JP2012003284A - 全反射型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 走査型と全反射型との両方の機能を選択的に使用できるレーザー顕微鏡を提供する。
【解決手段】 走査型のレーザー顕微鏡２は、光源４から出射したビームを対物レンズ３４を介して標本３８上に照射して、この標本３８から蛍光を発生させる照射手段を有する。さらに、全反射型顕微鏡として、上記構成に加えて、ビームを対物レンズ３４の瞳位置と共役な位置に集光させるレンズ１０と、このビームに対して平行に所定の距離オフセットさせ、対物レンズ３４の中心からオフセットさせた位置にこのビームを入射するとともに、この対物レンズ３４で屈折させて標本３８に対してビームを斜めに入射し、カバーガラス３６と標本３８との界面で全反射させる平行平面板１２とを備え、集光レンズ１０と平行平面板１２とをそれぞれ照射手段に対して挿脱可能な装置で挿入する挿脱装置８と、レーザー走査装置１６を所定の角度に保持する保持手段とを有する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、例えば、生物学や医学などの用途に用いられ、レーザー走査装置を備え、標本上にレーザービームを照射して励起された標本からの蛍光を検出して像を得るレーザー顕微鏡に関する。

このような形式の従来の走査型レーザー顕微鏡を図５を参照して説明する。走査型レーザー顕微鏡１０２は、レーザー光源１０４からレーザービーム（以下、ビームという）を所定の方向に出射させ、ビームエクスパンダ１０６でこのビームを任意の径に拡大させて出射させる。また、ダイクロイックミラー１０８で、入射されたビームを直角の方向に反射させ、このビームを１対のガルバノメータスキャナ１１０ｘ，１１０ｙで、それぞれＸ、Ｙ方向に走査する。そして、瞳投影レンズ１１２を介してビームを所定の距離で集光させ、折り返しミラー１１４で結像レンズ１１６へと反射させ、このビームを対物レンズ１１８を介してカバーガラス１２０が載置された標本１２２に照射する。

この結果、標本１２２からは、この標本１２２の特性に対応した蛍光が発せられる。この蛍光は、対物レンズ１１８および結像レンズ１１６などを介して前記ダイクロイックミラー１０８に入射する。このダイクロイックミラー１０８に入射した蛍光は透過し、共焦点レンズ１２４を介して、共焦点ピンホール１２６で焦点を結ぶ。そして、レーザーカットフィルタ１２８を介して選択された蛍光のみを光電子倍増管１３０に入射し、入射光量に応じた電気信号に光電変換させる。

そして、この電気信号をガルバノメータスキャナ１１０ｘ，１１０ｙの走査角度に同期して画像メモリに蓄積し、ビデオ信号に同期して読み出して、画像モニタ上に画像を表示させる。

このような走査型レーザー顕微鏡では、用途が特定されており、汎用性が制限されるという問題があった。この問題点を解決した顕微鏡として、特開平６−２７３８５号公報で開示されている走査型レーザー顕微鏡が知られている。
この走査型レーザー顕微鏡１４４は、図６に示すように、切り替え可能な第１の光路（顕微鏡観察用光路：実線）１４６と、第２の光路（肉眼視観察用光路：破線）１４８とを備えている。

まず、この顕微鏡の光路を顕微鏡観察用の第１の光路１４６に設定した場合について説明する。
この顕微鏡１４４は、レーザー光源１５０から出射されたレーザービーム（以下、ビームという）をビームエクスパンダ１５２に入射させる。このビームエクスパンダ１５２は、順に集束レンズ１５４と、ピンホール１５６と、ラインフィルタ１５８と、コリメータレンズ１６０と、ミラー１６２とを備えている。なお、コリメータレンズ１６０とミラー１６２とは、光路上を一体となって挿脱可能な第１のスライダ１６４上に設置されている。
そして、ミラー１６６を介してビームを反射させ、ビームに対して傾けられたダイクロイックミラー１６８に入射させる。このダイクロイックミラー１６８は、このビームを透過させ、ミラー１７０を介してビームを反射させる。また、ミラー１７２を介してビームを反射させる。なお、このミラー１７２は、光路上を挿脱可能な第２のスライダ１７４上に設置されている。
そして、ガルバノメータスキャナ１７６を介してビームを走査し、瞳投影レンズ１７８を介してこのビームを所定の距離で集光させる。そして、対物レンズ１８０を介して標本１８２上にビームを集光、照射させる。

この標本１８２から発せられる蛍光を対物レンズ１８０、瞳投影レンズ１７８などを順に遡って、ダイクロイックミラー１６８に入射させる。このダイクロイックミラー１６８は、蛍光を反射させ、スポット投影レンズ１８４、共焦点ピンホール１８６、レーザーカットフィルタ１８８および光電子倍増管１９０を順に介して、標本１８２の像を得る。

一方、この顕微鏡が肉眼視観察用の第２の光路１４８に設定した場合について説明する。この場合、上記の構成から第１および第２のスライダ１６４，１７４が顕微鏡観察用の光路から外されている。
その代わりに、ラインフィルタ１５８を透過したビームを、前記コリメータレンズ１６０よりも大径の他のコリメータレンズ１９２に入射させ、平行光にする。そして、コレクターレンズ１９４を介して前記ガルバノメータスキャナ１７６付近でビームを集光させ、このビームを反射させる。そして、このビームを瞳投影レンズ１７８を介して、観察光学プリズム１９６に入射させるが、このプリズム１９６は、ビームを透過させる。そして、対物レンズ１８０を介して標本１８２にビームを照射させる。
この標本１８２から発せられた蛍光を対物レンズ１８０を介してプリズム１９６に入射させ、このプリズム１９６内で複数回反射させ、所定の方向に出射させる。この蛍光をレーザーカットフィルタ１９８を介して、肉眼視する。

従って、観察光学プリズム１９６を光路上から外し、第１および第２のスライダ１６４，１７４を光路上に入れると、従来と同様な共焦点顕微鏡観察用の光学系が構成される。

一方、観察光学プリズム１９６を光路上に入れ、第１および第２のスライダ１６４，１７４を光路上から外すと、肉眼視観察用の光学系が構成される。
従って、上記の構成の顕微鏡では、２つのスライダ１６４，１７４を光路上から挿脱して、同一のレーザー光源１５０を顕微鏡観察用の光源および肉眼視観察用の光源としても使用することができる。

ところで、近年より、生体細胞の機能解析が盛んに行なわれるようになっている。これら細胞の機能解析の中で、特に細胞膜の機能を解析するために、細胞膜およびその近傍からの蛍光のみを検出するために、全反射型顕微鏡が用いられるようになっている。
全反射型顕微鏡は、近接場光学（レーザー）顕微鏡の一種である。この顕微鏡は、標本をそれぞれ屈折率の異なる標本とカバーガラスとの界面におけるエバネッセント場で励起して、標本の特性に対応した蛍光を標識させるものである。この顕微鏡では、カバーガラスと標本（主に細胞膜）との間の屈折率の差を利用して、対物レンズの中心からオフセットされた位置からカバーガラスに向けて斜めに照明光（レーザービーム）を導く。このカバーガラス内でレーザービームを全反射させて、カバーガラスから僅かに滲み出るレーザービームで標本を励起させる。エバネッセント場は、界面から遠ざかるにつれて、指数関数的に減衰する。可視光領域では、ガラスと水（生細胞）との界面では、１００ｎｍ〜２００ｎｍの滲み出し深さを得ることは容易で、この滲み出し深さが、深さ方向の空間分解能として得られる。

しかしながら、上記の一般的な走査型レーザー顕微鏡および特開平６−２７３８５号公報による顕微鏡は、特に細胞膜の機能を解析するための装置としては、十分な性能を発揮できないことがある。また、走査型レーザー顕微鏡と、細胞膜の機能を解析するのに適した全反射型レーザー顕微鏡との両方を揃えると、コスト高になるという欠点がある。
また、特開平６−２７３８５号公報による顕微鏡では、２つの光路が設けられ、２つの観察系を備えているが、２つの異なる顕微鏡としての機能を有するものではない。

本発明は、このような事情によりなされ、走査型レーザー顕微鏡としての機能を備えているとともに、簡単な操作で全反射型レーザー顕微鏡としての機能をも備え、それぞれの顕微鏡に切り替えて選択的に使用することができるレーザー顕微鏡を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明のレーザー顕微鏡は、レーザー光源と、このレーザー光源から発せられたレーザービームを走査するレーザー走査装置と、このレーザービームを対物レンズを介して標本上に照射して、この標本から蛍光を発生させる照射手段と、前記標本の像を得るようにこの蛍光を検出する検出手段とを備えている。そして、前記レーザービームを前記対物レンズの瞳位置と共役な位置に集光させる集光レンズと、このレーザービームに対して平行に所定の距離オフセットさせ、前記対物レンズの中心からオフセットさせた位置にこのレーザービームを入射させるとともに、この対物レンズで屈折させて前記標本に対してレーザービームを斜めに入射させ、前記標本に接するように配置された透明でかつ前記標本に接する面が平坦なカバー材、または前記標本が接するように保持された透明でかつ前記標本に接する面が平坦な標本保持部材と、前記標本との界面で前記レーザービームを全反射させるオフセット手段と、前記集光レンズと前記オフセット手段とをそれぞれ単体もしくは一体にして前記レーザービームの光路上に入れる第１の位置と光路上から外す第２の位置とに挿脱可能な挿脱手段とをさらに備えていることを特徴とするものである。
このような構成にすることにより、走査型レーザー顕微鏡を全反射型レーザー顕微鏡としても使用することができ、用途に合わせて機能を選択することができるので、コストを低下させることができる。

本発明によれば、走査型レーザー顕微鏡としての機能を備えているとともに、簡単な操作で全反射型レーザー顕微鏡としての機能をも備え、それぞれの顕微鏡を選択的に使用することができるレーザー顕微鏡を提供することができる。このため、走査型および全反射型の両方のレーザー顕微鏡をそれぞれ揃えるよりも、コストを大きく低下させることができる。

第１の実施の形態にかかる、肉眼視で全反射型レーザー顕微鏡観察を行なう場合のレーザー顕微鏡の概略的な説明図。 第１の実施の形態にかかる、撮像装置で全反射型レーザー顕微鏡観察を行なう場合のレーザー顕微鏡の概略的な説明図。 第１の実施の形態にかかる、共焦点走査型レーザー顕微鏡観察を行なう場合のレーザー顕微鏡の概略的な説明図。 第２の実施の形態にかかる、レーザー顕微鏡を示す概略的な説明図。 従来の実施の形態にかかる、走査型レーザー顕微鏡を示す概略的な説明図。 従来の実施の形態にかかる、走査型レーザー顕微鏡を示す概略的な説明図。

以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。

（第１の実施の形態）
まず、第１の実施の形態について図１ないし図３を参照して説明する。
始めに、肉眼で全反射型レーザー顕微鏡観察を行なう場合について、図１を用いて説明する。

図１に示すように、レーザー顕微鏡２は、出射口（図示せず）から所定の方向にレーザービーム（以下、ビームという）を出射するレーザー光源４を備えている。このレーザー光源４の前方には、複数の光学部材を有し、ビームを所定の径に拡大させるビームエクスパンダ６が設けられている。このビームエクスパンダ６の前方には、挿脱装置（挿脱手段）８が設けられている。この挿脱装置８は、ビームの光路上に順に集光レンズ１０と平行平面板（屈折光学系）１２とを備えている。この集光レンズ１０は、後述するガルバノメータスキャナ１６ｘ，１６ｙ間のほぼ中央にビームを集光させる。
また、この平行平面板１２は、互いに平行な２つの面を備え、これら面に対して垂直な軸回りに回動可能に枢支されている。このため、この平行平面板１２の平行な２つの面の一方の面に入射されたビームを他方の面から出射させる場合、この平行平面板１２の回動角度に応じて、前記出射口から出射されたビームの光路に対して平行に所定の距離オフセットさせて出射させることができる。

なお、この挿脱装置８は、手動もしくは電動で光路上から挿脱させることができる。すなわち、この挿脱装置８をビームの光路上に配置される第１の位置と、光路上から外す第２の位置とに手動もしくは電動で移動させることができる。また、これら集光レンズ１０および平行平面板１２をそれぞれ単体として光路上から手動もしくは電動で挿脱させることもできる。すなわち、これら集光レンズ１０および平行平面板１２をそれぞれ第１の位置と第２の位置とに手動もしくは電動で移動させることができる。ここでは、これら集光レンズ１０および平行平面板１２は、第１の位置に配置されている。

そして、この挿脱装置８の前方には、ビームの光路に対して４５°傾けられたダイクロイックミラー１４が設けられている。このダイクロイックミラー１４は、ビームを反射させ、このビームよりも長い波長域の光を透過させるようになっている。このため、このミラー１４の中央から所定の方向にオフセットされて入射されたビームを直角に反射させる。
このビームの光路には、１対のガルバノメータスキャナ（レーザー走査装置）１６ｘ，１６ｙが互いに平行に設けられているとともに、ビームの光路に対してそれぞれ所望の角度に傾けられている。これらスキャナ１６ｘ，１６ｙは、それぞれＸ方向、Ｙ方向にビームを移動させて、後述する標本３８上を走査させるように、可動に形成されている。なお、ここでいうＸ方向、Ｙ方向とは、後述するカバーガラス３６と標本３８との界面上に採られている。また、ここでは、これらガルバノメータスキャナ１６ｘ，１６ｙをビームに対して所望の角度（ここでは４５°）傾けた状態に保持して使用する。すなわち、ダイクロイックミラー１４に反射されたビームを１対のガルバノメータスキャナ１６ｘ，１６ｙの中央から所定の方向にオフセットさせた位置に入射させる。このビームをそれぞれ直角に反射させるので、ガルバノメータスキャナ１６ｙで反射されたビームは、ダイクロイックミラー１４で反射されたビームに対して平行な光路を有する。

このビームの光路上には、標本３８にビームを照射させる照射手段が設けられている。この照射手段は、瞳投影レンズ１８を備え、この瞳投影レンズ１８の中央からオフセットされた位置にビームを入射させる。そして、このビームを任意の角度に屈折して出射させる。
この瞳投影レンズ１８の前方には、第１および第２のキューブ２０ａ，２０ｂを備えたターレット２０が配設されている。第１のキューブ２０ａと第２のキューブ２０ｂとの中央には、枢軸が設けられている。このため、ターレット２０を枢軸の周りに回転させることができ、光路に対して第１のキューブ２０ａと第２のキューブ２０ｂとを選択的に配置させることができる。

そして、第１のキューブ２０ａには、光路に対して所定の角度傾けられたミラー２２が配設されている。また、第２のキューブ２０ｂには、ダイクロイックミラー２４とレーザーカットフィルタ２６とが配設されている。なお、ターレット２０に対してビームが入射および出射される方向には、図示しない開口が設けられている。ここでは、第１のキューブ２０ａに設けられたミラー２２が光路上に配置されている。すなわち、瞳投影レンズ１８から出射されたビームをミラー２２で反射させる。
そして、このビームの光路上には、入射されたビームを透過させ、標本からの蛍光を反射するダイクロイックコーティングが施された観察光学プリズム２８が設けられている。なお、この観察光学プリズム２８は、光路上から挿脱させることができる。すなわち、この観察光学プリズム２８をビームの光路上に配置する第１の位置と、光路上から外す第２の位置とに移動可能である。ここでは、この観察光学プリズム２８は、第１の位置に配置されている。

そして、このビームの光路上には、結像レンズ３０が設けられている。透過されたビームをこの結像レンズ３０の中央から所定の距離オフセットさせた位置に入射させる。このレンズ３０を出射されたビームを後述する対物レンズ３４の瞳位置３２に集光させる。
なお、この瞳位置３２と、前記ガルバノメータスキャナ１６ｘ，１６ｙ間のほぼ中間の位置とは、共役に設定されている。

このビームの光路上には、対物レンズ３４が設けられている。一般に、全反射型レーザー顕微鏡観察には、高ＮＡを有する対物レンズが使用される。これは、この種の観察手法が行なわれる観察対象、すなわち標本３８は、一般的には生細胞なので、基本的にその屈折率は水（１．３３）とほぼ同じである。このため、カバーガラス３６と標本３８との界面で全反射を生じさせるには、対物レンズ３４のＮＡは、１．３３よりも大きくなければならない。

そして、前記対物レンズ３４の中央からオフセットさせた位置にビームを入射させる。この対物レンズ３４の前方には、ビームを透過、もしくは屈折させる透明なカバー材（ここではカバーガラス）３６が設けられている。このカバーガラス３６は、標本３８に接する面が平坦に形成されている。なお、この顕微鏡２が倒立型の場合は、通常、シャーレの底部もしくはスライドガラスなどの標本保持部材が透明なカバー材３６として働く。
前記対物レンズ３４を出射されたビームをカバーガラス３６に斜めから照射（入射）させる。このビームをカバーガラス３６と標本３８との界面で全反射させる。そして、カバーガラス３６の界面から僅かに滲み出る励起光（エバネッセント場）で標本３８を励起させて、標本の特性に応じた蛍光を発生させる。

標本３８から発せられた蛍光を対物レンズ３４および結像レンズ３０を介して観察光学プリズム２８に入射させる。この蛍光をこのプリズム２８内で複数回反射させ、所定の方向に出射させる。この蛍光の光路上には、所望の蛍光のみを出射させるレーザーカットフィルタ４０が設けられている。従って、肉眼で標本３８の観察を行なうことができる。

次に、ＣＣＤカメラのような撮像装置で全反射型レーザー顕微鏡観察を行なう場合について、図２を用いて説明する。以下、同一の部材には、上記で用いた符号を使用し、詳しい説明を省略する。

前記ターレット２０は、回転され、第２のキューブ２０ｂに設けられたダイクロイックミラー２４とレーザーカットフィルタ２６とが光路上に配置されている。このダイクロイックミラー２４は、ビームを反射させ、このビームよりも長い波長域の光を透過させるようになっている。このため、ミラー２２を用いた場合と同様に、瞳投影レンズ１８から出射されたビームを反射させる。
また、観察光学プリズム２８は、第２の位置にあり、光路上から外されている。このため、ダイクロイックミラー２４で反射されたビームを直接、結像レンズ３０に入射させる。
従って、標本３８の特性に応じた蛍光を対物レンズ３４および結像レンズ３０を順に遡って、ダイクロイックミラー２４に入射させるとともにこのミラー２４を透過させて、この蛍光をレーザーカットフィルタ２６に入射させる。そして、この蛍光の光路上には、撮像装置（ここではＣＣＤカメラ）４２が設けられている。従って、この蛍光をＣＣＤカメラ４２によって撮像し、図示しない画面に表示させて観察を行なうことができる。

最後に、走査型レーザー顕微鏡観察を行なう場合について、図３を用いて説明する。
前記挿脱装置８は、第２の位置にあり、光路上から外されている。すなわち、集光レンズ１０と平行平面板１２とは、第２の位置にあり、光路上から外されている。また、ターレット２０は、回転され、第１のキューブ２０ａに設けられたミラー２２が光路上に配置されている。また、観察光学プリズム２８も、第２の位置にあり、光路から外されている。

従って、レーザー光源４で出射されたビームをビームエクスパンダ６を介して径を拡大させ、ダイクロイックミラー１４のほぼ中央に入射させる。このダイクロイックミラー１４は、ガルバノメータスキャナ１６ｘの方向に向けてビームを反射させる。なお、上述したように、ガルバノメータスキャナ１６ｘ，１６ｙは、可動に形成されている。

瞳投影レンズ１８を介してミラー２２で反射されたビームを結像レンズ３０を介して対物レンズ３４に入射させる。対物レンズ３４は、このビームで標本３８上にスポットを形成する。そして、ガルバノメータスキャナ１６ｘ，１６ｙの走査角度に応じて、スポットで標本３８上を走査させる。この標本３８の特性に応じて発生された蛍光を対物レンズ３４、結像レンズ３０、ミラー２２、瞳投影レンズ１８、ガルバノメータスキャナ１６ｙ，１６ｘを順に遡って、ダイクロイックミラー１４に入射させる。このダイクロイックミラー１４は、この蛍光を透過させる。また、この蛍光の光路上には、共焦点レンズ４４が設けられ、入射された蛍光を所定の焦点距離に集光させる。この集光位置には、ピンホール４６が設けられている。そして、この光路上には、レーザーカットフィルタ４８が設けられ、所定の波長域のビームをカットする。そして、このフィルタ４８の前方には、光電子倍増管５０が設けられている。光電子倍増管５０に入射されたビームを、この入射光量に応じて電気信号に光電変換させる。そして、この電気信号を前記ガルバノメータスキャナ１６ｘ，１６ｙの走査角度に同期して画像メモリに蓄積させ、ビデオ信号に同期して読み出して、画像モニタ上に画像を表示させて観察を行なうことができる。
従って、上記のような構成で、走査型レーザー顕微鏡観察と、肉眼視またはＣＣＤカメラによる全反射型レーザー顕微鏡観察とを切り替えて使用することができる。このため、１つの顕微鏡で、２つの機能を有する顕微鏡を提供することができる。

なお、本実施の形態では、平行平面板１２は、第１の位置と第２の位置とを移動可能としたが、走査型レーザー顕微鏡として使用する場合、平行な２つの面をビームの光路に対して直角に配置させることが可能であれば第１の位置に配置したままでもよい。

（第２の実施の形態）
次に、第２の実施の形態について、図４を参照して説明する。本実施の形態は、第１の実施の形態の構成と同一部分を備えているので、これらの部分については、説明を省略する。また、第１の実施の形態で用いた部材については、同じ符号を使用して、説明を省略する。

図４に示すように、レーザー顕微鏡２は、制御器６０を備えている。この制御器６０は、それぞれ後述する集光レンズターレット６２と、平行平面板駆動装置６４と、ターレット２０と、観察光学プリズム駆動装置６６と、対物レンズ３４のレボルバ６８とにそれぞれ接続されている。
ビームエクスパンダ６とダイクロイックミラー１４との間には、集光レンズターレット６２が設けられている。この集光レンズターレット６２は、集光レンズ６２ａと、凸レンズおよび凹レンズの組み合わせにより、単レンズの集光レンズ６２ａよりも長い焦点距離を有する集光レンズシステム６２ｂと、図示しない空穴とを備えている。すなわち、この集光レンズターレット６２は、３段切り替えとなっている。この空穴がビームエクスパンダ６から出射されたビームの光路上に配置された場合、このビームをコリメート光の状態を保って直進させる。なお、この集光レンズターレット６２は、制御器６０で制御される。

従って、走査型レーザー顕微鏡観察を行なう場合、集光レンズターレット６２は、空穴が光路上に設定される。また、全反射型レーザー顕微鏡観察を行なう場合、集光レンズ６２ａもしくは集光レンズシステム６２ｂが光路上に配置される。そして、これら集光レンズ６２ａおよび集光レンズシステム６２ｂについて説明する。

上述のように、一般に、全反射型レーザー顕微鏡観察には、高ＮＡを有する対物レンズが使用される。例えば、対物レンズのＮＡが１．６５の場合、屈折率差（１．６５−１．３３＝０．２２）に余裕があるので、結像レンズ３０から対物レンズ３４に向けて出射させるビームのＮＡは、大きくすることができる。しかし、対物レンズ３４のＮＡが１．４の場合、屈折率差は０．０７しかなく、効率の良い照明を行なうには、結像レンズ３０から対物レンズ３４への出射ビームのＮＡは、かなり小さなものにする必要がある。また、結像レンズ３０から対物レンズ３４への出射ビームのＮＡは、小さければよいというものではなく、この値が小さすぎると、照明範囲を十分に得ることができなくなる。

なお、ビームエクスパンダ６から出射されるビームの光束をΦｏとすると、対物レンズ３４から出射されるビームの光束Φｏｂは、以下の式で表せられる。
Φｏｂ＝Φｏ×Ｆ’／（Ｆ×Ｂ）
ここで、Ｂは対物レンズ３４の倍率、Ｆ’は瞳投影レンズ１８の焦点距離、Ｆは集光レンズ６２ａおよび集光レンズシステム６２ｂの焦点距離である。
従って、全反射型レーザー顕微鏡観察を行なう場合、結像レンズ３０から対物レンズ３４への出射ビームのＮＡは、対物レンズ３４のＮＡと標本３８の屈折率との差を考慮して、最適な値にすることが必要である。

このため、本実施の形態では、光路に設定された対物レンズ３４の種類により、集光レンズ６２ａもしくは集光レンズシステム６２ｂが選択されて設置される。なお、対物レンズ３４は、レボルバ６８に装着され、制御器６０は、光路上に設置された対物レンズ３４の種類を自動判別して、集光レンズターレット６２を駆動させる。

次に、平行平面板１２について説明する。この平行平面板１２は、平行平面板駆動装置６４上に設置されている。この平行平面板１２は、集光レンズターレット６２とダイクロイックミラー１４との間に配設されている。また、平行平面板１２は、平行平面板駆動装置６４により、ビームの光路を有する面内で回動可能に枢支されている。

この平行平面板１２の回動角度は、走査型レーザー顕微鏡観察を行なう場合と、全反射型レーザー顕微鏡観察を行なう場合とで、それぞれ設定される。また、全反射型レーザー顕微鏡観察を行なう場合には、光路に設定された対物レンズ３４の種類により設定される。なお、対物レンズ３４は、レボルバ６８に装着され、制御器６０は、光路上に設置された対物レンズ３４の種類を検出して、これに対応する回転角に平行平面板１２が設定される。すなわち、光路に設定された対物レンズ３４の種類により、ビームの最適なオフセット量が設定される。この値は、対物レンズ３４の倍率とＮＡとの両者によって異なる。
また、走査型レーザー顕微鏡観察を行なう場合、対物レンズ３４の種類に関係なく、平行平面板１２は、ビームの光路に対して垂直に設定される。

次に、この顕微鏡２の制御系について説明する。走査型レーザー顕微鏡観察を行なう場合、集光レンズターレット６２は、空穴に設定される。平行平面板１２は、平行平面板駆動装置６４によって、光路に対して垂直に設定される。また、ターレット２０にはミラー２２が設定されるように制御され、観察光学プリズム２８は、観察光学プリズム駆動装置６６によって、光路から外されるように制御される。

全反射型レーザー顕微鏡観察を行なう場合、肉眼視観察を行なうか、ＣＣＤカメラ４２による観察を行なうかによって、ターレット２０が選択される。肉眼視観察を行なう場合にはミラー２２が、ＣＣＤカメラ４２による観察を行なう場合にはダイクロイックミラー２４とレーザーカットフィルタ２６とがそれぞれ光路上に設置されるように制御される。

さらに、使用する対物レンズ３４により、集光レンズターレット６２と、平行平面板１２の角度とが設定される。
本実施の形態では、集光レンズターレット６２に集光レンズ６２ａと集光レンズシステム６２ｂとが配置されたが、これらの代わりにズーム機能を有する集光レンズを用い、焦点距離を可変にしてもよい。また、それぞれ異なる焦点距離を有する複数の集光レンズを集光レンズターレット６２内に配置させ、これらを切り替えて用いてもよい。

従って、本実施の形態では、制御器６０を用いて、電動で走査型レーザー顕微鏡観察と全反射型レーザー顕微鏡観察とを切り替えることができる。また、全反射型レーザー顕微鏡観察を行なう場合には、使用する対物レンズ３４に最適な照明を行なうことができる。

なお、第２の実施の形態では、走査型レーザー顕微鏡観察を行なう場合、平行平面板１２は、ビームに対して直角になるように制御されるが、第１の実施の形態のように第２の位置に移動させるようにしてもよい。
また、第１および第２の実施の形態では、ビームをオフセットさせる手段として、平行平面板（屈折光学系）１２を用いて説明したが、複数のミラー（反射光学系）を使用するなど、ビームをオフセットさせることができれば、他の光学系を用いても構わない。

また、この平行平面板１２は、レーザー光源４とダイクロイックミラー１４との間に設けたが、例えば、ガルバノメータスキャナ１６ｙと瞳投影レンズ１８との間に設けるなど、他の位置に設けてもよい。
また、第１の実施の形態では、照射手段は、瞳投影レンズ１８から対物レンズ３４までを指すように示したが、ビームエクスパンダ６から瞳投影レンズ１８までも含まれる。
また、上述した顕微鏡では、正立型の走査型顕微鏡を例に説明したが、これに限るものではなく、例えば、倒立型の顕微鏡であってもよい。

これまで、いくつかの実施の形態について図面を参照しながら具体的に説明したが、本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で行なわれるすべての実施を含む。

２…レーザー顕微鏡、４…レーザー光源、８…挿脱装置、１０…集光レンズ、１２…平行平面板、１６ｘ，１６ｙ…ガルバノメータスキャナ、３４…対物レンズ、３６…カバー材、３８…標本。

本発明は、全反射型顕微鏡に関する。

本発明は、光路に設定された対物レンズの種類により、光の最適なオフセット量が設定される、全反射型顕微鏡を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明に係る全反射型顕微鏡は、光源と、前記光源からの光を複数種から選択される対物レンズを介して標本上に照射して、この標本から蛍光を発生させる照射手段と、前記標本の像を得るようにこの蛍光を検出する検出手段と、前記光の光路に設けられて前記光を前記対物レンズの瞳位置と共役な位置に集光させる集光レンズと、前記光源からの光を前記複数種から選択される対物レンズの中心に対してオフセットさせた位置に入射し、この対物レンズで屈折させて前記標本に対して前記光を斜めに入射させ、前記標本に接するように配置された透明でかつ前記標本に接する面が平坦なカバー材、または前記標本が接するように保持された透明でかつ前記標本に接する面が平坦な標本保持部材と、前記標本との界面で前記光を全反射させるオフセット手段と、前記複数種から選択される対物レンズの種類を検出して、前記対物レンズの瞳位置と共役な位置の集光位置を、前記複数種から選択される対物レンズの種類に合わせたオフセット量に前記オフセット手段を制御する制御部とを備えていることを特徴とする。

本発明によれば、光路に設定された対物レンズの種類により、光の最適なオフセット量が設定される、全反射型顕微鏡を提供できる。

Claims (3)

1. レーザー光源と、
   このレーザー光源から発せられたレーザービームを走査するレーザー走査装置と、
   このレーザービームを対物レンズを介して標本上に照射して、この標本から蛍光を発生させる照射手段と、
   前記標本の像を得るようにこの蛍光を検出する検出手段と、
   を具備したレーザー顕微鏡において、
   前記レーザービームを前記対物レンズの瞳位置と共役な位置に集光させる集光レンズと、
   このレーザービームに対して平行に所定の距離オフセットさせ、前記対物レンズの中心からオフセットさせた位置にこのレーザービームを入射させるとともに、この対物レンズで屈折させて前記標本に対してレーザービームを斜めに入射させ、前記標本に接するように配置された透明でかつ前記標本に接する面が平坦なカバー材、または前記標本が接するように保持された透明でかつ前記標本に接する面が平坦な標本保持部材と、前記標本との界面で前記レーザービームを全反射させるオフセット手段と、
   前記集光レンズと前記オフセット手段とをそれぞれ単体もしくは一体にして前記レーザービームの光路上に入れる第１の位置と光路上から外す第２の位置とに挿脱可能な挿脱手段と、
   をさらに具備したことを特徴とするレーザー顕微鏡。
2. 前記オフセット手段は、レーザービームを屈折させる屈折光学系、もしくは反射させる反射光学系を備えていることを特徴とする請求項１に記載のレーザー顕微鏡。
3. 前記集光レンズは、その焦点距離を変え得るズーム機構、もしくはそれぞれ異なる焦点距離を有する複数の集光レンズを切り替え可能に備えていることを特徴とする請求項１もしくは２に記載のレーザー顕微鏡。

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