JP2011526148A - 遺伝子foxP3のTSDR領域のDNAメチル化分析による制御性T細胞のDNAメチル化分析 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
ID No.)2〜配列番号17、特に配列番号4及び配列番号5から選択されるプライマー対の少なくとも1つのプライマーを用いた増幅を含む。
SM.Conversion of peripheral CD4+CD25- naive
T cells to CD4+CD25+regulatory T cells by TGF-beta
induction of transcription factor Foxp3. J Exp Med. 2003 Dec
15;198(12):1875-86.)、(Park HB, Paik DJ, Jang E, Hong S,
Youn J.Acquisition of anergic and suppressive activities intransforming growth
factor-beta-costimulated CD4+CD25-T cells. Int Immunol.
2004Aug;16(8):1203-13. Epub 2004 Jul 5)、(Fu S, Zhang N,
Yopp AC, Chen D, Mao M,Chen D, Zhang H, Ding Y, Bromberg JS. TGF-beta induces
Foxp3 + T-regulatorycells from CD4 + CD25 - precursors. Am J
Transplant. 2004 Oct;4(10):1614-27.)、(Fantini
MC, BeckerC, Monteleone G, Pallone F, Galle PR, Neurath MF. Cutting edge:
TGF-beta induces a regulatoryphenotype in CD4+CD25- T cells through Foxp3
induction and down-regulation ofSmad7. J Immunol. 2004
May 1;172(9):5149-53.)、(Wan YY, Flavell RA. IdentifyingFoxp3-expressing suppressor T cells with a
bicistronicreporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Apr5;102(14):5126-31. Epub 2005 Mar 28.)、(Fantini MC, BeckerC, Tubbe I, Nikolaev A,Lehr HA, Galle PR, Neurath
MF. TGF-(beta) inducedFoxp3+ regulatory T cells suppress Th1-mediated
experimental colitis. Gut. 2005Sep 14)。しかしながら、これらの細胞の安定性及びin vivo効力はこれまで十分に試験されていない。Foxp3遺伝子座の接近容易性の分析は、どの程度まで制御性T細胞系統への永続的な変換が起こったかを決定するか、又はin vivo状態/活性を決定するうえで、Treg又は他の機能的に等価な細胞の存在について、単なるFoxp3の発現よりも良好なマーカーである。したがって、本発明者らは、TGF−β又は他のサイトカイン若しくはサイトカイン様タンパク質、機能的サイトカイン等価物等の存在下で5日間活性化及び培養したCD25−CD4+T細胞に由来するFoxp3遺伝子座のメチル化状態を分析した。5日目に、Th1条件下で培養した対照細胞は、軽度のFoxp3発現(2%未満)を示したが、一方でTGF−βの存在下で刺激した細胞のほぼ95%が部分的に脱メチル化したFoxp3+であった(図2A)。興味深いことに、部分的な脱メチル化はTGF−βの存在下で刺激した細胞においてのみ観察された。
forkhead box transcription factor FoxP3 is associated withpoor prognosis in
ovarian cancer. Clin. Cancer Res.11 (23), 8326-8331
(2005))。FoxP3の高い発現レベルは卵巣癌と関連する。さらに、制御性T細胞転写因子FOXP3の遺伝子発現は慢性移植片対宿主病患者において減少した(Zorn, E., et al. Reduced
frequency of FOXP3+ CD4+CD25+ regulatory Tcells in patients with chronic graft-versus-host
disease. Blood 106 (8),2903-2911 (2005))。また、アレルギー性ぜんそくにおけるFoxP3の役割が記載されている(Schmidt-Weber, CB. and Blaser, K. The roleof the FOXP3 transcription factor in the immune regulation
of allergic asthma. Curr Allergy Asthma Rep 5 (5), 356-361 (2005))。
transplantation tolerance. ImmunolRes.
2006;33(3):195-212、June CH, Blazar BR. Clinical
applicationof expanded CD4(+)25(+) cells. Semin
Immunol. 2006 Jan 31、Khazaie K, von BoehmerH. The
impact of CD4(+)CD25(+) Treg on tumor specificCD8(+) T
cell cytotoxicity and cancer. Semin CancerBiol. 2006 Apr;16(2):124-136. Epub
2006 Jan 26.、及びそれらに引用される参考文献)に記載されており、当業者であれば本発明の状況下でこれらの方法を適用することが可能である。「治療」という用語は上記Foxp3発現関連疾患の予防も含む。
配列は5’から3’の方向で示す。プライマーはバイサルファイト特異的PCR及びシークエンシング反応に使用した。鎖特異性及び配向:プライマー「p」及び「o」は+1鎖に基づいて単位複製配列を生成し、プライマー「p」はフォワード配向を示し、プライマー「o」はリバース配向を示す。
p−TGTTTGGGGGTAGAGGATTT(配列番号12)
o−TATCACCCCACCTAAACCAA(配列番号13)
p−メチル化GTTTTCGATTTGTTTAGATTTTTTCGTT(配列番号14)
p−非メチル化GTTTTtGATTTGTTTAGATTTTTTtGTT(配列番号15)
o−メチル化CCTCTTCTCTTCCTCCGTAATATCG(配列番号16)
o−非メチル化CCTCTTCTCTTCCTCCATAATATCA(配列番号17)
非メチル化776_209−222_nm ATGGTGGTTGGATGTGTTGGGTT(配列番号18)
メチル化776_209−222_m ATGGCGGTCGGATGCGTC(配列番号19)
et al.)による全ての証拠は、FOXP3 TSDRの脱メチル化が安定なTreg表現型だけに限定されており、一時的にFOXP3を発現する活性化T細胞においては起こらないことを示唆するものである。したがって、メチル化分析は遺伝子発現及びタンパク質合成の分析と比べて明らかな利点をもたらす。
材料及び方法
試料、試料調製−健常ドナー
末梢血試料を、地方倫理委員会の承認を踏まえたインフォームドコンセントの後に健常ドナーから得た。主要な末梢血白血球集団の選別については、試料をBaron et al.(EJI 2007)に従って処理した。CD4選別については、フィコール−ハイパーク(Sigma-Aldrich)を用いた密度勾配遠心分離によって末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。CD4+T細胞をバフィーコート由来PBMCから、抗CD4マイクロビーズ及びAutoMACS磁気分離システム(Miltenyi Biotec)を用いて単離した。細胞表面染色用の抗体は全てBD
Pharmingenから入手した。PE抗ヒトFOXP3染色セットは、eBioscienceから入手した。全てのマイクロビーズはMiltenyi Biotecから購入した。MACS選別したCD4+T細胞を、抗CD45RA−FITC及び抗CD25−APCを用いて染色した。細胞をFACS(Aria,BD-Bioscience)によってCD25高CD45RA−Tregと、CD25−CD45RA+ナイーブT細胞とに選別した。一定分量のCD4集団を用いて、フローサイトメトリーによってFOXP3+細胞の含量を決定した。ここでは、分析ゲートは選別ゲートと類似している。サイトメトリー分析は、FACS Calibur(BD Biosciences)及びFlowJoソフトウェア(Tree Star)を用いて、以前に記載されているように行った(Huehn, J., Siegmund, K.,
Lehmann, J., Siewert,C.,
Haubold, U., Feuerer,M.,
Debes, G. F., Lauber,J., Frey, O., Przybylski, G. K., Niesner,U., Rosa, M. d.
l., Schmidt, C. A., Braeuer, R., Buer, J.,Scheffold, A. and Hamann,A.,
Developmental stage, phenotype and migration distinguish naive- andeffector/memory-like
CD4+ regulatory T cells. J ExpMed 2004. 199:303-313.)。細胞内FOXP3染色は、PE抗ヒトFOXP3染色セット(eBioscience)を用いて、製造業者の使用説明書に従って行った。
黒色腫患者はステージIVの転移性疾患を有しており、ヒスタミン二塩酸塩を添加した、若しくは添加しないIL−2の皮下投与、又はIFN−αと併用した、5日間にわたって漸減させた(decrescendo)IL−2の静脈内投与による3回の異なるIL−2に基づく治療計画を受けていた(Asemissen AM, Scheibenbogen C, Hellstrand K, Thoren F, Gehlsen K,
Lesch A, Thiel E, Keilholz U.Addition of histamine to IL-2 treatment augments
type 1 T cell responses inmelanoma patients in vivo: immunological results from
a randomized clinicaltrial of IL-2 with or without histamine. Clinical Cancer
Res 11, 290-297, 2005、及びKeilholz U, Goey SH, Punt CJA,
Proebstle T,Salzmann R, Scheibenbogen C, SchadendorfD, Lienard D, Hantich B,
Geueke A-M, Eggermont AMM. IFNβ/IL-2 with or without Cisplatinum inmetastatic
melanoma: a randomized trial of the EORTC melanoma cooperativegroup. J Clin
Oncology, 2579-2588, 1997)。インフォームドコンセントの後、IL−2療法の前及び2週間後にヘパリン添加血液試料を採取し、末梢血単核細胞(PBMC)を、フィコール−ハイパーク1.077(Biochrom,Berlin,Germany又はSigma-Aldrich)を用いた密度勾配遠心分離によって単離し、液体窒素中で保管した。細胞外染色については、以下の表面mAbを使用した:抗CD3−PercP(クローンSK7)、抗CD25−PE(M−A251)、抗CD4−FITC(B9.11)。核抗FOXP3−APC染色は、抗FOXP3−APC(PCH101)(eBioscience,SanDiego,USA)を用いて、製造業者の使用説明書に従って行った。データ収集をFACS Calibur(BD Bioscience)で行った。
血液を1つ又は複数の10ml容BDバキュテナー管(BD Vacutainer(登録商標)Plus採血管、BD 366643 16mm×100mm、10.0ml、K2 EDTA)に採取し、各々の管を血液凝固を避けるために即座に約10回反転させた。採血管を遠心ブレーキを切っている状態で、4℃、1500gで10分間遠心分離した。遠心分離の後、血漿と赤血球との間の細胞層を含む液を約0.5ml〜1ml、プレラベル2ml容クライオバイアル(Fisherbrand 2−ml Round−Style Bottom Cryogenic Storage Vial(Fisher Scientific #12−567−501))に、使い捨てピペット(Jumbo Bulb Pipette(VWR #100500−622))を用いて移した。採血から4時間以内に試料を−70/80℃で凍結して、ドライアイス上で輸送するまでこの温度で保管した。
foxp3遺伝子を有するsf遺伝子座(Brunkow ME et al(2001) Nat Gen.
27:68)の30.8kb領域に焦点をあわせ、CpG密度に基づいてメチル化分析のための配列を選択した。特に、プロモーター領域及びエクソン・イントロン境界には単位複製配列設計を考慮した。PCRの際に、TSDR領域を分析するようにプライマーを設計した。
Walter, J. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066)に従って(一部変更して)行ったが、これにより非メチル化シトシンがウラシルへと変換される一方で、メチル化シトシンは変化しないままであった。続くPCR増幅において、ウラシルがチミンに置き換わる。このため、シークエンシング反応における「C」の検出は、この部位でのゲノムDNAのメチル化を反映する。同じ部位での「T」の検出は反対に、ゲノムシトシンのメチル修飾の非存在を反映する。
Adorjan, P., Hildmann,T.,
Piepenbrock, C. (2004) Bioinformatics. 20,3005-3012)。
示唆されたFOXP3 TSDR脱メチル化のTregに対する特異性を検証するために、定量リアルタイムPCRシステム(qPCR)を確立した。このシステムは、FOXP3 TSDRのバイサルファイト変換されたメチル化DNA及びバイサルファイト変換された非メチル化DNAの両方に対する、メチル化依存性プライマー及びハイブリダイゼーションプローブから成る(図1A)。このシステムを試験することによって、非生理的に高い濃度(2億コピーのプラスミドDNA)であっても高い特異性があり、異なる種との交差反応性がないことを示した(図1B)。検出は、10000個のメチル化コピー中、単一のDNAコピーまでという絶対感度、かつ最低でも2.5個の非メチル化コピーという相対感度で可能であった(データは示さない)。
次に、全血におけるFOXP3脱メチル化によるTreg計数の実現可能性を引き出すために、様々な白血球画分のメチル化レベルを試験した。本発明者らは、単離したCD15+顆粒球、CD14+単球、CD58+ナチュラルキラー細胞、並びにCD8+記憶(CD27+CD45RA+)及びCD8+ナイーブ(CD27+CD45RA−)細胞傷害性T細胞画分の両方が、この遺伝子座でDNAの1%未満というわずかな脱メチル化しか示さなかったことを示す。CD19+記憶及びナイーブB細胞画分は、2%未満の脱メチル化FOXP3プロモーターを含む(表1)。この画分が不完全な精製に起因するのか、又は脱メチル化FOXP3を有する天然のB細胞亜画分に起因するのかについては不明確である。
CD25++FOXP3+Treg以外の、末梢血から得た全ての単離白血球画分は、ex vivo実験において完全にメチル化される。したがって、安定にFOXP3を発現するTregに相当する細胞画分の全血試料からの同定及び定量化は、本発明者らのqPCRアッセイを適用して脱メチル化DNAを検出することによって可能である。免疫調節(immunmodulating)療法のレポーターとしての、末梢血におけるDNAメチル化によるTregレベルを分析するために、臨床的に応用されたサイトカイン癌療法におけるアッセイの有効性を試験した。このために、細胞傷害性T細胞及びNK細胞の活性化を達成するために利用されるIl−2療法を選択する。つい最近では、Foxp3+T細胞もこの療法によって増進されることが研究から示されている。後者の効果は、該療法が免疫系を抑制するというよりも刺激する働きをするため、禁忌である。しかしながら、CD25++細胞及びFOXP3+細胞のFACS分析は、制御特性のない活性化T細胞の測定を除外することができない。本発明者らは、転移性黒色腫を有する6人の患者の末梢血におけるCD4+CD25++Foxp3+Tregの頻度に対するIL−2療法の影響を、メチル化及びFACS分析の両方によって分析した(図3)。患者は、ヒスタミン二塩酸塩を添加した、若しくは添加しないIL−2の長期皮下投与、又はIFN−αと併用した、5日間にわたって漸減させたIL−2の静脈内投与による3回の異なるIL−2に基づく療法計画を受けていた。療法の前に、FACS測定によって、PBMCにおけるCD4+CD25++Foxp3+Tregの平均レベルが4.5%であり(1.9%〜8.9%の範囲にわたる)、標準偏差が2.4%であることが示された。Treg数をqPCRによって決定した場合、FOXP3 TSDR脱メチル化の平均レベルは3.4%であり(2.4%〜4.2%の範囲にわたる)、標準偏差が0.7%であった。IL−2療法後の平均FOXP3レベルは、FACSによって測定した場合、11.6%であり(5.1%〜17.3%の範囲にわたる)、標準偏差が4.6%であることが分かったが、これは療法後にTregが1.7倍〜4.1倍増大することと解釈される。FOXP3 TSDRの脱メチル化によって決定した場合、平均Treg数は8.8%であり(6.9%〜11.5%の範囲にわたる)、標準偏差が1.6%であったが、これは療法後に2.1倍〜2.8倍増大することと解釈される。2つの技法によるTreg数の推定値はよく相関しており(ピアソン相関 R=0.65、P=0.023)、共にIL2治療時にTregがおよそ2倍増大することを示唆している。この研究において観察される、全血試料におけるFOXP3脱メチル化についての患者間の差異は小さく、かかるアッセイが、以前に報告された、健常個体と比べた癌患者におけるTregの増大を保持しつつ、癌患者の血液試料におけるTregを決定する場合の差異を低減する可能性が再確認された。
本発明者らは、健常対照、結腸直腸癌患者、肺癌患者、前立腺癌患者及び乳癌患者から得た合計115種の凍結「バフィーコート」において、FOXP3 TSDRのメチル化状態を完全盲検研究で測定した。FOXP3はX連鎖性であるため、女性ドナーについての脱メチル化は、Treg数を報告するうえで2倍に補正した。健常ドナーについては、平均Treg数は1.4%であった(0.4%〜2.9%の範囲にわたる)。結腸直腸癌患者については、平均Treg数は2.3%であり(0.6%〜3.5%の範囲にわたる、19%という不測の外れ値が1つ)。外れ値を除外すると、平均Treg数は1.64%であり、健常ドナーよりわずかにしか高くなかった。肺癌患者におけるTreg数は0.5%〜4.4%の範囲であり、平均は2.3%であった。結腸直腸癌患者の結果は正常対照とは有意に異ならなかったが、肺癌患者におけるTreg数は有意に上昇している(p=0.003)。早期肺腫瘍(ステージ1及びステージII、補足情報を参照されたい)から得られた試料において、9種のうち6種でTreg数が有意に上昇していることが分かった。結腸癌及び肺癌に関する受信者動作特性(ROC)曲線は、結腸癌についてはAUC(曲線下面積)が0.66であり、肺癌についてはAUCが0.75であることを示している(図4、図5C)。
試料、試料調製−健常ドナー
末梢血試料を、地方倫理委員会の承認を踏まえたインフォームドコンセントの後に健常ドナーから得た。主要な末梢血白血球集団の選別については、試料をBaron et al.(36)に従って処理した。CD4+T細胞選別については、フィコール−ハイパーク(Sigma-Aldrich,Munich,Germany)を用いた密度勾配遠心分離によって末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。CD4+T細胞をバフィーコート由来PBMCから、抗CD4マイクロビーズ及びAutoMACS磁気分離システム(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)を用いて単離した。全てのマイクロビーズはMiltenyi Biotecから購入し、細胞表面染色用の抗体は全てBD Pharmingen(Heidelberg,Germany)から入手した。細胞内FOXP3染色は、PE抗ヒトFOXP3染色セット(eBioscience,SanDiego,USA)を用いて、製造業者の使用説明書に従って行った。MACS選別したCD4+T細胞を、抗CD45RA FITC及び抗CD25−APCを用いて染色した。細胞をFACS(Aria,BD-Bioscience,Heidelberg,Germany)によってCD25高CD45RA−Tregと、CD25−CD45RA+ナイーブT細胞とに選別した。一定分量のCD4集団を用いて、フローサイトメトリーによってFOXP3+細胞の含量を決定した。ここでは、分析ゲートは選別ゲートと類似している。サイトメトリー分析は、FACS Calibur(BD Biosciences)及びFlowJoソフトウェア(Tree Star,Ashland,OR,USA)を用いて、以前に記載されているように行った(50)。
黒色腫患者はステージIVの転移性疾患を有しており、以前に記載されるようなヒスタミン二塩酸塩を添加した、若しくは添加しないIL−2の皮下投与を受けていた。インフォームドコンセントの後、IL−2療法の前及び2週間後にヘパリン添加血液試料を採取し、末梢血単核細胞(PBMC)を、フィコール−ハイパーク1.077(Biochrom,Berlin,Germany又はSigma-Aldrich)を用いた密度勾配遠心分離によって単離し、液体窒素中で保管した。細胞外染色については、以下の表面mAbを使用した:抗CD3−PercP(クローンSK7)、抗CD25−PE(M−A251)、抗CD4−FITC(B9.11)。核抗FOXP3−APC染色は、抗FOXP3−APC(PCH101)(eBioscience)を用いて、製造業者の使用説明書に従って行った。データ収集をFACS Calibur(BD Bioscience)で行った。
血液を1つ又は複数の10ml容BDバキュテナー管(BD Vacutainer(登録商標)Plus採血管、BD 366643 16mm×100mm、10.0mL、K2 EDTA)に採取し、各々の管を血液凝固を避けるために即座に約10回反転させた。採血管を遠心ブレーキを切っている状態で、4℃、1500gで10分間遠心分離した。遠心分離の後、血漿と赤血球との間の細胞層を含む液を約0.5ml〜1ml、プレラベル2ml容クライオバイアル(Fisherbrand 2−mL Round−Style Bottom Cryogenic Storage Vial(Fisher Scientific,Schwerte,Germany,#12−567−501))に、使い捨てピペット(Jumbo Bulb Pipette(VWR,Darmstadt,Germany,#100500−622))を用いて移した。採血から4時間以内に試料を−70/80℃で凍結して、ドライアイス上で輸送するまでこの温度で保管した。書面によるインフォームドコンセントを、地方倫理指針に従って全ての研究の参加者から得た。
結腸直腸癌患者の腫瘍及び健常組織に由来する、ホルマリン固定し、パラフィン包埋(FFPE)した組織から得た最大で8つの切片のDNA単離を、Qia−AMP DNA FFPE組織キット(Qiagen,Hilden,Germany)を用いて、製造業者のプロトコルに従って行った。DNA単離前の変性として、ホルマリンから取り出した(formalin released)組織を、2mg/mlのプロテイナーゼKを含有する50mM Tris/HCl(pH8)、1mM EDTA、0.5%Tween 20中で一晩インキュベートし、続いて90℃で10分間インキュベートした。
ゲノムDNAを、DNeasy血液及び組織キット(Qiagen,Hilden,Germany)を用いて単離した。PBMC及び選別した血液細胞については、培養細胞用のプロトコルに従い、バフィーコートからのDNA単離については全血プロトコルを用いた。ゲノムDNAのバイサルファイト処理は、Olek et al.(Olek, A.,
Oswald,J., Walter, J. 1996. A modified and improved
method for bisulphitebased cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res.
24:5064-6)に従って(一部変更して)行った。
リアルタイムPCRは、各々15pmolのTSDR用のメチル化又は非メチル化特異的フォワード及びリバースプライマー(36)、5pmolの加水分解プローブ、200ngのλ−DNA(New England Biolabs,Frankfurt,Germany)、及び30ngのバイサルファイト処理ゲノムDNA鋳型又は各量のプラスミド標準を含有するRoche LightCycler(登録商標)480Probes Master(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)を用いて、20μlの最終反応容量中で行った。各々の試料を、Light−Cycler 480 System(Roche)を用いて三連で(in triplicate)分析した。サイクリング条件は、95℃で10分間の予熱工程、及び95℃で15秒間、続いて61℃で1分間の50サイクルから成るものであった。
PCR産物は、選別したナイーブT細胞及び制御性T細胞から得たバイサルファイト処理ゲノムDNAを用いて、FOXP3 TSDR用のメチル特異的及び非メチル特異的プライマーによって生成させた。DNA断片を、pCR2.1−TOPOベクターに、TOPO TA Cloning(登録商標)Kit(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)を用いて、製造業者の使用説明書に従ってクローニングし、シークエンシングによって検証した。プラスミドをQiagen製のPlasmid Midi Kitを用いて精製し、Qubit蛍光光度計(Invitrogen)によって濃度を決定し、希釈して、各々メチル化及び非メチル化FOXP3 qPCRアッセイのためのqPCR反応の標準として、100fg、10fg、1fg及び0.1fgの最終濃度(20000個、2000個、200個及び20個のプラスミドコピーに相当する)を得た。
メチル化及び非メチル化FOXP3 DNAの量は、二次導関数最大法(second-derivative
maximum method)による交点での線形回帰による検量線から推定した。中央値を用いてバフィーコート試料の三連の測定値を統合した。非メチル化DNAの割合は、非メチル化FOXP3 TSDR−DNAと、メチル化及び非メチル化FOXP3 TSDR−DNAの合計との比率としてコンピューターで計算した。女性患者については、この比率を2倍に乗じた。ROC曲線下面積は台形法則を用いて推定した。ウイルコクソンの順位和検定を用いて、正常患者と癌患者との脱メチル化率を比較した。ウイルコクソンの符号付き順位検定を用いて、IL−2治療前と治療後との脱メチル化率を比較した。相関分析については、ピアソンの積率相関係数及びt検定統計値を使用した。全てのP値は両側P値であった。
免疫組織化学染色を以前に記載されるように行った。手短に述べると、スライドガラスをヒトFOXP3タンパク質に対するラットモノクローナル抗体(PCH101、200倍;eBioscience,SanDiego,USA)、続いてビオチン結合ウサギ抗ラット及びEnVisionペルオキシダーゼキット(Dako,Glostrup,Denmark)と共にインキュベートした。10個の無作為に選択した高倍率視野(1HPF=0.237mm2)を、腫瘍組織及び対応する正常結腸粘膜/肺実質におけるFOXP3+細胞浸潤について分析し、各事例において10個のHPFを平均化した。
Claims (15)
- 哺乳動物のFoxP3陽性CD25+CD4+制御性T細胞を同定する方法であって、TSDR領域等の該foxp3遺伝子の1つ又は複数の調節領域における少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析することを含み、前記少なくとも1つのCpGの少なくとも90%又は少なくとも92%以上の脱メチル化が、FoxP3陽性CD25+CD4+制御性T細胞の指標となる、方法。
- 前記CpG位置が、該遺伝子foxp3のCpGアイランド、プロモーター領域及び/又はTSDR領域等の上流領域から選択される調節領域に位置する、請求項1に記載の方法。
- 前記メチル化状態の分析を、全血、パラフィン包埋組織、血液、組織、固形組織の画分、細胞又は組織の培養物、体液、器官、及びTregを含有することが疑われる他の試料の群から選択される試料中で行う、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記メチル化状態の分析が、メチル化特異的酵素消化、プロモーターメチル化、CpGアイランドメチル化、バイサルファイトシークエンシング、MSP、HeavyMethyl、MethyLight、Ms−SNuPE、PCR及び/又はリアルタイムPCRを含む方法を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記メチル化状態の分析が、配列番号4及び配列番号5並びに配列番号6及び配列番号7から選択されるプライマー対の少なくとも1つのプライマーを用いた増幅を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記メチル化状態の分析が、配列番号18及び配列番号19によるプローブのいずれかにより分析されるような少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態の分析を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- a)パラフィン包埋試料等の哺乳動物起源の保存組織試料を準備する工程、
b)前記試料のfoxp3遺伝子中の少なくとも1つのCpG位置におけるメチル化状態を分析する工程、及び
c)前記試料中に存在する制御性T細胞の量を前記メチル化状態に基づいて同定する工程を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記組織のTreg浸潤及びFoxP3発現の状態に応じて組織状態を決定する工程をさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 哺乳動物の免疫状態を診断する方法であって、
a)診断を受ける前記哺乳動物に由来するT細胞を含有する試料を準備する工程、
b)foxp3遺伝子中の少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析する工程、
c)前記試料中に存在する制御性T細胞の量を前記メチル化状態に基づいて同定する工程、及び
d)前記哺乳動物の免疫状態を同定された前記量に基づいて決定する工程を含み、1つの対立遺伝子における前記少なくとも1つのCpGの脱メチル化が少なくとも91%又は少なくとも92%以上であることが、FoxP3陽性CD25+CD4+制御性T細胞の指標となる、方法。 - 前記CpG位置が、該遺伝子foxp3のCpGアイランド、プロモーター領域又はTSDR領域等の上流領域に位置する、請求項9に記載の方法。
- 前記メチル化状態の分析を、全血、パラフィン包埋組織、血液、組織、固形組織の画分、細胞又は組織の培養物、体液、器官、及びTregを含有することが疑われる他の試料の群から選択される試料中で行う、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記制御性T細胞の量を、該制御性T細胞におけるFoxP3発現を調節する、Tregの量を変更する、又はTreg増加、Tregレベル、Treg移動挙動若しくはTreg生存を調節することが疑われる化学的及び/又は生物学的物質に応じて測定及び/又はモニタリングすることをさらに含む、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞、幹細胞若しくは前駆細胞におけるfoxp3発現、又はtregの増殖、分化、生存及び細胞死を調節する化学的及び/又は生物学的物質、及び/又は培養条件を同定するin vitro方法であって、前記化学的及び/又は生物学的物質の1つ又は複数をT細胞と接触させること、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法を行うこと、並びに前記化学的及び/又は生物学的物質又は条件が分析されたCpG位置のメチル化を調節するか否かを検出することを含み、前記物質又は条件が該分析されたCpG位置の脱メチル化を少なくとも90%又は91%又は92%増大させる、方法。
- 制御性T細胞を該遺伝子foxp3中のCpG位置のメチル化状態の分析に基づいて同定するキットであって、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法を行うための材料を含む、キット。
- FoxP3陽性制御性T細胞又はCD25+CD4+制御性T細胞を、検出及び/又は同定するための、請求項14に記載のキットの使用。
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