で公知である（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ、１９９６；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９８、１２０、１１８２０−１１８２１；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．とＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８１、１０３、３１８５−３１９１；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．とＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９８１、２２、１８５９−１８６２；Ｄａｈｌ，Ｂ．Ｊ．ら、Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ、．１９９０、４４、６３９−６４１；Ｒｅｄｄｙ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９４、２５、４３１１−４３１４；Ｗｉｎｃｏｔｔ，Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９５、２３、２６７７−２６８４；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂ．Ｅ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９６７、２３、２３０１−２３１３；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９６７、２３、２３１５−２３３１）。
本発明のＲＮＡアンチセンス化合物（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）は、本明細書の方法により合成し得るか、若しくはＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ（コネチカット州ラファイエット）から購入し得る。一旦合成されれば、相補ＲＮＡアンチセンス化合物をその後、当該技術分野で既知の方法によりアニーリングして二本鎖（二重鎖形成した）アンチセンス化合物を生じ得る。例えば、二重鎖は、３０μｌのＲＮＡオリゴヌクレオチドの相補鎖のそれぞれ（５０μＭのＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液）および１５μｌの５×アニーリング緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ
ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）を組合せること、次いで９０℃で１分間、その後３７℃で１時間加熱することにより形成させ得る。生じる二重鎖形成したアンチセンス化合物は、標的核酸の役割を検討するためのキット、アッセイ、スクリーニング若しくは他の方法で使用し得る。
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド若しくは混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは数種の異なる型のものであり得る。これらは、結合されたヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが結合されたヌクレオシドの５’および３’の「ウィング」セグメントの間に配置されている第一の型、ならびに「ギャップ」セグメントが該オリゴマー化合物の３’若しくは５’いずれかの末端に位置する第二の「開放端」型を包含する。第一の型のオリゴヌクレオチドは当該技術分野で「ギャップマー」若しくはギャップトオリゴヌクレオチドとしてもまた知られる。第二の型のオリゴヌクレオチドは当該技術分野で「ヘミマー」若しくは「ウィングマー」としてもまた知られる。
［２’−Ｏ−Ｍｅ］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−Ｍｅ］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエートおよび２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドは、上のとおりＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの自動ＤＮＡ合成機モデル３９４を使用して合成する。オリゴヌクレオチドは、自動合成機、ならびにＤＮＡ部分について２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトならびに５’および３’ウィングにつ
いて５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトを使用して合成する。５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトについて増大した反応時間を伴う結合段階を組込むことにより、標準的合成周期を改変する。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、そして濃アンモニア（ＮＨ４ＯＨ）中５５℃で１２〜１６時間脱保護する。脱保護したオリゴをその後、適切な方法（沈殿、カラムクロマトグラフィーにより回収し、真空中で容量を減少させ、そしてキャピラリー電気泳動および質量分析により収量および純度について分光測光的に分析する。
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［−２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルアミダイトの代わりの２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトの使用を伴い、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上の手順のとおり製造した。
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチド
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチルホスホジエステル］−−［２’−デオキシホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルアミダイトの代わりの２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトの使用、該キメラ構造のウィング部分内のホスホジエステルヌクレオチド間結合を生成させるためのヨウ素での酸化、および中央のギャップのためのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を生成させるための３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を利用する硫化を伴い、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上の手順のとおり製造する。
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，６２３，０６５号明細書（引用することにより本明細書に組込まれる）に従って合成する。
Ｃ反応性タンパク質を標的とする二重鎖形成アンチセンス化合物の設計およびスクリーニング
本発明により、本発明のアンチセンス化合物およびそれらの相補物を含んでなる一連の核酸二重鎖を、Ｃ反応性タンパク質を標的とするように設計し得る。該二重鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は表１の１オリゴヌクレオチドの最低８核酸塩基の部分を含んでなる。鎖の端は、オーバーハングを形成するための１個若しくはそれ以上の天然の若しくは修飾核酸塩基の付加により改変しうる。ｄｓＲＮＡのセンス鎖をその後アンチセンス鎖の相補物として設計かつ合成し、そして、いずれかの末端への修飾若しくは付加もまた含有しうる。例えば、一態様において、ｄｓＲＮＡ二重鎖の双方の鎖が中央の核酸塩基で相補的であり、それぞれ一方若しくは双方の末端にオーバーハングを有する。該二重鎖のアンチセンスおよびセンス鎖は約１７から２５個までのヌクレオチド、若しくは約１９から２３個までのヌクレオチドを含んでなる。あるいは、該アンチセンスおよびセンス鎖は２０、２１若しくは２２ヌクレオチドを含んでなる。
例えば、配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列番号６２４）を有しかつデオキシチミジン（ｄＴ）の２核酸塩基のオーバーハングを有するアンチセンス鎖を含んでなる二重鎖は、以下の構造を有する（アンチセンス 配列番号６２５、相補物 配列番
号６２６）：
Figure 2012029693
オーバーハングは２から６個までの核酸塩基の範囲にわたることができ、また、これらの核酸塩基は標的核酸に相補的であっても若しくはなくてもよい。別の態様において、該二重鎖は一方の末端のみにオーバーハングを有しうる。
別の態様において、同一の配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列番号６２４）を有するアンチセンス鎖を含んでなる二重鎖を、示されるとおり平滑端（一本鎖オーバーハングなし）を伴い製造する（アンチセンス 配列番号６２４、相補物 配列番号６２７）：
Figure 2012029693
該ＲＮＡ二重鎖は単分子若しくは二分子であり得る。すなわち、該二本の鎖は単一分子の一部であり得るか、若しくは別個の分子でありうる。
該二重鎖のＲＮＡ鎖は、本明細書に開示される方法により合成し得るか、若しくはＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，（コネチカット州ラファイエット）から購入し得る。一旦合成されれば、相補鎖をアニーリングする。該一本鎖を分注しそして５０μＭの濃度に希釈する。一旦希釈されれば、３０μＬの各鎖を１５μＬのアニーリング緩衝液の５×溶液と合せる。前記緩衝液の最終濃度は、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４および２ｍＭ酢酸マグネシウムである。最終容量は７５μＬである。この溶液を９０℃で１分間インキュベートし、そしてその後１５秒間遠心分離する。チューブを３７℃で１時間静置させ、その時点でｄｓＲＮＡ二重鎖を実験で使用する。ｄｓＲＮＡ二重鎖の最終濃度は２０μＭである。この溶液は凍結保存し（−２０℃）得、そして５回まで凍結−融解し得る。
一旦調製されれば、二重鎖形成したアンチセンス化合物を、Ｃ反応性タンパク質の発現を調節するそれらの能力について評価する。
細胞が８０％コンフルエンシーに達した場合に、それらを本発明の二重鎖形成したアンチセンス化合物で処理する。９６ウェルプレートで増殖させた細胞について、ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１減血清培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で１回洗浄し、そしてその後、１２μｇ／ｍＬのリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および２００ｎＭの最終濃度の所望の二重鎖アンチセンス化合物を含有する１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１培地で処理する。５時間の処理後に培地を新鮮培地と交換する。細胞を処理１６時間後に収集し、この時点でＲＮＡを単離しかつ標的の低下をＲＴ−ＰＣＲにより測定する。
オリゴヌクレオチドの単離
微細孔性ガラス固体支持体からの切断、および濃水酸化アンモニウム中５５℃で１２〜１６時間デブロッキングした後に、オリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオシドを１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃからの＞３容量のエタノールでの沈殿により回収する。合成したオリゴヌクレオチドを、電子スプレー質量分析法（分子量測定）およびキャピラリーゲル電気泳動により分析し、そして最低７０％の完全長の物質であると判断した。合成で得たホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量を、−１６ａｍｕ生成物（＋／−３２＋／−４８）に関する正しい分子量の比により決定した。いくつかの研究のため、オリゴヌクレオチドをＣｈｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１、２６６、１８１６２−１８１７１により記述されるところのＨＰＬＣにより精製した。ＨＰＬＣで精製した物質で得られた結果は、ＨＰＬＣで精製していない物質で得られたものと同様であった。
オリゴヌクレオチド合成−９６ウェルプレート形式
オリゴヌクレオチドは、９６ウェル形式で同時に９６配列を集成することが可能な自動合成機で、固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホルアミダイトの化学を介して合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は水性ヨウ素での酸化により提供した。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、水性アセトニトリル中での３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を利用する硫化により生成させた。標準的な塩基保護β−シアノエチル−ジイソ−プロピルホスホルアミダイトは商業的製造供給元（例えばＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ、若しくはＰｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）から購入した。標準的でないヌクレオシドは標準的な若しくは特許を受けた方法に従って合成する。それらを塩基保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトとして利用する。
オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、そして上昇された温度（５５〜６０℃）で濃ＮＨ４ＯＨを用いて１２〜１６時間脱保護し、そして遊離された生成物をその後真空中で乾燥した。乾燥した生成物をその後滅菌水に再懸濁してマスタープレートを提供し、それから全部の分析および試験プレートサンプルをその後、自動ピペッターを利用して希釈した。
オリゴヌクレオチドの分析−９６ウェルプレート形式
各ウェル中のオリゴヌクレオチドの濃度は、サンプルの希釈およびＵＶ吸収分光学により評価した。個々の生成物の完全長の完全性は、９６ウェル形式（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥＴＭ ＭＤＱ装置）、若しくは個別に調製したサンプルについては商業的キャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置（例えばＢｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥＴＭ ５０００、ＡＢＩ
２７０装置）のいずれかでのＣＥにより評価した。塩基およびバックボーン組成は電子スプレー質量分析法を利用する化合物の質量分析により確認した。全部のアッセイ試験プレートを、単一および多チャンネル自動ピペッターを使用してマスタープレートから希釈した。プレートは、該プレート上の化合物の最低８５％が最低８５％の完全長であった場合に許容できると判断した。
細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理
標的核酸の発現に対するアンチセンス化合物の効果は多様な細胞型のいずれでも試験し得るが、但し、標的核酸が測定可能な濃度で存在する。これは、例えばＰＣＲ若しくはノーザンブロット分析を使用して慣例に測定し得る。以下の細胞型は具体的説明の目的上提
供されるが、しかし他の細胞型を慣例に使用し得る。但し、標的が選ばれた細胞型で発現される。これは、当該技術分野で慣例の方法、例えばノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ若しくはＲＴ−ＰＣＲにより容易に測定し得る。
Ｔ−２４細胞：
ヒト移行細胞、膀胱癌細胞株Ｔ−２４はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）から得た。Ｔ−２４細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、１ｍＬあたり１００単位のペニシリンおよび１ｍＬあたり１００マイクログラムのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を補充した完全マッコイ５Ａ基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中で慣例に培養した。細胞はそれらが９０％コンフルエンスに達した場合にトリプシン処理および希釈により慣例に継代した。細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ分析での使用のため７０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレ―ト（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ ＃３５３８７２）に接種した。
ノーザンブロッティング若しくは他の分析のため、細胞を１００ｍｍ若しくは他の標準的組織培養プレートに接種し、そして適切な量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理しうる。
Ａ５４９細胞：
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）から得た。Ａ５４９細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、１ｍＬあたり１００単位のペニシリンおよび１ｍＬあたり１００マイクログラムのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を補充したＤＭＥＭ基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中で慣例に培養した。細胞はそれらが９０％コンフルエンスに達した場合にトリプシン処理および希釈により慣例に継代した。
ＮＨＤＦ細胞：
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（メリーランド州ウォーカーズビル）から得た。ＮＨＤＦは、供給元により推奨されるとおり補充した線維芽細胞増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州ウォーカーズビル）中で慣例に維持した。細胞は、供給元により推奨されるとおり１０回までの継代の間維持した。
ＨＥＫ細胞：
ヒト胎児由来ケラチノサイト（ＨＥＫ）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（メリーランド州ウォーカーズビル）から得た。ＨＥＫは、供給元により推奨されるとおり処方したケラチノサイト増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州ウォーカーズビル）中で慣例に維持した。細胞は、供給元により推奨されるとおり１０回までの継代の間慣例に維持した。
Ｈｅｐ３Ｂ細胞：
ヒト肝癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ（Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＢ−８０６４；バージニア州マナサス）から得た。この細胞株は最初、８歳の黒人男性の肝細胞癌に由来した。
該細胞は、形態学において上皮でありかつヌードマウスで腫瘍形成性である。これらの細胞は、Ｌｏｚａｎｓｋｉら（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、ｖｏｌ．８、１９９６ ｐｐ．５３４−５４０）により記述されるプロトコルに従い、１μＭのデキサメサゾン（Ｓｉｇｍａ−カタログ番号Ｄ２９１５ ミズーリ州セントルイス）、４００Ｕ／ｍｌのＩＬ１Ｂ（Ｓｉｇｍａ−カタログ番号Ｉ９４０１）および２００Ｕ／ｍｌのＩＬ６（Ｓｉｇｍａ−カタログ番号Ｉ１３９）を含有する培地の添加により、Ｃ反応性タンパク質を産生するように誘導し得る。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、アールの平衡塩溶液、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＡＴＣＣ ＃２０−２００３、バージニア州マナサス）および１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）中で慣例に培養した。細胞はそれらが９０％コンフルエンスに達した場合にトリプシン処理および希釈により慣例に継代した。
誘導されたＣ反応性タンパク質のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を測定するために、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したＭＥＭ中６ウェルプレート（Ｐｒｉｍａｒｉａ、ニュージャージー州フランクリン、カタログ番号３８４６）の各ウェルに１００，０００細胞の密度でプレーティングし、そして一夜接着させた。翌日、上述されたところの最終濃度１μＭのデキサメサゾン、４００Ｕ／ｍｌのＩＬ１Ｂおよび２００Ｕ／ｍｌのＩＬ６を補充した通常培地中で２４時間、Ｃ反応性タンパク質を産生するよう細胞を誘導した。この誘導期間の終了時に培地を除去し、そして、３種のサイトカインを補充したＭＥＭ単独（−）血清中５０〜１５０ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび３．０〜４．５μｇのリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬で細胞を４時間処理した。４時間の薬物処理の終了時に培地を除去し、そしてＦＣＳおよびサイトカインを含有する新鮮ＭＥＭを各ウェルに添加し、そして追加の２０時間静置させた。オリゴヌクレオチドでの処理の２４時間後に、キアゲン［ＱＩＡＧＥＮ］（Ｒ）ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ、カリフォルニア州バレンシア）処置を使用してＲＮＡを収集し、そしてＲＴ−ＰＣＲ分析を使用してＣ反応性タンパク質のＲＮＡを検出した。
初代ラット肝細胞：
初代ラット肝細胞は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ（マサチューセッツ州ウィルミントン）から購入したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから調製し、そして１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、１ｍｌあたり１００単位のペニシリン、および１ｍｌあたり１００マイクログラムのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中で慣例に培養した。細胞は、アンチセンスオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験での使用のため、８０％コンフルエンスまで培養した。
初代ウサギ肝細胞：
ニュージーランドホワイトラビットからの初代ウサギ肝細胞はＩｎＶｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州ボルチモア）から購入し、そして１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、１ｍｌあたり１００単位のペニシリン、および１ｍｌあたり１００マイクログラムのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中で慣例に培養した。初代ウサギ肝細胞を購入しかつ１００％コンフルエンシーでトランスフェクトする。
初代マウス肝細胞：
初代マウス肝細胞は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ（マサチューセッツ州ウィルミントン）から購入したＢａｌｂ／ｃマウスから調製し、そして、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、１ｍｌあたり１００単位のペニシリンおよび１ｍｌあたり１００マイクログラムのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中で慣例に培養した。細胞は、アンチセンスオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験での使用のため８０％コンフルエンスまで培養した。
初代ヒト肝細胞：
プレーティング前の初代ヒト肝細胞をＩｎＶｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州ボルチモア）から購入した。細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中で培養した。細胞は、製造供給元からの受領に際してオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。
初代カニクイザル肝細胞：
プレーティング前の初代カニクイザル肝細胞をＩｎＶｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州ボルチモア）から購入した。細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中で培養した。細胞は、製造供給元からの受領に際してオリゴヌクレオチドで処理した。
アンチセンス化合物での処理：
細胞が６５〜７５％コンフルエンシーに達した場合にそれらをオリゴヌクレオチドで処理した。９６ウェルプレートで増殖させた細胞については、ウェルを１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１減血清培地若しくは高グルコース無血清ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で１回洗浄し、そしてその後、３．７５μｇ／ｍＬのリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）および所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含有する１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１培地で処理した。細胞は三重で処理しかつデータを得る。３７℃での４〜７時間の処理後に培地を新鮮培地と交換した。細胞はオリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後に収集した。
使用されるオリゴヌクレオチドの濃度は細胞株ごとに異なる。特定の細胞株の至適のオリゴヌクレオチド濃度を決定するために、細胞をある範囲の濃度の陽性対照オリゴヌクレオチドで処理する。ヒト細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドを、ヒトＨ−ｒａｓを標的とするＩＳＩＳ １３９２０（ＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧ、配列番号１）若しくはヒトＪｕｎ−Ｎ末端キナーゼ−２（ＪＮＫ２）を標的とするＩＳＩＳ
１８０７８（ＧＴＧＣＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＡＡＡＴＣ、配列番号２）のいずれかから選択する。双方の対照はホスホロチオエートバックボーンをもつ２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルを太字で示す）である。マウス若しくはラ
ット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスおよびラット双方のｃ−ｒａｆを標的とするホスホロチオエートバックボーンをもつ２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルを太字で示す）、ＩＳＩＳ １５７７０、ＡＴＧＣＡＴＴＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡ、配列番号３である。ｃ−Ｈ−ｒａｓ（ＩＳＩＳ １３９２０について）、ＪＮＫ２（ＩＳＩＳ １８０７８について）若しくはｃ−ｒａｆ（ＩＳＩＳ １５７７０について）ｍＲＮＡの８０％阻害をもたらす陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度をその後、その細胞株のその後の実験での新たなオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用する。８０％阻害が達成されない場合は、ｃ−Ｈ−ｒａｓ、ＪＮＫ２若しくはｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡの６０％阻害をもたらす陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度をその後、その細胞株のその後の実験でのオリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として利用する。６０％阻害が達成されない場合、その特定の細胞株はオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験に適しないとみなす。本明細書で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は５０ｎＭから３００ｎＭまでである。
Ｃ反応性タンパク質発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
Ｃ反応性タンパク質発現のアンチセンス調節は当該技術分野で既知の多様な方法でアッセイし得る。例えば、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルを、例えばノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、若しくはリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により定量し得る。リアルタイム定量的ＰＣＲが現在好ましい。ＲＮＡ分析は全細胞ＲＮＡ若しくはポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡで実施し得る。本発明の好ましいＲＮＡ分析方法は、本明細書の他の実施例で記述されるところの全細胞ＲＮＡの使用である。ＲＮＡの単離方法は当該技術分野で公知である。ノーザンブロット分析もまた当該技術分野で慣例である。リアルタイム定量的（ＰＣＲ）は、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティから入手可能かつ製造元の説明書に従って使用される商業的に入手可能なＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ７６００、７７００若しくは７９００配列検出装置を使用して便宜的に達成し得る。
Ｃ反応性タンパク質のタンパク質レベルは、免疫沈降法、ウエスタンブロット分析（イムノブロット）、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）若しくは蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）のような当該技術分野で公知の多様な方法で定量し得る。Ｃ反応性タンパク質に向けられた抗体は、ＭＳＲＳの抗体カタログ（Ａｅｒｉｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミシガン州バーミングハム）のような多様な供給源から同定しかつ得ることができるか、または、当該技術分野で公知の慣習的モノクローナル若しくはポリクローナル抗体生成方法を介して製造し得る。
Ｃ反応性タンパク質阻害剤の使用のための表現型アッセイの設計
Ｃ反応性タンパク質阻害剤が本明細書に開示される方法により一旦同定されれば、該化合物を、特定の疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｔｅ）若しくは状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の処置における有効性を暗示する測定可能なエンドポイントをそれぞれ有する１種若しくはそれ以上の表現型アッセイでさらに検討する。表現型アッセイ、キットおよびそれらの使用のための試薬は当業者に公知であり、そして、健康および疾患時のＣ反応性タンパク質の役割および／若しくは関連を検討するために本明細書で使用する。いくつかの商業的製造供給元のいずれか１つから購入し得る代表的表現型アッセイは、細胞生存率、細胞傷害性、増殖若しくは細胞の生存を測定するためのもの（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ボストン）、酵素アッセイ（Ｐａｎｖｅｒａ，ＬＬＣ、ウィスコンシン州マディソン；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州フランクリンレイクス；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）、細胞調節、シ
グナル伝達、炎症、酸化的過程およびアポトーシス（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ Ｉｎｃ．、ミシガン州アンアーバー）を包含するタンパク質に基づくアッセイ、トリグリセリド蓄積（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、血管新生アッセイ、管形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイならびに代謝アッセイ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州テメキュラ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を包含する。
制限しない一例において、特定の表現型アッセイに適切であると決定された細胞（すなわち乳癌研究に選択されたＭＣＦ−７細胞；肥満研究のための脂肪細胞）を、上述された方法により決定される至適濃度のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究から同定されたＣ反応性タンパク質阻害剤ならびに対照化合物で処理する。処理期間の終了時に、処理および未処理細胞を、表現型の結果およびエンドポイントを決定するためのアッセイに特異的な１種若しくはそれ以上の方法により分析する。
表現型のエンドポイントは、時間若しくは処理用量に対する細胞の形態学の変化、ならびにタンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖若しくは金属のような細胞成分のレベルの変化を包含する。ｐＨ、細胞周期の段階、該細胞による生物学的指標の取り込み若しくは排出を包含する細胞状態の測定値もまた目的のエンドポイントである。
処理後の細胞の遺伝子型の分析（細胞の遺伝子の１種若しくはそれ以上の発現の測定）もまた、Ｃ反応性タンパク質阻害剤の有効性すなわち効力の指標として使用する。特徴遺伝子、すなわち特定の疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｔｅ）、状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）若しくは表現型と関連することが疑われる遺伝子を、処理および未処理双方の細胞で測定する。
本明細書に記述される表現型アッセイにかけられる細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物、またはヒトおよびヒト以外の双方の生存生物体から単離された組織若しくは液体由来である。ある態様において、組織およびその構成細胞は、限定されるものでないが血液（例えばヒト造血前駆細胞、ヒト造血幹細胞のような造血細胞、ＣＤ３４＋細胞ＣＤ４＋細胞）、リンパ球および他の血液系統の細胞、骨髄、脳、幹細胞、血管、肝、肺、骨、乳房、軟骨、子宮頚部、結腸、角膜、胚、子宮内膜、内皮、上皮、食道、筋膜、線維芽細胞、小胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ）、神経節細胞、膠細胞、杯細胞、腎、リンパ節、筋、ニューロン、卵巣、膵、末梢血、前立腺、皮膚、皮膚、小腸、脾、胃、精巣および胎児組織を挙げることができる。他の態様において、液体およびその構成細胞は、限定されるものでないが、血液、尿、滑液、リンパ液および脳脊髄液を挙げることができる。表現型アッセイは、ｅｘ ｖｉｖｏでＣ反応性タンパク質阻害剤で処理した組織でもまた実施しうる。
ＲＮＡの単離
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの単離
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡはＭｉｕｒａら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、４２、１７５８−１７６４）に従って単離した。他のポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの単離方法は当該技術分野で慣例である。簡潔には、９６ウェルプレ―トで増殖させた細胞については、細胞から増殖培地を除去し、そして各ウェルを２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄した。６０μＬの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、２０ｍＭバナジル−リボヌクレオシド複合体）を各ウェルに添加し、プレートを穏やかに攪拌し、そしてその後室温で５分間インキュベートした。５５μＬのライセートを、オリゴｄ（Ｔ）被覆した９６ウェルプレート（ＡＧＣＴ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アービン）に移した。プレートを室温で６０分間インキュベートし、２
００μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。最後の洗浄後にプレートの水気をペーパータオルで拭き取って過剰の洗浄緩衝液を除去しかつその後５分間風乾した。７０℃に前加熱した６０μＬの溶出緩衝液（５ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．６）を各ウェルに添加し、プレートを９０℃のホットプレート上で５分間インキュベートし、そして溶出物をその後新しい９６ウェルプレ―トに移した。
１００ｍｍ若しくは他の標準的プレート上で増殖させた細胞は、適切な容量の全部の溶液を使用して同様に処理しうる。
全ＲＮＡの単離
全ＲＮＡは、製造元の推奨する手順に従い、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州バレンシア）から購入したＲＮＥＡＳＹ ９６ＴＭキットおよび緩衝液を使用して単離した。簡潔には、９６ウェルプレ―ト上で増殖させた細胞については、細胞から増殖培地を除去し、そして各ウェルを２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄した。１５０μＬの緩衝液ＲＬＴを各ウェルに添加し、そしてプレートを２０秒間活発に攪拌した。１５０μＬの７０％エタノールをその後各ウェルに添加し、そしてピペットで３回出し入れすることにより内容物を混合した。サンプルをその後、廃棄物収集トレイを取り付けかつ真空源に接続したＱＩＡＶＡＣＴＭマニホールドに接続したＲＮＥＡＳＹ ９６ＴＭウェルプレートに移した。真空を１分間適用した。５００μＬの緩衝液ＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ ９６ＴＭプレートの各ウェルに添加しかつ１５分間インキュベートし、そして真空を再度１分間適用した。追加の５００μＬの緩衝液ＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ ９６ＴＭプレートの各ウェルに添加し、そして真空を２分間適用した。１ｍＬの緩衝液ＲＰＥをその後ＲＮＥＡＳＹ ９６ＴＭプレートの各ウェルに添加し、そして真空を９０秒間適用した。その後緩衝液ＰＲＥ洗浄を反復し、そして真空を追加の３分間適用した。その後プレートをＱＩＡＶＡＣＴＭマニホールドから取り外し、そしてペーパータオルで水分を拭き取った。プレートをその後、１．２ｍＬ収集チューブを含有する収集チューブラックに取り付けたＱＩＡＶＡＣＴＭマニホールドに再接続した。その後、ＲＮＡを、１４０μＬのＲＮアーゼを含まない水を各ウェルにピペットで入れること、１分インキュベートすること、およびその後真空を３分間適用することにより溶出した。
反復ピペッティングおよび溶出段階は、ＱＩＡＧＥＮ（Ｒ） ＢＩＯ−ＲＯＢＯＴＴＭ
９６０４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を使用して自動化しうる。本質的には、培養プレート上で細胞を溶解した後に、プレートをロボットデッキに移し、そこでピペッティング、ＤＮアーゼ処理および溶出段階を実施する。
Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲ分析
Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルの定量は、製造元の説明書に従ってＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ７６００、７７００若しくは７９００配列決定装置（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用するリアルタイム定量的ＰＣＲにより達成した。これは、リアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物のハイスループット定量を可能にする、閉鎖管のゲルに基づかない蛍光検出装置である。増幅産物をＰＣＲが完了した後に定量する標準的ＰＣＲと対照的に、リアルタイム定量的ＰＣＲでの産物はそれらが蓄積する際に定量される。これは、フォワードおよびリバースＰＣＲプライマーの間で特異的にアニーリングしかつ２種の蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応に包含することにより達成される。レポーター色素（例えば、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アラメダ、若しくはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、ア
イオワ州コーラルビルのいずれかから得られるＦＡＭ若しくはＪＯＥ）はプローブの５’端に結合し、また、クエンチャー色素（例えば、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アラメダ若しくはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビルのいずれかから得られるＴＡＭＲＡ）はプローブの３’端に結合する。プローブおよび色素が無傷である場合、レポーター色素の発色は３’のクエンチャー色素の近接により消光される。増幅の間は、標的配列への該プローブのアニーリングが、Ｔａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性により切断され得る基質を創製する。ＰＣＲ増幅周期の伸長期の間は、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断が、プローブの残部から（およびこれゆえにクエンチャー部分から）レポーター色素を遊離し、そして配列特異的な蛍光シグナルが生成される。各周期で、付加的なレポーター色素分子がそれらのそれぞれのプローブから切断され、そして、蛍光強度を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ 配列決定装置に作り付けのレーザー光学により定期的間隔でモニターする。各アッセイで、未処理の対照サンプルからのｍＲＮＡの連続希釈を含有する一連の同時反応が標準曲線を生成し、それを使用して、試験サンプルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害パ―セントを定量する。
定量的ＰＣＲ分析前に、測定されている標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブの組を、ＧＡＰＤＨ増幅反応で「多重化」されるそれらの能力について評価する。多重化において、標的遺伝子および内的標準遺伝子ＧＡＰＤＨの双方が単一サンプル中で同時に増幅される。この分析では、未処理細胞から単離したｍＲＮＡを連続希釈する。各希釈を、ＧＡＰＤＨのみ、標的遺伝子のみ（「一重化」）若しくは双方（多重化）に特異的なプライマー−プローブの組の存在下で増幅する。ＰＣＲ増幅後に、ＧＡＰＤＨおよび標的ｍＲＮＡのシグナルの希釈の関数としての標準曲線を、一重化および多重化双方のサンプルから生成する。多重化したサンプルから生成したＧＡＰＤＨおよび標的のシグナルの傾きおよび相関係数の双方が、一重化サンプルから生成したそれらの対応する値の１０％以内にある場合には、その標的に特異的なプライマー−プローブの組は多重化可能とみなされる。他のＰＣＲ方法もまた当該技術分野で既知である。
遺伝子標的の量は逆転写リアルタイムＰＣＲにより得られる。リアルタイムＰＣＲの前に、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する目的上、単離したＲＮＡを逆転写（ＲＴ）反応にかける。逆転写酵素およびリアルタイムＰＣＲの試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、（カリフォルニア州カールズバッド）から得た。ＲＴ、リアルタイムＰＣＲ反応は、３０μＬの全ＲＮＡ溶液（２０〜２００ｎｇ）を含有する９６ウェルプレートに２０μＬのＰＣＲカクテル（ＭｇＣｌ２を含まない２．５×ＰＣＲ緩衝液、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、３７５μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰのそれぞれ、３７５ｎＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのそれぞれ、１２５ｎＭのプローブ、４単位のＲＮアーゼ阻害剤、１．２５単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ（Ｒ） Ｔａｑ、５単位のＭｕＬＶ逆転写酵素および２．５× ＲＯＸ色素）を添加することにより実施した。ＲＴ反応は４８℃で３０分間のインキュベーションにより実施した。ＰＬＡＴＩＮＵＭ（Ｒ） Ｔａｑを活性化するための９５℃で１０分インキュベーション後に、４０周期の２段階ＰＣＲプロトコル、すなわち９５℃１５秒間（変性）次いで６０℃１．５分間（アニーリング／伸長）を実施した。遺伝子標的の相当量を得るこの方法を本明細書でリアルタイムＰＣＲと称する。
リアルタイムＰＣＲにより得られる遺伝子標的の量は、発現が一定である遺伝子ＧＡＰＤＨの発現レベルを使用してか、若しくはＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．オレゴン州ユージーン）を使用して全ＲＮＡを定量することによるかのいずれかで正規化する。ＧＡＰＤＨ発現は、リアルタイムＰＣＲにより、多重化する標的と同時に若しくは個別に実施されることにより定量する。全ＲＮＡはＲｉｂ
ｏＧｒｅｅｎＴＭ ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．オレゴン州ユージーン）を使用して定量する。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ試薬によるＲＮＡの定量方法はＪｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．ら、（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８、２６５、３６８−３７４）に教示されている。
このアッセイにおいて、１７０μＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ操作試薬（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５で３５０倍希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ試薬）を、３０μＬの精製した細胞ＲＮＡを含有する９６ウェルプレートにピペッティングする。該プレートは４８５ｎｍの励起および５３０ｎｍの測定でＣｙｔｏｆｌｕｏｒ ４０００読み取り装置（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で読み取る。
ヒトＣ反応性タンパク質に対するプローブおよびプライマーは、公表された配列情報（ＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）受託番号Ｍ１１７２５．１、配列番号４として本明細書に組込まれる）を使用して、ヒトＣ反応性タンパク質配列にハイブリダイズするように設計した。ヒトＣ反応性タンパク質について、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＴＣＡＴＧＣＴＴ（配列番号５）
リバースプライマー：ＴＣＣＧＡＣＴＣＴＴＴＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡ（配列番号６）であり、また、ＰＣＲプローブは：ＦＡＭ−ＴＧＴＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴ−ＴＡＭＲＡ（配列番号７）であり、ここでＦＡＭは蛍光色素でありかつＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。ヒトＧＡＰＤＨについて、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（配列番号８）
リバースプライマー：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（配列番号９）であり、また、ＰＣＲプローブは：５’ＪＯＥ−ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号１０）であり、ここでＪＯＥは蛍光レポーター色素でありかつＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
ラットＣ反応性タンパク質に対するプローブおよびプライマーは、公表された配列情報（ＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）受託番号Ｍ８３１７６．１、配列番号１１として本明細書に組込まれる）を使用して、ラットＣ反応性タンパク質配列にハイブリダイズするように設計した。ラットＣ反応性タンパク質について、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＡＡＧＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＧＴＣＡＣＣ（配列番号１２）
リバースプライマー：ＧＧＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＣＡＡＴＧＴＡ（配列番号１３）であり、また、ＰＣＲプローブは：ＦＡＭ−ＴＣＣＴＧＧＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＧＴＧＣＣＴＴＣＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号１４）であり、ここでＦＡＭは蛍光レポーター色素でありかつＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。ラットＧＡＰＤＨについて、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＴＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴ（配列番号１５）
リバースプライマー：ＣＡＣＣＧＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＧＴ（配列番号１６）であり、また、ＰＣＲプローブは：５’ＪＯＥ−ＴＴＧＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＴＣＴＣＡ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号１７）であり、ここでＪＯＥは蛍光レポーター色素でありかつＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析
アンチセンス処理の１８時間後に、細胞単層を冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして１ｍＬのＲＮＡＺＯＬＴＭ試薬（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ “Ｂ” Ｉｎｃ．、テキサス州フレンズウッド）中で溶解した。製造元の推奨するプロトコルに従って全ＲＮＡを調製した。２０マイクログラムの全ＲＮＡを、ＭＯＰＳ緩衝液系（ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｉｎｃ．、オハイオ州ソロン）を使用して１．１％ホルムアルデヒドを含有する１．２％アガロースゲルを通過す
る電気泳動により分画した。ＲＮＡは、ノーザン／サザン転写緩衝液系（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ “Ｂ” Ｉｎｃ．、テキサス州フレンズウッド）を使用する一夜キャピラリー転写によりゲルからＨＹＢＯＮＤＴＭ−Ｎ＋ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に転写した。ＲＮＡの転写はＵＶ可視化により確認した。メンブレンは、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲＴＭ ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ ２４００装置（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用してＵＶ架橋により固定し、そしてその後、ストリンジェントな条件についての製造元の推奨を使用し、ＱＵＩＣＫＨＹＢＴＭハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用してプロービングした。
ヒトＣ反応性タンパク質を検出するため、ヒトＣ反応性タンパク質特異的なプローブを、フォワードプライマーＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＴＣＡＴＧＣＴＴ（配列番号５）およびリバースプライマーＴＣＣＧＡＣＴＣＴＴＴＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡ（配列番号６）を使用するＰＣＲにより製造した。負荷および転写の効率の変動について正規化するため、メンブレンを細片に切り、そしてヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）についてプロービングした。
ラットＣ反応性タンパク質を検出するためには、ラットＣ反応性タンパク質特異的なプローブを、フォワードプライマーＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＴＣＡＴＧＣＴＴ（配列番号１２）およびリバースプライマーＴＣＣＧＡＣＴＣＴＴＴＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡ（配列番号１３）を使用するＰＣＲにより製造した。負荷および転写の効率の変動について正規化するため、メンブレンを細片に切り、そしてラットグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）についてプロービングした。
ハイブリダイズさせたメンブレンを、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭ装置およびＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴＴＭソフトウェアＶ３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使用して可視化かつ定量した。データは未処理の対照でのＧＡＰＤＨレベルに正規化した
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトＣ反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害
本発明により、一連のアンチセンス化合物を、公表された配列（ＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）受託番号Ｍ１１７２５．１、配列番号４として本明細書に組込まれる）を使用して、ヒトＣ反応性タンパク質ＲＮＡの多様な領域を標的とするよう設計した。該化合物を表１に示す。「標的部位」は、該化合物が結合する特定の標的配列の最初（最も５’）のヌクレオチド番号を示す。表１中の全化合物は、５ヌクレオチドの「ウィング」により双方の側（５’および３’の方向）で隣接されている１０個の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成される、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。該化合物を、ヒトＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルに対するそれらの影響について、本明細書の他の実施例に記述されるところの定量的リアルタイムＰＣＲにより分析した。表１に示されるデータは、サイトカインで誘導したＨｅｐ３Ｂ細胞を１５０ｎＭの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した３回の実験からの平均である。各データ点の陽性対照は配列番号により表中で同定される。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は「データなし」を示す。
Figure 2012029693
Figure 2012029693
表１に示されるとおり、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４６、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０および７１は、このアッセイでヒトＣ反応性タンパク質発現の最低５０％の阻害を示し、そして従って好ましい。配列番号３６、２２および５６がより好ましい。これらの好ましい配列が相補的である標的領域は、本明細書で「好ましい標的セグメント」と称され、そして従って本発明の化合物によるターゲッティングに好ましい。これらの好ましい標的セグメントを表４に示す。これらの配列はチミン（Ｔ）を含有することが示されているが、しかし、当業者は、チミン（Ｔ）はＲＮＡ配列中では一般にウラシル（Ｕ）により置換されていることを認識するであろう。該配列は、表１に示される好ましいアンチセンス化合物の逆相補物（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を表す。「標的部位」は、該オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の最初（最も５’）のヌクレオチド番号を示す。好ましい標的セグメントのそれぞれが見出された種もまた表４に示す。
本発明のさらなる態様において、第二の一連のアンチセンス化合物を、公表された配列（ＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）受託番号Ｍ１１７２５．１、配列番号４として本明細書に組込まれる）を使用して、ヒトＣ反応性タンパク質ＲＮＡの多様な領域を標的とするように設計した。該化合物を表２に示す。「標的部位」は該化合物が結合する特定の標的配列上の最初（最も５’）のヌクレオチド番号を示す。表２中の全化合物は、５ヌクレオチドの「ウィング」により双方の側（５’および３’の方向）で隣接されている１０個の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成される長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。
該化合物を、公表された配列情報（ＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）受託番号Ｍ１１７２５．１、配列番号４として本明細書に組込まれる）を使用して、ヒトＣ反応性タンパク質にハイブリダイズするように設計したプローブおよびプライマーの第二の組を使用する定量的リアルタイムＰＣＲにより、ヒトＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルに対するそれらの効果について分析した。ヒトＣ反応性タンパク質について、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＧＣＴＴＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＡＡ（配列番号７３）
リバースプライマー：ＴＧＣＧＣＣＡＣＴＡＴＧＴＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣ（配列番号７４）
であり、また、ＰＣＲプローブは：ＦＡＭ−ＴＣＴＧＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＡＡＣＡＡＧＣＡＡＴＧ−ＴＡＭＲＡ（配列番号７５）であり、ここでＦＡＭは蛍光色素でありかつＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。表２に示されるデータは、サイトカインで誘導したＨｅｐ３Ｂ細胞を１５０ｎＭの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した３
回の実験からの平均である。各データ点の陽性対照は配列番号により表中で同定される。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は「データなし」を示す。
Figure 2012029693
Figure 2012029693
Figure 2012029693
Figure 2012029693
表２に示されるとおり、配列番号８５、９５、１１２、１２１、１２２、１２９、１３５、１３６、１３７、１４５、１４７、１４９、１５０、１５４、１５７、１５９、１６１、１６２、１６４、１６６、１６７、１７０、１７１、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８３、１８５、１８６、１９０、１９２、１９３、１９４、１９６、１９７、１９８、１９９、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１４、２１５、２１７、２２０、２２１、２２２、２２４、２２８、２２９、２３４、２３６、２３７、２３８、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４９、２５０、２５２、２５
３および２５５は、このアッセイにおいてヒトＣ反応性タンパク質発現の最低５０％阻害を示し、そして従って好ましい。これらの好ましい配列が相補的である標的領域を本明細書で「好ましい標的セグメント」と称し、そして従って本発明の化合物により標的とされるために好ましい。これらの好ましい標的セグメントを表４に示す。これらの配列はチミン（Ｔ）を含有することが示されるが、しかし、当業者は、チミン（Ｔ）はＲＮＡ配列中で一般にウラシル（Ｕ）により置換されていることを認識するであろう。該配列は、表２に示される好ましいアンチセンス化合物の逆相補物を表す。「標的部位」は、該オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の最初（最も５’）のヌクレオチド番号を示す。好ましい標的セグメントのそれぞれが見出された種もまた表４に示す。
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるラットＣ反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害
本発明により、一連のアンチセンス化合物を、公表された配列（ＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）受託番号Ｍ８３１７６．１、配列番号１１として本明細書に組込まれる）を使用して、ラットＣ反応性タンパク質ＲＮＡの多様な領域を標的とするように設計した。該化合物を表３に示す。「標的部位」は、該化合物が結合する特定の標的核酸上の最初（最も５’）のヌクレオチド番号を示す。表３中の全化合物は、５ヌクレオチドの「ウィング」により双方の側（５’および３’の方向）で隣接されている１０個の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成される、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。該化合物を、本明細書の他の実施例で記述されるところの定量的リアルタイムＰＣＲによりラットＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルに対するそれらの効果について分析した。表３に示されるデータは、初代ラット肝細胞を１５０ｎＭの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した３回の実験からの平均である。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は「データなし」を示す。
Figure 2012029693
表３に示されるとおり、配列番号２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７６、２７７，２７９、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８８および２８９は、この実験においてラットＣ反応性タンパク質発現の最低２５％の阻害を示し、そして従って好ましい。これらの好ましい配列が相補的である標的領域を本明細書で「好ましい標的セグメント」と称し、そして従って本発明の化合物によるターゲッティングに好ましい。これらの好ましい標的セグメントを表４に示す。これらの配列はチミジン（Ｔ）を含有することが示されるが、しかし、当業者は、チミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列中で一般にウラシル（Ｕ）により置換されていることを認識するであろう。該配列は表１、２および３に示される好ましいアンチセンス化合物の逆相補物を表す。「標的部位」は、該オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の最初（最も５’）のヌクレオチド番号を示す。好ましい標的セグメントのそれぞれが見出された種もまた表４に示す。
Figure 2012029693
Figure 2012029693
Figure 2012029693
これらの「好ましい標的セグメント」は、本発明のアンチセンス化合物とのハイブリダイゼーションに利用できかつそれらに到達可能であることが実験により見出されたため、本発明の知識を備えた当業者は、単に慣例の実験を使用して、これらの好ましい標的セグメントに特異的にハイブリダイズしかつ結果としてＣ反応性タンパク質の発現を阻害する他の化合物を包含する本発明のさらなる態様を認識することができるか、若しくは確認することが可能であることができる。
本発明により、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライス体、および標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズする他の短いオリゴマー化合物を包含する。
Ｃ反応性タンパク質のタンパク質レベルのウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析（イムノブロット分析）は標準的方法を使用して実施する。細胞はオリゴヌクレオチド処理の１６〜２０時間後に収集し、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１００μｌ／ウェル）に懸濁し、５分間沸騰させかつ１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷する。ゲルを１５０Ｖで１．５時間泳動し、そしてウエスタンブロッティングのためメンブレンに転写する。一次抗体種に向けられた放射標識若しくは蛍光標識した二次抗体とともに、Ｃ反応性タンパク質に向けられた適切な一次抗体を使用する。バンドをＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使用して可視化する。
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるウサギＣ反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害
本発明により、一連のアンチセンス化合物を、公表された配列（ＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）受託番号Ｍ１３４９７．１、配列番号４３９として本明細書に組込まれる）を使用して、ウサギＣ反応性タンパク質のＲＮＡの多様な領域を標的とするように設計した。該化合物を表５に示す。「標的部位」は、該化合物が結合する特定の標的核酸上の最初（最も５’）のヌクレオチド番号を示す。表５中の全化合物は、５ヌクレオチドの「ウィング」により双方の側（５’および３’の方向）で隣接されている１０個の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成される、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。
該化合物を、本明細書の他の実施例に記述されるところの定量的リアルタイムＰＣＲによりウサギＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルに対するそれらの効果について分析した。ウサギＣ反応性タンパク質に対するプローブおよびプライマーは、公表された配列情報（ＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）受託番号Ｍ１３４９７．１、配列番号４３９として本明細書に組込まれる）を使用して、ウサギＣ反応性タンパク質の配列にハイブリダイズするように設計した。ウサギＣ反応性タンパク質について、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＧＧＣＧＣＧＡＧＣＴＧＡＣＡＴＡＴＣＡ（配列番号４４０）リバースプライマー：ＣＴＴＧＧＣＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＣ（配列番号４４１）であり、また、ＰＣＲプローブは：ＦＡＭ−ＴＡＣＧＴＧＧＴＧＡＡＧＴＡＣＡＴＧＴＣＡＡＧＣＣＣＣＡＧ−ＴＡＭＲＡ（配列番号４４２）であり、ここでＦＡＭは蛍光レポーター色素でありかつＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。ウサギＧＡＰＤＨについて、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＴＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴ（配列番号４４３）
リバースプライマー：ＣＡＣＣＧＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＧＴ（配列番号４４４）であり、また、ＰＣＲプローブは：５’ＪＯＥ−ＴＴＧＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＴＣＴＣＡ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号４４５）であり、ここでＪＯＥは蛍光レポーター色素でありかつＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。表５に示されるデータは、初代
ウサギ肝細胞を１０ｎＭの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した３回の実験からの平均である。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は「データなし」を示す。
Figure 2012029693
Figure 2012029693
Figure 2012029693
表５に示されるとおり、配列番号４９４、４９５、４９８、５０１、５０２、５０３、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４および５３５は、この実験でウサギＣ反応性タンパク質の発現の最低２５％の阻害を示し、そして従って好ましい。
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトＣ反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害：用量応答試験
本発明のさらなる一態様において、５種のオリゴヌクレオチドを付加的な用量応答試験のため選択した。サイトカインで誘導したＨｅｐ３Ｂ細胞を５０、１００および１５０ｎＭのＩＳＩＳ １３３７１２、１３３７１９、１３３７２６、１４０１８０および１４０１７７で処理し、そして、本明細書の他の実施例で記述されるとおりオリゴヌクレオチド処理の２４時間後にｍＲＮＡレベルを測定した。未処理細胞が対照としてはたらいた。
これらの試験の結果を表６に示す。データは２回の実験からの平均であり、そしてサイトカインで誘導した対照の阻害パーセントとして表す。
Figure 2012029693
表６に示されるとおり、ＩＳＩＳ １３３７１２、ＩＳＩＳ １３３７２６およびＩＳＩＳ １４０１８０はヒトＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルの低下で用量依存性の様式で有効であり、そして従って本発明の好ましい化合物である。
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるラットＣ反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害：用量応答試験
本発明のさらなる一態様において、３種のオリゴヌクレオチドを付加的な用量応答試験に選択した。ラット初代肝細胞を５０、１５０および３００ｎＭのＩＳＩＳ １９７１８１、１９７１７８、１９７１８３および１９７１９０で処理した。標的ｍＲＮＡのレベルを、本明細書の他の実施例に記述されるとおりオリゴヌクレオチド処理後２４時間に測定した。未処理の細胞が対照としてはたらいた。
これらの試験の結果を表７に示す。データは３回の実験からの平均であり、そして対照の阻害パーセントとして表す。
Figure 2012029693
表７に示されるとおり、ＩＳＩＳ １９７１８１、ＩＳＩＳ １９７１７８、ＩＳＩＳ
１９７１８３およびＩＳＩＳ １９７１９０は、ラットＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルの低下で用量依存性の様式で有効であり、そして従って本発明の好ましい化合物である。
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるラットＣ反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害：ｉｎ ｖｉｖｏ用量応答試験
本発明のさらなる一態様において、３種のオリゴヌクレオチドを付加的なｉｎ ｖｉｖｏ用量応答試験に選択した。３月齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットが、生理的食塩水または１、１０若しくは２５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ １９７１７８（配列番号２７５）、ＩＳＩＳ １９７１８３（配列番号２８０）およびＩＳＩＳ １９７１９０（配列番号２８７）の皮下注入を週２回２週間受領した。処置期間の終了時に動物を殺し、そして肝の標的ｍＲＮＡレベルを本明細書の他の実施例に記述されるところのリアルタイムＰＣＲにより測定した。生理的食塩水で処置した動物が対照としてはたらいた。ラット肝のＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルは、ＩＳＩＳ １９７１７８の１回の１ｍｇ／ｋｇ投与後に５％、また、ＩＳＩＳ １９７１９０の１回の１０ｍｇ／ｋｇ投与後に１８％低下した。
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるウサギＣ反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害：用量応答試験
本発明のさらなる一態様において、４種のオリゴヌクレオチドを付加的な用量応答試験に選択した。ウサギ初代肝細胞を１０、５０ １５０および３００ｎＭのＩＳＩＳ ２８０２７９、２８０２９０、２８０２９８および２８２３０３で処理した。本明細書の他の実施例で記述されるとおり、オリゴヌクレオチド処理の２４時間後にｍＲＮＡレベルを測定した。未処理の細胞が対照としてはたらいた。
これらの試験の結果を表８に示す。データは２回の実験からの平均であり、そして対照の阻害パーセントとして表す。
Figure 2012029693
表８に示されるとおり、ＩＳＩＳ ２８０３０３およびＩＳＩＳ ２８０２９０は、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルの低下で用量依存性の様式で有効であり、そして従って本発明の好ましい化合物である。
カニクイザルの肝組織中でのＣ反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害（ＩＳＩＳ １３３７２６）
さらなる一態様において、雄性カニクイザルをＩＳＩＳ １３３７２６（配列番号３６）で処置し、そしてＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡのレベルを肝組織中で測定した。
雄性カニクイザルを２処置群すなわち対照動物（ｎ＝４；生理的食塩水処置のみ）および処置動物（ｎ＝８；ＩＳＩＳ １３３７２６で処置）に分割した。処置群の動物にはそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ １３３７２６を皮下に週２回４週間投与した。対照群の動物は生理的食塩水のみで処置した。３日後に全動物を殺し、そしてＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡの分析のため肝を採取した。ｍＲＮＡのレベルは生理的食塩水で処置した動物のものに正規化した。１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ １３３７２６で処置した動物において、肝内のＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルはそれぞれ４２％および６９％低下した。
肝酵素ＡＬＴおよびＡＳＴのレベルを毎週測定し、そして変化は示されず、オリゴヌクレオチド処置の進行中の毒性効果がないことを示す。
本試験の結果は、ＩＳＩＳ １３３７２６での処置に際しての肝のＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡの有意の低下を示す。
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスＣ反応性タンパク質発現の調節
本発明により、一連のアンチセンス化合物を、公表された配列（ＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）受託番号ＮＭ＿００７７６８．１、配列番号５４０として本明細書に組込まれる）を使用して、マウスＣ反応性タンパク質ＲＮＡの多様な領域を標的とするように設計した。該化合物を表９に示す。「標的部位」は、該化合物が結合する特定の標的核酸上の最初（最も５’）のヌクレオチド番号を示す。表９中の全化合物が、５ヌクレオチドの「ウィング」により双方の側（５’および３’の方向）で隣接されている１０個の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成される、長さ２０ヌクレオチドのキメ
ラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。
該化合物を、本明細書の他の実施例に記述されるところの定量的リアルタイムＰＣＲにより、マウスＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルに対するそれらの効果について分析した。マウスＣ反応性タンパク質に対するプローブおよびプライマーは、公表された配列情報（ＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）受託番号ＮＭ＿００７７６８．１、配列番号５４０として本明細書に組込まれる）を使用して、マウスＣ反応性タンパク質配列にハイブリダイズするように設計した。マウスＣ反応性タンパク質について、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＡ（配列番号５４１）リバースプライマー：ＧＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＧＴＧ（配列番号５４２）であり、また、ＰＣＲプローブは：ＦＡＭ−ＴＧＣＧＧＡＡＡＡＧＴＣＴＧＣＡＣＡＡＧＧＧＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号５４３）であり、ここでＦＡＭは蛍光レポーター色素でありかつＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。マウスＧＡＰＤＨについて、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＧＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＧＴ（配列番号５４４）リバースプライマー：ＧＧＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴ（配列番号５４５）であり、また、ＰＣＲプローブは：５’ＪＯＥ−ＡＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号５４６）であり、ここでＪＯＥは蛍光レポーター色素でありかつＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。表９に示されるデータは、初代マウス肝細胞を１５０ｎＭの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した１回の実験からである。該データは対照の未処理細胞に関する発現パーセントとして提示する。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は「データなし」を示す。
Figure 2012029693
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２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスＣ反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害：用量応答試験
本発明のさらなる一態様において、７種のオリゴヌクレオチドを付加的な用量応答試験に選択した。初代マウス肝細胞を１０、５０ １５０および３００ｎＭのＩＳＩＳ １３３６８８、１３３６９７、１３３７０２、１３３７０８、１４７８８０、１４７８６８、１４７８８３で処理した。ｍＲＮＡレベルは本明細書の他の実施例で記述されるとおりオリゴヌクレオチド処理の２４時間後に測定した。未処理の細胞が対照としてはたらいた。
これらの試験の結果を表１０に示す。データは３回の実験からの平均であり、そして対照の阻害パーセントとして表す。
Figure 2012029693
表１０に示されるとおり、ＩＳＩＳ １１３６９７および１４７８６８はＣ反応性タンパク質発現を用量依存性の様式で阻害した。
ｉｎ ｖｉｖｏでのウサギＣ反応性タンパク質のアンチセンス阻害
本発明のさらなる一態様において、ＩＳＩＳ ２８０３０３（配列番号５３３）をウサ
ギでのＣ反応性タンパク質に対するその効果について試験した。雄性ニュージーランドホワイトラビットは通常飼料を給餌され、そして２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ２８０３０３の皮下注入を週２回３週間受領した。生理的食塩水を注入した動物が対照としてはたらいた。オリゴヌクレオチドおよび生理的食塩水注入群はそれぞれ４動物を包含した。処置期間の終了時に動物を殺し、そしてＲＮＡ抽出のため肝を単離した。肝でのＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルを、本明細書の他の実施例により記述されるところのリアルタイムＰＣＲにより測定した。生理的食塩水対照に関して、ＩＳＩＳ ２８０３０３はＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡ発現を５２％阻害した。
アテローム硬化性斑形成の研究のためのウサギモデル
ワタナベ遺伝性高脂血症（ＷＨＨＬ）系統のウサギがアテローム硬化性斑形成のモデルとして使用されている。高脂肪飼料を給餌したニュージーランドホワイトラビットもまたアテローム硬化性斑形成のモデルとして使用されている。ＷＨＨＬ若しくは高脂肪飼料を給餌したニュージーランドホワイトラビットのＣ反応性タンパク質アンチセンス化合物での処置を、アテローム硬化性斑疾患の治療的若しくは予防的処置としてのそれらの可能性を試験するのに使用する。ウサギに、５、１０、２９若しくは５０ｍｇ／ｋｇのＣ反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを注入する。生理的食塩水単独若しくは対照オリゴヌクレオチドで処置した動物が対照としてはたらく。処置の間、血清サンプルを収集し、そしてコレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＶＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドを包含する血清脂質について、慣例の臨床分析により評価する。肝組織のトリグリセリド含量はトリグリセリドＧＰＯアッセイ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を使用して測定する。肝、腎、心、大動脈および他の組織を獲得し、そして慣例の手順を使用して組織学的分析のため処理する。肝および腎組織を好塩基性顆粒および炎症浸潤の証拠について検査する。大動脈は、アテローム硬化を可視化するため、慣例の手順を使用してズダンＩＶのような色素で染色する。大動脈組織はまた、慣例の組織学的手順を使用してパラフィンに埋込みかつ切片に切断し、そして該切片を内膜病変の存在について評価する。
アテローム硬化性斑形成のマウスモデル：ＬＤＬ受容体遺伝子を欠くヒトＣ反応性タンパク質トランスジェニックマウス
ＬＤＬ受容体はＣ反応性タンパク質を含有するＬＤＬ粒子の消失の原因である。ＬＤＬ受容体なしでは、動物はＣ反応性タンパク質を含有するＬＤＬ粒子を血漿から効果的に消失し得ず、従ってＣ反応性タンパク質およびＬＤＬコレステロールの血清濃度が顕著に上昇する。ヒトＣ反応性タンパク質導入遺伝子を発現するマウス（ＴｇＮ−ｈＡｐｏＢ ＋／＋）およびＬＤＬ受容体について欠損のマウス（ＬＤＬｒ −／−）は双方ともアテローム硬化性斑発生の動物モデルとして使用されている。ＬＤＬ受容体欠損の遺伝子型がヒトＣ反応性タンパク質トランスジェニックの遺伝子型と組合される場合（ＴｇＮ−ｈＡｐｏＢ ＋／＋；ＬＤＬｒ −／−）にアテローム硬化性斑が迅速に発生する。本発明により、この遺伝的背景のマウスを使用して、アテローム硬化症および斑形成を予防する化合物の能力を検討する。
雄性ＴｇＮ−ｈＡｐｏＢ ＋／＋；ＬＤＬｒ −／−マウスを、１０若しくは２０ｍｇ／ｋｇのＣ反応性タンパク質アンチセンスオリゴヌクレオチドで週２回１２週間処置する。対照群は生理的食塩水若しくは対照オリゴヌクレオチドで処置する。血清総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロールおよびトリグリセリドを、Ｏｌｙｍｐｕｓ臨床検査装置（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州メルビル）を使用する慣例の臨床分析により２、４、６、８および１２週に測定する。肝中のマウスアポリポタンパク質ｍＲＮＡを１２週に測定する。
加えて、１２週試験で使用した処置条件を用い、４か月試験をＴｇＮ−ｈＡｐｏＢ ＋／＋；ＬＤＬｒ −／−マウスで実施する。マウスはＣ反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドで４か月間処置して、アテローム硬化性斑の形成を予防するこうした化合物の能力を評価する。血清総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロールおよびトリグリセリドを、Ｏｌｙｍｐｕｓ臨床検査装置（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州メルビル）を使用する慣例の臨床分析により２、４、６、８、１２および１６週に測定する。肝中のマウスＣ反応性タンパク質ｍＲＮＡを１６週にリアルタイムＰＣＲにより測定する。４か月の処置期間の終了時に、追加の処置マウスを麻酔しかつ１０％ホルマリンで灌流する。灌流した動脈樹枝状分岐を単離し、そしてアテローム硬化性斑の存在について検査する。動脈樹枝状分岐の切片をパラフィンに埋込みかつ慣例の方法を使用する組織学的分析のため調製する。
アテローム硬化性斑形成のマウスモデル：Ｂ６．１２９Ｐ−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃノックアウトマウス
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メーン州バーハーバー）から得たＢ６．１２９Ｐ−ＡｐｏＥｔｍ１Ｕｎｃノックアウトマウス（本明細書でＡｐｏＥノックアウトマウスと称する）は、Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ突然変異についてホモ接合性であり、そして齢若しくは性により影響を受けない総血漿コレステロール濃度の顕著な増大を示す。これらの動物は３月齢で近位大動脈中に脂肪線条を提示する。これらの病変は齢とともに増大しかつより少ない脂質しかしより細長い細胞を伴う病変（前アテローム硬化性病変のより進行した段階に典型的）に進行する。
これらのマウスにおける突然変異はアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子に存する。ＡｐｏＥタンパク質の主な役割はコレステロールおよびトリグリセリドを身体中に輸送することである。それはリポタンパク質構造を安定化し、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）および関連タンパク質に結合し、そしてＨＤＬの１サブクラスに存在してそれらにＬＤＬＲに結合する能力を提供する。ＡｐｏＥは肝および脳中で最も豊富に発現されている。雌性Ｂ６．１２９Ｐ−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃノックアウトマウス（ＡｐｏＥノックアウトマウス）を以下の試験で使用して、アテローム硬化性斑形成を予防するための潜在的化合物としてＣ反応性タンパク質アンチセンスオリゴヌクレオチドを評価した。
雌性ＡｐｏＥノックアウトマウスは齢が５から７週までの範囲にわたり、そして試験開始前２週間、通常飼料を与える。ＡｐｏＥノックアウトマウスにその後、０．１５％の追加したコレステロールを含む６０％脂肪飼料を任意に摂取させて脂質代謝異常および肥満を誘発させる。対照動物は、追加したコレステロールを含まない高脂肪飼料で維持する。一夜絶食後に各群からのマウスに５、２５若しくは５０ｍｇ／ｋｇのＣ反応性タンパク質を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドを３日ごとに６週間腹腔内に投与する。対照群は対照オリゴヌクレオチドを注入する動物および生理的食塩水を注入する動物よりなる。
処置期間中および終了時に、血糖値、コレステロール（総コレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロール）、トリグリセリドならびに肝酵素レベルをＯｌｙｍｐｕｓ臨床検査装置（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州メルビル）を使用する慣例の臨床分析により測定する。試験終了時および最終注入４８時間後に動物を殺し、そしてリアルタイムＰＣＲにより肝中の標的ｍＲＮＡレベルについて評価する。処置期間の終了時に、追加の処置マウスを麻酔しかつ１０％ホルマリンで灌流する。灌流した動脈樹枝状分岐を単離しかつアテローム硬化性斑の存在について検査する。動脈樹枝状分岐の切片はパラフィンに埋込みかつ慣例の方法を使用する組織学的分析の
ため調製する。
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡ発現のアンチセンス阻害：用量応答試験
さらなる一態様において、４種のオリゴヌクレオチドを付加的な用量応答試験に選択した。本明細書に記述されるとおり培養した、サイトカインで誘導したＨｅｐ３Ｂ細胞を、２５、５０、７５および１５０ｎＭのＩＳＩＳ ３２９９５６（配列番号１４９）、ＩＳＩＳ ３３００１２（配列番号２０５）、ＩＳＩＳ ３３００３１（配列番号２２４）およびＩＳＩＳ １３３７２６（配列番号３６）で処理した。オリゴヌクレオチド処理の２４時間後に、ヒトＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルを、本明細書に記述されるところのリアルタイムＰＣＲを使用して定量した。ＩＳＩＳ １１３５２９（ＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＡ；配列番号５９７として本明細書に組込まれる）はＣ反応性タンパク質を標的とせず、そして対照としてはたらいた。細胞を１５０および３００ｎＭのＩＳＩＳ １１３５２９で処理した。ＩＳＩＳ １１３５２９は、５ヌクレオチドの「ウィング」により双方の側（５’および３’の方向）で隣接されている１０個の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成される、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。
Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡ発現のレベルは、オリゴヌクレオチドで処理されなかったサイトカインで誘導した細胞（誘導）およびサイトカイン処理もオリゴヌクレオチド処理も受領しない細胞（基礎）でもまた測定した。
この用量応答試験の結果を表１１に示す。データは３回の実験からの平均である。結果は、サイトカインで誘導した細胞からのＣ反応性タンパク質ｍＲＮＡの発現に対して正規化した。基礎のＣ反応性タンパク質ｍＲＮＡはサイトカインで誘導した発現の１１％であった。１５０および３００ｎＭのＩＳＩＳ １１３５２９で処理した細胞は、サイトカインで誘導したレベルのそれぞれ７６および８４％のＣ反応性タンパク質ｍＲＮＡを発現した。
Figure 2012029693
これらのデータは、ＩＳＩＳ ３２９９５６、ＩＳＩＳ ３３００１２、ＩＳＩＳ ３３００３１およびＩＳＩＳ １３３７２６が、サイトカインで誘導したＨｅｐ３Ｂ細胞におけるヒトＣ反応性タンパク質の発現を用量依存性の様式で阻害したことを示す。
Ｈｅｐ３Ｂ細胞によるヒトＣ反応性タンパク質の分泌のアンチセンス阻害：用量応答試験
本発明のさらなる一態様において、４種のオリゴヌクレオチドを、サイトカインで誘導したＨｅｐ３Ｂ細胞からのＣ反応性タンパク質の分泌に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド処理の効果を測定するための付加的な用量応答試験に選択した。本明細書に記述されるとおり培養した、サイトカインで誘導したＨｅｐ３Ｂ細胞を、１５０および３００ｎＭのＩＳＩＳ ３２９９５６（配列番号１４９）、ＩＳＩＳ ３３００１２（配列番号２０５）、ＩＳＩＳ ３３００３１（配列番号２２４）およびＩＳＩＳ １３３７２６（配列番号３６）で処理した。細胞を１５０および３００ｎＭの対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １１３５２９（配列番号５９７）で処理した。オリゴヌクレオチド処理の２４時間後に、サイトカインで誘導したＨｅｐ３Ｂ細胞から培地中に分泌されたヒトＣ反応性タンパク質を、商業的に入手可能なキット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ Ｉｎｃ．、メーン州ポートランド）を使用するＥＬＩＳＡにより測定した。Ｃ反応性タンパク質分泌は、オリゴヌクレオチドで処理しなかったサイトカインで誘導した細胞（誘導）およびサイトカイン処理もオリゴヌクレオチド処理も受領しなかった細胞（基礎）でもまた測定した。
この用量応答試験の結果を表１２に示す。データは３回の実験からの平均である。結果は、サイトカインで誘導した細胞から分泌されたＣ反応性タンパク質レベルに対し正規化した。培地中の基礎Ｃ反応性タンパク質レベルは、サイトカインで誘導したレベルの８％であった。
Figure 2012029693
これらのデータは、ＩＳＩＳ ３２９９５６、ＩＳＩＳ ３３００１２およびＩＳＩＳ
１３３７２６が、サイトカインで誘導したＨｅｐ３Ｂ細胞からのＣ反応性タンパク質の分泌を用量依存性の様式で阻害したことを示す。ＩＳＩＳ ３３００３１はより低用量のオリゴヌクレオチドでＣ反応性タンパク質の分泌を阻害した。対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １１３５２９はＣ反応性タンパク質の分泌を阻害しなかった。
多様な２’−デオキシギャップおよび多様な２’−ＭＯＥウィングを有するＣ反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
さらなる一態様において、Ｃ反応性タンパク質を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、配列番号３６および２０５のヌクレオチド配列を使用しかつ多様なギャップおよびウィングセグメント長さを使用して設計した。該化合物を表１３に示す。「標的部位」は、該化合物が結合する特定の標的配列上の最初（最も５’）のヌクレオチド番号を示す。表１３中の全化合物は長さが１６から２０ヌクレオチドまでの範囲にわたるキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。「ギャップ」領域は、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される「ウィング」により一方若しくは双方の側（５’および３’の方向）で隣接されている２’−デオキシヌクレオチドよりなる。２’−デオキシギャップの長さは１０から１８ヌクレオチドまで変動し、また、２’−ＭＯＥウィングの長さは１から５ヌクレオチドまで変動する。各オリゴヌクレオチドの正確な構造を表１３に「配置」として明示する。例えば３〜１４〜３の明示は、最初（最も５’）の３ヌクレオチドおよび最後（最も３’）の３ヌクレオチドが２’−ＭＯＥヌクレオチドでありかつギャップ中の１４ヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチドであることを示す。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。
Figure 2012029693
付加的なオリゴヌクレオチドを、配列番号３６および２０５のヌクレオチド配列を使用しかつ均一に修飾したヌクレオチドを組込んで設計した。ＩＳＩＳ ３５３４８９および
ＩＳＩＳ ３５３４７３（それぞれ配列番号３６および２０５として本明細書に組込まれる配列）は、配列番号４のそれぞれ標的部位１６７１および１７１９にハイブリダイズする。これら２化合物は、均一に、該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートヌクレオシド間結合を伴う２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。全部のシトシンは５−メチルシトシンである。
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの１サブセットを、サイトカインで誘導したＨｅｐ３Ｂ細胞での試験に選択した。試験した全部のオリゴヌクレオチドは、配列番号２０５として本明細書で表される同一のヌクレオチド配列を共有し、かつ、糖部分の修飾に関して変動している。細胞を本明細書に記述されるとおり培養かつ誘導し、そしてその後、５０、１００および２００ｎＭのＩＳＩＳ ３５３４７０、ＩＳＩＳ ３５３５１２、ＩＳＩＳ ３５３４７２、ＩＳＩＳ ３５３４７３およびＩＳＩＳ ３３００１２で２４時間処理した。サイトカインで誘導した細胞が対照としてはたらき、それに対してデータを正規化した。Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡは本明細書に記述されるところのリアルタイムＰＣＲにより測定した。表１４に示されるデータは３回の実験の平均を表し、そしてサイトカイン処理のみを受領する細胞からのデータに対して正規化されている。ギャップマーについて、各オリゴヌクレオチドの配置を表１３について記述されたと同一の様式で示す。均一に２’−ＭＯＥヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドは「均一２’−ＭＯＥ」により示す。
Figure 2012029693
付加的なオリゴヌクレオチドを、配列番号３６および２０５のヌクレオチド配列を使用しかつ化合物中に異なるヌクレオシド間結合を使用して設計した。ＩＳＩＳ ３５３５１４およびＩＳＩＳ ３５３５１５（それぞれ配列番号３６および２０５として本明細書に組込まれる配列）は配列番号４のそれぞれ標的部位１６７１および１７１９にハイブリダイズする。これら２化合物は、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される３ヌクレオチドのウィングセグメントにより双方の側（５’および３’）で隣接されている２’−デオキシヌクレオチドから構成される１４ヌクレオチドのギャップセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドである。ヌクレオチド２と３との間、およびヌクレオチド１８と１９との間のヌクレオシド間結合はホスホジエステルである。該化合物中の全部の他のヌクレオシド結合はホスホルチオエートである。全部のシトシンは５−メチルシトシンである。
付加的なオリゴヌクレオチドを、ヒトＣ反応性タンパク質の公的に入手可能な配列（配列番号４として本明細書に組込まれる）を使用して設計した。該化合物を表１５に示す。
「標的部位」は、該化合物が結合する特定の標的配列上の最初（最も５’）のヌクレオチド番号を示す。これらの化合物は、「ギャップ」セグメントがオリゴマー化合物の３’若しくは５’いずれかの末端に配置されかつ２’−デオキシヌクレオチドよりなる、長さ１５ヌクレオチドのヘミマーすなわち「開放端」型の化合物である。残存するセグメントは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。各オリゴヌクレオチドの正確な構造は表１５中に「配置」として明示する。例えば５〜１０という明示は、第一の化学修飾の５ヌクレオチドセグメントが５’末端にありかつ第二の化学修飾の１０ヌクレオチドセグメントが３’末端にあることを示す。２’−ＭＯＥ〜２’−デオキシという明示は、５’末端が２’−ＭＯＥヌクレオチドから構成されかつ３’末端が２’−デオキシヌクレオチドから構成されることを示し；２’−ＭＯＥヌクレオチドはさらに太字で示す。存在する場合、「Ｏ」はヌクレオシド間（バックボーン）結合がホスホジエステルであることを示す。全部の他のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。
Figure 2012029693
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトＣ反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害：用量応答試験
さらなる一態様において、ヒトＣ反応性タンパク質を標的とするオリゴヌクレオチドを付加的な用量応答試験に選択した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後に、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡおよび分泌されたタンパク質を、本明細書に記述されるとおり培養しかつＨｅｐ３Ｂ細胞について本明細書に記述されるとおりサイトカインで誘導した初代ヒト肝細胞で測定した。
初代ヒト肝細胞を、１２．５、２５、５０、１００および２００ｎＭのＩＳＩＳ ３３００１２（配列番号２０５）およびＩＳＩＳ １３３７２６（配列番号３６）で処理した。オリゴヌクレオチド処理を受領しなかった、サイトカインで誘導した細胞が対照としてはたらき、全部のデータをそれに対して正規化した。いずれもＣ反応性タンパク質を標的としない、ＩＳＩＳ １３６５０（ＴＣＣＣＧＣＣＴＧＴＧＡＣＡＴＧＣＡＴＴ、配列番号６１４）およびＩＳＩＳ １１３５２９（配列番号５９７）が対照オリゴヌクレオチドとしてはたらいた。細胞を１００および２００ｎＭのＩＳＩＳ １１３５２９およびＩＳＩＳ １３６５０で処理した。ＩＳＩＳ １３６５０は、５ヌクレオチドの「ウィング」により双方の側（５’および３’方向）で隣接されている１０個の２’−デオキシヌクレ
オチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成される、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。
Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルを、オリゴヌクレオチド処理の２４時間後に、本明細書の他の実施例に記述されるところのリアルタイムＰＣＲにより測定した。これらの試験の結果を表１６に示す。データは３回の実験からの平均であり、そしてサイトカインで誘導した細胞からのデータに関するｍＲＮＡ発現のパーセントとして表す。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は測定されなかったことを示す。
Figure 2012029693
表１６に示されるとおり、２５、５０、１００および２００ｎＭの用量のＩＳＩＳ ３３００１２および１３３７２６は、オリゴヌクレオチド処理の２４時間後にＣ反応性ｍＲＮＡの発現を用量依存性の様式で阻害した。
さらなる一態様において、表１６に提示される同一の実験で、サイトカインで誘導した初代ヒト肝細胞から組織培地中に分泌されたＣ反応性タンパク質を、オリゴヌクレオチド処理の２４時間後に商業的に入手可能なキット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ Ｉｎｃ．、メーン州ポートランド）を使用するＥＬＩＳＡにより測定した。表１７に示されるデータは３回の実験からの平均であり、そして、サイトカインで誘導した対照に関する分泌されたタンパク質のパーセントとして表す。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は測定されなかったことを示す。
Figure 2012029693
表１７に示されるとおり、ＩＳＩＳ ３３００１２はオリゴヌクレオチド処理の２４時間後のＣ反応性タンパク質の分泌を阻害した。
さらなる一態様において、サイトカインで誘導した初代ヒト肝細胞中でのＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルを、オリゴヌクレオチド処理の４８時間後に測定した。細胞を１２．５、２５、５０、１００および２００ｎＭのＩＳＩＳ ３３００１２およびＩＳＩＳ
１３３７２６で処理した。ＩＳＩＳ １３６５０およびＩＳＩＳ １１３５２９が対照オリゴヌクレオチドとしてはたらいた。細胞は１００および２００ｎＭのＩＳＩＳ １１３５２９およびＩＳＩＳ １３６５０で処理した。表１８に示されるデータは３回の実験からの平均であり、そしてサイトカインで誘導した対照細胞に関するｍＲＮＡ発現のパーセントとして表す。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は測定されなかったことを示す。
Figure 2012029693
表１８に示されるとおり、ＩＳＩＳ ３３００１２および１３３７２６は、オリゴヌクレオチド処理の４８時間後にＣ反応性ｍＲＮＡ発現を用量依存性の様式で阻害した。
さらなる一態様において、４８時間のＩＳＩＳ ３３００１２およびＩＳＩＳ １３３７２６での処理を反復し、そしてＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡおよびタンパク質双方を
測定した。Ｃ反応性タンパク質はオリゴヌクレオチド処理の４８時間後にリアルタイムＰＣＲにより測定した。表１９に示されるデータは３回の実験からの平均であり、そしてサイトカインで誘導した対照細胞に関するｍＲＮＡ発現のパーセントとして表す。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は測定されなかったことを示す。
Figure 2012029693
表１９に示されるとおり、ＩＳＩＳ ３３００１２および１３３７２６は、オリゴヌクレオチド処理の４８時間後にＣ反応性ｍＲＮＡ発現を用量依存性の様式で阻害した。
さらなる一態様において、表１９に提示される同一の実験で、サイトカインで誘導した初代ヒト肝細胞から組織培地中に分泌されたＣ反応性タンパク質を、オリゴヌクレオチド処理の４８時間後に商業的に入手可能なキット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ Ｉｎｃ．、メーン州ポートランド）を使用するＥＬＩＳＡにより測定した。表２０に示されるデータは３回の実験からの平均であり、かつ、サイトカインで誘導した対照に関する分泌されたタンパク質のパーセントとして表す。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は測定されなかったことを示す。
Figure 2012029693
表２０に示されるとおり、ＩＳＩＳ ３３００１２および１３３７２６は、オリゴヌクレオチド処理の４８時間後のＣ反応性タンパク質の発現を用量依存性の様式で阻害した。２００ｎＭの用量で、ＩＳＩＳ １３３７２６およびＩＳＩＳ ３３００１２は、サイトカインで誘導した細胞中でのＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡを、基礎発現レベル、すなわちサイトカインで誘導されていない細胞で観察されるレベルより下のレベルに低下させることが可能であった。ノーザンおよびイムノブロット分析もまた、オリゴヌクレオチド処理の４８時間後のＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現の低下を確認した。
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）Ｃ反応性タンパク質ｍＲＮＡの配列決定
本発明により、当該技術分野で入手可能でないカニクイザルのＣ反応性タンパク質ｍＲＮＡの一部分を増幅かつ配列決定した。ヒトＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）受託番号Ｍ１１７２５．１、配列番号４として本明細書に組込まれる）の位置５３７ないし２２０１は、ＩＳＩＳ １３３７２６およびＩＳＩＳ ３３００１２がハイブリダイズする標的セグメントを含有する。カニクイザルＣ反応性タンパク質ｍＲＮＡの対応するセグメントを、ヒト配列に対して設計した１連の８組のプライマーを使用して増幅かつ配列決定した。全ＲＮＡをカニクイザル初代肝細胞（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）から精製した。逆転写を実施してｃＤＮＡを生じさせ、そして次いでおよそ４０回のＰＣＲ増幅を実施した。カニクイザルフラグメントのゲル精製後に、ＲＥＴＲＯＧＥＮＴＭキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して各生成物のフォワードおよびリバース配列決定反応を実施した。このキットを使用して一本鎖ｃＤＮＡを創製し、そしてＡＭＰＬＩＴＡＱＴＭ ＰＣＲ反応のための試薬を提供した。配列決定した生成物を集成して、カニクイザルＣ反応性タンパク質ｍＲＮＡをほぼ完成した。このカニクイザル配列は配列番号６１５として本明細書に組込まれ、そしてヒトＣ反応性タンパク質ｍＲＮＡの位置５３７ないし２２０１に９３％相同である。位置１０１−２９０からのヒトＣ反応性タンパク質と９７％の相同性を共有する付加的な一配列を配列番号６１６として本明細書に組込む。
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドによるカニクイザルＣ反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害：用量応答試験
さらなる一態様において、ヒトＣ反応性タンパク質を標的とするオリゴヌクレオチドを、追加の用量応答試験のため選択したを初代カニクイザル肝細胞中で標的ｍＲＮＡを阻害するそれらの能力について試験した。ヒトおよびカニクイザルのＣ反応性タンパク質の間の高程度の同一性により、ＩＳＩＳ １３３７２６（配列番号３６）およびＩＳＩＳ ３３００１２（配列番号２０５）は、本明細書に開示されるカニクイザルｍＲＮＡ（配列番号６１５）のそれぞれ標的部位１１４７および１１９５でカニクイザルＣ反応性タンパク質に完全な相補性を伴いハイブリダイズする。初代カニクイザル肝細胞を、Ｈｅｐ３Ｂ細胞について本明細書に記述されるとおりサイトカインで誘導し、そして５０、１００および２００ｎＭのＩＳＩＳ ３３００１２（配列番号２０５）およびＩＳＩＳ １３３７２６（配列番号３６）で処理した。ＩＳＩＳ １１３５２９（配列番号５９７）が対照オリゴヌクレオチドとしてはたらいた。細胞は１５０および３００ｎＭのＩＳＩＳ １１３５２９で処理した。
Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡレベルをオリゴヌクレオチド処理の２４時間後に測定した。表２１に示されるデータは３回の実験からの平均であり、そしてサイトカインで誘導した対照に関するｍＲＮＡ発現のパーセントとして表す。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は測定されなかったことを示す。
Figure 2012029693
表２１に示されるとおり、ＩＳＩＳ ３３００１２（試験した全用量）ならびにＩＳＩＳ １３３７２６（１５０および３００ｎＭで）は、オリゴヌクレオチド処理の２４時間後にＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡ発現を用量依存性の様式で阻害した。
さらなる一態様において、表２１に提示される同一の実験で、サイトカインで誘導した初代カニクイザル肝細胞から組織培地中に分泌されたＣ反応性タンパク質を、オリゴヌクレオチド処理の２４時間後に商業的に入手可能なキット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ Ｉｎｃ．、メーン州ポートランド）を使用するＥＬＩＳＡにより測定した。表２２に示されるデータは３回の実験からの平均であり、そしてサイトカインで誘導した対照細胞に関する分泌されたタンパク質のパーセントとして表す。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は測定されなかったことを示す。
Figure 2012029693
表２２に示されるとおり、ＩＳＩＳ ３３００１２および１３３７２６は、オリゴヌクレオチド処理の４８時間後のＣ反応性タンパク質の分泌を用量依存性の様式で阻害した。
これらのデータは、ＩＳＩＳ １３３７２６およびＩＳＩＳ ３３００１２が、ヒトＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡ発現を標的とするよう設計されている一方で、カニクイザル初代肝細胞中でのＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡおよび分泌型タンパク質双方を阻害することが可能であり、そして従ってｉｎ ｖｉｖｏでカニクイザルＣ反応性タンパク質の阻害を試験するのに使用し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを示す。
ｉｎ ｖｉｖｏでのＣ反応性タンパク質のアンチセンス阻害：カニクイザル
カニクイザル（雄性若しくは雌性）は、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡ若しくはタンパク質レベルを低下させるそれらの潜在能力、ならびに、限定されるものでないが心血管系指標、アテローム硬化症、脂質疾患、肥満および斑形成を挙げることができるＣ反応性タンパク質と関連する表現型のエンドポイントについてアンチセンスオリゴヌクレオチドを評価するのに有用である。一試験は、脂質およびコレステロールが正常であるか若しくは高い飼料を給餌された、正常および誘発された高コレステロール血症のサルを包含する。該試験期間中に観察するパラメータは：総血漿コレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリド、動脈壁のコレステロール含量および冠動脈内膜肥厚を包含する。
さらなる一態様において、アテローム発生性飼料を給餌したカニクイザルは、ヒトのアテローム硬化症に対する多くの類似点を伴うアテローム硬化症を発症し、そしてアテローム硬化症を予防若しくは改善するアンチセンス化合物の潜在能力を評価するのに使用される。雌性カニクイザルはリポタンパク質および心血管系でいくつかの類似点をヒトと共有している。これらの特徴に加え、生殖生物学の類似点が存在する。カニクイザルのメスはヒトのものに類似の２８日の月経周期を有する。血漿ホルモン濃度がカニクイザルの月経周期を通じて測定されており、また、卵胞期および黄体期の持続期間、ならびに周期にわたる血漿エストラジオールおよびプロテステロン濃度もまた女性のものに著しく類似している。
Ｃ反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、カニクイザルで
有効性および毒性について評価する。これらの試験のため選んだオリゴヌクレオチドは、ヒトおよびサル双方のＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡの３’ＵＴＲの２個の別個の領域にハイブリダイズする。ＩＳＩＳ １３３７２６（配列番号３６）およびＩＳＩＳ ３３００１２（配列番号２０５）は、本明細書に記述されるところの５〜１０〜５の配置をもつキメラオリゴヌクレオチドである。ＩＳＩＳ ３５３５１２（配列番号３６）およびＩＳＩＳ ３５３４９１（配列番号２０５）は、それぞれ本明細書に記述されるところの３〜１４〜３の配置をもつ同一のキメラオリゴヌクレオチドである。カニクイザルは表２３に記述されるとおり処置する。表２３に提示される９群のそれぞれは５動物よりなり、そしてこれらの群のそれぞれ中の雄性および雌性の数は同一である。
Figure 2012029693
全動物に、試験第１、３、５、８、１１、１５、１８、２２、２５および２９日に皮下注入を介して投与する。投与の第一日を第１日と指定する。動物は全般的外観および挙動、飼料消費量ならびに体重の変化について評価する。血液サンプルは、試験の開始前に１、２および３週間隔で、第１日および第２９日の投与直前、ならびに投与後１、２、４および２４時間、ならびに第８、１５および２２日の投与直前に収集する。血液サンプルは血清化学、血液学、凝固および尿分析パラメータを包含する臨床病理学評価にかける。分析される血清化学パラメータは、ナトリウム、カリウム、塩素、二酸化炭素、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、カルシウム、リン、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、総蛋白、アルブミン、グロブリン、アルブミン／グロブリン比、血糖値、コレステロールおよびトリグリセリドを包含する。血液学パラメータは、赤血球（ＲＢＣ）数、白血球（ＷＢＣ）数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、網状赤血球数、プラスモディウム数、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、血小板数および血球形態学を包含する。評価される凝固パラメータは、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）およびプロトロンジン時間（ＰＴ）を包含する。評価される尿分析パラメータは、色、特徴、ｐＨ、比重、白血球エステラーゼ、亜硝酸塩、ウロビリノーゲン、尿蛋白、尿糖、ケトン、ビリルビン、潜血および顕微鏡検査を包含する。血清中のＣ反応性タンパク質は免疫化学発光アッセイ（ＩＣＭＡ）を使用して測定する。全部の臨床パラメータは当該技術分野で既知の慣例の手順を使用して測定する。加えて、毒物動態分析を実施して血清中のＣ反応性タンパク質オリゴヌクレオチドの濃度を測定する。さらに、インターロイキン−１、インターロ
イキン−６、インターロイキン−８、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−α、単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）、ならびにＲＡＮＴＥＳを包含するサイトカインおよびケモカインの血清濃度を測定して、いかなる免疫若しくは炎症応答の程度も決定する。
試験第３０日の生理的食塩水若しくはオリゴヌクレオチドの最終投与２４時間後に動物を殺す。最終体重を記録し、そして肉眼的剖検を実施して、死体、筋／骨格系、全部の外表面および開口部、頭蓋腔ならびに脳の外表面、関連する器官および組織を伴う頚部、関連する器官および組織を伴う胸腔、腹腔および骨盤腔を評価する。尿を膀胱から収集しかつ本明細書に前述されたとおり分析する。腎、肝、肺、心および脾重量を記録する。心血管系、消化器、リンパ系／造血系、尿生殖器および内分泌組織を収集し、そして１０％中性緩衝ホルマリン中で保存する。生理的食塩水および２０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドで処置した動物から収集した組織は、１０％中性緩衝ホルマリン中での保存後にパラフィンに埋込み、切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、そして病理学的異常について検査する。骨髄切片が変化若しくは異常を示す症例では顕微鏡検査のため骨髄スメアを収集する。ホルマリン中で保存していない収集した肝組織の一部分を、ＲＮアーゼ活性を阻害する緩衝液中でホモジェナイズし、そして本明細書に記述されるところのリアルタイムＰＣＲによりＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡ発現について評価する。この試験で評価されるパラメータが、Ｃ反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性および毒性を決定する。
ｉｎ ｖｉｖｏでのヒトＣ反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド：痩身マウス試験
さらなる一態様において、ヒトＣ反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、血清脂質、血糖および毒性の指標に対するそれらの効果について試験した。雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）に標準的げっ歯類飼料を給餌した。マウスに、２５および５０ｍｇ／ｋｇの以下のアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわちＩＳＩＳ １３３７２６（配列番号３６）、ＩＳＩＳ ３２９９５６（配列番号１４９）、ＩＳＩＳ
３３００１２（配列番号２０５）およびＩＳＩＳ ３３００３１（配列番号２２４）のそれぞれの腹腔内注入を与えた。各オリゴヌクレオチド処置群は５マウスよりなった。合計１０匹の生理的食塩水を注入した動物が対照としてはたらいた。注入は週２回４週間投与した。処置期間終了時にマウスを殺した。身体、肝および脾重量を記録し、そして有意の変化は表されなかった。
ＡＬＴ、ＡＳＴ、コレステロール（ＣＨＯＬ）、血糖（ＧＬＵＣ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ）、トリグリセリド（ＴＲＩＧ）および非エステル化遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）の慣例の臨床分析のため血清を収集した。これらのパラメータはＯｌｙｍｐｕｓ臨床検査装置（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州メルビル）を使用する慣例の手順により測定した。データを表２４に提示する。
Figure 2012029693
これらのデータは、５０ｍｇ／ｋｇ用量のＩＳＩＳ ３３００３１のみが肝トランスアミナーゼＡＬＴおよびＡＳＴの有意の増大をもたらしたことを示し、最高用量のＩＳＩＳ
３３００３１での肝毒性効果を示唆する。５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ３３００３１での処置はまたコレステロールおよびＬＤＬコレステロールの増大ももたらした。コレステロールの中程度の増大が５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ３２９９５６で処置した動物で観察された。非エステル化遊離脂肪酸の増大は、この試験で使用した全部のオリゴヌクレオチドで処置したマウスで観察された。
これらのデータは、ヒトＣ反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、明白な毒性を生じさせることなく痩身マウスで標的の発現を効果的に阻害したことを示す。
ｉｎ ｖｉｖｏでのＣ反応性タンパク質のアンチセンス阻害：ラット試験
さらなる一態様において、Ｃ反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを付加的な動物モデルで試験した。標準的げっ歯類飼料で維持した雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）が、７５および１００ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ １９７１７８（配列番号２７５）の腹腔内注入を週あたり１回６週間受領した。生理的食塩水を注入した動物が対照としてはたらいた。各処置群は５動物よりなった。処置期間の終了時に動物を殺し、そしてＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡおよびタンパク質発現ならびに肝、ならびに血清中のＣ反応性タンパク質発現について評価した。ｍＲＮＡは本明細書の他の実施例により記述されるところのリアルタイムＰＣＲにより測定した。タンパク質は商業的に入手可能なキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用するＥＬＩＳＡにより測定した。各処置群の５動物から平均したデータを、生理的食塩水で処置した動物からの結果に対し正規化し、そして表２５に提示する。
Figure 2012029693
これらのデータは、ＩＳＩＳ １９７１７８が、肝のＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡおよびタンパク質ならびに血清タンパク質を顕著に減少させたことを示す。血清Ｃ反応性タンパク質濃度の低下は、ＥＬＩＳＡキットからのラットＣ反応性タンパク質抗体を使用するイムノブロット分析により確認された。これらの結果は、肝のＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡの低下が血清Ｃ反応性タンパク質濃度を低下させることを示し、肝のＣ反応性タンパク質産生と血清濃度との間の重要な関連を具体的に説明する。
Ｃ反応性タンパク質を標的とするオリゴヌクレオチドの特異性
さらなる一態様において、Ｃ反応性タンパク質ｍＲＮＡに対するＩＳＩＳ ３３００１２の特異性を検討した。ＢＬＡＳＴ検索を実施して、ＩＳＩＳ ３３００１２がＣ反応性タンパク質以外の遺伝子にハイブリダイズし得るかどうかを決定した。この検索は、ＩＳＩＳ ３３００１２に対する潜在的結合部位をもつ配列を伴う数種の遺伝子を示した。これらの遺伝子を表２６に示し、ここに不適合の数を示す。全部の潜在的なＩＳＩＳ ３３００１２の標的部位は、ＩＳＩＳ ３３００１２に関して２〜３個の不適合ヌクレオチドを含有する。配列のＵｎｉｇｅｎｅ ＩＤ受託番号（双方とも米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースにより入手可能である）もまた示す。遺伝子配列中で結合部位が反復されている回数を、表２６の「計数」欄に示す。
Figure 2012029693
ＩＳＩＳ ３３００１２が表２６中の遺伝子の発現に影響を及ぼすかどうかを試験するために、本明細書に記述されるとおり培養した初代ヒト肝細胞を２００ｎＭのＩＳＩＳ ３３００１２で４８時間処理した。表２６中の遺伝子の発現を、公的に入手可能な配列に対し設計したプライマーおよびプローブを使用する、本明細書に記述されるところのリアルタイムＰＣＲにより測定した。これらのデータは、ＩＳＩＳ ３３００１２が表２６中の遺伝子のいずれの発現も調節しなかったことを示し、初代肝細胞中ではＩＳＩＳ ３３００１２がＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズしかつ阻害することを具体的に説明した。
Ｃ反応性タンパク質を標的とするオリゴマー化合物で処理した細胞に応答する細胞の増殖および生存
細胞周期の調節は多様な癌治療薬の基礎である。調節されない細胞増殖は癌細胞の特徴であり、従って、最新の化学療法剤は、例えば細胞分裂に必要とされる新たなＤＮＡの合成を阻害することにより分裂細胞を標的とする。しかしながら、健康な組織中の細胞もまた、細胞増殖を調節する剤により影響を及ぼされる。
いくつかの場合において、細胞周期阻害剤は癌細胞でアポトーシスを引き起こすがしか
し正常細胞が増殖停止を受けそして従って影響を及ぼされないままとどまることを可能にする（Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、１９９９、２１、７０４−７０９；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９７、５７、２０１３−２０１９；ＥｖａｎとＬｉｔｔｌｅｗｏｏｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８１、１３１７−１３２２；ＬｅｅｓとＷｅｉｎｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ Ｓ Ａ、１９９９、９６、４２２１−４２２３）。抗癌剤に対する感作の一例は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の低下した若しくは非存在の発現を有する細胞で観察される（Ｂｕｎｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８２、１４９７−１５０１；Ｂｕｎｚら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９９、１０４、２６３−２６９；Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９９、５９、３８３１−３８３７；Ｗａｈｌら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９６、２、７２−７９）。しかしながら、癌細胞はしばしばアポトーシスを逃れる（ＬｏｗｅとＬｉｎ、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓｉｓ、２０００、２１、４８５−４９５；Ｒｅｅｄ、Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．、１９９８、４ Ｓｕｐｐｌ １、Ｓ８−１４）。癌細胞中での細胞周期の検問所のさらなる破壊は、正常細胞がＧ１に避難しかつ影響を及ぼされないままとどまることを可能にしつつ化学療法に対する感受性を増大させ得る。その阻害が細胞を抗癌剤に対し感作するｐ５３のような遺伝子を同定するのに細胞周期アッセイを使用する。
細胞周期アッセイ
Ｃ反応性タンパク質を標的とするオリゴマー化合物の効果を、正常ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）ならびに２種の乳癌細胞株ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄで検査した。細胞株の全部はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナサス）から得られる。後者の２細胞株は同様の遺伝子を発現する。ＭＣＦ７細胞は腫瘍抑制因子ｐ５３を発現する一方、Ｔ４７Ｄ細胞はｐ５３が欠損している。ＭＣＦ−７およびＨＭＥＣ細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を補充した低グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）中で慣例に培養する。Ｔ４７Ｄ細胞は１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）中で培養した。細胞は、それらがおよそ９０％コンフルエンスに達した場合にトリプシン処理および希釈により慣例に継代した。細胞は、ＨＭＥＣ細胞についてウェルあたりおよそ５０，０００〜６０，０００細胞、ＭＣＦ−７についてウェルあたりおよそ１４０，０００細胞、およびＴ４７Ｄ細胞についてウェルあたりおよそ１７０，０００細胞で２４ウェルプレートにプレーティングし、そしてウェルに一夜接着させた。
ＩＳＩＳ １３３７２６（配列番号３６）を使用して、細胞周期の進行に対するＣ反応性タンパク質のアンチセンス阻害の効果を試験した。無作為化対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ２９８４８（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ；ここでＮはＡ、Ｔ、Ｃ若しくはＧであり；配列番号６１７として本明細書に組込まれる）が、陰性対照すなわち細胞周期の進行を調節しない化合物を使用された。加えて、細胞増殖の阻害の陽性対照をアッセイした。陽性対照は、ヒトＪａｇｇｅｄ２を標的としかつ細胞周期の進行を阻害することが既知であるＩＳＩＳ １４８７１５（ＴＴＧＴＣＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣ；配列番号６１８として本明細書に組込まれる）であった。ＩＳＩＳ ２９２４８およびＩＳＩＳ １４８７１５は、５ヌクレオチドの「ウィング」により双方の側（５’および３’の方向）で隣接されている１０個の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成される、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジ
ンである。
オリゴヌクレオチドは、２００ｎＭのオリゴヌクレオチドおよび６μｇ／ｍＬのリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）の最終濃度を達成するように、ＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）中でリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬と混合した。細胞に添加する前に、オリゴヌクレオチド、リポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬およびＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体を徹底的に混合しかつ０．５時間インキュベートした。培地をプレートから除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。Ｔ４７Ｄ若しくはＭＣＦ７細胞を含有する各ウェルを１５０μｌのリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した。ＨＭＥＣを含有する各ウェルは１５０μＬのハンクス平衡塩溶液で洗浄した。各ウェル中の洗浄緩衝液を１００μＬのオリゴヌクレオチド／ＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体／リポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬のカクテルで置き換えた。対照細胞はリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬のみを受領した。プレートを３７℃で４時間インキュベートし、その後培地を除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。１００μｌの完全増殖培地を各ウェルに添加した。７２時間後に、慣例の手順を使用してフローサイトメトリー分析のため細胞を調製し、そして、フローサイトメーターを使用して細胞周期プロファイルを生成させるために細胞をヨウ化プロピジウムで染色した。細胞周期プロファイルはＭｏｄＦｉｔプログラム（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｉｎｃ．、メーン州トプシャム）で分析した。
核ＤＮＡの断片化はアポトーシスの特質であり、そして「サブＧ１（ｓｕｂＧ１）」として分類される低二倍体ＤＮＡ内容物を伴う細胞の増大を生じさせる。Ｇ１期の細胞の増大はＳ期への進入前での細胞周期の停止を暗示し；Ｓ期の細胞の増大はＤＮＡ合成の間の細胞周期の停止を暗示し；そしてＧ２／Ｍ期の細胞の増大は有糸分裂直前若しくはその間の細胞周期の停止を暗示する。データを未処理の対照細胞の細胞周期プロファイルに関する各期の細胞のパーセントとして表し、そして表２７に示す。
Figure 2012029693
これらのデータは、ＩＳＩＳ １３３７２６がＨＭＥＣ、ＭＣＦ７細胞若しくはＴ４７Ｄ細胞中での細胞周期の進行に有意に影響を及ぼさなかったことを示す。
カスパーゼアッセイ
プログラムされた細胞死すなわちアポトーシスは、正常細胞のターンオーバーを包含する多様な生物学的過程、ならびに免疫系および胚の発達の重要な一局面である。アポトーシスは、それらにより事象のカスケードが選ばれた一組のタンパク質の切断に至る、細胞内プロテアーゼの一ファミリーであるカスパーゼの活性化を必要とする。カスパーゼファミリーは２群、すなわち、カスパーゼ−８および−９のような開始体（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）カスパーゼ、ならびに開始体カスパーゼにより活性化されるカスパーゼ−３、−６および−７のような実行体（ｅｘｅｃｕｔｉｏｎｅｒ）カスパーゼに分割し得る。カスパーゼファミリーは、異なる基質の好みをもつ少なくとも１４メンバーを含有する（ＴｈｏｒｎｂｅｒｒｙとＬａｚｅｂｎｉｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８１、１３１２−１３１６）。カスパーゼアッセイは、その阻害が正常細胞に影響を及ぼすことなく乳癌細胞株においてアポトーシスを選択的に引き起こす遺伝子を同定するため、およびその阻害がｐ５３欠損のＴ４７Ｄ細胞中で細胞死をもたらしかつｐ５３を発現するＭＣＦ７細胞中でもたらさない遺伝子を同定するために利用されている（Ｒｏｓｓら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２０００、２４、２２７−２３５；Ｓｃｈｅｒｆら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２０００、２４、２３６−２４４）。化学療法剤タキソール、シスプラチン、エトポシド、ゲムシタビン、カンプトテシン、アフィジコリンおよび５−フルオロウラシルは、全部、カスパーゼ依存性の様式でアポトーシスを誘導することが示されている。
本発明のさらなる一態様において、Ｃ反応性タンパク質を標的とするオリゴマー化合物を、正常ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）ならびに２種の乳癌細胞株ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄで検査した。ＨＭＥＣおよびＭＣＦ７細胞はｐ５３を発現する一方、Ｔ４７Ｄ細胞はこの腫瘍抑制遺伝子を発現しない。細胞を、黒色側壁および平坦な透明底を伴う９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、ニューヨーク州コーニング）中で、細胞周期アッセイについて記述されたとおり培養した。フェノールレッドを含むおよび含まないＤＭＥＭ培地はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州カールズバッド）から得た。フェノールレッドを含むおよび含まないＭＥＧＭ培地はＣａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（メリーランド州ウォーカーズビル）から得た。
ＩＳＩＳ １３３７２６（配列番号３６）を使用して、カスパーゼ活性に対するＣ反応性タンパク質のアンチセンス阻害の効果を試験した。無作為化対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ２９８４８（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ；ここでＮはＡ、Ｔ、Ｃ若しくはＧであり；配列番号６１７として本明細書に組込まれる）を陰性対照すなわちカスパーゼ活性を遂げない化合物として使用した。カスパーゼ活性化の陽性対照として、ヒトＪａｇｇｅｄ２を標的とするオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １４８７１５（配列番号６１８）若しくはヒトＮｏｔｃｈ１を標的とするオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ２２６８４４（ＧＣＣＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＧ；配列番号６１９として本明細書に組込まれる）もまたアッセイした。これらの遺伝子の双方は、阻害される場合にカスパーゼ活性およびその後アポトーシスを誘導することが既知である。ＩＳＩＳ ２９２４８、ＩＳＩＳ １４８７１５およびＩＳＩＳ ２２６８４４は全部、５ヌクレオチドの「ウィング」により双方の側（５’および３’の方向）で隣接されている１０個の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成される、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。
オリゴヌクレオチドを、２００ｎＭのオリゴヌクレオチドおよび６μｇ／ｍＬのリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）の最終濃度を達成するように、
ＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）中でリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬と混合した。細胞に添加する前に、オリゴヌクレオチド、リポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬およびＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体を徹底的に混合しかつ０．５時間インキュベートした。培地をプレートから除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。各ウェルを１５０μｌのリン酸緩衝生理的食塩水（ＨＭＥＣ細胞については１５０μＬのハンクス平衡塩溶液）で洗浄した。各ウェル中の洗浄緩衝液を１００μＬのオリゴヌクレオチド／ＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体／リポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬カクテルで置き換えた。Ｃ反応性タンパク質を標的とする化合物ＩＳＩＳ ２２６８４４およびＩＳＩＳ １４８７１５は三重で試験し、そしてＩＳＩＳ ２９２４８は６個までの複製ウェルで試験した。未処理の対照細胞はリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬のみを受領した。プレートを３７℃で４時間インキュベートし、その後培地を除去しかつプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。１００μｌのフェノールレッドを含まない完全増殖培地を各ウェルに添加した。
カスパーゼ−３活性は、ペプチド配列（ＤＥＶＤ）中のアスパラギン酸残基の後の切断を検出する蛍光測定ＨＴＳカスパーゼ−３アッセイ（カタログ番号ＨＴＳ０２；ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）で評価した。ＤＥＶＤ基質は、カスパーゼ−３による切断に際して蛍光の青色から緑色へのシフトを表す蛍光分子で標識されている。オリゴヌクレオチド処理した細胞中の活性のカスパーゼ−３を、製造元の説明書に従ってこのアッセイにより測定する。オリゴヌクレオチド処理の４８時間後に、１０μＭジチオスレイトールを含有する５０μＬのアッセイ緩衝液を各ウェルに添加し、次いで２０μＬのカスパーゼ−３蛍光基質複合物を添加した。ウェル中の蛍光を、蛍光プレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸＴＭ ＧＥＭＩＮＩＸＳＴＭ読み取り装置、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使用して即座に検出した（励起／測定 ４００／５０５ｎｍ）。プレートを覆い、そして３７℃でそして追加の３時間インキュベートし、その後蛍光を再度測定した（励起／測定 ４００／５０５ｎｍ）。時間０での値を３時間で得た測定値から減算した。未処理の対照細胞から得た測定値を１００％活性と指定した。
実験は３種の細胞型すなわちＨＭＥＣ、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７のそれぞれで複製し、そして表２８に結果を示す。これらのデータから、１００％より上若しくは下のカスパーゼ活性の値は、該化合物がカスパーゼ活性をそれぞれ刺激若しくは阻害する能力を有することを示すと考えられる。データは未処理の対照値に関する蛍光の増大パーセントとして示す。
Figure 2012029693
これらのデータから、ＩＳＩＳ １３３７２６によるＣ反応性タンパク質発現の阻害が、未処理の対照細胞の対照に比較してＭＣＦ７細胞中でのアポトーシスの阻害をもたらしたことが明らかである。これらのデータは、このオリゴマー化合物が、アポトーシスの阻害が望ましい状態の処置、例えば神経変性性障害における応用を伴う候補の剤であることを示す。
Ｃ反応性タンパク質を標的とするオリゴマー化合物を使用する血管新生の阻害のアッセイ
血管新生は内皮細胞による新たな血管（静脈および動脈）の成長である。この過程は多数のヒト疾患の発症において重要であり、そして充実性腫瘍の増殖の調節においてとりわけ重要であると考えられている。新たな血管形成を伴わなければ、腫瘍は数ミリメートルの大きさ以上に成長しないであろうと考えられている。抗癌剤としてのそれらの使用に加え、血管新生の阻害剤は、糖尿病性網膜症、心血管系疾患、慢性関節リウマチおよび乾癬の処置に対する潜在能力を有する（ＣａｒｍｅｌｉｅｔとＪａｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０７、２４９−２５７；ＦｒｅｅｄｍａｎとＩｓｎｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．、２００１、３３、３７９−３９３；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｆａｓｅｂ
Ｊ．、１９９７、１１、４５７−４６５；Ｓａａｒｉｓｔｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０００、１９、６１２２−６１２９；ＷｅｂｅｒとＤｅ Ｂａｎｄｔ、Ｊｏｉｎｔ Ｂｏｎｅ Ｓｐｉｎｅ、２０００、６７、３６６−３８３；Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、１９９９、１４、１２８７−１２９４）。
血管新生の尺度としての内皮管形成アッセイ
血管新生は、内皮細胞の相互とのおよび細胞外マトリックス分子との相互作用を促進する多数の因子により刺激されて毛細管の形成をもたらす。この形態形成過程は付近の組織への酸素の送達に必要であり、そして胚の発達、創傷治癒および腫瘍増殖において不可欠の役割を演じている（ＣａｒｍｅｌｉｅｔとＪａｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０７、２４９−２５７）。さらに、この過程は、内皮細胞による管様構造の形成を評価した組織培養アッセイで再現し得る。細胞の増殖支持体として、コラーゲンＩ（Ｋａｎａｙａｓｕら、Ｌｉｐｉｄｓ、１９９１、２６、２７１−２７６）、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（Ｙａｍａｇｉｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、２７２、８７２３−８７３０）およびフィブリン（Ｂａｃｈら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、１９９８、２３８、３２４−３３４）のような多様なマトリックスを使用するアッセイのいくつかの
異なる変形物が存在する。このアッセイにおいて、ＨＵＶＥＣを、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）に非常に類似であるエンゲルブレス−ホルム−スワムマウス腫瘍由来のマトリックス（Ｋｌｅｉｎｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８６、２５、３１２−３１８；ＭａｄｒｉとＰｒａｔｔ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、１９８６、３４、８５−９１）上にプレーティングする。未処理のＨＵＶＥＣは、この支持体上で増殖される場合に管様構造を形成する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの管形成の喪失がｉｎ ｖｉｖｏでの血管新生の阻害と相互に関連づけられており（ＣａｒｍｅｌｉｅｔとＪａｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０７、２４９−２５７；Ｚｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００２、６２、２０３４−２０４７）、これは血管新生についてのエンドポイントとしてのｉｎ ｖｉｔｒｏ管形成の使用を支持する。
さらなる一態様において、初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）を使用して、管形成活性に対するＣ反応性タンパク質を標的としたオリゴマー化合物の効果を測定した。ＨｕＶＥＣは、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ補助物質（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州ウォーカーズビル）を補充したＥＢＭ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州ウォーカーズビル）中で慣例に培養した。細胞はそれらがおよそ９０％コンフルエンスに達した場合にトリプシン処理および希釈により慣例に継代し、そして１５継代までの間維持した。ＨｕＶＥＣはおよそ３０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングする。１日後に細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトする。管形成アッセイはｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カリフォルニア州テメキュラ）を使用して実施する。
ＩＳＩＳ １３３７２６（配列番号３６）を使用して、内皮管形成に対するＣ反応性タンパク質の阻害の効果を試験した。無作為化対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ２９８４８（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ；ここでＮはＡ、Ｔ、Ｃ若しくはＧであり；配列番号６１７として本明細書に組込まれる）が陰性対照すなわち管形成に影響を及ぼさない化合物としてはたらいた。インテグリン−β３を標的としかつ内皮管形成を阻害することが既知であるＩＳＩＳ １９６１０３（ＡＧＣＣＣＡＴＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＡ、配列番号６２０として本明細書に組込まれる）を陽性対照として使用した。
オリゴヌクレオチドを、７５ｎＭのオリゴヌクレオチドおよび２．２５μｇ／ｍＬのリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）の最終濃度を達成するように、ＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）中でリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬と混合した。
細胞に添加する前に、オリゴヌクレオチド、リポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬およびＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体を徹底的に混合しそして０．５時間インキュベートした。未処理の対照細胞はリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬のみを受領した。培地をプレートから除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。各ウェルを１５０μｌのリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した。各ウェル中の洗浄緩衝液を１００μＬのオリゴヌクレオチド／ＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体／リポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬カクテルで置き換えた。ＩＳＩＳ １３３７２６およびＩＳＩＳ １９６１０３は三重で試験し、また、ＩＳＩＳ ２９８４８は６個までの複製物で試験した。プレートを３７℃で４時間インキュベートし、その後培地を除去しかつプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。１００μｌの完全増殖培地を各ウェルに添加した。トランスフェクションの５０時間後に、細胞をＥＣＭａ−ｔｒｉｘＴＭ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で被覆した９６ウェルプレートに移す。これらの条件下で、未処理のＨ
ＵＶＥＣは管様構造を形成する。３７℃で一夜インキュベーション後に、処理および未処理細胞を光学顕微鏡法により検査する。個々のウェルに、管形成の程度に依存して１から５までの個別のスコアを割り当てる。１のスコアは管形成を伴わないウェルを指す一方、５のスコアは全細胞が広範囲の管の網状構造を形成しつつあるウェルに与える。結果は未処理の対照サンプルに関する管形成のパーセントとして表す。ＩＳＩＳ １３３７２６、ＩＳＩＳ ２９８４８およびＩＳＩＳ １９６１０３での処理はそれぞれ８１％、１００％および５１％の管形成をもたらした。これらの結果は、ＩＳＩＳ １３３７２６が管形成を阻害し、そして従って血管新生の阻害が望ましい状態の処置、例えば癌、糖尿病性網膜症、心血管系疾患、慢性関節リウマチおよび乾癬の処置における応用を伴う候補の剤であることを具体的に説明する。
マトリックスメタロプロテイナーゼ活性
血管新生の間、内皮細胞は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を分解しなければならず、そして従ってこの分解を達成するためにマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を分泌しなければならない。ＭＭＰは、８種の異なる分類にある亜鉛依存性エンドペプチダーゼの一ファミリーであり、５種は分泌型でありかつ３種は膜型ＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）である（ＥｇｅｂｌａｄとＷｅｒｂ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２、１６１−１７４）。ＭＭＰは、細胞外マトリックスの構造的成分のみならずしかしまた増殖因子結合タンパク質、増殖因子前駆体、受容体チロシンキナーゼ、細胞接着分子および他のプロテイナーゼも包含する広範な一群の基質を切断することによりそれらの効果を発揮する（Ｘｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００２、１５４、１０６９−１０８０）。
さらなる一態様において、アポリポタンパク質Ｂのアンチセンス阻害を、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の上の培地中のＭＭＰ活性に対する効果について評価した。ＭＭＰ活性はＥｎｚＣｈｅｋゼラチナーゼ／コラゲナーゼアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）を使用して測定した。ＨＵＶＥＣは管形成アッセイについて記述されたとおり培養する。ＨＵＶＥＣをウェルあたりおよそ４０００細胞で９６ウェルプレートにプレーティングし、そして１日後にトランスフェクトする。
ＨＵＶＥＣをＩＳＩＳ １３３７２６（配列番号３６）で処理してＣ反応性タンパク質発現を阻害した。無作為化配列をもつオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ２９８４８（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ；ここでＮはＡ、Ｔ、Ｃ若しくはＧであり；配列番号６１７として本明細書に組込まれる）が陰性対照すなわちＭＭＰ活性に影響を及ぼすことが期待されない処理としてはたらいた。ＩＳＩＳ ２５２３７（ＧＣＣＣＡＴＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣ、配列番号６２１）はインテグリンβ３を標的とし、そしてＭＭＰ活性の阻害の陽性対照として使用した。ＩＳＩＳ ２５２３７は、４ヌクレオチドの「ウィング」により双方の側（５’および３’の方向）で隣接されている１０個の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成される、長さ１８ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。
細胞を、７５ｎＭのオリゴヌクレオチドおよび２．２５μｇ／ｍＬのリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬で、管形成アッセイについて記述されたとおり処理した。ＩＳＩＳ １３３７２６およびＩＳＩＳ ２５２３７は三重で試験し、また、ＩＳＩＳ
２９８４８は６個までの複製物で試験した。プレートを３７℃でおよそ４時間インキュベートし、その後培地を除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。１００μｌの完全増殖培地を各ウェルに添加した。トランスフェクションのおよそ５０時間後に、Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル透明底プレート（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ、カリフォルニア州ブリスベーン）の各ウェルに酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）溶液を添加する。ＡＰＭＡ溶液は不活性のＭＭＰ前駆体タンパク質の切断を促進するのに使用する。ＨＵＶＥＣ上の培地をその後９６ウェルプレートのウェルに移す。３０分後にクエンチした蛍光発生性のＭＭＰ切断基質を添加し、そして基礎蛍光を直ちに４８５ｎｍ励起／５３０ｎｍ測定で読取る。暗所で３７℃での一夜インキュベーション後に、プレートを再度読取ってＭＭＰ活性に対応する蛍光の量を測定する。ＨＵＶＥＣライセートからの全タンパク質を使用して測定値を正規化し、そして、ＭＭＰ活性を、オリゴヌクレオチド処理を受領しなかった未処理の対照細胞からのＭＭＰ活性に関するパーセントとして表す。ＭＭＰ活性は、ＩＳＩＳ １３３７２６、ＩＳＩＳ ２９８４８およびＩＳＩＳ ２５２３７で処理した細胞からの培地中で７８％、８２％および５８％であった。これらのデータは、ＩＳＩＳ １３３７２６がＭＭＰ活性を阻害しなかったことを示す。
Ｃ反応性タンパク質を標的とするオリゴマー化合物の脂肪細胞アッセイ
インスリンは身体全体で不可欠のシグナル伝達分子であるが、しかしその主要な標的器官は肝、骨格筋および脂肪組織である。インスリンはグルコース恒常性の主要調節物質であり、そして末梢のグルコース利用および肝のグルコース産生の均衡を維持するのを助ける。正常循環濃度のインスリンのグルコース恒常性を維持する低下した能力は、糖尿病、中心性肥満、高血圧、多嚢胞性卵巣症候群、脂質代謝異常およびアテローム硬化症としばしば関連するインスリン抵抗性に現れる（Ｓａｌｔｉｅｌ、Ｃｅｌｌ、２００１、１０４、５１７−５２９；ＳａｌｔｉｅｌとＫａｈｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２００１、４１４、７９９−８０６）。
インスリンに対する未分化脂肪細胞の応答
インスリンは前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を促進する。脂肪細胞数の増大をもたらす肥満の状態は、インスリンの抗脂質溶解効果によりグルコース輸送が損なわれているインスリン抵抗性状態でさえ起こる。トリグリセリド分解の阻害は、グルコース輸送の刺激よりもはるかにより低いインスリン濃度を必要として、脂肪貯蔵の維持若しくは拡張をもたらす（Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９９、１９、６２８６−６２９６；Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９８、１８、３７０８−３７１７）。
細胞分化の特質の１つは遺伝子発現のアップレギュレーションである。脂肪細胞分化の間、脂肪細胞における遺伝子発現パターンはかなり変化する。脂肪細胞分化の間にアップレギュレートされることが既知の数種の遺伝子は、ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）、脂肪細胞脂質結合タンパク質（ａＰ２）、グルコース輸送体４（Ｇｌｕｔ４）およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲ−γ）を包含する。インスリンシグナル伝達は、脂肪細胞分化の重要な調節因子ＰＰＡＲ−γを結合しかつ不活性化する化合物により改善される（Ｏｌｅｆｓｋｙ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００、１０６、４６７−４７２）。インスリンは脂肪細胞の細胞表面へのＧＬＵＴ４の転位を誘導し、そこでそれはグルコースを細胞中に輸送する（トリグリセリド合成に必要な活性）。全部の形態の肥満および糖尿病において、脂肪細胞での損なわれたインスリン刺激性のグルコース輸送に寄与する主要な一因子はＧＬＵＴ４のダウンレギュレーションである。インスリンはまた、脂肪酸合成および脂質生合成を促進するように機能する脂肪細胞中の優勢なリパーゼであるホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）も誘導する（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８１、２５６、６３１１−６３２０）。脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質（ａＰ２）は脂肪酸およびレチノイド輸送タンパク質の多遺伝子ファミリーに属する。ａＰ２は、脂質シャトルとしてはたらき、疎水性脂肪酸を可溶化しかつそれらを利用のため適切な代謝系に送達すると主張されている（Ｆｕら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒ
ｅｓ．、２０００、４１、２０１７−２０２３；Ｐｅｌｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９９、２６１、４５６−４５８）。一緒に、これらの遺伝子はグルコースの取り込みならびに脂肪の代謝および利用で重要な役割を演じている。
レプチン分泌およびトリグリセリド含量の増大もまた脂肪細胞分化の十分に確立されたマーカーである。それは分化した脂肪細胞のマーカーとしてはたらく一方、レプチンは、エネルギーの貯蔵および放出における脂肪細胞の役割と独立の機構（オ―トクリン、パラクリン、内分泌および神経系）によりグルコース恒常性もまた調節する。脂肪細胞が分化する際に、インスリンは、トリグリセリド合成を促進することおよびトリグリセリド分解を阻害することの双方によりトリグリセリド蓄積を増大させる（ＳｐｉｅｇｅｌｍａｎとＦｌｉｅｒ、Ｃｅｌｌ、２００１、１０４、５３１−５４３）。トリグリセリド蓄積は細胞の大きさおよび細胞数としっかりと相関するため、それは分化した脂肪細胞の優れた指標である。
細胞分化のマーカーの発現に対するによるＣ反応性タンパク質のアンチセンス阻害の効果を前脂肪細胞で検査した。ヒト白色前脂肪細胞（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州リサーチトライアングルパーク）を前脂肪細胞培地（ＺｅｎＢｉｏ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州リサーチトライアングルパーク）中で増殖させた。トランスフェクション１日前に、９６ウェルプレートにおよそ３０００細胞／ウェルを接種した。
無作為化対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ２９８４８（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ；ここでＮはＡ、Ｔ、Ｃ若しくはＧであり；配列番号６１７として本明細書に組込まれる）を陰性対照すなわち脂肪細胞分化を調節しない化合物として使用した。脂肪細胞分化を阻害する腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を、レプチン分泌により評価されるところの脂肪細胞分化の阻害の陽性対照として使用した。測定した全部の他のパラメータについて、ＰＰＡＲ−γの阻害剤、ＩＳＩＳ １０５９９０（ＡＧＣＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＴＣＣＧＴＴＡ、配列番号６２２として本明細書に組込まれる）が脂肪細胞分化の阻害の陽性対照としてはたらいた。ＩＳＩＳ ２９８４８およびＩＳＩＳ １０５９９０は、５ヌクレオチドの「ウィング」により双方の側（５’および３’の方向）で隣接されている１０個の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成される、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。
オリゴヌクレオチドを、２５０ｎＭのオリゴヌクレオチドおよび７．５μｇ／ｍＬのリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）の最終濃度を達成するように、ＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）中でリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬と混合した。細胞に添加する前に、オリゴヌクレオチド、リポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬およびＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体を徹底的に混合し、そして０．５時間インキュベートした。未処理の対照細胞はリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬のみを受領した。培地をプレートから除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。各ウェルを１５０μｌのリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した。各ウェル中の洗浄緩衝液を１００μＬのオリゴヌクレオチド／ＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体／リポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬カクテルで置き換えた。ＩＳＩＳ １３３７２６およびＩＳＩＳ １０５９９０は三重で試験し、ＩＳＩＳ ２９８４８は６個までの複製ウェル中で試験した。プレートを３７℃で４時間インキュベートし、その後培地を除
去しそしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。１００μｌの完全増殖培地を各ウェルに添加した。細胞がコンフルエンスに達した（およそ３日）後に、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＩＢＭＸ、デキサメサゾンおよびインスリンを含有する分化培地（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．）にそれらを３日間曝露した。細胞にその後脂肪細胞培地（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．）を供給し、該培地は２ないし３日間隔で交換した。
脂肪細胞を培養している培地中へのレプチン分泌をタンパク質ＥＬＩＳＡにより測定した。トランスフェクション後第９日に、９６ウェルプレートをヒトレプチンに対するモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）で被覆しかつ４℃で一夜放置した。プレートをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングし、そして処理した脂肪細胞の培地の希釈をプレート中で室温で２時間インキュベートした。未結合成分を除去するための洗浄後に、ヒトレプチンに対する二次モノクローナル抗体（ビオチンと結合）を添加した。その後プレートをストレプトアビジン結合ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とともにインキュベートし、そして、ＨＲＰにより切断される場合に青色になる３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンとのインキュベーションにより酵素レベルを測定した。ＯＤ４５０（色素の吸光度が細胞ライセート中のレプチン濃度に比例する）を各ウェルについて読み取った。表２９に示される結果は、未処理の対照サンプルに関する対照のパーセントとして表す。レプチン分泌に関して、１００％より上若しくは下の値は、該化合物がレプチン分泌をそれぞれ刺激若しくは阻害する能力を有することを示すと考えられる。
トリグリセリド蓄積アッセイは脂肪細胞によるトリグリセリドの合成を測定する。トリグリセリドの蓄積は、ＩｎｆｉｎｉｔｙＴＭトリグリセリド試薬キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を使用して測定した。トランスフェクション後第９日に細胞を洗浄しかつ室温で溶解し、そしてトリグリセリドアッセイ試薬を添加した。トリグリセリドの蓄積は、酵素リポタンパク質リパーゼによりトリグリセリドから遊離されるグリセロールの量に基づき測定した。遊離されるグリセロールはグリセロールキナーゼによりリン酸化され、そしてグリセロールリン酸酸化酵素によるグリセロール−１−リン酸のジヒドロキシアセトンリン酸への酸化の間に過酸化水素が生成される。ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がＨ２Ｏ２を使用して４−アミノアンチピリンおよび３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸を酸化して赤色色素を生じさせる。グリセロールの濃度に比例する色素の吸光度を、ＵＶ分光光度計を使用して５１５ｎｍで測定した。グリセロール濃度を各アッセイの標準曲線から計算し、そしてデータをブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）により測定されるところの全細胞タンパク質に対し正規化した。表２９に表示される結果は、未処理の対照サンプルに関する対照のパーセントとして表す。これらのデータから、１００％より上若しくは下のトリグリセリド（ＴＲＩＧ）蓄積の値は、該化合物がトリグリセリドの蓄積をそれぞれ刺激若しくは阻害する能力を有することを示すと考えられる。
４種の特質遺伝子すなわちＨＳＬ、ａＰ２、Ｇｌｕｔ４およびＰＰＡＲγの発現もまた、本発明の化合物でトランスフェクトした脂肪細胞中で測定した。細胞をトランスフェクション後第９日にグアニジウム含有緩衝液中で溶解し、そして全ＲＮＡを収集する。各サンプル中の全ＲＮＡの量はＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して測定した。脂肪細胞分化の特質遺伝子Ｇｌｕｔ４、ＨＳＬ、ａＰ２およびＰＰＡＲ−γについてのプライマー／プローブの組を使用して、該全ＲＮＡでリアルタイムＰＣＲを実施した。表２９に示されるｍＲＮＡレベルは未処理の対照の値に関する対照のパーセントとして表す。４種の脂肪細胞分化の特質遺伝子に関して、１００％より上若しくは下の値は、該化合物がそれぞれ脂肪細胞分化を刺激する若しくはそれを阻害する能力を有することを示すと
考えられる。
Figure 2012029693
ＩＳＩＳ １３３７２６は発現レベルレプチン、トリグリセリドおよびＧＬＵＴ４を低下させ、このアンチセンスオリゴヌクレオチドが、脂肪細胞分化の阻害が望ましい応用、例えば肥満、高脂血症、アテローム硬化症、アテローム発生、糖尿病、高血圧若しくは他の代謝性疾患のための、ならびに幹細胞若しくは前駆細胞の多能性の表現型の維持における潜在的応用を有する候補の剤であることを示唆する。
Ｃ反応性タンパク質を標的とするオリゴマー化合物を使用する炎症アッセイ
炎症アッセイは、適応免疫応答の活性化およびエフェクター期を調節する遺伝子を同定するよう設計されている。活性化期の間、適切な抗原からのシグナルを受領するＴリンパ球（Ｔ細胞としてもまた知られる）はクローン拡張を受け、サイトカインを分泌し、そして可溶性増殖因子、サイトカインおよび同時刺激分子のそれらの受容体をアップレギュレートする（Ｃａｎｔｒｅｌｌ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１４、２５９−２７４）。これらの変化はＴ細胞の分化およびエフェクター機能を駆動する。エフェクター期では、非免疫エフェクター細胞によるサイトカインに対する応答が、宿主組織に対し広範囲の損傷をなし得る炎症メディエータの産生を制御する。適応免疫系の細胞、それらの産物、ならびに炎症に関与する多様な酵素カスケード（例えば補体、凝固、フィブリン溶解およびキニンカスケード）とのそれらの相互作用は、炎症性疾患の潜在的な介入点を表す。ここに提示する炎症アッセイは、免疫応答の活性化期の特質を測定する。
アンチセンス化合物で処理した樹状細胞を使用して、樹状細胞媒介性のＴ細胞同時刺激の調節因子を同定する。Ｔ細胞活性化の決定的な結果である（ＤｅＳｉｌｖａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１、１４７、３２６１−３２６７；ＳａｌｏｍｏｎとＢｌｕｅｓｔｏｎｅ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１、１９、２２５−２５２）Ｔ細胞によるインターロイキン−２（ＩＬ−２）産生のレベルを、Ｔ細胞活性化についてのエンドポイントとして使用する。Ｔリンパ球は病理学的炎症応答を媒介する重要な免疫調節細胞である。Ｔリンパ球の至適の活性化は、一次抗原認識事象ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）からの二次すなわち同時刺激シグナルの双方を必要とする。樹状細胞は知られている最も効率的なＡＰＣであり、そして主としてＴ細胞への抗原提示、感染および疾患の間の高レベルの同時刺激分子の発現、ならびに免疫学的記憶の誘導および維持の原因である（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕとＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９２、２４５−２５２）。多数の同時刺激リガンド−受容体対がＴ細胞活性化に影響することが示されている一方、主要な一シグナルは、ＡＰＣ上のＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）によるＴ細胞上のＣＤ２８の会合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）により送達される（Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、６、７
９７−８０７；Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１４、２３３−２５８）。ＡＰＣによるＴ細胞同時刺激の阻害は、免疫抑制の新規かつより特異的な戦略に期待できる。加えて、同時刺激シグナルを遮断することは、移植を促進若しくは自己免疫を弱めるための利用性を提供するとみられる長期の免疫学的アネルギー（無応答性すなわち寛容）の発生に至るとみられる。Ｔ細胞アネルギーは、増殖因子ＩＬ−２を産生するＴ細胞の不全の直接の結果である（ＤｅＳｉｌｖａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１、１４７、３２６１−３２６７；ＳａｌｏｍｏｎとＢｌｕｅｓｔｏｎｅ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１、１９、２２５−２５２）。
免疫応答の活性化期の尺度としての樹状細胞のサイトカイン産生
本発明のさらなる一態様において、ＩＳＩＳ １３３７２６（配列番号３６）の効果をＴ細胞の樹状細胞媒介性の同時刺激で検査した。樹状細胞（ＤＣ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を、５００Ｕ／ｍＬの顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）中、抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ−ＢＤ、カリフォルニア州サンディエゴ）被覆した９６ウェルプレート上でおよそ６５００細胞／ウェルでプレーティングした。ＤＣをプレーティング２４時間後にアンチセンス化合物で処理した。
無作為化対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ２９８４８（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ；ここでＮはＡ、Ｔ、Ｃ若しくはＧであり；配列番号６１７として本明細書に組込まれる）が、陰性対照すなわち樹状細胞媒介性のＴ細胞同時刺激に影響を及ぼさない化合物としてはたらいた。ＣＤ８６の阻害剤、ＩＳＩＳ １１３１３１（ＣＧＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＣＣ、配列番号６２３として本明細書に組込まれる）が、樹状細胞媒介性のＴ細胞同時刺激の阻害の陽性対照としてはたらいた。ＩＳＩＳ ２９８４８およびＩＳＩＳ １１３１３１は、５ヌクレオチドの「ウィング」により双方の側（５’および３’の方向）で隣接されている１０個の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成される、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。
オリゴヌクレオチドは、２００ｎＭのオリゴヌクレオチドおよび６μｇ／ｍＬのリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）の最終濃度を達成するように、ＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）中でリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬と混合した。細胞に添加する前に、オリゴヌクレオチド、リポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬およびＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体を徹底的に混合し、そして０．５時間インキュベートした。培地を細胞から除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。各ウェルを１５０μｌのリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した。各ウェル中の洗浄緩衝液を１００μＬのオリゴヌクレオチド／ＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体／リポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬カクテルで置き換えた。未処理の対照細胞はリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬のみを受領した。ＩＳＩＳ １３３７２６および陽性対照は三重で試験し、また、陰性対照のオリゴヌクレオチドは６個までの複製物で試験した。プレートをオリゴヌクレオチドとともに３７℃で４時間インキュベートし、その後培地を除去しかつプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。新鮮増殖培地およびサイトカインを添加し、そしてＤＣ培養を追加の４８時間継続した。ＤＣをその後、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ミズーリ州セントルイス）を補充したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）中でＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞と共培養する。培養上清を２４時間後に収集し、そしてＩＬ−２レベルについてアッセイし（ＩＬ−２ ＤＵＯＳＥＴＴＭキット、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）、未処理の対照サンプルに関するパーセントとして表す。１００％より大きい値は炎症応答の誘導を示す一方、１００％未満の値は炎症応答の低下を示す。
ＩＳＩＳ １３３７２６、ＩＳＩＳ ２９８４８およびＩＳＩＳ １１３１３１で処理した細胞の培養上清は、未処理の対照細胞からの培養上清で見出されたＩＬ−２濃度のそれぞれ８４％、８３％および５５％のＩＬ−２を含有した。これらの結果は、ＩＳＩＳ １３３７２６がＴ細胞同時刺激を阻害しなかったことを示す。
炎症応答のエフェクター期の尺度としてのサイトカインシグナル伝達
サイトカインシグナル伝達アッセイは、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α双方に対する非免疫エフェクター細胞（最初は内皮細胞）の炎症応答を調節する遺伝子を同定するように設計されている（Ｈｅｙｎｉｎｃｋら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９９９、１４５、１４７１−１４８２；Ｚｅｔｏｕｎｅら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、２００１、１５、２８２−２９８）。サイトカイン刺激に対する応答は、４種の遺伝子すなわちＡ２０、細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、インターロイキン−９（ＩＬ−８）およびマクロファージ炎症性タンパク質２（ＭＩＰ２α）の発現レベルをたどることによりモニターする。下述されるとおり、これらの遺伝子は炎症応答の多数のパラメータを調節する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、これらのサイトカインに対する細胞性応答を変える遺伝子を同定する。
Ａ２０は、ＴＲＡＦ２で刺激したＮＫ−κＢのシグナル伝達を遮断することにより炎症前遺伝子の転写を制限するジンクフィンガータンパク質である。マウスでの研究は、ＴＮＦ−αがマウスにおけるＡ２０発現を劇的に増大させること、およびＡ２０発現がそれらの生存に決定的に重要であることを示している（Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００、２８９、２３５０−２３５４）。
ＩＣＡＭ−１は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のような炎症メディエータに応答して顕著にアップレギュレートされる、休止内皮細胞上で低レベルで発現されている接着分子である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、１９９０、３４６、４２５−４３４）。ＩＣＡＭ−１発現は炎症部位に循環白血球を誘引するはたらきをする。
ＩＬ−８は、ケモカイン遺伝子スーパーファミリー（そのメンバーは、マクロファージ、血管平滑筋細胞および内皮細胞の炎症前の表現型を促進する）の１メンバーである（Ｋｏｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２、２５８、１７９８−１８０１）。ＩＬ−８は、好中球を炎症部位に誘引する能力をもつ主要な誘導可能なケモカインの１種として知られている。より最近、ＩＬ−８は、急性の好中球媒介性の炎症の主要メディエータに関係があるとされており、そして従って潜在的な抗炎症標的である（Ｍｕｋａｉｄａら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ、１９９８、９、９−２３）。
白血球溢出において中心的な役割を演じていることが既知の別のケモカインＭＩＰ２αは、より最近、急性炎症に関与していることが示された（Ｌｕｋａｃｓら、Ｃｈｅｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９、７２、１０２−１２０）。ＭＩＰ２αは、微生物感染、リポ多糖（ＬＰＳ）の注入、ならびにＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αのような炎症前メディエータでの細胞の刺激に応答して発現される（Ｋｏｐｙｄｌｏｗｓｋｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９、１６３、１５３７−１５４４）。内皮細胞は、ＭＩＰ２αの供給源である数種の細胞型の１つである（Ｒｕｄｎｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００、１６４、６
５７６−６５８２）。
Ｃ反応性タンパク質を標的とするＩＳＩＳ １３３７２６の効果をヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）で検査した。ＨＵＶＥＣは供給元の推奨に従って培養する。ＨＵＶＥＣはウェルあたりおよそ３０００細胞の接種密度で９６ウェルプレートにプレーティングし、そしてアンチセンス化合物で２４時間後に処理する。
無作為化対照オリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ ２９８４８（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ；ここでＮはＡ、Ｔ、Ｃ若しくはＧであり；配列番号６１７として本明細書に組込まれる）を陰性対照すなわちサイトカインシグナル伝達に影響を及ぼさない化合物として使用した。ＩＳＩＳ ２９８４８は、５ヌクレオチドの「ウィング」により双方の側（５’および３’の方向）で隣接されている１０個の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成される、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。
オリゴヌクレオチドは、７５ｎＭのオリゴヌクレオチドおよび２．２５μｇ／ｍＬのリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）の最終濃度を達成するように、ＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）中でリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬と混合した。細胞に添加する前に、オリゴヌクレオチド、リポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬およびＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体を徹底的に混合し、そして０．５時間インキュベートした。培地を細胞から除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。各ウェルを１５０μＬのリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した。各ウェル中の洗浄緩衝液を１００μＬのオリゴヌクレオチド／ＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ媒体／リポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬カクテルで置き換えた。未処理の対照細胞はリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ試薬のみを受領した。ＩＳＩＳ １３３７２６は三重で試験し、また、ＩＳＩＳ ２９８４８は６個までの複製ウェル中で試験した。プレートをオリゴヌクレオチドとともに３７℃で４時間インキュベートし、その後培地を除去しかつプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。新鮮増殖培地およびサイトカインを添加し、そしてＤＣ培養を追加の４６時間継続し、その後ＨＵＶＥＣＳを０．１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β若しくは１ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで２時間刺激した。全ＲＮＡをトランスフェクション後４８時間に収集し、そして、Ａ２０、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−８およびＭＩＰ２αのｍＲＮＡ発現を検出するためのプライマー／プローブの組を使用するリアルタイムＰＣＲを実施する。表３０に示される各遺伝子の発現レベルは全ＲＮＡに対し正規化されており、そして値は未処理の対照サンプルに関するパーセントとして表す。１００％以上の値は炎症応答の誘導を示す一方、１００％未満の値は炎症応答の低下を示す。
Figure 2012029693
ＩＳＩＳ １３３７２６は、ＩＬ−１β刺激に応答してＩＣＡＭ−１、ＩＬ−８およびＭＩＰ２αの発現を阻害し、そして従って、炎症応答の阻害若しくは低下が望ましい状態、例えば慢性関節リウマチ、喘息および炎症性腸疾患のような状態の処置のための候補の剤である。逆に、ＩＳＩＳ １３３７２６はＴＮＦ−αの存在下でＩＬ−８の応答を刺激し、この刺激経路ではＣ反応性タンパク質の阻害が免疫応答を刺激し得、そして、免疫応答の刺激が望ましい状態、例えば免疫不全を特徴とする状態の処置のための候補の剤であることを示唆する。
ｉｎ ｖｉｖｏでのマウスＣ反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド：痩身マウス試験
さらなる一態様において、マウスＣ反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、標的発現、血清脂質、血糖および毒性の指標に対するそれらの効果について試験した。雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）に標準的げっ歯類飼料を給餌した。マウスに５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ １４７８６８（配列番号５８０）およびＩＳＩＳ １４７８８０（配列番号５９２）のそれぞれの腹腔内注入を与えた。各オリゴヌクレオチド処置群は５マウスよりなった。合計５匹の生理的食塩水を注入した動物が対照としてはたらいた。注入は週２回２週間投与した。処置期間の終了時にマウスを殺した。週１回記録した体重、また、剖検で記録した肝および脾重量にも有意の変化は観察されなかった。
肝でのＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡ発現を、本明細書の他の実施例により記述されるところのリアルタイムＰＣＲにより測定した。５０ｍｇ／ｋｇ用量のＩＳＩＳ １４７８６８およびＩＳＩＳ １４７８８０はマウスＣ反応性タンパク質ｍＲＮＡのそれぞれ４８％および５％の減少をもたらした。
ＡＬＴ、ＡＳＴ、コレステロール（ＣＨＯＬ）、血糖（ＧＬＵＣ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ）およびトリグリセリド（ＴＲＩＧ）の慣例の臨床分析のため血清を収集した。これらのパラメータはＯｌｙｍｐｕｓ臨床検査装置（Ｐｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州メルビル）を使用する慣例の手順により測定した。データを表３１に提示する。
Figure 2012029693
これらのデータは、ＩＳＩＳ １４７８６８若しくはＩＳＩＳ １４７８８０での処置が測定した血清パラメータの変化をもたらさなかったことを示す。一緒に、これらの結果は、ＩＳＩＳ １４７８６８が毒性を引き起こすことなくｉｎ ｖｉｖｏでＣ反応性タンパク質のｍＲＮＡ発現を低下させたことを具体的に説明する。ＩＳＩＳ １４７８８０はマウスで毒性を引き起こさなかった。

Claims (29)

  1. Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ１５ないし３０核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子の最低８核酸塩基部分に１００％相補性であり、かつ、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡの発現を阻害し、かつ、配列番号１８６の配列またはその最低８核酸塩基のフラグメントを含むことを特徴とする、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  2. ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  3. ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  4. キメラオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  5. 化合物の少なくとも一部分がＲＮＡとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド−ＲＮＡ二重鎖を形成する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  6. 最低１個の改変されたヌクレオシド間結合、糖部分若しくは核酸塩基を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  7. 最低１個の２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  8. 最低１個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  9. 最低１個の５−メチルシトシンを有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  10. 配列番号１８６の配列が、２ないし５個の隣接する２’Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、かつ、全部のシチジン残基が５−メチルシチジンである、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  11. 一本鎖である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  12. Ｃ反応性タンパク質の発現が阻害されるように、細胞若しくは組織を請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含んでなる、細胞若しくは組織中でのＣ反応性タンパク質の発現の阻害方法。
  13. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなるキット若しくはアッセイ装置。
  14. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含んでなるＣ反応性タンパク質と関連する疾患若しくは状態を有する動物の予防若しくは処置用の製薬学的製剤。
  15. 疾患若しくは状態が心血管系障害である、請求項１４に記載の製薬学的製剤。
  16. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とするヒトＣ反応性タンパク質を発現する生物学的系におけるＣ反応性タンパク質の発現の阻害剤。
  17. 生物学的系がヒトである、請求項１６に記載の阻害剤。
  18. Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ８ないし８０核酸塩基のオリゴ若しくはポリヌクレオチドであって、前記分子の最低８核酸塩基部分に相補的であり、かつ、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡの発現を阻害するオリゴ若しくはポリヌクレオチドを有効成分として含んでなる、哺乳動物組織中での脂肪細胞分化を阻害するための製剤。
  19. 哺乳動物組織が代謝性疾患を有する哺乳動物からの組織である、請求項１８に記載の製剤。
  20. 代謝性疾患が、肥満、高脂血症、アテローム硬化症、アテローム発生、糖尿病および高血圧よりなる群から選択される、請求項１９に記載の製剤。
  21. Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ８ないし８０核酸塩基のオリゴ若しくはポリヌクレオチドであって、前記分子の最低８核酸塩基部分に相補的であり、かつ、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡの発現を阻害するオリゴ若しくはポリヌクレオチドを有効成分として含んでなる、幹細胞若しくは前駆細胞の多能性の表現型を維持するための製剤。
  22. Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ８ないし８０核酸塩基のオリゴ若しくはポリヌクレオチドであって、前記分子の最低８核酸塩基部分に相補的であり、かつ、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡの発現を阻害するオリゴ若しくはポリヌクレオチドを有効成分として含んでなる、哺乳動物組織中でのアポトーシスを阻害するための製剤。
  23. 哺乳動物組織が神経変性性障害を有する哺乳動物からの組織である、請求項２２に記載の製剤。
  24. Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ８ないし８０核酸塩基のオリゴ若しくはポリヌクレオチドであって、前記分子の最低８核酸塩基部分に相補的であり、かつ、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡの発現を阻害するオリゴ若しくはポリヌクレオチドを有効成分として含んでなる、哺乳動物組織中での血管新生を阻害するための製剤。
  25. 哺乳動物組織が、癌、糖尿病性網膜症、心血管系疾患、慢性関節リウマチおよび乾癬よりなる群から選択される状態を有する哺乳動物からの組織である、請求項２４に記載の製剤。
  26. Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ８ないし８０核酸塩基のオリゴ若しくはポリヌクレオチドであって、前記分子の最低８核酸塩基部分に相補的であり、かつ、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡの発現を阻害するオリゴ若しくはポリヌクレオチドを有効成分として含んでなる、哺乳動物組織中での炎症応答を阻害若しくは低下するための製剤。
  27. 哺乳動物組織が、慢性関節リウマチ、喘息および炎症性腸疾患よりなる群から選択される疾患を有する哺乳動物からである、請求項２６に記載の製剤。
  28. Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ８ないし８０核酸塩基のオリゴ若しくはポリヌクレオドであって、前記分子の最低８核酸塩基部分に相補的であり、かつ、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡの発現を阻害するオリゴ若しくはポリヌクレオチドを有効成分として含んでなる、免疫不全を伴う哺乳動物被験体を処置するための製剤。
  29. 心血管系疾患を包含する心血管系障害、代謝性疾患、肥満、高脂血症、アテローム硬化症、アテローム発生、糖尿病、高血圧、神経変性性障害、癌、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、喘息および炎症性腸疾患よりなる群から選択される１疾患の処置のための医薬品の製造における、Ｃ反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とし、前記分子の最低８核酸塩基部分に相補的であり、かつ、Ｃ反応性タンパク質のｍＲＮＡの発現を阻害する、長さ８ないし８０核酸塩基のオリゴ若しくはポリヌクレオチドの使用。
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