JP2011527011A - マイクロ流体流れ制御のためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

マイクロチャネル内で流体流れを制御するためのシステムおよび方法は、すべてがマイクロチャネルと連通する、流体出口ウェルと１つまたは複数の流体入口ウェルとを備える流体回路を含む。負圧の差が出口ウェルに加えられ、入口ウェルからマイクロチャネルへの流体流れは、入口ウェルを大気圧に開放するまたは閉じることによって制御される。入口ウェルからの流体流れを停止するために、負圧の差を入口ウェルに加えて入口ウェルと出口ウェルの圧力を等しくすることができる。異なる入口ウェルを順次大気に開放して閉じることによって、制御された量の異なる試薬を連続的にマイクロチャネルに導入することができる。

Description

本発明は、マイクロ流体アッセイを実施するためのシステムおよび方法に関する。より詳細には、本発明は、マイクロチャネルを通る流れを制御するためのシステムおよび方法に関する。

核酸の検出は、医学、法科学、産業加工、動植物の育種、および多くの他の分野において中心的な役割を果たす。病状（たとえば、癌）、感染性微生物（たとえば、ＨＩＶ）、遺伝系統、遺伝子マーカーなどを検出する能力は、疾患の診断および予後診断、マーカー利用選抜、犯罪現場の特徴の正確な特定、産業微生物を繁殖させる能力、および多くの他の技法に関して広く普及している技術である。目的とする核酸の完全性の判定は、感染症または癌の病理学と関係することがある。少量の核酸を検出するための最も強力かつ基本的な技術の１つが、核酸配列の一部または全部を何回も複製し、次いで増幅産物を分析することである。ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）は、いくつかのさまざまな増幅技法のうちでおそらく最もよく知られている技法であろう。

ＰＣＲは、短いＤＮＡ断片を増幅するための強力な技法である。ＰＣＲを用いると、単一の鋳型ＤＮＡ分子から開始して何百万ものＤＮＡコピーを迅速に産生することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡを変性させて一本鎖にし、変性した鎖にプライマーをアニーリングして、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によりプライマーを伸長させるという３段階の温度サイクルを含む。このサイクルは、検出および分析に十分なコピーが得られるまで繰り返される。原理上は、ＰＣＲの各サイクルごとにコピーの数が２倍になり得る。実際には、各サイクルで達成される増加は常に２倍に満たない。そのうえ、ＰＣＲサイクルが続くと、必要な反応物の濃度が減少するので、増幅ＤＮＡ産物の増加は最終的に止まる。ＰＣＲに関する一般的な詳細については、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（２００５年までの補遺あり）、およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０年）を参照されたい。

リアルタイムＰＣＲは、反応を進行させつつ増幅ＤＮＡ産物の増加を典型的にはＰＣＲサイクルごとに１回測定するという、開発が進む一連の技法である。産物の蓄積を経時的に監視することによって、ＤＮＡ鋳型分子の初期濃度を推定するだけでなく、反応の効率を判定することができる。リアルタイムＰＣＲに関する一般的な詳細については、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ： Ａｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓら編、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕ．Ｋ．（２００４年）を参照されたい。

現在、増幅ＤＮＡの存在を示すいくつかの異なるリアルタイム検出化学技法（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）がある。これらのほとんどは、ＰＣＲプロセスの結果として性質が変化する蛍光指示薬によって決まる。これらの検出化学技法の中には、二本鎖ＤＮＡに結合すると蛍光収率を増加させるＤＮＡ結合色素（ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎなど）がある。他のリアルタイム検出化学技法は、フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用する。フェルスター共鳴エネルギー転移は、色素の蛍光収率が別の光吸収部分またはクエンチャーに対する近接度に大きく影響される現象である。これらの色素およびクエンチャーは、典型的にはＤＮＡ配列特異的なプローブまたはプライマーに取り付けられる。ＦＲＥＴベースの検出化学技法としては、加水分解プローブおよび立体配座プローブがある。加水分解プローブ（ＴａｇＭａｎ（登録商標）プローブなど）は、オリゴヌクレオチド・プローブに取り付けられたクエンチャー色素分子からレポーター色素分子を切断するためにポリメラーゼ酵素を使用する。立体配座プローブ（分子標識など）は、オリゴヌクレオチドに取り付けられた色素を利用する。標的ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの立体配座が変化すると、この色素の蛍光発光が変化する。

その開示が参照により本明細書に組み込まれ、本願の譲受人に譲渡された「Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ−Ｃｈａｎｎｅｌｓ」という名称の同時係属中の米国特許出願第１１／５０５，３５８号には、マイクロチャネルを流れつつ緩衝液などの非反応性流体の液滴（フローマーカーとして知られている）により互いに分離されている個々の液滴の中でＰＣＲを実施するプロセスが記載されている。

１つまたは複数のマイクロチャネルがその内部に形成されているマイクロ流体チップを含むマイクロチャネル内でＰＣＲなどのインラインアッセイ（ｉｎ−ｌｉｎｅ ａｓｓａｙ）を実施するためのデバイスが当技術分野で知られている。これらのチップは、チップ上面にある試料シッパチューブ（ｓｉｐｐｅｒ ｔｕｂｅ）および開放ポートを利用して、試薬および試料物質（たとえば、ＤＮＡ）を受け取ってチップ内のマイクロチャネルに送る。チップのプラットフォームは、チップ上面にある開放ポートにおいて典型的にはピペッタによって分注される試薬を受け取るように設計され、試薬は、典型的には各マイクロチャネルの反対端において適用される真空の影響下で開放ポートからマイクロチャネルに流れ込む。ＤＮＡ試料は、チップの下に延びるシッパチューブを介してマイクロポートプレートのポートからマイクロチャネルに供給され、マイクロチャネルに適用される真空によりシッパチューブを通して試料物質がポートから吸い出される。

米国特許出願第１１／５０５，３５８号 米国特許出願第１１／８５０，２２９号

ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００年） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（２００５年まで補遺あり） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０年） Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ： Ａｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓら編、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕ．Ｋ．（２００４年）

いくつかの応用例では、上面の開放ポートの全部からの流体がマイクロチャネルに流れ込むことが望ましいが、他の応用例では、流体が上面開放ポートの１つ以上全部未満から流れることが望ましい。同様に、典型的にはマイクロチップの下を延びるシッパチューブを介して異なる試薬をマイクロチャネルに導入するために、試薬をマイクロチャネルに導入するのに所望される順序に対応する順序で、シッパチューブを試薬容器から試薬容器に移動させることが必要である。これには、マイクロチップのマイクロ流体チャネル内でインラインアッセイを実施する処理機器がシッパチューブと異なる試薬容器の間の相対的移動を行う手段を含むことが必要である。加えて、マイクロチャネルから側方に突出するシッパチューブは非常に壊れやすく、そのため特別な扱い、包装、および出荷を必要とする。

本発明の態様は、流体が回路に導入される入口ポートと、この入口ポートと流体連通する少なくとも１つの流体流れ用マイクロチャネルと、このマイクロチャネルと流体連通する出口ポートとを含むマイクロ流体回路内の流体流れを制御する方法において実施される。この方法は、第１の圧力を出口ポートに加え、大気圧などの、第１の圧力より高い第２の圧力に入口ポートを開放することによって、入口ポートからマイクロチャネルへの流体流れを発生させるステップと、次いで入口ポートを第２の圧力に対して閉じて第１の圧力を入口ポートに加えることによって入口ポートからの流体流れを停止するステップとを含む。

本発明のさらなる態様は、マイクロ流体流れを制御するシステムにおいて実施される。このシステムは、流体が回路に導入される少なくとも１つの入口ポートと、この入口ポートと流体連通する少なくとも１つのマイクロ流体流れ用マイクロチャネルと、このマイクロチャネルと流体連通する出口ポートとを含むマイクロ流体回路を備える。システムは、出口ポートと連通する少なくとも１つの圧力源と、この圧力源と連通し、各入口ポートと機能的に関連付けられた弁機構とをさらに含む。この弁機構は、（１）圧力源によって生成される第１の圧力に、または（２）第１の圧力より高い第２の圧力に、入口ポートを選択的に接続するように適合される。

本発明のさらなる態様によれば、システムは、流体を入口ポートからマイクロチャネルに流れ込ませるために、圧力源に第１の圧力を出口ポートに加えさせ、弁機構に入口ポートを第２の圧力に開放させるように適合された制御装置を含む。入口ポートが所定の時間の間第２の圧力に開放された後で、制御装置は、入口ポートからマイクロチャネルへの流れを停止させるために、弁機構に入口ポートを第２の圧力に対して閉じさせ、入口ポートを圧力源に開放させる。

本発明のさらなる態様は、所定量の異なる反応流体をマイクロチャネルに順次導入する方法において実施される。この方法は、マイクロチャネルと、このマイクロチャネルと流体連通し、異なる反応流体がマイクロチャネルに導入される複数の入口ポートと、およびマイクロチャネルと流体連通する出口ポートとを含むマイクロ流体回路を提供するステップを含む。負圧の差が出口ポートに加えられ、所定の時間の間、他の入口ポートを閉じながら各入口ポートをより高い圧力に順次開放して、所定量の流体をその入口ポートからマイクロチャネルに流れさせ、さらにその所定の時間の後で、その入口ポートをより高い圧力に対して閉じ、時間の間、負圧の差をその入口ポートに開放して入口ポートとマイクロチャネルの入口の圧力を等しくし、次いで弁を入口ポートに対して閉鎖することによりその入口ポートからの流体流れを停止することによって、所定量の反応流体が入口ポートのそれぞれからマイクロチャネルに順次導入される。

本発明の上記および他の態様および実施形態について、下記で添付の図面を参照して説明する。

添付の図面は、本明細書に組み込まれて明細書の一部を形成し、本発明の種々の実施形態を示す。図面において、類似する参照番号は同一のまたは機能的に類似する要素を示す。

本発明の態様を実施するマイクロ流体チップおよび流れ制御システムの概略図である。 本発明の態様を実施するマイクロ流体チップおよび流れ制御システムの一代替実施形態の概略図である。 本発明の態様を実施するマイクロ流体チップおよび流れ制御システムの第２の代替実施形態の概略図である。 本発明の態様によりマイクロチャネル内で連続的なマルチプレックスアッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｓｓａｙ）を実施するステップを示す流れ図である。 マイクロチャネル内でのＤＮＡ、ポリメラーゼ、アッセイプライマー、および結果として生じる試料試験ストリーム（ｓａｍｐｌｅ ｔｅｓｔ ｓｔｒｅａｍ）の流れの時間履歴プロファイルを示す。 流れ計測を達成するための、マイクロ流体チップの流体入口ウェルへの負圧および大気圧の間欠的な適用の時間履歴プロファイルを示す。

本明細書では、「ａ」および「ａｎ」という単語は「１つまたは複数」を意味する。そのうえ、特に定義しない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が関連する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施にあたって本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を使用できるが、好ましい材料および方法を本明細書で説明する。

本発明の態様を実施するマイクロ流体流れ用のシステムが図１に示されている。このシステムはマイクロ流体回路を含み、図示の実施形態では、マイクロ流体回路はマイクロ流体チップ１０上にある。マイクロ流体チップ１０は、入口ポート１２、１４、１６と、この入口ポート１２、１４、１６と流体連通するマイクロチャネル２０と、同様にマイクロチャネル２０と流体連通する出口ポート１８とを含む。図１に示される実施形態は例示的なものである。マイクロ流体回路は、３つより多いまたは少ない入口ポートを含むことができるし、入口ポートのいくつかまたはすべてと連通する複数のマイクロチャネルを含むことができる。マイクロ流体回路は、複数の出口ポートを含むこともできる。流体は流体入口ポート１２、１４、および１６を通って回路に導入される。流体は、当技術分野で知られている任意の適切な方法で流体入口ポートに供給することができる。または別法として、流体は、その開示が参照により本明細書に組み込まれ、本願の譲受人に譲渡された米国特許出願第１１／８５０，２２９号「Ｃｈｉｐ ａｎｄ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ｄｅｓｉｇｎ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ａｓｓａｙｓ」に記載されている流体連通する方法で各ポートに結合された流体含有カートリッジを用いて、流体入口ポートに供給することができる。

マイクロ流体チップ１０は、ガラス、シリカ、石英、またはプラスチック、または他の任意の適切な材料から形成することができる。

流体は流体出口１８を通ってマイクロチャネル２０から回収され、たとえば本願の譲受人に譲渡された米国特許出願第１１／８５０，２２９号に記載されているチップなどの任意の適切な廃棄物リザーバに堆積させることができる。

回路を通る流体の動きは、出口ポート１８に加えられる負圧と入口ポート１２、１４、１６の１つまたは複数に加えられる負圧の差を用いて生成および制御される。出口ポート１８と入口ポート１２、１４、１６の１つまたは複数の間に負圧差を加えることによって、流体が入口ポート（複数可）からマイクロチャネル２０を通って出口ポート１８に流れる。圧力差は、負圧源２２などの１つまたは複数の圧力源によって生成することができる。圧力源は、一実施形態では真空ポンプを備えることができる。図示の実施形態では、出口ポート１８と入口ポート１２、１４、１６の間の圧力差は、入口ポート１２、１４、１６のそれぞれおよび出口ポート１８における圧力を制御する圧力制御弁を用いて制御される。

より具体的には、圧力制御弁３０は圧力源２２および出口ポート１８と連通して配置されている。同様に、圧力制御弁２４は入口ポート１２と連通して配置され、圧力制御弁２６は入口ポート１４と連通して配置され、圧力制御弁２８は入口ポート１６と連通して配置されている。３つより多い入口ポートを有する構成では、好ましくは各入口ポートと関連付けられた圧力制御弁を有する。図１の図示の実施形態では、弁２４、２６、２８は、関連付けられた各入口ポート１２、１４、１６をそれぞれ、丸で囲まれた文字「Ａ」で示される大気圧か、または代替圧力源のいずれかに選択的に接続できる三方弁である。代替圧力源は負圧源２２であってもよい。すなわち、図示の実施形態では、弁２４は、圧力ライン３２を介して圧力源２２と連通し、圧力ライン３４を介して入口ポート１２と連通する。弁２６は、圧力ライン３６を介して圧力源２２と連通し、圧力ライン３８を介して入口ポート１４と連通する。弁２８は、圧力ライン４０を介して圧力源２２と連通し、圧力ライン４２を介して入口ポート１６と連通する。弁３０は、圧力ライン４４を介して圧力源２２に接続され、圧力ライン４６によって出口ポート１８に接続される。図示の実施形態では、弁３０は、出口ポート１８を、丸で囲まれた「Ａ」で示される大気圧または圧力源２２のいずれかに選択的に接続する三方弁でもある。

圧力源２２および弁２４、２６、２８、３０は、制御装置５０によって制御することができる。制御装置５０は、制御ライン５２を介して圧力源２２に、制御ライン５４を介して弁２４に、制御ライン５６を介して弁２６に、制御ライン５８を介して弁２８に、制御ライン６０を介して弁３０に接続される。制御装置５０は、無線で、または当業者に知られている他の手段によって、種々の構成要素の１つまたは複数に接続することもできる。制御装置５０は、プログラムされたコンピュータまたは他のマイクロプロセッサを備えることができる。

上述のように、入口ポート１２、１４、および／または１６からマイクロチャネル２０を通って出口ポート１８に至る流体流れは、出口ポート１８と入口ポートの１つまたは複数の間に負圧差を加えることによって生成される。より具体的には、入口ポート１２からの流体流れを生成するために、負圧源２２を制御弁３０ならびに圧力ライン４４および４６を介して出口ポート１８に接続することによって、負圧が出口ポート１８に加えられる。入口ポート１２は弁２４によって大気圧に開放される。これによって、出口ポート１８と入口ポート１２の間に負圧の差が生じる。流体が入口ポート１２から流れている間の他の入口ポートからの流体流れが望ましくないと仮定して、入口ポート１４を弁２６によって大気圧に対して閉じ、入口ポート１６を弁２８によって大気圧に対して閉じる。入口ポート１２からの流体流れを停止するために、弁２４は、入口ポート１２を大気圧に対して閉じるように（たとえば、制御装置５０により）作動される。入口ポート１２からの流体の流れを迅速に停止するために、入口ポート１２とマイクロチャネルの入口の圧力を等しくするのに十分な時間の間、入口ポート１２を制御弁２４により負圧源２２に接続し、次いで制御弁２４を閉鎖してこの圧力平衡を維持することが望ましい場合がある。

出口ポート１８と適用可能な入口ポートの間の圧力差によって生成される流量が分かっていると仮定すると、流量を生成するために所望量の流体をマイクロチャネル２０に導入する時間の間、圧力差を維持することによって、所定量の流体を入口ポート１２、１４、および１６のいずれかからマイクロチャネル２０に導入することができる。圧力差の維持は、入口ポートおよび出口ポートに関連付けられた圧力制御弁を適切に制御することによって行うことができる。

制御弁２４の作動およびタイミングは制御装置５０によって制御することができる。

次に入口ポート１４からの流体流れを生成するために、弁２６が、負圧が出口ポート１８に加えられている間に入口ポート１４を大気圧に開放するように（たとえば、制御装置５０によって）作動され、したがって出口ポート１８と入口ポート１４の間に負圧の差が生じる。入口ポート１４からの流体流れは、入口ポート１４を大気圧に対して閉じるように弁２６を作動させることによって停止し、さらに、入口ポート１４からの流れを迅速に停止するために、弁２６は、マイクロチャネルの入口と入口ポート１４の圧力を等しくするのに十分な時間の間、入口ポート１４を負圧源２２に開放し、次に弁２６を閉鎖してこの圧力平衡を維持する。

同様に、入口ポート１６からの流体流れを生成するために、弁２８が、負圧が出口ポート１８に加えられている間に入口ポート１６を大気圧に開放するように（たとえば、制御装置５０によって）作動され、したがって出口ポート１８と入口ポート１６の間に負圧の差が生じる。入口ポート１６からの流体流れは、入口ポート１６を大気圧に対して閉じるように弁２８を作動させることによって停止し、さらに、入口ポート１６からの流れを迅速に停止するために、弁２８は、マイクロチャネルの入口と入口ポート１６の圧力を等しくするのに十分な時間の間、入口ポート１６を負圧源２２に開放し、次に弁２８を閉鎖する。

図２および図３は、マイクロ流体回路の出口ポートと入口ポートの１つまたは複数の間の圧力差を制御するための代替構成を示す。図２は、各入口ポート１２、１４、１６が、１つの三方弁ではなく２つの二方弁に結合されている点を除いて、図１に示されるシステムと類似のシステムを示す。より具体的には、入口ポート１２は、入口ポート１２を圧力ライン３２および６２を介して圧力源２２に選択的に接続する第１の二方弁２４ａに結合される。入口ポート１２はまた、入口ポート１２を圧力ライン６４を介して大気圧「Ａ」に選択的に接続する第２の二方弁２４ｂにも結合される。

同様に、入口ポート１４は、ポート１４を圧力ライン３６および６６を介して圧力源２２に選択的に接続する第１の二方弁２６ａに、ならびに入口ポート１４を圧力ライン６８を介して大気圧に選択的に接続する第２の二方弁２６ｂに結合される。入口ポート１６は、入口ポート１６を圧力ライン４０および７０を介して圧力源２２に選択的に接続する第１の二方弁２８ａに、ならびに入口ポート１６を圧力ライン７２を介して大気圧に選択的に接続する第２の二方弁２８ｂに結合される。

図２に示されるシステムでは、出口ポート１８は、出口ポート１８を圧力ライン４４および４６を介して圧力源２２に選択的に接続する二方弁７６に結合される。

制御装置５０は、制御ライン５２を介して負圧源２２を制御し、制御ライン６０を介して二方弁７６を制御し、制御ライン７２を介して二方弁２４ａを制御し、制御ライン７４を介して二方弁２４ｂを制御する。制御装置５０はまた、これらの弁を制御するために弁２６ａ、２６ｂ、２８ａ、および２８ｂにも連結されるが、図が不必要に乱雑になるのを避けるために、制御装置５０とそれぞれの弁の間の制御接続は図２に示さない。

図３は、本発明の態様を実施するシステムの一代替構成を示す。図３の実施形態では、各入口ポート１２、１４、１６は、圧力源＃１ ２２または圧力源＃２ ８０のいずれかにポートを選択的に接続する三方弁に結合される。より具体的には、入口ポート１２は、圧力ライン８８、９０、および１００を介して圧力源＃１ ２２に、または圧力ライン９６、９８、および１００を介して圧力源＃２ ８０に、入口ポート１２を選択的に接続するように構成された弁８２に結合される。入口ポート１４は、圧力ライン９０および１０２を介して圧力源＃１ ２２に、または圧力ライン９６および１０２を介して圧力源＃２ ８０に、入口ポート１４を選択的に接続するように構成された弁８４に結合される。入口ポート１６は、圧力ライン９０、９２、および１０４を介して圧力源＃１ ２２に、または圧力ライン９６、９４、および１０４を介して圧力源＃２ ８０に、ポート１６を選択的に結合するように構成された圧力弁８６に結合される。出口ポート１８は、圧力ライン１０６および１０８を介して圧力源＃１ ２２に出口ポート１８を選択的に接続する弁１２０に結合される。

制御装置５０は、制御ライン５２を介して圧力源＃１ ２２を制御し、制御ライン１１０を介して圧力源＃２ ８０を制御する。制御装置５０はまた、制御ライン１１８を介して圧力弁１２０を、制御ライン１１６を介して圧力弁８２を、制御ライン１１４を介して圧力弁８４を、および制御ライン１１２を介して圧力弁８６を制御する。

入口ポート１２からの流体流れを生成するために、制御弁１２０は圧力源＃１ ２２に出口ポート１８を接続するように（たとえば、制御装置５０によって）作動され、制御弁８２は圧力源＃２ ８０に入口ポート１２を接続するように作動される。圧力源＃２ ８０によって生成される圧力は、好ましくは圧力源＃１ ２２によって生成される圧力より大きい。したがって、出口ポート１８と入口ポート１２の間に負圧の差が生じる。入口ポート１４および１６は、入口ポートとマイクロチャネルの入口の圧力を等しくするために、ある時間の間、それぞれ弁８４および８６によって圧力源＃１ ２２に接続され、次いで確立された圧力を維持するために弁８４および８６を閉鎖する。このため、入口ポート１４および１６とマイクロチャネルの入口の間に圧力差はなく、したがって入口ポート１４および１６から出口ポート１８への流体流れはない。入口ポート１２からの流体流れを停止するために、制御弁８２は、出口ポート１８と入口ポート１２の圧力を等しくするために圧力源＃１ ２２に入口ポート１２を接続し、次いで制御弁８２を閉鎖するように作動される。

入口ポート１４からの流体流れを生成するために、制御弁８４は、出口ポート１８と入口ポート１４の間に負圧の差を生じさせるために圧力源＃２ ８０に入口ポート１４を接続するように作動される。入口ポート１２および１６につながる弁８２および８６は閉じられ、このため入口ポート１２および１６とマイクロチャネルの入口の間に圧力差はなく、したがって入口ポート１２および１６から出口ポート１８への流体流れはない。入口ポート１４からの流体流れを停止するために、制御弁８４は、マイクロチャネルの入口と入口ポート１４の圧力を等しくするために圧力源＃１ ２２に入口ポート１４を接続するように作動され、次に弁８４はこの圧力平衡を維持するために閉鎖される。

入口ポート１６からの流体流れを生成するために、制御弁８６は、出口ポート１８と入口ポート１６の間に負圧の差を生じさせるために圧力源＃２ ８０に入口ポート１６を接続するように作動される。入口ポート１２および１４は、入口ポートとマイクロチャネルの入口の圧力を等しくするために、ある時間の間、それぞれ弁８２および８４によって圧力源＃１ ２２に接続され、次いで確立された圧力を維持するために弁８４および８６を閉鎖する。このため、入口ポート１２および１４と出口ポート１８の間に圧力差はなく、したがって入口ポート１２および１４から出口ポート１８への流体流れはない。入口ポート１６からの流体流れを停止するために、制御弁８６は、出口ポート１８と入口ポート１６の圧力を等しくするために圧力源＃１ ２２に入口ポート１６を接続し、次に制御弁８６を閉鎖するように作動される。

一代替構成として、三方弁８２、８４、８６はそれぞれ、各関連付けられた入口ポートと圧力源＃１ ２２または圧力源＃２ ８０とを選択的に接続する２つの二方弁によって置き換えることができる。

本発明での使用に適切な弁としては、ＩＱ Ｖａｌｖｅｓ Ｃｏ．、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、ＦｌｏｒｉｄａおよびＴｈｅ Ｌｅｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔによる二方電磁弁および三方電磁弁がある。

図１、図２、および図３に示されるシステムは、本願の譲受人に譲渡された、同時係属中の米国特許出願第１１／５０５，３５８号に記載されている、マイクロチャネルを通って流れて緩衝液などの非反応性流体の液滴によって互いに分離されるアッセイ試薬の別個の液滴内でＰＣＲを実施するプロセスにおいて利用することができる。このプロセスを、図４および図５を参照して説明する。

図４はマイクロチャネルを通って流れる別個の液滴内でＰＣＲを実施するステップを示す流れ図であり、図５はチャネルを通る種々の材料の流れを示す時間履歴曲線（ｔｉｍｅ ｈｉｓｔｏｒｙ ｃｕｒｖｅ）を示す。プロセスを、図１に示されるシステムに関して説明する。ただし、このプロセスはまた、図２または図３のシステムまたは図１、図２、および図３のシステムの混合組合せを使用しても実施できることを理解されたい。

図４を参照すると、ステップ１３０において、関連付けられた弁によりポートを負圧源２２に接続し、入口１２、１４、および１６への弁を閉鎖することによって、負圧が出口ポート１８および入口ポート１２、１４、１６のすべてなどに加えられる。これは、廃棄物ポートとどの入口ポートの間にも圧力差がなく、したがってマイクロチャネル２０への流体流れがないので、停止条件として知られている。

ステップ１３２では、ＤＮＡ／緩衝液の入口ポートに結合された弁（たとえば、入口ポート１２に関連付けられた弁２４）は、図５の曲線１６２によって示される試料流れ条件（すなわち、出口ポート１８と入口ポート１２の間の負圧の差）を生成するために負圧から大気圧に切り換えられる。図４に示されていないが、ポリメラーゼ入口ポートに結合された弁も、図５の曲線１６４によって示されるポリメラーゼ流れを生成するために負圧から大気圧に切り換えることができる。ＤＮＡ／緩衝液混合物は、マイクロチャネル２０を通る共通の流れに組み込まれる。

ステップ１３４では、タイマ遅延（ｔｉｍｅｒ ｄｅｌａｙ）は、チャネルをＤＮＡ／緩衝液（および、任意選択でポリメラーゼ）混合物で満たすように実施される。

ステップ１３６では、プライマー１の入口ポートに結合された弁（たとえば、入口ポート１４に関連付けられた弁２６）は、試料流れストリームと混合されるマイクロチャネル２０へのプライマー流れ条件を生成するために負圧から大気圧に切り換えられる。ステップ１３８では、所望のタイマ注入量に比例するタイマ遅延が、混合物に流れ込むプライマー１の量を制御するために実施される。ステップ１４０では、プライマー１の入口ポートに結合された弁が、元の条件すなわち弁を閉鎖した状態の負圧に切り換えられ、プライマーの流れを停止し、それによって（クロック周期４を通して）図５の流れ曲線１６６の第１の部分が生成される。

所望のスペーサー・インタリーブ（ｓｐａｃｅｒ ｉｎｔｅｒｌｅａｖｅ）に比例するタイマ遅延が、ステップ１４２において実施される。これは、プライマーが流れない試料流れ条件である。

ステップ１４４では、プライマー２の入口ポートに結合された弁（たとえば、入口ポート１６に関連付けられた弁２８）は、試料流れストリームと混合されるマイクロチャネル２０へのプライマー流れ条件を生成するために、弁が閉鎖した状態で負圧から大気圧に変更される。プライマー２の所望の注入量に比例するタイマ遅延がステップ１４６において実施される。さらに、ステップ１４８では、プライマー２の入口ポートに結合された弁が元の負圧に切り換えられ、弁が閉鎖条件となり、プライマー２の流れを停止させる。ステップ１４４、１４６、および１４８によって、図５に示される流れ曲線１６８が生成される。

ステップ１５０では、完全なアッセイ条件が生成されるまで、プライマーを追加して以前に注入したプライマーを別個に追加で注入するプライマー注入シーケンスが繰り返され、したがって流れ曲線１７０が生成される。その結果生成される試料試験ストリームの流れ曲線は、図５の曲線１７２によって示される。曲線の各「突出部」は、試料流れストリームで混合されるプライマーの別個の量を示す。別個のＰＣＲ（または他の）アッセイは、試料／プライマー混合物の各別個の量（またはボーラス）で実施することができる。

ステップ１５２では、流れているマイクロ流体ストリームに関するＰＣＲの熱サイクルが実施され、それによって各試験ボーラス内でＰＣＲ増幅反応が生成される。ステップ１５４では、流れているマイクロ流体ストリームに関するＤＮＡ熱融解分析（ｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｌｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）が実施される。さらに、ステップ１５６では、一連のアッセイ熱融解データが、マイクロチャネル２０内で実施されたマルチプレックスアッセイの試験ボーラスごとに生成される。

図６に示すように、入口ポートに結合されたどの弁も、入口ポートで注入される流体の量を調整するために、パルス幅を変調するように動作することができる。たとえば、上述のように、入口ポートに結合された弁は、マイクロチャネルに注入される所望量の流体に対応する所定の時間の間、流れ条件に設定することができる。入口ポートに結合された弁を流れ条件に設定する時間を短くすることによって、注入される流体の量を少なくすることができる。ただし、指定の物理サイズの反応液滴を生じさせることが望ましい場合があり、したがって指定の時間の間（および、より少量に対応する、より短時間ではない）、入口ポートからの流体流れを有することが望ましい場合がある。指定の時間の間ポートからの流れを維持しながら入口ポートからの流体流れの量を少なくするために、図６の曲線１７４および１７６に示すように、所望の流れ時間にわたって、ポートに結合された弁を負圧と大気圧（またはより高い他の圧力）の間で変調させることができる。その結果生成される、入口ポートにおける圧力は図６の曲線１８０によって示される。その結果発生する試薬流れは、図６の曲線１７８に示されるように、ある流量において流れ時間全体にわたって全体的に一定の流れであり、その結果、流れ時間全体にわたって入口弁が大気圧に開放され続けている場合に比べて注入される流体の量が少なくなる。

本発明の種々の実施形態／変形形態について上記で説明してきたが、これらは例示的なものとして提示されたに過ぎず、限定としてではないことを理解されたい。したがって、本発明の範囲は、上述の例示的な実施形態のいずれによっても制限されるべきではない。さらに、記述がない限り、上記の実施形態のいずれも相互に排他的でない。したがって、本発明は、種々の実施形態の特徴の任意の組合せおよび／または統合を含むことができる。

加えて、上記で説明され図面に示されたプロセスは一連のステップとして示されているが、これは単に分かりやすくするために行われたものである。したがって、いくつかのステップを追加してもよく、いくつかのステップを省略してもよく、ステップの順序を並べ替えてもよいことが企図されている。

Claims (32)

1. 流体が回路内に導入される入口ポートと、前記入口ポートと流体連通する少なくとも１つの流体流れ用マイクロチャネルと、前記マイクロチャネルと流体連通し、前記マイクロチャネルからの流体が回収される出口ポートとを含むマイクロ流体回路内の流体流れを制御する方法であって、
   ａ．第１の圧力を前記出口ポートに加え、前記入口ポートを前記第１の圧力より高い第２の圧力に開放することにより、前記出口ポートと前記入口ポートの間に負圧の差を生成することによって、前記入口ポートから前記マイクロチャネルへの流体流れを発生させるステップと、
   ｂ．次いで、前記入口ポートを前記第２の圧力に対して閉じ、前記第１の圧力を前記入口ポートに加えることによって、前記入口ポートからの前記流体流れを実質的に停止するステップとを備える方法。
2. 前記第１の圧力が大気圧より低い圧力であり、前記第２の圧力が大気圧である、請求項１に記載の方法。
3. 停止する前記ステップが、所定の時間の間、前記第１の圧力を前記入口ポートに加えるステップを含む、請求項１に記載の方法。
4. 停止する前記ステップが、前記入口ポートと前記出口ポートの間の前記圧力差が実質的にゼロになるまで前記第１の圧力を前記入口ポートに加えるステップを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記所定の時間の後で、前記第１の圧力を前記入口ポートから除去し、前記入口ポートを前記第２の圧力に対して閉じ続けて前記入口ポートからの流体流れを防ぐことをさらに含む、請求項３に記載の方法。
6. 前記第１の圧力を前記入口ポートから除去した後で、前記入口ポートを前記第２の圧力に再開放することによって、前記入口ポートから前記マイクロチャネルへの流体流れを再発生させることをさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記マイクロ流体回路が複数の入口ポートを備え、前記少なくとも１つのマイクロチャネルが前記入口ポートのそれぞれと流体連通し、さらにステップａ中に、前記他のポートのそれぞれを前記第２の圧力に対して閉じることによって他のすべての入口ポートからの流体流れを実質的に防ぐステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. ｃ．ステップｂの後で、前記第２の入口ポートを前記第２の圧力に開放することによって第２の入口ポートから前記マイクロチャネルへの流体流れを発生させるステップと、
   ｄ．次いで、前記第２の入口ポートを前記第２の圧力に対して閉じ、所定の時間の間、前記第２の入口ポートを前記第１の圧力に開放することによって、および前記弁を前記入口ポートに対して閉鎖して前記確立された圧力を維持することによって、前記第２の入口ポートからの前記流体流れを実質的に停止するステップとをさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記入口ポートのそれぞれに対してステップａ〜ｂを繰り返すステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
10. 前記流体が、生物学的試料物質、試薬、緩衝液、またはマーカー材料を含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記入口ポートから前記マイクロチャネルへの所定量の流体の前記流れに対応するステップａの所定の所要時間の後でステップｂを開始することによって、前記入口ポートから前記マイクロチャネルに流れ込む流体の量を制御するためにステップａの所要時間を制御するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
12. 所定量の流体流れに対応するステップａの所定の所要時間を指定するステップと、
    ステップａの前記所定の所要時間中に（１）前記入口ポートを前記第２の圧力に開放すること、および（２）前記入口ポートを前記第２の圧力に対して閉じることを交互に実施することによって、前記所定量より少ない、前記入口ポートから前記マイクロチャネルへの流体流れの量を計測するステップとをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. マイクロ流体流れを制御するためのシステムであって、
    ａ．流体が回路に導入される少なくとも１つの入口ポートと、前記入口ポートと流体連通する少なくとも１つのマイクロ流体流れ用マイクロチャネルと、前記マイクロチャネルと流体連通し、前記マイクロチャネルからの流体が回収される出口ポートとを備えるマイクロ流体回路と、
    ｂ．前記出口ポートおよび前記少なくとも１つの入口ポートと選択的に連通する少なくとも１つの圧力源と、
    ｃ．各入口ポートに機能的に関連付けられ、前記圧力源と連通する弁機構であって、それぞれ（１）前記圧力源によって生成された第１の圧力に、または（２）前記第１の圧力より高い第２の圧力に、前記関連付けられた入口ポートを選択的に接続するように適合された弁機構とを備えるシステム。
14. 前記少なくとも１つの圧力源が真空ポンプを備え、前記第１の圧力が、前記真空ポンプによって生成される負圧であり、前記第２の圧力が大気圧を含む、請求項１３に記載のシステム。
15. 前記少なくとも１つの圧力源が、前記第１の圧力を生成するための第１のポンプと、前記第２の圧力を生成するための第２のポンプとを備える、請求項１３に記載のシステム。
16. 前記圧力源および前記弁機構の動作を制御し、前記圧力源に前記第１の圧力を前記出口ポートに加えさせ、前記弁機構に前記入口ポートを前記第２の圧力に開放させて流体を前記入口ポートから前記マイクロチャネルに流れ込ませ、さらに前記入口ポートが所定の時間の間、前記第２の圧力に開放された後で、前記弁機構に前記入口ポートを前記第２の圧力に対して閉じさせ、所定の時間の間、前記入口ポートを前記第１の圧力に開放させ、前記弁を前記前記入口ポートに対して閉鎖して前記入口ポートからの前記マイクロチャネルへの流れを停止するように適合された制御装置をさらに備える、請求項１３に記載のシステム。
17. 前記弁機構が、前記入口ポートを、前記第２の圧力または前記第１の圧力のいずれかに選択的に連通させるように適合された三方弁を備える、請求項１３に記載のシステム。
18. 前記弁機構が、選択的に、前記入口ポートを前記第２の圧力に開放し、または前記入口ポートを前記第２の圧力に対して閉じるように構成および配置された第１の二方弁と、選択的に、前記入口ポートを前記第１の圧力に開放し、または前記入口ポートを前記第１の圧力に対して閉じるように構成および配置された第２の二方弁とを備える、請求項１３に記載のシステム。
19. 前記圧力源が、前記出口ポートと前記弁機構の両方と選択的に連通する単一の真空ポンプを備える、請求項１３に記載のシステム。
20. 前記出口ポートに機能的に関連付けられ、前記出口ポートを前記圧力源に選択的に接続するように適合された出口弁機構をさらに備える、請求項１９に記載のシステム。
21. 前記マイクロ流体回路が複数の入口ポートを備える、請求項１３に記載のシステム。
22. 前記制御装置が、前記弁機構に、前記入口ポートを前記第２の圧力に対して閉じさせ、所定の時間の間、前記入口ポートを前記第１の圧力に開放させるように適合された、請求項１６に記載のシステム。
23. 前記制御装置がさらに、前記所定の時間の後で、前記弁機構に、流体が前記入口ポートから前記マイクロチャネルに流れ込むのを防ぐために前記入口ポートが前記第２の圧力に対して閉じた状態を保ちながら前記入口ポートを前記第１の圧力に対して閉じさせるように適合された、請求項２２に記載のシステム。
24. 前記制御装置がさらに、前記弁機構に、前記所定の時間の後で、前記入口ポートを前記第１の圧力に対して閉じさせ、前記入口ポートを前記第２の圧力に再解放させて、前記入口ポートから前記マイクロチャネルへの流体流れを再発生させるように適合された、請求項２２に記載のシステム。
25. 前記マイクロ流体回路が、ガラス、シリカ、石英、またはプラスチックで作製されたチップを備える、請求項１３に記載のシステム。
26. 前記弁機構が電磁弁を備える、請求項１３に記載のシステム。
27. マイクロチャネルと、前記マイクロチャネルと流体連通し、異なる反応流体が前記マイクロチャネルに導入される複数の入口ポートと、前記マイクロチャネルと流体連通し、前記マイクロチャネルからの流体が回収される出口ポートとを含むマイクロ流体回路に、所定量の異なる反応流体を順次導入する方法であって、
    第１の圧力を前記出口ポートに加えることと、
    順次、
    所定の時間の間、前記他の入口ポートは前記第２の圧力に対して閉じられながら各入口ポートを前記第１の圧力より高い第２の圧力に開放し、前記出口ポートとその入口ポートの間の負圧の差を生じさせ、所定量の流体をその入口ポートから前記マイクロチャネルに流れ込ませて、
    前記所定の時間の後で、その入口ポートを前記第２の圧力に対して閉じ、前記第１の圧力をその入口ポートに加えることにより、その入口ポートからの流体流れを実質的に停止することによって、
    所定量の反応流体を前記入口ポートのそれぞれから前記マイクロチャネルに順次導入することとを含む方法。
28. 流体流れを停止することが、所定の時間の間、前記第１の圧力を前記入口ポートに加えることを含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記第１の圧力が大気圧より低い圧力であり、前記第２の圧力が大気圧である、請求項２７に記載の方法。
30. 停止する前記ステップが、前記入口ポートと前記出口ポートの間の前記圧力差が実質的にゼロになるまで前記第１の圧力を前記入口ポートに加えるステップを含む、請求項２７に記載の方法。
31. 前記流体が、生物学的試料物質、試薬、緩衝液、またはマーカー材料を含む、請求項２７に記載の方法。
32. 前記所定時間中に（１）前記入口ポートを前記第２の圧力に開放すること、および（２）前記入口ポートを前記第２の圧力に対して閉じることを交互に実施することによって、前記所定流体量より少ない、前記入口ポートから前記マイクロチャネルへの流体流れの量を計測することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。

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