JP6062850B2 - 遺伝子ccr6及びblr1のdnaメチル化分析による免疫細胞、特にt細胞の検出 - Google Patents
遺伝子ccr6及びblr1のdnaメチル化分析による免疫細胞、特にt細胞の検出 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6062850B2 JP6062850B2 JP2013506682A JP2013506682A JP6062850B2 JP 6062850 B2 JP6062850 B2 JP 6062850B2 JP 2013506682 A JP2013506682 A JP 2013506682A JP 2013506682 A JP2013506682 A JP 2013506682A JP 6062850 B2 JP6062850 B2 JP 6062850B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- ccr6
- seq
- methylation
- memory
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2523/00—Reactions characterised by treatment of reaction samples
- C12Q2523/10—Characterised by chemical treatment
- C12Q2523/125—Bisulfite(s)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Hudson JT, 3rd, Waikel RL, Martin WD, Williams IR.
CCR6 expression distinguishes mouse myeloid and lymphoid dendritic cell subsets:
demonstration using a CCR6 EGFP knock-in mouse. Eur J
Immunol. 2002;32:104-112)、Th17細胞のマスター調節因子である転写因子RORγtの過剰発現が、ヒト及びマウスのT細胞上でのCCR6発現をもたらす(Hirota K,
Yoshitomi H, Hashimoto M, et al. Preferential recruitment of CCR6-expressing
Th17 cells to inflamed joints via CCL20 in rheumatoid arthritis and its animal
model. J Exp Med. 2007; 204:2803-2812、Manel N, Unutmaz
D, Littman DR. The differentiation of human T(H)-17 cells requires transforming
growth factor-beta and induction of the nuclear receptor ROR-gamma-t. Nat Immunol. 2008;9:641-649)。本発明者らはしたがって、CCR6遺伝子座のDNAメチル化を含む後成的機構が、ヒトT細胞における安定したCCR6発現の調節に寄与するか否かを調査した。本発明者らは、一次T細胞において転写活性を有し、ヒトのCCR6−T細胞及びCCR6+T細胞において差次的にメチル化される、CCR6遺伝子内の非コード領域を同定することができた。これらの観察結果及びDNAメチル化阻害剤5’−アザシチジンの誘導効果から、後成的機構がヒト免疫細胞、特にCCR6陽性記憶T細胞における安定したCCR6発現の調節、及び異なるホーミング特性のインプリンティングに関与することが示唆される。関節リウマチに関与することが報告されている細胞集団であるIL17陽性画分がCCR6陽性であることが示されたため、このマーカーは特に診断的価値がある(下記を参照されたい)。このマーカーの脱メチル化を測定する完全に定量的なメチル化アッセイを行う用途が好ましい。
Regulatory T cell-mediated transplantation tolerance. Immunol
Res. 2006; 33(3):195-212、June CH, Blazar
BR. Clinical application of expanded CD4(+)25(+) cells. Semin
Immunol. 2006 Jan 31、Khazaie K, von Boehmer
H. The impact of CD4(+)CD25(+) Treg on tumor specific
CD8(+) T cell cytotoxicity and cancer. Semin Cancer
Biol. 2006 Apr;16(2):124-136. Epub 2006 Jan 26、及びそれらにおいて引用される参考文献)、当業者は本発明との関連でこれらの方法を適用することが可能である。「治療」という用語は、上記CCR6及び/又はBLR1の発現に関連した疾患の予防も含む。
TB, Farber JM. CC-chemokine receptor 6 is expressed on diverse memory subsets
of T cells and determines responsiveness to macrophage inflammatory protein 3
alpha. J Immunol. 1999; 162:186-194.、Sato K, Kawasaki H, Nagayama H, et al.
Chemokine receptor expressions and responsiveness of cord blood T cells. J Immunol. 2001;166:1659-1666)、CCR6発現がT細胞プライミング時に獲得されることが示唆される。CCR6発現は、IL−1、IL−6、TGF−β及びTNF−αを含有するサイトカインカクテルを用いてナイーブCCR6−CD4+T細胞から新たに誘導することができる(非特許文献14、Sato K, Kawasaki H, Nagayama H, et al.
Chemokine receptor expressions and responsiveness of cord blood T cells. J Immunol. 2001;166:1659-1666)。
than)受容体の変調によるものであることを排除することはできない。これらのデータから、CCR6遺伝子座の重要な領域におけるDNAメチル化が、記憶T細胞における永久的にCCR6を発現する表現型の獲得に関与することが示される。
DNA methylation controls Foxp3 gene expression. Eur J
Immunol. 2008; 38:1654-1663)。
細胞、抗体及びフローサイトメトリー
バフィーコート(DRK Blutspendedienst,Berlin,Germany)及び末梢血サンプルを、地方倫理委員会の承認に従ってインフォームドコンセント後に健常ドナーから得た。フィコールハイパック勾配(Sigma-Aldrich)を用いてPBMCを分離した。細胞表面抗原を、以下のモノクローナル抗体を用いて、単一パラメーター又は多重パラメーターの蛍光活性化細胞選別装置(FACS)分析によって分析した:PE−抗CCR6(11A9)及びAlexa700−抗CD4(RPA−T4)(どちらもBD Biosciences製)。APC−抗CD25(BC96)はebioscienceから購入した。Beckman Coulter製のPE−Cy5−抗CD8(B9.11)、PE−Cy5−抗CD56(N901)及びFITC−抗CD25(B1.49.9)。社内(DRFZ,Berlin)で生成された抗体:FITC−抗CD45RA(4G11)、Alexa405−抗CD4(TT1)及びAlexa405−抗CD3(OKT3)。一部の実験では、CCR6発現をビオチン化CCR6(11A9、BD Biosciences)を用いた間接免疫蛍光法によって検出し、続いてAPC結合ストレプトアビジン(SouthernBiotech)を用いて染色した。染色は非特異的な結合を遮断するために、0.5%ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝生理食塩水中で行った。FACSCanto II(BD Biosciences)をデータ取得に用い、FlowJoソフトウェア(Treestar)を使用して分析を行った。
抗CD4磁性ビーズ又は抗CD8磁性ビーズのそれぞれ及び自動MACS分離システム(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)をメーカーの使用説明書に従って用いて、全CD4+T細胞及びCD8+T細胞をPBMCから富化した。抗CD4、抗CD8、抗CD25、抗CD45RA及び抗CCR6を用いた続く染色の後、以下の細胞集団をFACSAria(商標)又はFACSDiva(商標)細胞選別装置(BD Biosciences)で選別した:ナイーブCD4+T細胞(CD4+CD25−CD45RA+)、CD4+Treg(CD4+CD25high)、CCR6−ナイーブCD4+T細胞、CCR6−記憶CD4+T細胞(CD4+CD25−CD45RA−)、CCR6+記憶CD4+T細胞、CCR6−ナイーブCD8+T細胞(CD8+CD25−CD45RA+)、CCR6−記憶CD8+T細胞(CD8+CD25−CD45RA−)及びCCR8+記憶CD8+T細胞。再分析の際に、選別した細胞は常に98%を超える純度を示した。ex vivoで単離した細胞を、メチル化分析又はin vitro細胞培養(下記を参照されたい)のいずれかに使用した。
in vitro培養アッセイについては、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、非必須刺激(non-essential stimulation)、β−メルカプトエタノール及び5%ヒト血清を含有するRPMI 1640 Glutamax培地(Invitrogen)(完全培地(CM))中で細胞を培養した。ナイーブCD4+T細胞の刺激については、1×105個の細胞を平底マイクロタイタープレート内で、抗CD3及び抗CD28でコーティングされた1×105個の磁性ビーズ(Dynabeads、Invitrogen)とともに、20ng/mlのIL−2(R&D Systems)並びにIL−4、IL−12及びIFN−γに対する2μg/mlの中和抗体を添加したCM(中性条件、抗体はBD Biosciences製)中で4日間培養し、続いて1000U/mlのIL−2(Proleukin、Chiron)を含有するCMに移した。ナイーブCD4+細胞でのCCR6の誘導については、以下のサイトカインを培養の初めに添加した:10ng/mlのTGF−β、10ng/mlのIL−6、10ng/mlのIL−1、10ng/mlのTNF−α(R&D)。一部の実験では、細胞の刺激を同じ条件下で最大3回繰り返した。メチル化阻害薬5’−アザシチジン(Aza、Sigma-Aldrich)によるナイーブCD4+細胞でのCCR6の誘導については、48時間の培養後に5μMのAzaを添加した。
ヒトCCR6遺伝子座の差次的にメチル化される領域を、鋳型としてヒトcDNA、及び以下のプライマーを用いたPCRによって増幅した:(A)5’−GACTACGCGTCAGTAAGGGGGAGCCACTG−3’(配列番号11)、(B)5’−GACTAGATCTCAAGGAAAGCAGCTGACGA−3’(配列番号12)。増幅された501bpの要素を、MluI及びBglIIによってpGL3プロモーターベクター(Promega)に、最小SV40プロモーターの前にクローニングし、pGL3−CCR6を生成した。クローニングした領域のシークエンシングから、Ensemblに保管されたヒトゲノムのCCR6領域配列との100%の同一性が明らかになった。
プライマーをバイサルファイト特異的PCR及びシークエンシング反応に使用した。ゲノムDNAを、選別されたT細胞サブセットからDNeasy組織キット(Qiagen)を用いて、培養動物細胞用のプロトコルに従って単離した。ゲノムDNAのバイサルファイト処理を、これまでに記載されているように行った(Olek A, Oswald J,
Walter J. A modified and improved method for bisulphite
based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996;24:5064-5066.)。PCRを、1×PCRバッファー、1UのTaq DNAポリメラーゼ(Qiagen)、200μM dNTP、各12.5pmolのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに7ngのバイサルファイト処理したゲノムDNAを含有する25μLの最終容量で、95℃で15分間、並びに95℃で1分間、55℃で45秒間及び72℃で1分間の40サイクル、及び72℃で10分間の最終伸長工程で行った。PCR産物をEx−oSAP−IT(USB Corp.)を用いて精製し、PCRプライマー及びABI Big Dye Terminator v1.1ケミストリ(Applied Biosystems)を適用してシークエンシングし、続いてABI 3100遺伝子分析装置でキャピラリー電気泳動を行った。ESMEを用いてAB1ファイルを解釈した(Lewin J, Schmitt
AO, Adorjan P, Hildmann T, Piepenbrock C. Quantitative DNA methylation analysis based
on four-dye trace data from direct sequencing of PCR amplificates.
Bioinformatics. 2004; 20:3005-3012.)。
アンプリコン888の増幅プライマー(バイサルファイトシークエンシング用):
フォワード:(888p)GTTAGTGGGGTTGAGTAGGATA(配列番号1)
リバース:(888o)AAAACCCTAAAATCACAAAACTA(配列番号2)
アンプリコン1201の増幅プライマー(バイサルファイトシークエンシング用):
1201q TTGGTAATGTTTGTTTGGAAAG(配列番号3)
1201r CTCCTAAATCCCTCAACATCTA(配列番号4)
アンプリコン1202の増幅プライマー(バイサルファイトシークエンシング用):
1202o AAACTCACAACTTCCTTCACTC(配列番号5)
1202p AAGGGTAGTGTTAGAGGGTATTT(配列番号6)
アンプリコン1203の増幅プライマー(バイサルファイトシークエンシング用):
1203o CACCTAATCTTCATATAACACAAAA(配列番号7)
1203p GGTATAGTGTATTGGGAAGTGG(配列番号8)
アンプリコン1204の増幅プライマー(バイサルファイトシークエンシング用):
1204r TCTCTTTTTCTTATCACTTTACCA(配列番号27)
1204q TGTTTTTAGGAAAGGAAGTTTG(配列番号28)
アンプリコン1037の増幅プライマー(配列番号29;バイサルファイトシークエンシング用):
1037o CCTTATCTACTTCTTCCACAAAAT(配列番号9)
1037p AGTGATGAGTTGTGAGGTAGGT(配列番号10)
DMRの増幅プライマー(バイサルファイトシークエンシング用):
CpG(メチル化)特異的PCRシステム
フォワードプライマー GAGATGATAAGGGGTGC(配列番号14)
リバースプライマー ACACCTCACCTAAATCG(配列番号15)
プローブ HEX−TTTAGGCGTGAGGACGTGGAGTT−BHQ1(配列番号16)
TpG(脱メチル化)特異的PCRシステム
フォワードプライマー GAGATGATAAGGGGTGT(配列番号17)
リバースプライマー ACCACACCTCACCTAAATCA(配列番号18)
プローブ FAM−ATTTAGGTGTGAGGATGTGGAGTTTAGGG−BHQ1(配列番号19)
GCCAGTGGGGTTGAGCAGGACACAGGTCCTGCTGTGTCTAGCTGGTTCCCCAGAGAGATGATAAGGGGTGCGCTCCAGCTTCTCAGGCTCACTCAGGCGTGAGGACGTGGAGCTCAGGGCTCTGCAGGAAGGAGCGACCCAGGTGAGGTGTGGTCAAGATAGAGCAGAGCTGGGCAGCGGGCAGTGGAGCCTCGTGGGCAGCCTGGGGGTGGGGAGGCACAGTGCACTGGGAAGTGGAGAAAGTGTGAGTCCATCAGGCTGGCTGAGAATTGATCACGAACCTATTGTCTGTAAAACTTTTGTTATTTCCTGAGACGTGGTTCACAGCAACCCAGGTGCGAACAGCCTTGTGATTCTAGGGTTCT(配列番号13)
推定転写因子結合部位の予測については、MatInspectorツール(Genomatix)を用いた。
データは平均±SDとして表す。群間差を、指定のマンホイットニー検定又はウィルコクソン順位検定を用いて評価した。0.05未満のP値は有意であるとみなした。
CCR6遺伝子座内の非コード領域は、CCR6発現と相関して差次的メチル化を示す
本発明者らは以前に、差次的メチル化ハイブリダイゼーション(DMH)技法を用いて通常のナイーブCD4+T細胞とCD25highCD4+Tregとを比較することによって、ヒトTregにおける後成的に調節される遺伝子のスクリーニングを行った(非特許文献20)。このDMHスクリーニングでは、CCR6が差次的にメチル化される遺伝子の一つであることが分かった。好ましい差次的にメチル化される領域は、報告された2つのCCR6転写産物の上流に位置し、推定CCR6プロモーターと重複する(図1A)。DMHのデータを確認するために、本発明者らは、ヒト末梢血から単離された通常のナイーブCD45RA+CD4+T細胞及びCD25highCD4+Tregに由来するゲノムDNAを用いてバイサルファイトシークエンシングを行った。CD25highCD4+Tregは、大部分が脱メチル化されたCCR6領域を示したが(平均メチル化率23.8%)、通常のナイーブT細胞はほぼ完全にメチル化されていた(平均メチル化率81%)(図1B)。
K. CCR6 expression defines regulatory effector/memory-like cells within the
CD25+CD4+ T-cell subset. Blood. 2005;105:2877-2886.)に加えて、CCR6の発現はCD4+記憶T細胞及びCD8+記憶T細胞の両方について報告されている。CCR6遺伝子座の観察された脱メチル化が、ex vivoでCCR6を発現する細胞の画分に限定されるか否かを理解するために、CD4+T細胞及びCD8+T細胞のサブセットを、CCR6及びCD45RAの発現に従って選別し(図2A)、CCR6遺伝子座のバイサルファイトシークエンシングによって分析した。CCR6発現を欠くナイーブCD45RA+CD4+T細胞、及びCCR6−CD45RA−CD4+記憶T細胞の両方が強くメチル化されたが、CCR6を発現するCD4+記憶T細胞は、分析したCCR6領域のほぼ完全な脱メチル化を示した(図2B)。CD8+T細胞は全体的に低いDNAメチル化レベルを示したが、CCR6+CD8+記憶T細胞は明らかにCCR6−CD8+記憶T細胞と比較して低いメチル化CCR6領域を示した(図2B)。これらのデータに一致して、休止期のCD14+単球及びCD15+顆粒球等のCCR6発現を欠く末梢血白血球サブセットは、ほぼ完全にメチル化されたCCR6領域を示したが(平均メチル化率84%超)、CCR6を発現するCD56+NK細胞及びNKT細胞並びに成熟B細胞は、この部位で完全に脱メチル化されていた。まとめると、本発明者らのデータは、CCR6発現がヒト白血球においてCCR6領域の脱メチル化と相関することを示している。
CD4+記憶T細胞上のCCR6発現及び分析したCCR6領域の対応するメチル化パターンの両方が、細胞分裂時に安定しているかを調べるために、選別されたCCR6+CD25−CD45RA−CD4+T細胞をCFSEで標識し、記憶細胞の恒常的代謝回転を媒介するサイトカインを用いて、又はTCRによって誘発することによって刺激した。以前の報告(Geginat J, Sallusto F, Lanzavecchia A.
Cytokine-driven proliferation and differentiation of human naive, central
memory, and effector memory CD4(+) T cells. J Exp Med. 2001;194:1711-1719)と一致して、記憶T細胞がIL−7及びIL−15等の恒常性サイトカインの存在下で増殖し、多数の細胞分裂の後であっても全ての増殖細胞が高レベルのCCR6発現を維持していた(図3A)。TCR刺激はCCR6発現の下方調節をもたらし(Sallusto F, Kremmer E, Palermo B, et al. Switch in chemokine receptor
expression upon TCR stimulation reveals novel homing potential for recently
activated T cells. Eur J Immunol.
1999;29:2037-2045)、これはTGF−βによって阻害され、IL−4によって促進された(図3A及び図3B)。しかしながら、試験した全ての刺激条件下で、CCR6領域のメチル化状態は変化しないままであり、同等の低レベルのメチル化を示した(図3C)。重要なことには、TCR刺激の際にCCR6発現を失ったCCR6−/low細胞が、TCR刺激の非存在下での培養後にCCR6を急速に再発現したため、TCRによって誘導されるCCR6発現の下方調節は一時的でしかなかった(図3D)。このため、CCR6領域の脱メチル化はCCR6発現の長期安定性に関連する。
CCR6発現は、炎症性サイトカイン(TNF−α、IL−6、IL−1)+TGF−βのカクテルの存在下での活性化によって、ナイーブCD4+T細胞の画分に対してin vitroで誘導することができる。本発明者らは、この新たなCCR6発現の誘導が、CCR6領域の脱メチル化と関連しているか否かについて分析した。ナイーブCD4+T細胞を、炎症性サイトカイン及びTGF−βの存在下で抗CD3/抗CD28 Dynabeads(商標)で刺激した。in vitro培養の6日目に、サイトカインの非存在下で刺激したT細胞と比較して有意に高いT細胞の画分がCCR6を発現した(図4A)。しかしながら、両方の細胞集団がCCR6領域内でほぼ完全にメチル化され、未刺激ナイーブT細胞に対して違いを示さなかった(図1B及び図2B)。CCR6−細胞及びCCR6+細胞への選別後も、新たに誘導されたCCR6+細胞においてCCR6領域の選択的な脱メチル化は観察することができなかった(図4B)。サイトカインカクテルの存在下での反復刺激はCCR6+細胞の頻度を更に増大したが、CCR6領域の脱メチル化は依然として検出可能ではなく(図4C及び図4D)、炎症性サイトカインのカクテルがCCR6発現の誘導には十分であるが、CCR6遺伝子座の脱メチル化には十分でないことが示された。ex vivoで単離したCD4+記憶T細胞とは対照的に、炎症性サイトカインの存在下でのTCR刺激によるナイーブT細胞におけるCCR6の新たな誘導は、一時的なCCR6発現しかもたらさず、ほぼ全ての細胞が誘導性サイトカインの非存在下での長期のin vitro培養の際にCCR6発現を失った(図4D)。
DNAメチル化状態は、5’−アザシチジン(Aza)等のDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤の存在下でのDNA複製の誘導によって薬理学的に操作することができる。分析されるCCR6領域の脱メチル化が、CCR6発現の安定化に関与するか否かを更に調べるために、本発明者らは、ナイーブCD4+T細胞をAzaの存在下で抗CD3及び抗CD28 Dynabeads(商標)を用いて活性化した。驚くべきことに、Aza処理は、外因性サイトカインの非存在下であっても相当な割合の細胞においてCCR6発現を誘導し、これらのAza処理細胞においてCCR6領域の明らかな脱メチル化を検出することができた(図5A)。興味深いことに、Azaによって誘導されたCCR6+細胞を選別し、Azaの非存在下で中性条件下にて再刺激すると、CCR6発現の顕著な安定性がこれらの細胞において観察され、CCR6遺伝子座の脱メチル化がT細胞において安定したケモカイン受容体の発現を制御することが更に示された。
CCR6遺伝子座の好ましい差次的にメチル化される領域は、2つの予測CCR6転写産物の444/446塩基上流に位置する(図1A)。CCR6領域は、コンピュータにより予測されたプロモーター領域と部分的に重複する。転写開始部位のようなプロモーターに典型的な要素はCCR6領域においては検出されなかったが、転写調節因子PPAR、GATA、AHR、ETS1又はRXR(それらの一部、例えばETS1はメチル化依存的にそれらの標的配列に結合する)の推定結合部位が検出された(Maier H, Colbert J, Fitzsimmons D, Clark DR, Hagman
J. Activation of the early B-cell-specific mb-1 (Ig-alpha)
gene by Pax-5 is dependent on an unmethylated Ets
binding site. Mol Cell Biol. 2003;23:1946-1960, and
own unpublished observations)。
種々のT細胞種を2人の独立したドナーから精製し、FACS選別した。細胞傷害性T細胞及びヘルパーT細胞の分別のためのマーカーとしてCD4及びCD8を用いて、細胞を分離した。次いで、CD45RAを用いてこれらの集団をナイーブ細胞集団及び記憶細胞集団に更に分離した。記憶集団をCCR6陽性集団及びCCR6陰性集団に更に分離した。結果を以下の表1にまとめる。
Claims (9)
- 哺乳動物のNK細胞、記憶T細胞、記憶細胞傷害性T細胞、ナイーブB細胞及び/又は記憶B細胞を同定する方法であって、遺伝子ccr6の配列番号1及び配列番号2のプライマー対によって増幅されるアンプリコン888、並びに配列番号7及び配列番号8のプライマー対によって増幅されるアンプリコン1203から選択されるアンプリコン内の少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析することを含み、非活性化T細胞と比較した場合の脱メチル化状態が、NK細胞、記憶T細胞、記憶細胞傷害性T細胞、ナイーブB細胞及び/又は記憶B細胞の指標となる、方法。
- 遺伝子ccr6における脱メチル化が、CCR6+CD4+T細胞若しくはCCR6+CD8+T細胞、又は安定に活性化されたCCR6+CD4+T細胞若しくはCCR6+CD8+T細胞から選択される細胞の指標となり、前記方法が任意でCD3+細胞を単離する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- メチル化状態の分析が、メチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシング、メチル化特異的PCR、HeavyMethyl(商標)、MethyLight、又はMs−SNuPEから選択される方法を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- サンプルのプールを、少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態について分析する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子CCR6のメチル化状態の分析が、配列番号1及び配列番号2、並びに配列番号7及び配列番号8から選択されるプライマー対のうち少なくとも1つを用いた増幅を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- メチル化状態の分析が、配列番号1及び配列番号2のプライマー対によって増幅されるアンプリコン888の71位、98位、106位、135位、178位、193位、277位、316位及び339位、配列番号7及び配列番号8のプライマー対によって増幅されるアンプリコン1203の62位、101位、124位、202位、246位及び251位からなる群から選択される少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析することを含む、請求項5に記載の方法。
- 哺乳動物がマウス、ラット、サル又はヒトである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 非活性化T細胞におけるCCR6の発現を調整する化学物質及び/又は生体物質を同定するin vitro方法であって、前記化学物質及び/又は生体物質の1つ又は複数を免疫細胞と接触させることと、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法を行うことと、前記化学物質及び/又は生体物質が、分析されるCpG位置のメチル化を調整するか否かを検出することとを含む、方法。
- 物質が、分析されるCpG位置の少なくとも80%、又は90%、又は95%までの脱メチル化をもたらす、請求項8に記載の化学物質及び/又は生体物質を同定する方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US32922910P | 2010-04-29 | 2010-04-29 | |
US61/329,229 | 2010-04-29 | ||
PCT/EP2011/056871 WO2011135088A1 (en) | 2010-04-29 | 2011-04-29 | Detection of immune cells, in particular t cells through dna-methylation analysis of the genes ccr6 and blr1 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016106050A Division JP2016208977A (ja) | 2010-04-29 | 2016-05-27 | 遺伝子ccr6及びblr1のdnaメチル化分析による免疫細胞、特にt細胞の検出 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013524828A JP2013524828A (ja) | 2013-06-20 |
JP6062850B2 true JP6062850B2 (ja) | 2017-01-25 |
Family
ID=44022865
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013506682A Expired - Fee Related JP6062850B2 (ja) | 2010-04-29 | 2011-04-29 | 遺伝子ccr6及びblr1のdnaメチル化分析による免疫細胞、特にt細胞の検出 |
JP2016106050A Pending JP2016208977A (ja) | 2010-04-29 | 2016-05-27 | 遺伝子ccr6及びblr1のdnaメチル化分析による免疫細胞、特にt細胞の検出 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016106050A Pending JP2016208977A (ja) | 2010-04-29 | 2016-05-27 | 遺伝子ccr6及びblr1のdnaメチル化分析による免疫細胞、特にt細胞の検出 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9783846B2 (ja) |
EP (1) | EP2563932B1 (ja) |
JP (2) | JP6062850B2 (ja) |
DK (1) | DK2563932T3 (ja) |
ES (1) | ES2657846T3 (ja) |
PL (1) | PL2563932T3 (ja) |
WO (1) | WO2011135088A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016208977A (ja) * | 2010-04-29 | 2016-12-15 | エピオンティス ゲーエムベーハー | 遺伝子ccr6及びblr1のdnaメチル化分析による免疫細胞、特にt細胞の検出 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130302276A1 (en) * | 2010-10-22 | 2013-11-14 | Dana-Farber Cancer Insitute Inc., | Discovery of regulatory t cells programmed to suppress an immune response |
WO2014052545A2 (en) | 2012-09-28 | 2014-04-03 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Targeted expansion of qa-1-peptide-specific regulatory cd8 t cells to ameliorate arthritis |
US10208346B2 (en) | 2013-04-19 | 2019-02-19 | Epiontis Gmbh | Method for identifying the quantitative cellular composition in a biological sample |
CA2957958C (en) | 2014-08-27 | 2023-10-17 | Harvey Cantor | Intracellular osteopontin regulates the lineage commitment of lymphoid subsets |
WO2017171631A1 (en) * | 2016-03-31 | 2017-10-05 | Lion Tcr Pte. Ltd. | Non-activated t cells expressing exogenous virus-specific t cell receptor (tcr) |
EP3494210A4 (en) * | 2016-08-05 | 2020-03-11 | The Regents Of The University Of California | MORTALITY PRONOSTICER BASED ON DNA METHYLATION |
DE102018112644B4 (de) * | 2018-05-25 | 2020-06-10 | Epiontis Gmbh | CXCR3 als epigenetischer Marker zur Identifizierung von inflammatorischen Immunzellen, insbesondere CD8+ Gedächnis-T-Zellen |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6110695A (en) | 1997-12-02 | 2000-08-29 | The Regents Of The University Of California | Modulating the interaction of the chemokine, B Lymphocyte Hemoattractant, and its Receptor, BLR1 |
US20050101530A1 (en) | 2001-08-10 | 2005-05-12 | Topigen Pharmaceutique, Inc. | Cellular virus receptors and methods of use |
EP1718766A4 (en) * | 2004-02-10 | 2009-05-27 | Cornell Res Foundation Inc | METHOD FOR DETECTING PROMOTER METHYLATION STATE |
PL2563932T3 (pl) * | 2010-04-29 | 2018-07-31 | Epiontis Gmbh | Wykrywanie komórek odpornościowych, w szczególności komórek T poprzez analizę metylacji DNA genów CCR6 |
-
2011
- 2011-04-29 PL PL11716573T patent/PL2563932T3/pl unknown
- 2011-04-29 ES ES11716573.8T patent/ES2657846T3/es active Active
- 2011-04-29 JP JP2013506682A patent/JP6062850B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-04-29 US US13/636,556 patent/US9783846B2/en active Active
- 2011-04-29 WO PCT/EP2011/056871 patent/WO2011135088A1/en active Application Filing
- 2011-04-29 EP EP11716573.8A patent/EP2563932B1/en active Active
- 2011-04-29 DK DK11716573.8T patent/DK2563932T3/en active
-
2016
- 2016-05-27 JP JP2016106050A patent/JP2016208977A/ja active Pending
-
2017
- 2017-07-27 US US15/661,432 patent/US10590475B2/en active Active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016208977A (ja) * | 2010-04-29 | 2016-12-15 | エピオンティス ゲーエムベーハー | 遺伝子ccr6及びblr1のdnaメチル化分析による免疫細胞、特にt細胞の検出 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20170327871A1 (en) | 2017-11-16 |
ES2657846T3 (es) | 2018-03-07 |
US10590475B2 (en) | 2020-03-17 |
US20130089861A1 (en) | 2013-04-11 |
PL2563932T3 (pl) | 2018-07-31 |
JP2013524828A (ja) | 2013-06-20 |
US9783846B2 (en) | 2017-10-10 |
EP2563932B1 (en) | 2017-11-29 |
DK2563932T3 (en) | 2018-03-05 |
EP2563932A1 (en) | 2013-03-06 |
WO2011135088A1 (en) | 2011-11-03 |
JP2016208977A (ja) | 2016-12-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6062850B2 (ja) | 遺伝子ccr6及びblr1のdnaメチル化分析による免疫細胞、特にt細胞の検出 | |
EP1826278A1 (en) | Epigenetic modification of the loci for camta1 and/or foxp3 as a marker for cancer treatment | |
Yang et al. | Foxp3+ T cells expressing RORγt represent a stable regulatory T-cell effector lineage with enhanced suppressive capacity during intestinal inflammation | |
Cribbs et al. | Treg cell function in rheumatoid arthritis is compromised by CTLA‐4 promoter methylation resulting in a failure to activate the indoleamine 2, 3‐dioxygenase pathway | |
Tsagaratou et al. | TET methylcytosine oxidases in T cell and B cell development and function | |
Steinfelder et al. | Epigenetic modification of the human CCR6 gene is associated with stable CCR6 expression in T cells | |
Baron et al. | DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3+ conventional T cells | |
Stockis et al. | Comparison of stable human Treg and Th clones by transcriptional profiling | |
JP7385281B2 (ja) | 低抗原性細胞の製造方法 | |
Fogel et al. | Role of the IL-12/IL-35 balance in patients with Sjögren syndrome | |
Kressler et al. | Targeted de-methylation of the FOXP3-TSDR is sufficient to induce physiological FOXP3 expression but not a functional treg phenotype | |
Newman et al. | Acetylation of the Cd8 locus by KAT6A determines memory T cell diversity | |
US9096900B2 (en) | Epigenetic marker for the identification of natural killer cells | |
Minskaia et al. | Molecular markers distinguishing T cell subtypes with TSDR strand-bias methylation | |
Lu et al. | Dynamic changes in the regulatory T-cell heterogeneity and function by murine IL-2 mutein | |
US10294527B2 (en) | Epigenetic marker for the identification of natural killer cells | |
US20210100897A1 (en) | Methods for the stimulation of dendritic cell (dc) precursor population "pre-dc" and their uses thereof | |
Conteduca et al. | AIRE polymorphism, melanoma antigen-specific T cell immunity, and susceptibility to melanoma | |
Zhang et al. | Differentially‑expressed genes identified by suppression subtractive hybridization in the bone marrow hematopoietic stem cells of patients with psoriasis | |
Mescheriakova et al. | Genetics of multiple sclerosis | |
US9556484B2 (en) | Epigenetic marker for the identification of IL17 positive T cells in complex samples | |
De Simone | Dissecting Functional Heterogeneity in the Human CD8+ T Cell Compartment to Characterize Superior Effector Responses | |
Miron | Mechanisms of tissue compartmentalization in human T cells | |
Lorenzini | Functional Role of T Regulatory Cells in Peripheral Immune Tolerance in Multiple Sclerosis | |
Buang | Genetic and cellular mechanisms of autoimmunity in lupus-prone B6. 129-Sle16 mice |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140430 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150601 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150901 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160127 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160527 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20160711 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160831 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160916 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161124 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161215 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6062850 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |