JP2011523405A - Ｉｇｆ−ｉｉ／ｉｇｆ−ｉｉｅ結合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥに結合するタンパク質、およびそのようなタンパク質を使用する方法が記載されている。癌を治療するための新規方法も開示されている。癌は、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、および追加の療法、例えば、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーター、または上皮成長因子受容体阻害剤などを投与することによって治療される。一局面において、本開示は、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥ（例えば、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥ）に結合し、少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域を含むタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）を特徴とする。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２００８年５月９日に出願された米国出願第６１／０５１，９５６号、２００８年５月１５日に出願された米国出願第６１／０５３，４２７号および２００９年３月２５日に出願された米国出願第６１／１６３，１８０号への優先権を主張する。先行する出願の開示は、この出願の一部とみなされる（そして参考として援用される）。
ポリペプチドのインスリン様成長因子ファミリーは、正常な成長および発生において重要な役割を果たす。ＩＧＦ系のＩＧＦ ＩＩなどの成分の発現の変化は、多くの腫瘍型における悪性表現型の発生および維持に関わっており、この系を標的にする薬剤は、抗癌治療剤としての可能性を有し得ることを示す。腫瘍によるＩＧＦ−ＩＩ分泌増大に寄与し得るいくつかの経路が同定されており、これらには、母系性ＩＧＦ−ＩＩ対立遺伝子のゲノム刷り込みの喪失、父系性対立遺伝子複製を伴う異型接合性の喪失および／または転写制御の喪失が含まれる。そのような分泌の増大は、より多数の増殖、アポトーシスからの保護、および癌の転移能を可能にし、その理由は特にＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合する受容体、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、およびインスリン受容体（ＩＲ−Ａ）のアイソフォームが、腫瘍細胞中で一般にアップレギュレートされるためである。ＩＧＦ−ＩＩ産生の増大は、循環からのＩＧＦ−ＩＩのクリアランスの中心であると思われる、第３の型のＩＧＦ−ＩＩ受容体であるマンノース−６−リン酸受容体のダウンレギュレーションによってさらに悪化する。ＩＧＦ−ＩＩの局所的なレベルも、腫瘍により分泌される特定のＩＧＦ−ＩＩ結合タンパク質の発現の変化によって、または腫瘍によって生じるプロテアーゼ活性の増大の結果として上昇し得る。
これは癌の５０％の病因に関わっているが、ＩＧＦシグナル伝達軸を特異的に標的にする利用可能な治療剤は限られており、一方、これを是正するために、多くの研究取り組みが進行中である。乳癌治療モデルにおけるＥＧＦ受容体アンタゴニストの有効性は、ＩＧＦ系を介した耐性の急速な発生によって制限されることが最近実証された。ＩＧＦ系を妨害する治療剤の発見または開発は、ほとんどのＩＧＦ−Ｉ受容体は、高い親和性を伴ってＩＧＦ−ＩＩおよびインスリンの両方に結合するインスリン受容体のアイソフォームであるＩＲ−Ａとハイブリッド受容体を形成するように思われるという知見によって複雑になっている。したがって、チロシンキナーゼ阻害剤または抗体を用いたＩＧＦ−ＩＲの治療標的化はまた、インスリンシグナル伝達を遮断し、糖尿病を引き起こす可能性があり、最近の報告は、これが実際に起こることを示した。霊長類の研究における、ＩＧＦ−ＩＲ小分子キナーゼアンタゴニストの毒性問題も報告された。
正常な循環において、ＩＧＦ−ＩおよびＩＩの９５％は、６つの高親和性ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に結合している。主要な血清結合タンパク質はＩＧＦＢＰ−３であり、これは酸不安定タンパク質（ＡＬＳ）と三量体の複合体を形成する。通常ＩＧＦ−ＩＩは、１５６アミノ酸（ａａ）前駆体タンパク質として合成され、これはプロＩＧＦ−ＩＩとして公知である。このタンパク質は、Ｅドメインとして公知の８７ａａ Ｃ末端領域を含み、したがって「ＩＧＦ−ＩＩＥ」と呼ばれる。本明細書では、Ｅドメインを包含するアミノ酸１〜１０４を含むコンストラクトは、「ＩＧＦ−ＩＩＥ」と呼ばれる。タンパク質分解ステップにより、成熟した６７ａａ ＩＧＦ−ＩＩポリペプチドが放出される。文献において、ＩＧＦ−ＩＩの「長い」または「大きい」形態は、Ｅドメインの一部のみが切断された形態とも時折呼ばれる。長い、または大きい形態は、完全なＥドメインとは対照的に、Ｅドメインの一部のみを含有する場合があるにもかかわらず、時折ＩＧＦ−ＩＩＥとも呼ばれる。多くの腫瘍において、ゲノムレベルでの刷り込みの喪失に主に起因してＩＧＦ−ＩＩの産生が増大しており、または遊離ＩＧＦ−ＩＩのバイオアベイラビリティーの増大を可能にする腫瘍によって生じるプロテアーゼ活性の増大に起因して、結合タンパク質のレベルが減少している。最近のＩＧＦ ＩＩマウスモデルでは、Ａｐｃ＋／Ｍｉｎマウスと交配した、刷り込み特性が喪失した子孫マウスは、腫瘍形成を大いに増強することを示した。多くの腫瘍は、ＩＧＦ−ＩＩＥをプロセシングして成熟した７．５ｋＤａのタンパク質にする酵素機構を欠いており、したがってＩＧＦ−ＩＩＥを主に分泌する。この長いＩＧＦ−ＩＩリガンドは、２１個のアミノ酸の伸長、およびトレオニン７５において不完全なグリコシル化を有し、したがってＡＬＳに結合することができず、より多くの「遊離ＩＧＦ−ＩＩ」がＩＲまたはＩＧＦ−ＩＲを活性化することを可能にし、腫瘍性増殖を強化し、一部の癌では低血糖症を引き起こす。
したがって、ＩＧＦ依存性癌の治療剤として、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥに結合する抗体を設計する必要がある。さらに、療法の併用は、増強された、またはさらには相乗的な治療結果をもたらすことが多い。
癌の免疫療法治療は、従来の療法、例えば、手術、放射線療法、および化学療法などに優る多くの利点を有し、その理由は、治療剤、例えば、サイトカイン、抗体、または抗体様部分などは、腫瘍性細胞に対して非常に特異的となり得るためである。ＥＧＦＲ経路に関連するシグナル事象などの天然に存在する事象を遮断または妨害する抗体は、いくつかの腫瘍型の成長を低減するのに有効であることが示された。本発明者らはいくつかの結腸直腸癌細胞株を評価しており、すべてが、ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現するだけでなく、ＩＲ−Ａの発現のアップレギュレーションも有する。ＩＧＦ−ＩＩのＩＲ−Ａへの結合の作用は、分裂促進性シグナル伝達および転移を主にもたらし、悪性表現型を悪化させている。ＩＧＦ−ＩＩを標的にする治療剤は、ＩＲのダウンレギュレーションおよび予想される合併症の低血糖症を引き起こさずに、両受容体への結合を阻害することによってこのリガンドの作用を遮断するであろう。さらに、ＩＧＦ−ＩＩに加えてＩＧＦ−ＩＩＥを標的にする治療剤は、ＩＧＦ−ＩＩＥをさらにプロセシングしない腫瘍を標的にするであろう。ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥに特異的に結合する抗体の開発により、キナーゼアンタゴニストで示された毒性問題も軽減されるであろう。さらに、ＩＧＦ−ＩＩＥのみを標的にし、ＩＧＦ−ＩＩを標的にしない治療剤も価値があるものとなろう。
したがって、本開示はとりわけ、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの両方またはいずれかに結合し、本明細書で「ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質」と呼ばれるタンパク質、ならびにそのようなタンパク質を同定および使用する方法に関する。これらのタンパク質には、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの両方に結合し、かつ／またはそれに続くこれらの結合を阻害する抗体および抗体断片（例えば、霊長類抗体およびＦａｂ、特にヒト抗体およびＦａｂ）が含まれる。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥの過剰または不適切な活性を特徴とする癌などの疾患、特にヒト疾患を治療するのに使用することができる。多くの場合において、タンパク質は、耐容可能な低い毒性を有するか、毒性がまったくない。
一態様では、本開示は、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥ（例えば、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥ）に結合し、少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域を含むタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）を特徴とする。例えば、本タンパク質は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。一実施形態では、本タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥ、例えば、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥの結果として起こる結合に結合し、かつこれらを阻害する。別の実施形態では、本タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩではなく、ＩＧＦ ＩＩＥのみの結果として起こる結合に結合し、かつ／またはこれを阻害する。
本タンパク質は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含むことができる：（ａ）ヒトＣＤＲまたはヒトフレームワーク領域；（ｂ）ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、本明細書に記載されるＬＣ可変ドメインのＣＤＲと、少なくとも８５、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である、１つまたは複数の（例えば、１、２、または３つ）のＣＤＲを含む；（ｃ）ＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、本明細書に記載されるＨＣ可変ドメインのＣＤＲと、少なくとも８５、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である、１つまたは複数の（例えば、１、２、または３つ）のＣＤＲを含む；（ｄ）ＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、本明細書に記載されるＬＣ可変ドメインと、少なくとも８５、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である；（ｅ）ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、本明細書に記載されるＨＣ可変ドメインと、少なくとも８５、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である；（ｆ）本タンパク質は、本明細書に記載されるタンパク質によって結合したエピトープ、またはそのようなエピトープと重複するエピトープに結合する；および（ｇ）霊長類ＣＤＲまたは霊長類フレームワーク領域。
本タンパク質は、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥ、例えば、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥに結合することができ、結合親和性は、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、および１０１１Ｍ−１である。一実施形態では、本タンパク質は、１×１０−３、５×１０−４ｓ−１、または１×１０−４ｓ−１より遅いＫｏｆｆを伴って、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥに結合する。一実施形態では、本タンパク質は、１×１０２、１×１０３、または５×１０３Ｍ−１ｓ−１より速いＫｏｎを伴って、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥに結合する。一実施形態では、本タンパク質は、例えば、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、および１０−１０Ｍ未満のＫｉを伴って、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩＥ活性の両方を阻害する。一実施形態では、本タンパク質は、例えば、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、および１０−１０Ｍ未満のＫｉを伴って、ヒトＩＧＦ−ＩＩまたはヒトＩＧＦ−ＩＩＥ活性を阻害する。本タンパク質は、例えば、１００ｎＭ、１０ｎＭ、または１ｎＭ未満のＩＣ５０を有することができる。例えば、本タンパク質は、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）およびインスリン受容体（ＩＲ−Ａ）のアイソフォームの活性、ならびにＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥを調節することができる。本タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ−Ａ、ならびにＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの活性を阻害することができる。ヒトＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥに対する本タンパク質の親和性は、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または１ｎＭ未満のＫＤを特徴とするものであり得る。
好適な実施形態では、本タンパク質は、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、およびＭ００７２−Ｇ０６を含むリストから選ばれる抗体の軽鎖および重鎖を有するヒト抗体である。好適な実施形態では、本タンパク質は、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、およびＭ００７２−Ｇ０６を含むリストから選ばれるその重鎖を有するヒト抗体である。好適な実施形態では、本タンパク質は、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、およびＭ００７２−Ｇ０６を含むリストから選ばれるその軽鎖を有するヒト抗体である。好適な実施形態では、本タンパク質は、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、およびＭ００７２−Ｇ０６を含む重鎖のリストの対応するＣＤＲから選ばれる、１つまたは複数（例えば、１、２、または３つ）の重鎖ＣＤＲを有するヒト抗体である。好適な実施形態では、本タンパク質は、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、およびＭ００７２−Ｇ０６を含む重鎖のリストの対応するＣＤＲから選ばれる、１つまたは複数（例えば、１、２、または３つ）の軽鎖ＣＤＲを有するヒト抗体である。
一実施形態では、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、同じポリペプチド鎖の成分である。別の実施形態では、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、異なるポリペプチド鎖の成分である。例えば、本タンパク質は、ＩｇＧ．、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。本タンパク質は可溶性Ｆａｂ（ｓＦａｂ）とすることができる。他の実施では、本タンパク質には、Ｆａｂ２’、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ｓｃＦｖ：：Ｆｃ融合物、Ｆａｂ：：ＨＳＡ融合物、ＨＳＡ：：Ｆａｂ融合物、Ｆａｂ：：ＨＳＡ：：Ｆａｂ融合物、または本明細書の結合タンパク質のうちの１つの抗原結合部位を含む他の分子が含まれる。これらのＦａｂのＶＨおよびＶＬ領域は、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ２’、ｓｃＦｖ、ペグ化Ｆａｂ、ペグ化ｓｃＦｖ、ペグ化Ｆａｂ２、ＶＨ：：ＣＨ１：：ＨＳＡ＋ＬＣ、ＨＳＡ：：ＶＨ：：ＣＨ１＋ＬＣ、ＬＣ：：ＨＳＡ＋ＶＨ：：ＣＨ１、ＨＳＡ：：ＬＣ＋ＶＨ：：ＣＨ１、または他の適切な構築物として提供することができる。
一実施形態では、本タンパク質は、ヒト抗体もしくはヒト化抗体であり、またはヒトにおいて非免疫原性である。例えば、本タンパク質は、１つまたは複数のヒト抗体フレームワーク領域、例えば、全ヒトフレームワーク領域を含む。一実施形態では、本タンパク質は、ヒトＦｃドメイン、またはヒトＦｃドメインと、少なくとも９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるＦｃドメインを含む。
一実施形態では、本タンパク質は、霊長類抗体もしくは霊長類化抗体であり、またはヒトにおいて非免疫原性である。例えば、本タンパク質は、１つまたは複数の霊長類抗体フレームワーク領域、例えば、全霊長類フレームワーク領域を含む。一実施形態では、本タンパク質は、霊長類Ｆｃドメイン、または霊長類Ｆｃドメインと、少なくとも９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるＦｃドメインを含む。「霊長類」として、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓおよびＰａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ（ピグミーチンパンジー））、ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ）、テナガザル、サル、キツネザル、アイアイ（Ｄａｕｂｅｎｔｏｎｉａ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）、ならびにメガネザルが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥに対する霊長類抗体の親和性は、１ｎＭ未満のＫＤを特徴とする。
ある特定の実施形態では、本タンパク質は、マウスまたはウサギ由来の配列をまったく含まない（例えば、マウス抗体またはウサギ抗体ではない）。
ある特定の実施形態では、本タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥを発現する腫瘍細胞、例えば、結腸直腸細胞株ＳＷ１１１６（グレードＡ）、ＳＷ４８０（グレードＢ）、ＨＴ２９、ＳＷ４８０、Ｃａｃｏ２、ＨＣＴ１１６、ＳＷ６２０（すべてグレードＣ）、およびＣＯＬＯ２０５（グレードＤ）；乳癌細胞株ＭＣＦ−７および４Ｔ１；子宮癌細胞株ＳＫＵＴ−１（中胚葉性腫瘍）、横紋筋肉腫（ｒｈａｄｂｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）細胞株、ならびに肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７、およびＨｅｐ３Ｂに結合することができる。
一実施形態では、タンパク質は、ナノ粒子に物理的に会合し、細胞表面上でＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥを発現する細胞へとナノ粒子を誘導するのに使用することができる。
本明細書に記載される結合タンパク質は、例えば、医薬として許容可能な担体を含む医薬組成物として提供することができる。組成物は、少なくとも１０、２０、３０、５０、７５、８５、９０、９５、９８、９９、または９９．９％他のタンパク質種を含まないものとすることができる。
別の態様では、本開示は、試料中でＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥを検出する方法を特徴とする。この方法は、試料をＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質と接触させるステップと、存在する場合、タンパク質とＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥとの相互作用を検出するステップとを含む。いくつかの実施形態では、本タンパク質は検出可能な標識を含む。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を、対象中のＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥを検出するのに使用することができる。この方法は、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を対象に投与するステップと、対象中のタンパク質を検出するステップとを含む。いくつかの実施形態では、本タンパク質は検出可能な標識をさらに含む。例えば、検出するステップは、対象を画像化するステップを含む。
別の態様では、本開示は、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥの活性を調節する方法を特徴とする。この方法は、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥをＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質と接触させ（例えば、ヒト対象において）、それによってＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥの活性を調節するステップを含む。
別の態様では、本開示は、癌（例えば、転移性癌）を治療する方法を特徴とする。この方法は、対象における癌を治療するのに十分な量で、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を対象に投与するステップを含む。例えば、癌は、頭頸部癌、口腔癌、喉頭癌、軟骨肉腫、乳癌、喉頭癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巣癌、精巣癌、黒色腫、または脳腫瘍（例えば、星細胞腫、グリア芽細胞腫、グリオーマ）である。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、対象における転移活性を調節するのに有用である。本タンパク質は、転移活性を調節するのに有効な量でＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を対象に投与することができる。例えば、本タンパク質は、腫瘍成長、腫瘍塞栓症、腫瘍移動度、腫瘍侵襲性、および癌細胞増殖のうちの１つまたは複数を阻害する。この方法は、抗癌療法である第２の療法、例えば、化学療法剤、例えば、ＶＥＧＦ経路を通じてシグナル伝達をアンタゴナイズする薬剤、例えば、ベバシズマブの投与を対象に提供するステップをさらに含むことができる。一実施形態では、第２の療法は、５−ＦＵ、ロイコボリン、および／またはイリノテカンを投与するステップを含む。一実施形態では、第２の療法は、Ｔｉｅ１阻害剤（例えば、抗Ｔｉｅ１抗体）を投与するステップを含む。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を投与するステップを含む他の例示的な治療法は、以下に記載される。本明細書に記載されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、１つまたは複数の他のＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥ阻害剤、例えば、小分子阻害剤、例えば、広い特異性の阻害剤と併用して投与することができる。別の実施形態では、１つまたは複数のＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥ阻害剤は、別のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を含む。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）経路阻害剤である追加の抗癌療法と併用して投与することができる。ＥＧＦ経路阻害剤は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、例えば、小分子阻害剤（エルロチニブ（例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））もしくはゲフィチニブ（例えば、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））など）など、またはＥＧＦＲに結合する抗体、例えば、セツキシマブ（例えば、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））などとすることができる。この経路の追加の阻害剤には、ＰＤｌ５３０３５、ＳＵ５２７１、およびＺＤｌ８３９が含まれる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、対象（例えば、腫瘍を有するか、有している疑いのある対象）に薬剤を標的化送達する、例えば、薬剤を対象における腫瘍に向けるのに有用である。例えば、抗腫瘍薬剤（化学療法剤、毒素、薬物、または放射性核種（例えば、１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ）など）に結合したＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を、腫瘍を有するか、有している疑いのある対象に投与することができる。
別の態様では、本開示は、対象を画像化する方法を特徴とする。この方法は、対象にＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥ活性を実質的に阻害しないものである。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、検出可能な標識（例えば、放射性核種またはＭＲＩ検出可能な標識）を含むことができる。一実施形態では、対象は、腫瘍を有するか、有している疑いがある。この方法は、癌診断、術中の腫瘍検出、術後の腫瘍検出、または腫瘍の侵襲性活性のモニタリングに有用である。
一態様では、本開示は、本明細書に記載される障害、例えば、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）の治療用薬物を製造するための、本明細書に記載されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の使用を特徴とする。
抗癌薬開発の良好な候補である１つの経路は、成長ホルモン／インスリン様成長因子（ＧＨ／ＩＧＦ）軸である。げっ歯類および霊長類モデル系のインビトロおよびインビボ研究は、ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉは、乳房上皮細胞増殖および分化を誘導する一方で、アポトーシスを遮断することができることを例証している。ＧＨについての受容体は、マウス、ラット、サル、およびヒト乳房間質において同定された。大多数の受容体は、間質細胞上に見出されるが、乳房上皮細胞もＧＨ受容体（ＧＨＲ）を発現する。ＩＧＦ、その受容体および結合タンパク質は、これまで検査されたすべての哺乳動物種において、正常な乳腺発生のすべての段階の間に見出されている。Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇらは、乳房間質細胞上のその受容体を通じて作用するＧＨは、パラクリン様式で作用することによって、実質の増殖および分化を刺激することができるＩＧＦ−Ｉを誘導することを示した。
さらに、ＧＨ／ＩＧＦ軸は、進行性ヒト乳癌の成長にとって重要である。いくつかの独立した研究室により、ヒト乳癌細胞中にＧＨＲが観察された。Ｐｏｌｌａｋらは、ＭＣＦ−７細胞由来の乳癌は、対照マウスと比べて、ｌｉｔにとってホモ接合であるマウスにおいてよりゆっくりと成長することを報告した。ｌｉｔマウスは、ミスセンス突然変異を内部に持ち、下垂体ＧＨ放出ホルモン受容体の機能喪失、ならびにＧＨおよびＩＧＦ−Ｉの２次抑制（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）をもたらしている。Ｓｃｈａｌｌｙらは、ヌードマウスにおいて、ヒト乳房異種移植片の成長に対するＧＨ放出ホルモン（ＧＨＲＨ）アンタゴニストの阻害効果を実証する研究を最近公開した。ＧＨＲＨアンタゴニストは、処置された動物の血清および腫瘍の両方においてＩＧＦ−Ｉレベルを減少させた。Ｐｏｌｌａｋらは、ウシＧＨアンタゴニストを発現するマウスは、対照マウスと比較して、ジメチルベンゾアントラセンに曝されたとき、より小さい乳腺腫瘍を発生することを示した。Ｆｒｉｅｎｄらは、ＧＨアンタゴニストのペグビソマント（ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標））は、免疫不全マウスにおいて異種移植片として成長させたヒト乳癌細胞の成長を阻害することを示した。
したがって、一態様では、本発明は、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを投与することによって、癌の少なくとも１つの症状を治療する（例えば、回復させる）方法を提供する。
一実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを投与する前の期間に投与される。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質投与の期間は、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを初回投与する前の１日未満（例えば、１時間未満、または約１、２、３、４、６、８、１２、１８、もしくは２４時間）、あるいは１日から最大３５日（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１４、２０、２１、２８、３０、もしくは３５日、またはその間の任意の日もしくは範囲）の範囲とすることができる。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質投与の期間の後は、中断期間とすることができ、この期間には、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質も、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン阻害剤も投与されない。中断期間は、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを初回投与する前の１日未満（例えば、１時間未満、または約１、２、３、４、６、８、１２、１８、もしくは２４時間）、あるいは１日から最大３５日（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１４、２０、２１、２８、３０、もしくは３５日、またはその間の任意の日もしくは範囲）の範囲とすることができる。
別の実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの最初の投与の後に投与される。成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの最初の投与と、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の投与との間の期間は、１日未満（例えば、１時間未満、または約１、２、３、４、６、８、１２、１８、もしくは２４時間）、あるいは１日から最大３５日（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１４、２０、２１、２８、３０、もしくは３５日、またはその間の任意の日もしくは範囲）の範囲とすることができる。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の投与は、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの最初の投与の後継続され、一方、他の実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の投与は、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーター投与を開始した後中断される。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の投与が、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーター投与を開始した後中断されるいくつかの実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の投与は再開されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される併用療法は、一連（２回以上）のサイクルで投与することができる。例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質が、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの投与を開始する前のある期間に投与され、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質が、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーター投与を開始した際、または開始後に中断される構成では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを投与した後、または投与完了後に再開することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される併用療法は、薬剤を交互にするスケジュールを使用する。例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質がある期間投与され、その後成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの投与が続き、その後ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質のさらなる投与が続き、その後成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの別の投与が続くなどである。逆のスケジュールも使用することができる（成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーター、次いでＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、次いで成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーター、次いでＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質など）。いくつかの実施形態では、一方の薬剤の投与は、他方の薬剤を投与する前に中断される。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、対象における癌の少なくとも１つの症状を個々に回復させ、またはさもなければ、対象における障害を治療もしくは予防するのに有効な量でそれぞれ投与される。他の実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、対象における癌の少なくとも１つの症状を回復させ、またはさもなければ、対象における障害を治療もしくは予防するのに個々に有効な量未満の量でそれぞれ投与される。いくつかの実施形態では、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、対象における癌の少なくとも１つの症状を回復させ、またはさもなければ、対象における障害を治療もしくは予防するのに個々に有効な量未満の量で投与される。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、対象における癌の少なくとも１つの症状を回復させ、またはさもなければ、対象における障害を治療もしくは予防するのに個々に有効な量未満の量で投与される。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、相乗的有効量（例えば、単独で投与された、いずれかの化合物と比較した場合、相乗効果をもたらす量）で投与される。
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の説明で示す。本発明の他の特徴、目的、および利点は、この説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
図１Ａおよび１Ｂは、ＩＧＦ−ＩＩのＭ００６４−Ｆ０２ Ｆａｂとの複合体（以下の実施例８に記載されているような）の結晶解析によって求められたポリペプチドの折り畳みを示す図である。らせん体は、カール状のリボンによって、βシートは幅広の矢印によって示されている。 図２Ａおよび２Ｂは、結合タンパク質ＢＰ２およびＢＰ４と相互作用している抗体の１つのＳＰＲ親和性測定から得た一般的なプロファイルを示す図である。（Ａ）Ｍ００６３−Ｆ０２についてのデータ、（Ｂ）Ｍ００６４−Ｅ０４候補抗体についてのデータ。 図３は、Ｈｅｐ３Ｂコロニー形成に対するＤＸ−２６４７の効果を例示するグラフである。 図４は、プロ−ＩＧＦ ＩＩ前駆体を表す概略図である。 図５Ａは、ＤＸ−２６４７が、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥへの結合に関して、受容体／ＩＧＦＢＰと競合することを実証する図である。図５Ｂは結果を要約した図である。 図６Ａは、ＨｅｐＧ２コロニー形成に対するＤＸ−２６４７の効果を示すグラフである。図６Ｂは、３つの独立したコロニー形成実験についての表形式のデータを表す図である。 図７は、ＳＫＵＴ−１細胞の細胞生存能に対するＤＸ−２６４７の効果を示す棒グラフである。 図８は、１０％のＦＢＳを含有する完全培地中のＣｏｌｏ２０５細胞増殖に対するＤＸ−２６４７の効果を示す棒グラフである。 図９は、ＩＧＦ−ＩＩによって誘導されるＣｏｌｏ２０５細胞増殖に対するＤＸ−２６４７の効果を示す棒グラフである。 図１０は、ＨｅｐＧ２足場依存性コロニー形成に対するＤＸ−２６４７の効果を示す棒グラフである。 図１１は、異種移植片モデルにおけるＨｅｐ３Ｂ腫瘍増殖に対するＤＸ−２６４７の効果を表す線グラフである。
定義
便宜上、本発明をさらに説明する前に、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用されるある特定の用語をここで定義する。他の用語は、これらが本明細書に現れる際に定義する。
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、脈絡で明らかな別段の指示のない限り、複数の参照を含む。
用語「アゴニスト」は、本明細書で使用する場合、タンパク質の生物活性を模倣またはアップレギュレートする（例えば、増強する、もしくは補う）薬剤を指すことを意味する。アゴニストは、野生型タンパク質、または野生型タンパク質の少なくとも１つの生物活性を有するその誘導体とすることができる。アゴニストは、遺伝子の発現をアップレギュレートし、またはタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増大させる化合物であってもよい。アゴニストは、ポリペプチドと別の分子、例えば、標的ペプチドまたは核酸との相互作用を増大させる化合物であってもよい。
「アンタゴニスト」は、本明細書で使用する場合、タンパク質の少なくとも１つの生物活性をダウンレギュレートする（例えば、抑制または阻害する）薬剤を指すことを意味する。アンタゴニストは、タンパク質と別の分子、例えば、標的ペプチドもしくは酵素基質との相互作用を阻害し、または減少させる化合物とすることができる。アンタゴニストは、遺伝子の発現をダウンレギュレートし、または存在する発現されたタンパク質の量を低減する化合物であってもよい。
用語「抗体」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を指す。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略する）、および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略する）を含むことができる。別の例では、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域、および２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。用語「抗体」は、抗体の抗原結合性断片（例えば、単鎖抗体、Ｆａｂ断片およびｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（ｄｅ Ｗｉｌｄｔら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９６年；２６巻（３号）：６２９〜３９頁））、ならびに完全な抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにこれらのサブタイプ）の構造的特徴を有することができる。抗体は、任意の源に由来することができるが、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）、ならびに霊長類化が好適である。
ＶＨおよびＶＬ領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができ、これは、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれる、さらに保存された領域とともに散在している。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は定義されている（Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら（１９９１年） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ， Ｃ．ら（１９８７年） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６巻：９０１〜９１７頁を参照）。Ｋａｂａｔ定義が本明細書で使用される。各ＶＨおよびＶＬは一般に、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、以下の順序、すなわち、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配列されている。
本明細書で使用する場合、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、１つまたは複数のＣＤＲ領域が、抗原結合部位に適した構造内に位置されるように、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成することができるアミノ酸配列を指す。例えば、この配列は、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列のすべて、または一部を含むことができる。例えば、この配列は、１つ、２つ、もしくはそれ以上のＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸、内部アミノ酸を省くことができ、１つまたは複数の挿入もしくは追加の末端アミノ酸を含むことができ、または他の変更を含むことができる。一実施形態では、免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むポリペプチドは、別の免疫グロブリン可変ドメイン配列と結合することによって、抗原結合部位、例えば、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥと選択的に相互作用する構造を形成することができる。
抗体のＶＨ鎖またはＶＬ鎖は、重鎖または軽鎖定常領域のすべて、または一部をさらに含むことによって、それぞれ免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖を形成することができる。一実施形態では、抗体は、２本の免疫グロブリン重鎖および２本の免疫グロブリン軽鎖の四量体であり、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって相互結合されている。ＩｇＧにおいて、重鎖定常領域は、３つの免疫グロブリンドメイン、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域はＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は一般に、免疫系の様々な細胞（例えば、効果細胞）、および古典的な補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含めた宿主組織または因子への抗体の結合を媒介する。免疫グロブリンの軽鎖は、κ型またはλ型とすることができる。一実施形態では、抗体はグリコシル化されている。抗体は、抗体依存性細胞毒性および／または補体媒介性細胞毒性に対して機能性である場合がある。
抗体の１つまたは複数の領域は、ヒトまたは実質上ヒトとすることができる。例えば、可変領域のうちの１つまたは複数は、ヒトまたは実質上ヒトとすることができる。例えば、ＣＤＲのうちの１つまたは複数は、ヒト、例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３とすることができる。軽鎖ＣＤＲのそれぞれはヒトとすることができる。ＨＣ ＣＤＲ３はヒトであってもよい。フレームワーク領域の１つまたは複数は、ヒト、例えば、ＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４とすることができる。例えば、Ｆｃ領域はヒトであってもよい。一実施形態では、すべてのフレームワーク領域がヒトであり、例えば、ヒト体細胞、例えば、免疫グロブリンを産生する造血細胞、または非造血細胞に由来する。一実施形態では、ヒト配列は、生殖系列配列であり、例えば、生殖系列核酸によってコードされている。一実施形態では、選択されたＦａｂのフレームワーク（ＦＲ）残基は、最も類似した霊長類生殖系列遺伝子、特に、ヒト生殖系列遺伝子における、対応する残基のアミノ酸型に転換することができる。定常領域の１つまたは複数は、ヒトまたは実質上ヒトとすることができる。例えば、免疫グロブリン可変ドメイン、定常領域、定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬ１）、または抗体全体の少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９８、または１００％は、ヒトまたは実質上ヒトとすることができる。
抗体のすべて、または一部は、免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントによってコードされ得る。例示的なヒト免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに多くの免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長免疫グロブリンの「軽鎖」（約２５ｋＤａまたは約２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端（約１１０アミノ酸）で可変領域遺伝子によって、ＣＯＯＨ末端でκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされる。全長免疫グロブリンの「重鎖」（約５０ｋＤａまたは約４４６アミノ酸）は、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）、および他の上述の定常領域遺伝子のうちの１つ、例えば、γ（約３３０アミノ酸をコードする）によって同様にコードされる。ＨＣ ＣＤＲ３は、約３アミノ酸残基から３５アミノ酸残基を超えて変化するので、ヒトＨＣの長さは相当に変化する。
用語の全長抗体の「抗原結合性断片」は、対象とする標的に特異的に結合する能力を保持する、全長抗体の１つまたは複数の断片を指す。用語の全長抗体の「抗原結合性断片」の範囲内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の１本のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４１巻：５４４〜５４６頁）、ならびに（ｖｉ）機能性を保持する、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、すなわちＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらが１本のタンパク質鎖にされることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用してこれらを結合することができ、ＶＬ領域とＶＨ領域は、対になることによって、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知の一価の分子を形成する。例えば、米国特許第５，２６０，２０３号、同第４，９４６，７７８号、および同第４，８８１，１７５号；Ｂｉｒｄら（１９８８年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２巻：４２３〜４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５巻：５８７９〜５８８３頁を参照。
抗体断片は、当業者に公知の従来技法を含めて、任意の適切な技法を使用して得ることができる。用語「単一特異性抗体」は、特定の標的、例えば、エピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体を指す。この用語には、「モノクローナル抗体」、または「モノクローナル抗体組成物」が含まれ、本明細書で使用する場合、抗体がどのように生成されたかに関係なく、１個の分子組成物の抗体またはその断片の調製物を指す。
本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、見かけ上の結合定数、すなわちＫＡを指す。ＫＡは、解離定数（ＫＤ）の逆数である。結合タンパク質は、例えば、特定の標的分子、例えば、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥについて、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、および１０１１Ｍ−１の結合親和性を有することができる。第２の標的と比べて、第１の標的への結合タンパク質の親和結合性が高いことは、第２の標的に結合するためのＫＡ（または数値のＫＤ）より高い、第１の標的に結合するためのＫＡ（または小さい数値のＫＤ）によって示すことができる。そのような場合では、結合タンパク質は、第２の標的（例えば、第２の構造もしくはその模倣体での同じタンパク質；または第２のタンパク質）と比べて、第１の標的（例えば、第１の構造またはその模倣体でのタンパク質）に対する特異性を有する。結合親和性（例えば、特異性または他の比較について）の差は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、１０，０００、または１０５倍となり得る。
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（例えば、蛍光アッセイを使用して）を含めて、様々な方法によって求めることができる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤Ｐ２０）中である。これらの技法を使用することによって、結合タンパク質（または標的）濃度の関数として、結合した結合タンパク質および遊離結合タンパク質の濃度を測定することができる。結合した結合タンパク質の濃度（［Ｂｏｕｎｄ］）は、以下の式によって、遊離結合タンパク質の濃度（［Ｆｒｅｅ］）、および標的上の結合タンパク質に対する結合部位の濃度に関係しており、この場合、（Ｎ）は１標的分子当たりの結合部位の数である：
［Ｂｏｕｎｄ］＝Ｎ・［Ｆｒｅｅ］／（（１／ＫＡ）＋［Ｆｒｅｅ］）。
しかし、ＫＡの正確な判定をすることが常に必要ではなく、それは、例えば、ＥＬＩＳＡもしくはＦＡＣＳ分析などの方法を使用して求められ、ＫＡに比例し、したがってより高い親和性が、例えば２倍高いかどうかを求めることなどの比較のために使用することができる、親和性の定量的な測定値を得ること、親和性の定性的な測定値を得ること、または例えば、機能的なアッセイ、例えば、インビトロもしくはインビボアッセイにおける活性によって、親和性の推定を得ることで時に十分であるためである。
用語「結合タンパク質」は、標的分子と相互作用することができるタンパク質を指す。この用語は、「リガンド」と互換的に使用される。「ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質」は、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの両方と相互作用することができるタンパク質を指し、特に、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの両方と選択的に相互作用し、かつ／またはこれらを阻害するタンパク質を含む。例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は抗体である。同様に、「ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質」は、ＩＧＦ−ＩＩＥのみと相互作用することができるタンパク質を指し、特に、ＩＧＦ−ＩＩＥのみと選択的に相互作用し、かつ／またはこれのみを阻害するタンパク質を含む。
用語「癌」は、異常な１つもしくは複数の細胞、または組織の塊を指すことを意味する。これらの細胞または組織の成長は、正常な組織または細胞の成長を超え、この成長と非協調的であり、変化を誘起した刺激が停止した後も同じ過剰な様式で持続する。これらの新生物組織または細胞は、正常な組織または細胞と比べて、構造的な組織化および協調の欠如を示し、良性または悪性となり得る組織または細胞の塊をもたらし得る。本明細書で使用する場合、癌は任意の新生物を含む。癌として、それだけに限らないが、黒色腫、腺癌、悪性グリオーマ、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、甲状腺癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、脳腫瘍、肝癌、乳癌、卵巣癌、骨肉腫などが挙げられる。
「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。多くのフレームワークおよびＣＤＲのアミノ酸残基が、１つまたは複数の同類置換を含むことが可能である。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、本明細書に記載される結合タンパク質と比べて、突然変異（例えば、少なくとも１個、２個、もしくは４個および／または１５、１０、５、もしくは３個未満）を有することができ（例えば、保存アミノ酸または非必須アミノ酸置換）、この突然変異は、タンパク質機能に対して実質的な効果を有さない。特定の置換が許容される、すなわち、結合活性などの生物学的性質に悪影響しないかどうかは、例えば、突然変異が保存的であるかどうかを評価することによって、またはＢｏｗｉｅら（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７巻：１３０６〜１３１０頁の方法によって予測することができる。
バイオポリマーについてのモチーフ配列は、変異アミノ酸（ｖａｒｉｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）とすることができる位置を含むことができる。例えば、そのような脈絡において記号「Ｘ」は一般に、任意のアミノ酸（例えば、２０個の天然アミノ酸のいずれか、または１９個の非システインアミノ酸のいずれか）を指す。他の許容アミノ酸（ａｌｌｏｗｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）も、例えば、括弧およびスラッシュを使用して示すことができる。例えば、「（Ａ／Ｗ／Ｆ／Ｎ／Ｑ）」は、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、アスパラギン、およびグルタミンが、特定の位置で許容されることを意味する。
「実質上ヒト」免疫グロブリン可変領域は、免疫グロブリン可変領域が正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む免疫グロブリン可変領域である。「実質上ヒト」抗体は、抗体が正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒトアミノ酸位置を含む抗体である。
「エピトープ」は、結合タンパク質（例えば、Ｆａｂまたは全長抗体などの抗体）によって結合されている標的化合物上の部位を指す。標的化合物がタンパク質である場合では、この部位は、アミノ酸成分から完全になっていてもよく、タンパク質のアミノ酸の化学修飾（例えば、グリコシル部分）から完全になっていてもよく、またはこれらの組合せからなっていてもよい。重複エピトープは、少なくとも１つの共通のアミノ酸残基、グリコシル基、リン酸基、スルフェート基、または他の分子特徴を含む。
用語「成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーター」は、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路の成分の活性を調節することができる任意の化合物または分子、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストを指す。
２つの配列間の「相同性」または「配列同一性」（これらの用語は、本明細書で互換的に使用される）の計算は、以下のように実施される。配列が最適な比較目的のために整列される（例えば、最適なアライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、非相同配列を比較目的のために無視することができる）。最適なアライメントは、ギャップペナルティーが１２であり、ギャップ伸長ペナルティーが４であり、フレームシフトギャップペナルティーが５である、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスを有するＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して、最良スコアとして決定される。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されているとき、これらの分子は、その位置で同一である（本明細書で使用する場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、これらの配列によって共有されている同一位置の数の関数である。
好適な実施形態では、比較目的で整列される参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または１００％である。例えば、参照配列は、免疫グロブリン可変ドメイン配列の長さとすることができる。
「ヒト化」免疫グロブリン可変領域は、免疫グロブリン可変領域が正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含むように改変された免疫グロブリン可変領域である。「ヒト化」免疫グロブリンの説明には、例えば、ＵＳ６，４０７，２１３およびＵＳ５，６９３，７６２が含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「低いストリンジェンシー、中間のストリンジェンシー、高いストリンジェンシー、または非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記述する。ハイブリダイゼーション反応を実施するためのガイダンスは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）、６．３．１〜６．３．６．において見出すことができる。水性および非水性の方法がその参考文献に記載されており、いずれも使用することができる。本明細書で参照される具体的なハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：（１）約４５℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中の低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、その後に少なくとも５０℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で２回の洗浄（低いストリンジェンシー条件については、洗浄温度を５５℃まで上げることができる）、（２）約４５℃で、６×ＳＳＣ中の中間のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、その後に６０℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で１回または複数回の洗浄、（３）約４５℃で６×ＳＳＣ中の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、その後に６５℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で１回または複数回の洗浄、および（４）非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、６５℃で、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、７％のＳＤＳであり、その後に６５℃で、０．２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳで１回または複数回の洗浄である。非常に高いストリンジェンシー条件（４）が好適な条件であり、別段の指定のない限り、使用されるべきものである。本開示は、本明細書に記載される核酸、またはその補体、例えば、本明細書に記載される結合タンパク質をコードする核酸と、低い、中間の、高い、または非常に高いストリンジェンシーでハイブリダイズする核酸を含む。核酸は、参照核酸と同じ長さ、または参照核酸の長さの３０、２０、もしくは１０％以内とすることができる。この核酸は、本明細書に記載される免疫グロブリン可変ドメイン配列をコードする領域に対応することができる。
「単離された組成物」は、単離される組成物を得ることができる天然試料の少なくとも１つの成分の少なくとも９０％から取り出される組成物を指す。人工的または天然に生成される組成物は、対象とする化学種または化学種の集団が、重量−重量に基づいて少なくとも５、１０、２５、５０、７５、８０、９０、９２、９５、９８、または９９％純粋である場合、「少なくともある程度の純度の組成物」となり得る。
用語「モジュレーター」は、調節を引き起こすことができる、ポリペプチド、核酸、巨大分子、複合体、分子、小分子、化合物、化学種など（天然に存在する、もしくは天然に存在しない）、または生体物質、例えば、細菌、植物、真菌、もしくは動物の細胞もしくは組織などから作られた抽出物を指す。モジュレーターは、アッセイに含めることによって、機能的特性、生物活性、もしくはプロセス、またはこれらの組合せの阻害剤またはアクチベーター（直接または間接的に）（例えば、アゴニスト、部分アンタゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、抗微生物剤、微生物感染または増殖の阻害剤など）としての潜在的な活性を評価することができる。そのようなアッセイでは、多くのモジュレーターを一度にスクリーニングすることができる。モジュレーターの活性は、公知であっても、未知であっても、部分的に公知であってもよい。
「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を無効にすることなく、またはより好ましくは実質的に変更することなく、結合剤、例えば、抗体の野生型配列から変更することができる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基の変化は、活性の実質的な喪失をもたらす。
主題の方法によって治療される「患者」、「対象」、または「宿主」は、ヒトまたは非ヒト動物を意味することができる。
本明細書で使用する場合、用語「実質的に同一」（または「実質的に相同」）は、第２のアミノ酸または核酸配列と同一または等価（例えば、類似の側鎖、例えば、保存アミノ酸置換）である、十分な数のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含有し、その結果、第１および第２のアミノ酸または核酸配列が、同様の活性、例えば、結合活性、結合選択性、または生物活性を有する（またはこれらを有するタンパク質をコードする）ような第１のアミノ酸または核酸配列を指すのに本明細書で使用される。抗体の場合では、第２の抗体は、同じ特異性を有し、同じ抗原に対して、少なくとも５０％、少なくとも２５％、または少なくとも１０％の親和性を有する。
本明細書に開示される配列と類似または相同（例えば、少なくとも約８５％の配列同一性）の配列も、本願の一部である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上とすることができる。さらに、核酸セグメントが、選択的なハイブリダイゼーション条件（例えば、非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で鎖の補体とハイブリダイズするとき、実質的な同一性が存在する。核酸は、全細胞、細胞可溶化物中に、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。
統計的有意性は、任意の当技術分野で公知の方法によって求めることができる。例示的な統計的検定には、スチューデントＴ検定、マンホイットニーＵノンパラメトリック検定、およびウィルコクスンのノンパラメトリック統計的検定が含まれる。いくつかの統計的に有意な関係は、０．０５または０．０２未満のＰ値を有する。特定の結合タンパク質は、例えば、統計的に有意（例えば、０．０５または０．０２未満のＰ値）である、特異性または結合性の差を示すことができる。用語「誘導する」、「阻害する」、「強化する」、「上昇させる」、「増大させる」、「減少させる」などは、例えば、２つの状態間の区別可能な定性的または定量的な差を表し、２つの状態間の差、例えば、統計的に有意な差を指すことができる。
用語「治療する」または「治療」は、薬剤を単独で、または１つもしくは複数の他の薬剤（例えば、第２の薬剤）と併用して、対象、例えば、患者、例えば、障害（例えば、本明細書に記載されるような障害）、障害の症状、または障害に対する傾向を有する患者に塗布または投与することによって、例えば、障害、障害の症状、または障害へ向かう傾向を治し、癒し、軽減し、緩和し、変更し、矯正し、回復させ、改善し、またはこれらに影響を及ぼすことを指す。細胞の治療は、細胞の活性、例えば、内皮細胞が管または血管を形成する能力の低減を指す。低減は、必ずしも活性の全消失を必要としないが、低減、例えば、細胞の活性または数の統計的に有意な低減を必要とする。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質
本開示は、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥ（例えば、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥ）の両方またはいずれかに結合し、少なくとも１つの免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）可変領域を含むタンパク質を提供する。例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。いくつかの例示的なＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥおよびＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、本明細書に記載されている。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、単離されたタンパク質（例えば、少なくとも７０、８０、９０、９５、または９９％他のタンパク質を含まない）とすることができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥ、例えば、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの両方をさらに阻害することができる。
一態様では、本開示は、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥ（例えば、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥ）に結合し、少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域を含むタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）を特徴とする。例えば、本タンパク質は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。一実施形態では、本タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥ、例えば、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥに結合し、これらを阻害する。
本タンパク質は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含むことができる：（ａ）ヒトＣＤＲまたはヒトフレームワーク領域；（ｂ）ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、本明細書に記載されるＬＣ可変ドメインのＣＤＲと、少なくとも８５、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である、１つまたは複数のＣＤＲを含む；（ｃ）ＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、本明細書に記載されるＨＣ可変ドメインのＣＤＲと、少なくとも８５、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である、１つまたは複数のＣＤＲを含む；（ｄ）ＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、本明細書に記載されるＬＣ可変ドメインと、少なくとも８５、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である；（ｅ）ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、本明細書に記載されるＨＣ可変ドメインと、少なくとも８５、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である；（ｆ）本タンパク質は、本明細書に記載されるタンパク質によって結合されたエピトープ、またはそのようなエピトープと重複するエピトープに結合する；および（ｇ）霊長類ＣＤＲまたは霊長類フレームワーク領域。
ある特定の実施形態では、本タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩの以下のエピトープ、またはその断片に結合する：
式中、Ｘは任意のアミノ酸である。
より詳細には、本タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩの以下の配列、またはその断片に結合する：
式中、太字になっていない残基は、保存的変異を用いて置換することができる。
本タンパク質は、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥ、例えば、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥに結合することができ、結合親和性は、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、および１０１１Ｍ−１である。一実施形態では、本タンパク質は、１×１０−３、５×１０−４ｓ−１、または１×１０−４ｓ−１より遅いＫｏｆｆを伴って、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥに結合する。一実施形態では、本タンパク質は、１×１０２、１×１０３、または５×１０３Ｍ−１ｓ−１より速いＫｏｎを伴って、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥに結合する。一実施形態では、本タンパク質は、例えば、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、および１０−１０Ｍ未満のＫｉを伴って、ヒトヒトＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの活性を阻害する。本タンパク質は、例えば、１００ｎＭ、１０ｎＭ、または１ｎＭ未満のＩＣ５０を有することができる。例えば、本タンパク質は、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）およびインスリン受容体（ＩＲ−Ａ）のアイソフォームの活性、ならびにＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥを調節することができる。本タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ−Ａ、ならびにＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの活性を阻害することができる。ヒトＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥに対する本タンパク質の親和性は、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または１ｎＭ未満のＫＤを特徴とする場合がある。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は抗体とすることができる。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合抗体は、単一のポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）中、または異なるポリペプチド（例えば、ＩｇＧもしくはＦａｂ）上に含まれるそのＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列を有することができる。
好適な実施形態では、本タンパク質は、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、およびＭ００７２−Ｇ０６を含むリストから選ばれる抗体の軽鎖および重鎖を有するヒト抗体である。好適な実施形態では、本タンパク質は、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、およびＭ００７２−Ｇ０６を含むリストから選ばれるその重鎖を有するヒト抗体である。好適な実施形態では、本タンパク質は、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、およびＭ００７２−Ｇ０６を含むリストから選ばれるその軽鎖を有するヒト抗体である。好適な実施形態では、本タンパク質は、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、およびＭ００７２−Ｇ０６を含む重鎖のリストの対応するＣＤＲから選ばれる、１つまたは複数の重鎖ＣＤＲを有するヒト抗体である。好適な実施形態では、本タンパク質は、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、およびＭ００７２−Ｇ０６を含む重鎖のリストの対応するＣＤＲから選ばれる、１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲを有するヒト抗体である。
一実施形態では、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、同じポリペプチド鎖の成分である。別の実施形態では、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、異なるポリペプチド鎖の成分である。例えば、本タンパク質は、ＩｇＧ．、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。本タンパク質は、可溶性Ｆａｂとすることができる。他の実施では、本タンパク質には、Ｆａｂ２’、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ｓｃＦｖ：：Ｆｃ融合物、Ｆａｂ：：ＨＳＡ融合物、ＨＳＡ：：Ｆａｂ融合物、Ｆａｂ：：ＨＳＡ：：Ｆａｂ融合物、または本明細書の結合タンパク質のうちの１つの抗原結合部位を含む他の分子が含まれる。これらのＦａｂｓのＶＨおよびＶＬ領域は、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ２’、ｓｃＦｖ、ペグ化Ｆａｂ、ペグ化ｓｃＦｖ、ペグ化Ｆａｂ２、ＶＨ：：ＣＨ１：：ＨＳＡ＋ＬＣ、ＨＳＡ：：ＶＨ：：ＣＨ１＋ＬＣ、ＬＣ：：ＨＳＡ＋ＶＨ：：ＣＨ１、ＨＳＡ：：ＬＣ＋ＶＨ：：ＣＨ１、または他の適切な構築物として提供することができる。
一実施形態では、本タンパク質は、ヒト抗体もしくはヒト化抗体であり、またはヒトにおいて非免疫原性である。例えば、本タンパク質は、１つまたは複数のヒト抗体フレームワーク領域、例えば、全ヒトフレームワーク領域を含む。一実施形態では、本タンパク質は、ヒトＦｃドメイン、またヒトＦｃドメインと、少なくとも９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるＦｃドメインを含む。
一実施形態では、本タンパク質は、霊長類抗体もしくは霊長類化抗体であり、またはヒトにおいて非免疫原性である。例えば、本タンパク質は、１つまたは複数の霊長類抗体フレームワーク領域、例えば、全霊長類フレームワーク領域を含む。一実施形態では、本タンパク質は、霊長類Ｆｃドメイン、または霊長類Ｆｃドメインと、少なくとも９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるＦｃドメインを含む。「霊長類」として、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓおよびＰａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ（ピグミーチンパンジー））、ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ）、テナガザル、サル、キツネザル、アイアイ（Ｄａｕｂｅｎｔｏｎｉａ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）、ならびにメガネザルが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥに対する霊長類抗体の親和性は、１ｎＭ未満のＫＤを特徴とする。
ある特定の実施形態では、本タンパク質は、マウスまたはウサギ由来の配列をまったく含まない（例えば、マウス抗体またはウサギ抗体ではない）。
ある特定の実施形態では、本タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥを発現する腫瘍細胞、例えば、結腸直腸細胞株ＳＷ１１１６（グレードＡ）、ＳＷ４８０（グレードＢ）、ＨＴ２９＊、ＨＴ２９、ＳＷ４８０、ＣａＣＯ２、ＨＣＴ１１６、ＳＷ６２０（すべてグレードＣ）、およびＣＯＬＯ２０５（グレードＤ）；乳癌細胞株ＭＣＦ−７＊および４Ｔ１；子宮癌細胞株ＳＫＵＴ−１（中胚葉性腫瘍）、横紋筋肉腫細胞株、ならびに肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７、およびＨｅｐ３Ｂに結合することができる。
ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥ
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を発生させることができる例示的なＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥ配列として、ヒトもしくはマウスＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥアミノ酸配列、これらの配列のうちの１つと、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列、またはこれらの断片、例えば、シグナル配列もしくはプロドメインを含まない断片を挙げることができる。ヒトおよびマウスＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥアミノ酸配列、ならびにこれらをコードするｍＲＮＡ配列を以下に例示する。
ＩＧＦ−ＩＩ
＞インスリン様成長因子ＩＩ［ヒト、小細胞肺癌細胞株Ｔ３Ｍ−１１、ｍＲＮＡ、１３２２ｎｔ］（アクセションＳ７７０３５のトランケート型）
＞インスリン様成長因子ＩＩ；ＩＧＦ−ＩＩ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］。（アクセションＡＡＢ３４１５５のトランケート型）
＞Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓインスリン様成長因子２、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：６０５９８ ＩＭＡＧＥ：３００１３２９５）、完全なコード領域。（アクセションＢＣ０５３４８９のトランケート型）
＞Ｉｇｆ２タンパク質［Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］。（アクセションＡＡＨ５３４８９のトランケート型）
ＩＧＦ−ＩＩＥ
＞インスリン様成長因子ＩＩ［ヒト、小細胞肺癌細胞株Ｔ３Ｍ−１１、ｍＲＮＡ、１３２２ｎｔ］（アクセションＳ７７０３５のトランケート型）
＞インスリン様成長因子ＩＩ；ＩＧＦ−ＩＩ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］。（アクセションＡＡＢ３４１５５）
＞Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓインスリン様成長因子２、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：６０５９８ ＩＭＡＧＥ：３００１３２９５）、完全なコード領域。（アクセションＢＣ０５３４８９のトランケート型）
＞Ｉｇｆ２タンパク質［Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］。（アクセションＡＡＨ５３４８９）
ディスプレイライブラリー
ディスプレイライブラリーは実体のコレクションである；各実体は、アクセス可能なポリペプチド成分、およびポリペプチド成分をコードまたは同定する回復可能な成分を含む。ポリペプチド成分は多様であり、その結果、様々なアミノ酸配列が表される。ポリペプチド成分は、任意の長さ、例えば、３アミノ酸から３００を超えるアミノ酸とすることができる。ディスプレイライブラリー実体は、２つ以上のポリペプチド成分、例えば、ｓＦａｂの２本のポリペプチド鎖を含むことができる。一例示的実施では、ディスプレイライブラリーを使用することによって、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの両方に結合するタンパク質を同定することができる。１つの選択では、ライブラリーの各メンバーのポリペプチド成分は、ＩＧＦ−ＩＩおよび／もしくはＩＧＦ−ＩＩＥ、またはその断片を用いてプローブされ、ポリペプチド成分がＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥに結合する場合、ディスプレイライブラリーメンバーは、一般に支持体上の保持によって同定される。
保持されたディスプレイライブラリーメンバーは、支持体から回収され、分析される。分析は、同様の条件または異なった条件下での増幅および後続の選択を含むことができる。例えば、正の選択および負の選択を交互に行うことができる。この分析は、詳細な特徴づけのために、ポリペプチド成分のアミノ酸配列の決定、およびポリペプチド成分の精製も含むことができる。
ディスプレイライブラリーのために、様々な形式を使用することができる。例として以下のものが挙げられる。
ファージディスプレイ：タンパク質成分は一般に、バクテリオファージコートタンパク質に共有結合される。この結合は、コートタンパク質に融合したタンパク質成分をコードする核酸の翻訳から生じる。この結合は、可動性ペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、または終止コドンの抑制の結果として組み込まれたアミノ酸を含むことができる。ファージディスプレイは、例えば、Ｕ．Ｓ．５，２２３，４０９； Ｓｍｉｔｈ（１９８５年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８巻：１３１５〜１３１７頁；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；ＷＯ９０／０２８０９；ｄｅ Ｈａａｒｄら（１９９９年） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７４巻：１８２１８〜３０頁； Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８年） Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４巻：１〜２０頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２０００年） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２巻：３７１〜８頁、およびＨｏｅｔら（２００５年） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３巻（３号）３４４〜８頁に記載されている。タンパク質成分をディスプレイするバクテリオファージは、標準的なファージ準備法、例えば、成長培地からのペグ沈を使用して、成長させ、収集することができる。個々のディスプレイファージを選択した後、選択されたタンパク質成分をコードする核酸を、増幅後に、選択されたファージに感染した細胞、またはファージ自体から単離することができる。個々のコロニーまたはプラークを選ぶことができ、核酸を単離および配列決定することができる。
他のディスプレイ形式。他のディスプレイ形式として、細胞に基づくディスプレイ（例えば、ＷＯ０３／０２９４５６を参照）、タンパク質−核酸融合物（例えば、ＵＳ６，２０７，４４６を参照）、リボソームディスプレイ（例えば、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓら（１９９４年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１巻：９０２２頁、およびＨａｎｅｓら（２０００年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８巻：１２８７〜９２頁；Ｈａｎｅｓら（２０００年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３２８巻：４０４〜３０頁；およびＳｃｈａｆｆｉｔｚｅｌら（１９９９年） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２３１巻（１〜２号）：１１９〜３５頁を参照）、ならびにＥ． ｃｏｌｉ周辺質ディスプレイ（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２００５年１１月２２日；ＰＭＩＤ：１６３３７９５８）が挙げられる。
足場。ディスプレイに有用な足場として、抗体（例えば、Ｆａｂ断片、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦＶ）、単一ドメイン抗体、ラクダ抗体、およびラクダ化抗体）；Ｔ細胞受容体；ＭＨＣタンパク質；細胞外ドメイン（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート、ＥＧＦリピート）；プロテアーゼ阻害剤（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、エコチン、ＢＰＴＩ、など）；ＴＰＲリピート；トリフォイル（ｔｒｉｆｏｉｌ）構造；亜鉛フィンガードメイン；ＤＮＡ結合タンパク質；特に、単量体ＤＮＡ結合タンパク質；ＲＮＡ結合タンパク質；酵素、例えば、プロテアーゼ（特に、不活化されたプロテアーゼ）、ＲＮａｓｅ；シャペロン、例えば、チオレドキシンおよび熱ショックタンパク質；細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＨ２およびＳＨ３ドメインなど）；線形および拘束ペプチド；ならびに線形ペプチド基質が挙げられる。ディスプレイライブラリーは、合成および／または天然の多様な種類を含むことができる。例えば、ＵＳ２００４−０００５７０９を参照。
ディスプレイ技術は、標的の特定のエピトープに結合する結合タンパク質（例えば、抗体）を得るためにも使用することができる。これは、例えば、特定のエピトープを欠いている、または例えば、アラニンを用いてエピトープ内で突然変異した、競合する非標的分子を使用することによって行うことができる。そのような非標的分子は、ディスプレイライブラリーを標的に結合させているときの競合分子として、または例えば、標的に対して特異的でない解離しているディスプレイライブラリーメンバーを洗浄液中で捕獲するためのプレ溶出剤（ｐｒｅ−ｅｌｕｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）として、以下に記載される負の選択手順において使用することができる。
反復選択。好適な一実施形態では、ディスプレイライブラリー技術は、反復性モードで使用される。第１のディスプレイライブラリーは、標的のための１つまたは複数の結合タンパク質を同定するのに使用される。次いでこれらの同定された結合タンパク質は、突然変異生成法を使用して変更されることによって、第２のディスプレイライブラリーを形成する。次いで、例えば、より高いストリンジェンシー、またはより競合的な結合条件、および洗浄条件を使用することによって、より高い親和結合タンパク質が、第２のライブラリーから選択される。
いくつかの実施では、突然変異生成は、結合界面における領域を標的にする。例えば、同定された結合タンパク質が抗体である場合、突然変異生成は、本明細書に記載されるような重鎖または軽鎖のＣＤＲ領域に向けることができる。さらに、突然変異生成は、ＣＤＲ付近またはＣＤＲに隣接するフレームワーク領域に向けることができる。抗体の場合では、突然変異生成は、正確な段階的改善をするために、１個または数個のＣＤＲに限定することもできる。例示的な突然変異生成技法には、変異性ＰＣＲ、再結合、ＤＮＡシャッフリング、部位特異的突然変異生成、およびカセット突然変異生成が含まれる。
反復選択の一例では、本明細書に記載される方法が使用されることによって、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの両方に結合し、少なくとも、標的に対して最小限の結合特異性、または最小限の活性、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭ未満の結合についての平衡解離定数を有するタンパク質が、ディスプレイライブラリーから最初に同定される。例えば、最初のタンパク質と比べて増強された特性（例えば、結合親和性、動態、または安定性）を有する第２のタンパク質を同定するのに、最初に同定されたタンパク質をコードする核酸配列が、変異を導入するための鋳型核酸として使用される。
解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）選択。遅い解離速度により、特に、ポリペプチドとその標的との相互作用に関して、高い親和性を予測することができるので、本明細書に記載される方法を使用することによって、標的に対する結合相互作用に関して所望の（例えば、低減された）速度論的解離速度を有する結合タンパク質を単離することができる。
遅く解離する結合タンパク質をディスプレイライブラリーから選択するために、ライブラリーは、固定化された標的に接触させられる。次いで固定化された標的は、第１の溶液を用いて洗浄され、この溶液は、非特異的に、または弱く結合した生体分子を除去する。次いで、結合した結合タンパク質は、飽和量の遊離標的、または標的特異的な高親和性競合モノクローナル抗体、すなわち、粒子に結合していない標的の複製物を含む第２の溶液を用いて溶出される。遊離標的は、標的から解離する生体分子に結合する。再結合は、はるかに低濃度の固定化された標的に対して、飽和量の遊離標的によって実質上防止される。
第２の溶液は、実質的に生理的である、またはストリンジェントである溶液条件を有することができる。一般に、第２の溶液の溶液条件は、第１の溶液の溶液条件と同一である。第２の溶液の画分は、早い画分と遅い画分を区別するために、時間的な順序で収集される。より遅い画分は、早い画分における生体分子より、遅い速度で標的から解離する生体分子を含む。
さらに、インキュベーションを延長した後でさえ、依然として標的に結合したままであるディスプレイライブラリーメンバーを回収することも可能である。これらは、カオトロピック条件を使用して解離させることも、標的に結合したまま増幅することもできる。例えば、標的に結合したファージは、細菌性細胞と接触させることができる。
特異性の選択またはスクリーニング。本明細書に記載されるディスプレイライブラリースクリーニング法は、非標的分子に結合するディスプレイライブラリーメンバーを取り除く、選択またはスクリーニングプロセスを含むことができる。非標的分子の例として、磁気ビーズ上のストレプトアビジン、遮断剤、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシ脱脂乳、ダイズタンパク質、任意の捕獲モノクローナル抗体もしくは標的固定化モノクローナル抗体、または標的を発現しない非トランスフェクション細胞などが挙げられる。
一実施では、標的と、関連する非標的分子および関連するが、異なる非標的分子とを区別するために、いわゆる「負の選択」ステップが使用される。ディスプレイライブラリーまたはそのプールは、非標的分子に接触させられる。非標的に結合しない試料のメンバーは、収集され、その後の選択において使用されて、標的分子に結合され、またはさらには引き続いて負の選択が行われる。負の選択ステップは、標的分子に結合するライブラリーメンバーを選択する前でも後でもよい。
別の実施では、スクリーニングステップが使用される。ディスプレイライブラリーメンバーが、標的分子に結合させるために単離された後、単離された各ライブラリーメンバーは、非標的分子（例えば、上記に列挙した非標的）に結合するその能力を試験される。例えば、ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーニングを、このデータを得るために使用することができる。ＥＬＩＳＡスクリーニングは、各ライブラリーメンバーの標的への結合、ならびに関係する標的、または標的のサブユニット（例えば、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥ）との異種間反応性についての定量的データを得るためにも使用することができ、ｐＨ６またはｐＨ７．５などの異なる条件下でも使用することができる。非標的および標的結合データが比較されることによって（例えば、コンピューターおよびソフトウェアを使用して）、標的に特異的に結合するライブラリーメンバーが同定される。
他の例示的な発現ライブラリー
タンパク質の他のタイプのコレクション（例えば、発現ライブラリー）を、特定の特性（例えば、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥに結合する能力）を有するタンパク質を同定するために使用することができ、例えば、抗体のタンパク質アレイ（例えば、Ｄｅ Ｗｉｌｄｔら（２０００年） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８巻：９８９〜９９４頁を参照）、λ ｇｔ１１ライブラリー、ツーハイブリッドライブラリーなどが含まれる。
例示的なライブラリー
非ヒト霊長類を免疫し、ファージ上でディスプレイすることができる霊長類抗体遺伝子を回収することが可能である（以下を参照）。そのようなライブラリーから、免疫化において使用される抗原に結合する抗体を選択することができる。例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ．（２００３年）２２巻（２号）：２５７〜６７頁、またはＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．（２００５年）５７巻（１０号）：７３０〜８頁を参照。したがって、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥに結合し、これらを阻害する霊長類抗体を選択またはスクリーニングするために、チンパンジーまたはマカクを免疫し、様々な手段を使用することによって、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥに結合し、これらを阻害する霊長類抗体を得ることができる。ヒト定常領域を有する霊長類化Ｆａｂのキメラも作ることができる。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００４年）６巻（６号）：６７５〜８３頁。「ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅサルおよびヒト成分から遺伝子操作された霊長類化抗体は、ヒト抗体と構造的に区別不能である。したがってこれらは、ヒトにおいて有害な反応を引き起こしにくい場合があり、これらを長期間、慢性の処置に潜在的に適したものにしている」Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ． （２００１年）２巻（５号）：６３５〜８頁を参照。
一例示的なタイプのライブラリーは、ポリペプチドの種々のプールを提示し、そのそれぞれは、免疫グロブリンドメイン、例えば、免疫グロブリン可変ドメインを含む。対象とするのは、ライブラリーのメンバーが、霊長類もしくは「霊長類化」（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、もしくは「ヒト化」など）免疫グロブリンドメイン（例えば、免疫グロブリン可変ドメイン）、またはヒト定常領域を有するキメラ霊長類化Ｆａｂを含むディスプレイライブラリーである。ヒトまたはヒト化免疫グロブリンドメインライブラリーは、例えば、ヒト抗原を認識するヒトまたは「ヒト化」抗体を同定するのに使用することができる。この抗体の定常領域およびフレームワーク領域がヒトであるため、これらの抗体は、ヒトに投与された場合、これらの抗体自体が抗原として認識され、標的にされることを回避することができる。定常領域は、ヒト免疫系のエフェクター機能を動員するように最適化することもできる。このインビトロディスプレイ選択プロセスは、正常なヒト免疫系が、自己抗原に対して抗体を産生することができないことを克服する。
一般的な抗体ディスプレイライブラリーは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むポリペプチドをディスプレイする。「免疫グロブリンドメイン」は、免疫グロブリン分子の可変または定常ドメインに由来するドメインを指す。免疫グロブリンドメインは一般に、約７本のβ鎖で形成された２つのβシート、および保存されたジスルフィド結合を含有する（例えば、Ａ． Ｆ． ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＡ． Ｎ． Ｂａｒｃｌａｙ、１９８８年、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６巻：３８１〜４０５頁を参照）。ディスプレイライブラリーは、Ｆａｂ断片（例えば、２本のポリペプチド鎖を使用して）、または単鎖Ｆｖ（例えば、１本のポリペプチド鎖を使用して）としての抗体をディスプレイすることができる。他の形式も使用することができる。
Ｆａｂおよび他の形式の場合のように、ディスプレイされた抗体は、軽鎖および／または重鎖の一部として、１つまたは複数の定常領域を含むことができる。一実施形態では、各鎖は、例えば、Ｆａｂの場合のように、１つの定常領域を含む。他の実施形態では、追加の定常領域がディスプレイされる。
抗体ライブラリーは、いくつかのプロセスによって構築することができる（例えば、ｄｅ Ｈａａｒｄら、１９９９年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４巻：１８２１８〜３０頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９８年、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４巻：１〜２０頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、２０００年、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ２１巻：３７１〜３７８頁、およびＨｏｅｔら（２００５年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３巻（３号）３４４〜８頁を参照。さらに、各プロセスの要素は、他のプロセスの要素と組み合わせることができる。プロセスは、変異が、１つの免疫グロブリンドメイン（例えば、ＶＨもしくはＶＬ）、または複数の免疫グロブリンドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬ）中に導入されるように使用することができる。変異は、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のうちの１つまたは複数の領域内に、重鎖および軽鎖可変ドメインのいずれか、および両方のそのような領域に関して、免疫グロブリン可変ドメイン中に導入することができる。変異（複数可）は、所与の可変ドメインの３つすべてのＣＤＲ、または例えば、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１およびＣＤＲ２中に導入することができる。任意の組合せが実現可能である。一プロセスでは、抗体ライブラリーは、ＣＤＲをコードする種々のオリゴヌクレオチドを、核酸の対応する領域中に挿入することによって構築される。オリゴヌクレオチドは、単量体ヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを使用して合成することができる。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、２０００年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９６巻：５７〜８６頁には、トリヌクレオチド合成、およびオリゴヌクレオチドを受け入れるための操作された制限部位を有する鋳型を使用して、ＣＤＲをコードするオリゴヌクレオチドを構築する方法が記載されている。
別のプロセスでは、動物、例えば、げっ歯類が、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥで免疫される。この動物は、場合により、応答をさらに刺激するために抗原で追加免疫される。次いで脾臓細胞が動物から単離され、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸が、増幅およびクローン化されてディスプレイライブラリーにおいて発現される。
さらに別のプロセスでは、抗体ライブラリーは、未処置の生殖系列免疫グロブリン遺伝子から増幅された核酸から構築される。この増幅核酸は、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸を含む。免疫グロブリンをコードする核酸の源を以下に説明する。増幅は例えば、保存された定常領域にアニールするプライマーを用いたＰＣＲ、または別の増幅法を含むことができる。
免疫グロブリンドメインをコードする核酸は、例えば、霊長類（例えば、ヒト）、マウス、ウサギ、ラクダ、またはげっ歯類の免疫細胞から得ることができる。一例では、細胞は、特定の特性に関して選択される。成熟の様々な段階におけるＢ細胞を選択することができる。別の例では、Ｂ細胞は未処置である。
一実施形態では、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）が、表面に結合されるＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＧ分子を発現するＢ細胞を分類するのに使用される。さらに、ＩｇＧの様々なアイソタイプを発現するＢ細胞を単離することができる。別の好適な実施形態では、Ｂ細胞またはＴ細胞は、インビトロで培養される。細胞は、例えば、支持細胞とともに培養することによって、あるいはマイトジェンまたは他の調節性試薬、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンドもしくはＣＤ２０に対する抗体、ホルボールミリステートアセテート、細菌性リポ多糖、コンカナバリンＡ、フィトヘマグルチニン、またはアメリカヤマゴボウマイトジェンなどを添加することによって、インビトロで刺激することができる。
別の実施形態では、細胞は、本明細書に記載される状態の疾患、例えば、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）、炎症疾患（例えば、滑膜炎、アテローム性動脈硬化症）、関節リウマチ、骨関節炎、眼球状態（例えば、黄斑変性症）、糖尿病、アルツハイマー病、脳虚血、子宮内膜症、フィブリン侵襲性活性、血管新生、または毛細管形成を有する対象から単離される。別の実施形態では、細胞は、ヒト免疫グロブリン座位を含むトランスジェニック非ヒト動物から単離される。
好適な一実施形態では、細胞は、体細胞超変異のプログラムを活性化している。細胞は、例えば、抗免疫グロブリン、抗ＣＤ４０、および抗ＣＤ３８抗体を用いた処置により刺激されることによって、免疫グロブリン遺伝子の体細胞突然変異生成を起こすことができる。（例えば、Ｂｅｒｇｔｈｏｒｓｄｏｔｔｉｒら、２００１年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６巻：２２２８頁を参照）。別の実施形態では、細胞は未処置である。
免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸は、以下の例示的な方法によって天然のレパートリーから単離することができる。最初に、ＲＮＡが免疫細胞から単離される。全長の（すなわち、キャッピングされた）ｍＲＮＡが分離される（例えば、仔ウシ腸ホスファターゼを用いてキャップのないＲＮＡを分解することによって）。次いで、タバコ酸ピロホスファターゼを用いてキャップが除かれ、逆転写が使用されてｃＤＮＡが生成される。
第１の（アンチセンス）鎖の逆転写は、任意の適当なプライマーを用いて任意の様式で行うことができる。例えば、ｄｅ Ｈａａｒｄら、１９９９年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４巻：１８２１８〜３０頁を参照。プライマー結合領域は、例えば、免疫グロブリンの様々なアイソタイプを逆転写するために、様々な免疫グロブリンの中で一定とすることができる。プライマー結合領域は、免疫グロブリンの特定のアイソタイプに対して特異的にもなり得る。一般に、プライマーは、少なくとも１つのＣＤＲをコードする配列の３’である領域に特異的である。別の実施形態では、ポリ−ｄＴプライマーを使用することができる（また、重鎖遺伝子に好適となり得る）。
合成配列は、逆転写された鎖の３’末端に結合することができる。合成配列は、逆転写後のＰＣＲ増幅の間に順方向プライマーが結合するためのプライマー結合部位として使用することができる。合成配列を使用することにより、利用可能な多様性を完全に取り込むために、様々な順方向プライマーのプールを使用する必要をなくすことができる。
次いで、可変ドメインをコードする遺伝子は、例えば、１回または複数回のラウンドを使用して増幅される。複数回のラウンドが使用される場合、忠実度を増大させるためにネステッドプライマーを使用することができる。次いで増幅核酸は、ディスプレイライブラリーベクターにクローン化される。
第２のスクリーニング法
標的に結合する候補ライブラリーメンバーを選択した後、各候補ライブラリーメンバーをさらに分析することによって、例えば、標的、例えば、ＩＧＦ−ＩＩおよび／もしくはＩＧＦ−ＩＩＥについて、または他のタンパク質、例えば、別のメタロプロテイナーゼへの結合についてのその結合特性をさらに特徴づけることができる。各候補ライブラリーメンバーを、１つまたは複数の第２のスクリーニングアッセイにかけることができる。アッセイは、結合特性、触媒特性、阻害性特性、生理的な特性（例えば、細胞毒性、腎クリアランス、免疫原性）、構造的な特性（例えば、安定性、構造、オリゴマー化状態）、または別の機能的な特性についてのものとすることができる。例えば、ｐＨ感受性、イオン感受性、または熱感受性を求めるために、同じアッセイを繰り返して、しかし条件を変更して使用することができる。
適切な場合、アッセイは、ディスプレイライブラリーメンバーを直接使用することができ、選択されたポリペプチドをコードする核酸から生成される組換えポリペプチド、または選択されたポリペプチドの配列に基づいて合成される合成ペプチドを使用することができる。選択されたＦａｂの場合では、Ｆａｂは、評価することができ、無傷のＩｇＧタンパク質として改変および生成することができる。結合特性についての例示的なアッセイには、以下のものが含まれる。
ＥＬＩＳＡ。結合タンパク質は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価することができる。例えば、各タンパク質は、底面が、標的、例えば、限定的な量の標的でコーティングされたマイクロタイタープレートに接触させられる。このプレートは、緩衝液で洗浄されることによって、非特異的に結合したポリペプチドが除かれる。次いで、プレート上の標的に結合した結合タンパク質の量が、結合タンパク質、例えば、結合タンパク質のタグ、または一定部分を認識することができる抗体を用いてプレートをプローブすることによって求められる。この抗体は、検出系（例えば、適切な基質が提供される場合、非色分析産物を産生するアルカリホスファターゼまたは西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素）と結合される。
ホモジニアス結合アッセイ。本明細書に記載される結合タンパク質の標的に結合する能力は、ホモジニアスアッセイを使用して分析することができ、すなわち、アッセイのすべての成分が添加された後、追加の流体操作を必要としない。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）をホモジニアスアッセイとして使用することができる（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，８６８，１０３号を参照）。第１の分子（例えば、画分中で同定された分子）上のフルオロフォア標識は、第２の分子が第１の分子に近接している場合、その放出される蛍光エネルギーが、第２の分子（例えば、標的）上の蛍光標識によって吸収され得るように選択される。第２の分子上の蛍光標識は、転移エネルギー（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｅｎｅｒｇｙ）まで吸収すると、蛍光を放つ。標識同士間のエネルギー移動の効率は、分子を離している距離に関係するので、分子同士間の空間的な関係を評価することができる。分子同士間で結合が起こる状況では、アッセイにおける「受容体」分子標識の蛍光発光は、最大であるはずである。ＦＲＥＴによってモニターするために構成される結合事象は、好都合なことには、標準的な蛍光定量的検出手段によって、例えば、蛍光光度計を使用して測定することができる。第１または第２の結合分子の量を滴定することによって、結合曲線を作成して平衡結合定数を推定することができる。
ホモジニアスアッセイの別の例は、ＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（商標）（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｅｒｉｄｅｎ ＣＴ）である。ＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（商標）は、２つの標識されたビーズを使用する。一方のビーズは、レーザーによって励起されると一重項酸素を生成する。他方のビーズは、一重項酸素が第１のビーズから拡散し、他方のビーズと衝突すると光信号を生成する。信号は、２つのビーズが近接している場合のみに生成される。一方のビーズは、ディスプレイライブラリーメンバーに結合することができ、他方は、標的に結合することができる。信号を測定することによって、結合の程度が求められる。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）。結合タンパク質と標的の相互作用は、ＳＰＲを使用して分析することができる。ＳＰＲまたは生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）により、相互作用物のいずれにも標識化することなく、リアルタイムで生体分子相互作用が検出される。ＢＩＡチップの結合表面での質量変化（結合事象を示す）は、表面付近での光の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）をもたらす。屈折度の変化は、検出可能なシグナルを生成し、これは、生体分子同士間のリアルタイム反応の徴候として測定される。ＳＰＲを使用する方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号；Ｒａｅｔｈｅｒ、１９８８年、Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；ＳｊｏｌａｎｄｅｒおよびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ、１９９１年、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６３巻：２３３８〜２３４５頁；Ｓｚａｂｏら、１９９５年、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５巻：６９９〜７０５頁、ならびにＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）によって提供されているオンラインリソースに記載されている。
ＳＰＲからの情報を使用することによって、結合タンパク質の標的への結合に関する平衡解離定数（ＫＤ）、ならびにＫｏｎおよびＫｏｆｆを含めた速度論的パラメータの正確で定量的な測定値をもたらすことができる。そのようなデータは、様々な生体分子を比較するのに使用することができる。例えば、発現ライブラリーから選択されたタンパク質を比較することによって、標的に対する高い親和性を有し、または遅いＫｏｆｆを有するタンパク質を同定することができる。この情報は、構造−活性関係（ＳＡＲ）を作るのにも使用することができる。例えば、成熟型の親タンパク質の速度論的および平衡結合パラメータを、親タンパク質のパラメータと比較することができる。特定の結合パラメータ、例えば、高い親和性および遅いＫｏｆｆと相関する、所与の位置での変異アミノ酸を同定することができる。この情報は、構造的なモデル化（例えば、相同性モデル化、エネルギー最小化、またはＸ線結晶学もしくはＮＭＲによる構造決定を使用して）と組み合わせることができる。結果として、タンパク質とその標的との物理相互作用の理解を公式化し、他の設計プロセスを誘導するのに使用することができる。
細胞アッセイ。結合タンパク質を、細胞表面上で一過性に、または安定に対象とする標的を発現およびディスプレイする細胞に結合する能力についてスクリーニングすることができる。例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を蛍光標識することができ、アンタゴニスト抗体の存在または非存在下でのＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥへの結合は、フローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳ装置を使用して、蛍光強度の変化によって検出することができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合抗体を得るための他の例示的方法
ディスプレイライブラリーを使用することに加えて、他の方法もＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合抗体を得るために使用することができる。例えば、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥタンパク質またはその領域を、非ヒト動物、例えば、げっ歯類における抗原として使用することができる。
一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ座位の大きい断片を用いて、マウス抗体産生に欠陥のあるマウス菌株を操作することが可能である。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ）を生成および選択することができる。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎら、１９９４年、Ｎａｔ． Ｇｅｎ． ７巻：１３〜２１頁；Ｕ．Ｓ．２００３−００７０１８５、１９９６年１０月３１日に公開されたＷＯ９６／３４０９６、および１９９６年４月２９日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号を参照。
別の実施形態では、モノクローナル抗体は、非ヒト動物から得られ、次いで改変、例えば、ヒト化または脱免疫化される（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）。Ｗｉｎｔｅｒは、ヒト化抗体を調製するのに使用することができるＣＤＲ移植方法を記載している（１９８７年３月２６日に出願された英国特許出願第ＧＢ２１８８６３８Ａ号；米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体のＣＤＲのすべてが、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部と置換される場合もあり、いくつかのＣＤＲのみが、非ヒトＣＤＲと置換される場合がある。ヒト化抗体が、所定の抗原に結合するのに必要とされる数のＣＤＲを置換することが必要であるだけである。
ヒト化抗体は、抗原結合に直接関与していないＦｖ可変領域の配列を、ヒトＦｖ可変領域の等価な配列と置換することによって生成することができる。ヒト化抗体を生成するための一般的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｌ．、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９巻：１２０２〜１２０７頁、Ｏｉら、１９８６年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４巻：２１４頁、ならびにＱｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、および同第５，６９３，７６２号によって提供されている。これらの方法は、重鎖または軽鎖のうちの少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変領域のすべて、または一部をコードする核酸配列を単離し、巧みに操作し、発現させることを含む。そのような核酸の多数の源が利用可能である。例えば、核酸は、上述したように、所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから得ることができる。次いで、ヒト化抗体またはその断片をコードする組換えＤＮＡは、適切な発現ベクター中にクローン化することができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の免疫原性の低減
免疫グロブリンＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質（例えば、ＩｇＧまたはＦａｂ ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質）は、免疫原性を低減するために改変することができる。免疫原性の低減は、治療剤として使用することが意図されているＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質において望ましく、それは、免疫原性の低減により、対象が治療剤分子に対して免疫応答を発生させる機会が低減されるためである。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の免疫原性を低減するのに有用な技法には、潜在的なヒトＴ細胞エピトープの欠失／改変、およびＣＤＲの外側の配列（例えば、フレームワークおよびＦｃ）の「生殖系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）」が含まれる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合抗体は、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に開示されている方法による、ヒトＴ細胞エピトープの特定の欠失、または「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」によって改変することができる。簡単に言えば、抗体の重鎖および軽鎖可変領域が、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析される；これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープを表す（ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７において定義されているように）。ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に記載されているように、潜在的なＴ細胞エピトープを検出するために、「ペプチドスレッディング（ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」と呼ばれるコンピューターモデル化手法を適用することができ、さらに、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースは、ＶＨおよびＶＬ配列中に存在するモチーフを検索することができる。これらのモチーフは、１８の主要なＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのいずれにも結合し、したがって潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは、可変領域中の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは、１個のアミノ酸置換によって排除することができる。可能な同類置換が行われる限り、もっぱらではないが、多くの場合、ヒト生殖系列抗体配列におけるこの位置で共通のアミノ酸を使用することができる。ヒト生殖系列配列は、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｉ．Ａ．ら、１９９２年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７巻：７７６〜７９８頁；Ｃｏｏｋ， Ｇ． Ｐ．ら、１９９５年、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １６巻（５号）：２３７〜２４２頁；Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｄ．ら、１９９２年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ２２７巻：７９９〜８１７頁に開示されている。Ｖ ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｉ．Ａ．ら ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国によって編纂された）。脱免疫化変化が同定された後、ＶＨおよびＶＬをコードする核酸は、突然変異生成または他の合成法（例えば、デノボ合成、カセット置換など）によって構築することができる。突然変異を誘発された可変配列は、場合により、ヒト定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１またはκ定常領域に融合することができる。
いくつかの場合では、潜在的なＴ細胞エピトープは、抗体機能に重要であると公知であるか、または予測される残基を含む。例えば、潜在的なＴ細胞エピトープは通常、ＣＤＲに偏っている。さらに、潜在的なＴ細胞エピトープは、抗体構造および結合に重要なフレームワーク残基において生じ得る。これらの潜在的なエピトープを排除するための変化は、いくつかの場合では、例えば、変化を含む鎖および含まない鎖を作製および試験することによる、さらなる精査を必要とする。可能な場合、ＣＤＲと重複する潜在的なＴ細胞エピトープは、ＣＤＲの外側での置換によって排除された。いくつかの場合では、ＣＤＲ内の変更はオプションであるだけであり、したがって、この置換を含む変異体および含まない変異体が試験されるべきである。他の場合では、潜在的なＴ細胞エピトープを除くのに必要とされる置換は、抗体結合に極めて重要となり得るフレームワーク内の残基位置においてである。これらの場合では、この置換を含む変異体および含まない変異体が試験されるべきである。したがって、いくつかの場合では、いくつかの異なる脱免疫化重鎖および軽鎖可変領域が設計され、最適な脱免疫化抗体を同定するために、様々な重鎖／軽鎖の組合せが試験された。その場合、最終的な脱免疫化抗体の選択は、脱免疫化の程度、すなわち、可変領域内に残っている潜在的なＴ細胞エピトープの数とともに、様々な変異体の結合親和性を考慮することによって行うことができる。脱免疫化は、任意の抗体、例えば、非ヒト配列を含む抗体、例えば、合成抗体、マウス抗体、他の非ヒトモノクローナル抗体、またはディスプレイライブラリーから単離された抗体を改変するのに使用することができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合抗体は、結合特性が実質的に保持される限り、フレームワーク領域内の１つまたは複数の非生殖系列アミノ酸を、抗体の対応する生殖系列アミノ酸に戻すことによって、「生殖系列化される」。同様の方法を、定常領域、例えば、定常免疫グロブリンドメインにおいても使用することができる。
ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの両方に結合する抗体、例えば、本明細書に記載される抗体は、抗体の可変領域を、１つまたは複数の生殖系列配列とより類似させるために改変することができる。例えば、抗体は、例えば、フレームワーク、ＣＤＲ、または定常領域内に、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸置換を含むことによって、抗体を参照生殖系列配列により類似させることができる。一例示的な生殖系列化方法は、単離された抗体の配列と類似（例えば、特定のデータベースにおいて最も類似）した、１つまたは複数の生殖系列配列を同定するステップを含むことができる。次いで、突然変異（アミノ酸レベルで）が、付加的に、または他の突然変異と組み合わせて、単離された抗体において行われる。例えば、一部またはすべての可能な生殖系列突然変異をコードする配列を含む核酸ライブラリーが作製される。次いで、突然変異された抗体は、評価されることによって、例えば、単離された抗体と比べて、１つまたは複数の追加の生殖系列残基を有し、依然として有用である（例えば、機能活性を有する）抗体が同定される。一実施形態では、可能な限り多くの生殖系列残基が、単離された抗体中に導入される。
一実施形態では、突然変異生成は、１つまたは複数の生殖系列残基を、フレームワークおよび／または定常領域中に置換または挿入するのに使用される。例えば、生殖系列フレームワークおよび／または定常領域残基は、改変されている非可変領域と類似（例えば、最も類似）した生殖系列配列に由来する場合がある。突然変異生成後、抗体の活性（例えば、結合または他の機能活性）を評価することによって、１つまたは複数の生殖系列残基が許容される（すなわち、活性を阻止しない）かどうかを求めることができる。同様の突然変異生成を、フレームワーク領域中で実施することができる。
生殖系列配列の選択は、様々な方法で実施することができる。例えば、生殖系列配列は、選択性または類似性についての所定の判定基準、例えばこれが、少なくともある特定の割合の同一性、例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％同一性を満たす場合、選択することができる。選択は、少なくとも２、３、５、または１０個の生殖系列配列を使用して実施することができる。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の場合では、類似の生殖系列配列の同定は、１つのそのような配列を選択するステップを含むことができる。ＣＤＲ３の場合では、類似の生殖系列配列の同定は、１つのそのような配列を選択するステップを含むことができる一方、アミノ末端部分およびカルボキシ末端部分に別々に寄与する２つの生殖系列配列を使用するステップを含むことができる。他の実施では、例えば、コンセンサス配列を形成するために、１つまたは２つを超える生殖系列配列が使用される。
一実施形態では、特定の参照可変ドメイン配列、例えば、本明細書に記載される配列に関して、関連する可変ドメイン配列は、参照ＣＤＲ配列中の残基と同一でない、ＣＤＲアミノ酸位置の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５または１００％、ヒト生殖系列配列（すなわち、ヒト生殖系列核酸によってコードされたアミノ酸配列）中の対応する位置の残基と同一である残基を有する。
一実施形態では、特定の参照可変ドメイン配列、例えば、本明細書に記載される配列に関して、関連する可変ドメイン配列は、ヒト生殖系列配列、例えば、参照可変ドメイン配列に関連する生殖系列配列に由来するＦＲ配列と同一であるＦＲ領域の少なくとも３０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％を有する。
したがって、対象とする所与の抗体と同様の活性を有する一方で、１つまたは複数の生殖系列配列、特に１つまたは複数のヒト生殖系列配列とより類似した抗体を単離することが可能である。例えば、抗体は、ＣＤＲの外側の領域（例えば、フレームワーク領域）中の生殖系列配列と、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％同一とすることができる。さらに、抗体は、ＣＤＲ領域中の少なくとも１、２、３、４、または５つの生殖系列残基、改変されている可変領域と類似（例えば、最も類似）の生殖系列配列に由来する生殖系列残基を含むことができる。主に関心のある生殖系列配列は、ヒト生殖系列配列である。抗体の活性（例えば、ＫＡによって測定される場合の結合活性）は、元の抗体の因子、または１００、１０、５、２、０．５、０．１、および０．００１とすることができる。
ヒト免疫グロブリン遺伝子の生殖系列配列は決定されており、ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒのワールドワイドウェブを介して入手可能なＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（ＩＭＧＴ）、およびＶ ＢＡＳＥディレクトリ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｉ．Ａ．ら ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国による編纂、ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋのワールドワイドウェブを介して入手可能）を含めたいくつかの源から入手可能である。
Ｖκについての例示的な生殖系列参照配列として、Ｏ１２／Ｏ２、Ｏ１８／Ｏ８、Ａ２０、Ａ３０、Ｌ１４、Ｌ１、Ｌ１５、Ｌ４／１８ａ、Ｌ５／Ｌ１９、Ｌ８、Ｌ２３、Ｌ９、Ｌ２４、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｏ１１／Ｏ１、Ａ１７、Ａ１、Ａ１８、Ａ２、Ａ１９／Ａ３、Ａ２３、Ａ２７、Ａ１１、Ｌ２／Ｌ１６、Ｌ６、Ｌ２０、Ｌ２５、Ｂ３、Ｂ２、Ａ２６／Ａ１０、およびＡ１４が挙げられる。例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９５年、ＥＭＢＯ Ｊ． １４巻（１８号）：４６２８〜３頁を参照。
ＨＣ可変ドメインについての生殖系列参照配列は、特定の正準構造、例えば、Ｈ１およびＨ２超可変性ループ中の１−３構造を有する配列に基づくことができる。免疫グロブリン可変ドメインの超可変性ループ正準構造は、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９９２年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７巻：７９９〜８１７頁；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７巻：７７６〜７９８頁；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９５年、 ＥＭＢＯ Ｊ． １４巻（１８号）：４６２８〜３８頁に記載されているように、その配列から推測することができる。１−３構造を有する例示的な配列として、ＤＰ−１、ＤＰ−８、ＤＰ−１２、ＤＰ−２、ＤＰ−２５、ＤＰ−１５、ＤＰ−７、ＤＰ−４、ＤＰ−３１、ＤＰ−３２、ＤＰ−３３、ＤＰ−３５、ＤＰ−４０、７−２、ｈｖ３００５、ｈｖ３００５ｆ３、ＤＰ−４６、ＤＰ−４７、ＤＰ−５８、ＤＰ−４９、ＤＰ−５０、ＤＰ−５１、ＤＰ−５３、およびＤＰ−５４が挙げられる。
タンパク質産生
ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの両方（またはタンパク質形態である成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーター）に結合するタンパク質を発現させるのに、標準的な組換え核酸法を使用することができる。一般に、タンパク質をコードする核酸配列は、核酸発現ベクター中にクローン化される。もちろん、タンパク質が複数のポリペプチド鎖を含む場合、各鎖は、発現ベクター、例えば、同じまたは異なるベクター中にクローン化することができ、これらのベクターは、同じまたは異なる細胞中で発現される。
抗体産生。いくつかの抗体、例えばＦａｂは、細菌性細胞、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞中で産生させることができる。例えば、Ｆａｂが、ディスプレイ実体とバクテリオファージタンパク質（またはその断片）の間に抑制できる終止コドンを含むファージディスプレイベクター中の配列によってコードされる場合、ベクター核酸を、終止コドンを抑制することができない細菌生細胞中に移すことができる。この場合、Ｆａｂは、遺伝子ＩＩＩタンパク質と融合せず、周辺質および／または培地中に分泌される。
抗体は、真核細胞中に産生させることもできる。一実施形態では、抗体（例えば、ｓｃＦｖの）は、酵母細胞、例えば、Ｐｉｃｈｉａ（例えば、Ｐｏｗｅｒｓら、２００１年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２５１巻：１２３〜３５頁を参照）、Ｈａｎｓｅｕｌａ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどにおいて発現される。
好適な一実施形態では、抗体は、哺乳動物細胞中で産生される。クローン抗体またはその抗原結合性断片を発現させるための好適な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、１９８０年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７巻：４２１６〜４２２０頁に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含み、例えば、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、１９８２年、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９巻：６０１〜６２１頁に記載されているようなＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される）、リンパ球性細胞株、例えば、ＮＳ０骨髄腫細胞、およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００４年）２８９巻（１〜２号）：６５〜８０頁．）、ならびにトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニック哺乳動物に由来する細胞が含まれる。例えば、細胞は乳房上皮細胞である。
多様な免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞中のベクターの複製（例えば、複製起点）、および選択可能マーカー遺伝子を調節する配列などの追加の配列を担持することができる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、および同第５，１７９，０１７号を参照）。例えば、一般に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に対して、薬物、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートなどに対する耐性を付与する。好適な選択可能マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅とともに、ｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するため）、およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８を選択するため）が含まれる。
抗体またはその抗原結合部分を組換え発現させる例示的システムでは、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターは、リン酸カルシウムに媒介されるトランスフェクションによってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクター内で、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子は、エンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来、例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメント、またはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントなど）にそれぞれ作動可能に連結されることによって、遺伝子の高レベルの転写を推進する。組換え発現ベクターはＤＨＦＲ遺伝子も担持し、これは、メトトレキセート選択／増幅を使用してベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にする。選択された形質転換体宿主細胞は、培養されることによって、抗体の重鎖および軽鎖の発現を可能にし、無傷の抗体が培地から回収される。標準的な分子生物学技法が使用されることによって、組換え発現ベクターが調製され、宿主細胞がトランスフェクトされ、形質転換体が選択され、宿主細胞が培養され、培地から抗体が回収される。例えば、いくつかの抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧが結合したマトリックスを用いて、親和性クロマトグラフィーによって単離することができる。
Ｆｃドメインを含む抗体について、抗体産生システムは、Ｆｃ領域がグリコシル化された抗体を産生することができる。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメイン中のアスパラギン２９７でグリコシル化されている。このアスパラギンは、二分岐型オリゴ糖を用いて修飾するための部位である。このグリコシル化は、Ｆｃｇ受容体および補体Ｃ１ｑによって媒介されるエフェクター機能に必要とされることが実証された（ＢｕｒｔｏｎおよびＷｏｏｆ、１９９２年、Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５１巻：１〜８４頁；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、１９９８年、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １６３巻：５９〜７６頁）。一実施形態では、Ｆｃドメインは、アスパラギン２９７に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳動物発現系において産生される。Ｆｃドメインは、他の真核生物の翻訳後修飾も含むことができる。
抗体は、トランスジェニック動物によっても産生させることができる。例えば、米国特許第５，８４９，９９２号には、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において抗体を発現させる方法が記載されている。乳特異的なプロモーター、および対象とする抗体をコードする核酸、および分泌のためのシグナル配列を含む導入遺伝子が構築される。そのようなトランスジェニック哺乳動物のメスによって産生される乳は、その中に分泌される、対象とする抗体を含む。この抗体は、乳から精製することができ、いくつかの用途については、直接使用することができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の特徴づけ
その結合タンパク質についてのＥＣ５０（有効濃度５０％）値。一連または群の結合タンパク質中で、より低いＩＣ５０またはＥＣ５０値を有するものは、より高いＩＣ５０またはＥＣ５０値を有する結合タンパク質より、強力なＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥの阻害剤であると考えられている。例示的な結合タンパク質は、例えば、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥが２ｐＭであるとき、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥ活性の阻害についてのインビトロアッセイにおいて測定される場合、８００ｎＭ、４００ｎＭ、１００ｎＭ、２５ｎＭ、５ｎＭ、または１ｎＭ未満のＩＣ５０値を有する。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、その基質に対するＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥの活性を参照して特徴づけることもできる。
結合タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥに対する選択性についても評価することができる。例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥ、ならびにＩＧＦ−ＩＩのパネル（ｐａｎｅｌ）に対するその効力についてアッセイすることができ、ＩＣ５０値またはＥＣ５０値を、各ＩＧＦについて求めることができる。一実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥについて低いＩＣ５０値またはＥＣ５０値、および試験パネル内の別のＩＧＦについて、例えば、少なくとも２、５、または１０倍高い、より高いＩＣ５０値またはＥＣ５０値を示す化合物は、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥに対して選択的であると考えられる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、細胞に基づくアッセイにおいて、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥを阻害するその能力について評価することができる。３次元のコラーゲン基質内部の腫瘍細胞の増殖は、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥ過剰発現に対する応答において著しく増強され得る（Ｈｏｔａｒｙら、２００３年 Ｃｅｌｌ １１４巻：３３〜４５頁）。このアッセイへのＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の添加を使用することによって、タンパク質の阻害特性および他の特徴を求めることができる。
血清中のＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥの半減期を求めるために、ラット、マウス、またはサルにおける薬物動態試験を、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を用いて実施することができる。同様に、結合タンパク質の効果は、インビボで、例えば、本明細書に記載される疾患または状態、例えば、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）、炎症疾患（例えば、滑膜炎、アテローム性動脈硬化症）、関節リウマチ、骨関節炎、眼球状態（例えば、黄斑変性症）、糖尿病、アルツハイマー病、脳虚血、子宮内膜症、フィブリン侵襲性活性、血管新生、または毛細管形成を治療するのに治療剤として使用するための、例えば、疾患の動物モデルにおいて評価することができる。
医薬組成物
別の態様では、本開示は、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、例えば、本明細書に記載されるような、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥに結合するとして同定された抗体分子、他のポリペプチドもしくはペプチド、または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを含む組成物、例えば、医薬として許容可能な組成物または医薬組成物を提供する。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、医薬として許容可能な担体と一緒に製剤化することができる。医薬組成物には、治療組成物および診断組成物、例えば、インビボで画像化するための標識されたＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を含む組成物が含まれる。
医薬として許容可能な担体には、生理的に適合性である、任意かつすべての溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊椎、または表皮投与（例えば、注射もしくは注入による）に適していることが好ましいが、吸入および鼻腔内投与に適した担体も企図されている。投与経路に応じて、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、酸の作用、および化合物を不活性化し得る他の自然条件から化合物を保護するための物質でコーティングすることができる。
医薬として許容可能な塩は、親化合物の所望の生物活性を保持し、いずれの望まれない毒性効果も付与しない塩である（例えば、Ｂｅｒｇｅ， Ｓ．Ｍら、１９７７年、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ６６巻：１〜１９頁を参照）。そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、無毒性の無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など、ならびに無毒性の有機酸、例えば、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などから得られるものが含まれる。塩基付加塩には、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、ならびに無毒性の有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから得られるものが含まれる。
組成物は様々な形態とすることができる。これらには、例えば、液体、半固体、および固体剤形、例えば、溶液（例えば、注射用および注入用溶液）、分散物または懸濁液、錠剤、ピル、粉末、リポソーム、および坐剤などが含まれる。形態は、意図される投与方法および治療用途に依存する。多くの組成物は、抗体をヒトに投与するのに使用されるものと同様の組成物などの、注射用または注入用溶液の形態である。例示的な投与方法は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。一実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、静脈内注入または注射によって投与される。別の好適な実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、筋肉内または皮下注射によって投与される。
語句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、本明細書で使用する場合、経腸および局所投与以外の、通常注射による投与方法を意味し、限定することなく、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内注射および注入を含む。
組成物は、高薬物濃度に適した、溶液、マイクロエマルジョン、分散物、リポソーム、または他の秩序構造として製剤化することができる。滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つまたは組合せを含む適切な溶媒中に、必要量の結合タンパク質を組み込んだ後、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散物は、基本的な分散媒、および上記に列挙した成分からの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好適な調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分と、予め滅菌濾過したその溶液からの任意の所望の追加成分の粉末が得られる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散物の場合、要求される粒径を維持することによって、界面活性剤を使用することによって維持することができる。注射用組成物の吸収の延長は、組成物中に、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンなどを含めることによってもたらすことができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、様々な方法によって投与することができるが、多くの用途について、好適な投与の経路／方法は、静脈内注射または注入である。例えば、治療用途については、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、約１〜１００ｍｇ／ｍ２または７〜２５ｍｇ／ｍ２の用量に到達するために、３０、２０、１０、５、または１ｍｇ／分未満の速度で静脈内注入によって投与することができる。投与の経路および／または方法は、所望の結果に応じて変化する。ある特定の実施形態では、活性化合物は、インプラント、およびマイクロカプセル化送達システムを含めた制御放出製剤などの、化合物が急速に放出されるのを防ぐ担体を用いて調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製する多くの方法が利用可能である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、１９７８年、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。
医薬組成物は、医療用デバイスを用いて投与することができる。例えば、一実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、デバイス、例えば、無針皮下注射デバイス、ポンプ、またはインプラントを用いて投与することができる。
ある特定の実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、インビボで適切な分布を保証するように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの非常に親水性の化合物を除外する。本明細書に開示される治療化合物がＢＢＢを通過する（望まれる場合）のを保証するために、これらは、例えば、リポソームで製剤化することができる。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、同第５，３７４，５４８号、および同第５，３９９，３３１号を参照。リポソームは、特定の細胞または臓器中に選択的に輸送される、１つまたは複数の部分を含み、したがって標的薬物送達を増強することができる（例えば、Ｖ．Ｖ． Ｒａｎａｄｅ、１９８９年、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２９巻：６８５頁を参照）。
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整される。例えば、１回の大量瞬時投与を投与することができ、いくつかの分割量を経時的に投与することができ、または用量を、治療状況の要求によって示されるのに比例して低減もしくは増加させることができる。投与を容易にし、投与量を均一にするために、非経口組成物を単位剤形（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）で製剤化することが特に有利である。単位剤形は、本明細書で使用する場合、治療される対象にとって単位投与量として適した物理的に別個のユニットを指し、各ユニットは、必要な医薬担体とともに、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。単位剤形の仕様書は、（ａ）活性化合物の独特の特徴、および実現されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個々の感受性に対処するために、そのような活性化合物を調合する技術分野における固有の制限によって指示することができ、これらに直接依存し得る。
本明細書に開示される抗体の治療有効量または予防有効量についての例示的な、限定されない範囲は、抗体０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ抗体および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、例えば、約１〜１００ｍｇ／ｍ２または約５〜３０ｍｇ／ｍ２の用量に到達するために、３０、２０、１０、５、または１ｍｇ／分未満の速度で静脈内注入によって投与することができる。抗体より分子量が小さい結合タンパク質については、適切な量は、比例して少なくなる場合がある。投与量値は、軽減される状態のタイプおよび重症度によって変化し得る。特定の対象については、具体的な投与量レジメンを、個々の必要性、および組成物の投与を施し、または組成物の投与を監督する人の専門的判断によって、経時的に調整することができる。
本明細書に開示される医薬組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」の本明細書に開示されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを含むことができる。「治療有効量」は、所望の治療効果を実現するのに必要な投与量および時間で有効な量を指す。組成物の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの要因、ならびに個体において所望の応答を誘発するタンパク質の能力によって変化し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が、組成物のいずれの毒性作用または有害作用にも勝るものである。
「治療有効投与量」により、好ましくは、測定可能なパラメータ、例えば、ＩｇＧ抗体の循環濃度が、未処置の対象と比べて、統計的に有意な程度、または少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％調節される。測定可能なパラメータ、例えば、疾患に関連するパラメータを調節する化合物の能力は、ヒトの障害および状態、例えば、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）、炎症疾患（例えば、滑膜炎、アテローム性動脈硬化症）、関節リウマチ、骨関節炎、眼球状態（例えば、黄斑変性症）、糖尿病、アルツハイマー病、脳虚血、子宮内膜症、フィブリン侵襲性活性、血管新生、または毛細管形成における有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、インビトロでパラメータを調節する化合物の能力を試験することによって評価することができる。
「予防有効量」は、所望の予防結果を実現するのに必要な投与量および時間で有効な量を指す。一般に、予防用量は、疾患の前、または疾患の早期段階に対象において使用されるので、予防有効量は治療有効量より少なくなる。
安定化および保持
一実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、循環、例えば、血液、血清、リンパ液、または他の組織におけるその安定化および／または保持を、例えば、少なくとも１．５、２、５、１０、または５０倍改善する部分と物理的に付随している。例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、ポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドなどの実質的に非抗原性ポリマーと結合することができる。適当なポリマーは重量によって実質的に変化する。約２００〜約３５，０００（または約１，０００〜約１５，０００、および２，０００〜約１２，５００）の範囲の数平均分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｎｕｍｂｅｒ ａｖｅｒａｇｅ ｗｅｉｇｈｔ）を有するポリマーを使用することができる。例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、水溶性ポリマー、例えば、親水性ポリビニルポリマー、例えば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンと結合することができる。そのようなポリマーの非限定的リストには、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎａｔｅｄ）ポリオール、これらのコポリマー、およびこれらのブロックコポリマーが含まれ、ただし、ブロックコポリマーの水溶性は維持されている。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、担体タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンと結合することもできる。例えば、担体タンパク質を、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターと結合させるのに翻訳融合を使用することができる。
成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーター
成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路成分に作用することができる（例えば、間接的に（例えば、立体効果によって）または直接に（例えば、相互作用する、例えば、結合することによって））。成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路の成分およびこれらの活性は、Ｌｉｎ−Ｓｕ， Ｋ．およびＷａｊｎｒａｊｃｈ， Ｍ．Ｐ．、２００２年、Ｒｅｖ． Ｅｎｄｏｃｒ． Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｏｒｄ． ３巻：３１３〜３２３頁；Ｓａｌｖａｔｏｒｉ， Ｒ． ２００４年、Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒ． Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｏｒｄ． ５巻：１５〜２３頁、ならびにＳｃｈａｌｌｙ， Ａ．Ｖ．、２００８年、Ｎａｔ． Ｃｌｉｎ． Ｐｒａｃｔ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ４巻：３３〜４３頁に記載されている。成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路成分の例には、それだけに限らないが、成長ホルモンおよびその受容体、成長ホルモン放出ホルモンおよびその受容体、ソマトスタチン（成長ホルモン抑制ホルモン（ＧＨＩＨ）またはソマトトロピン）、ならびにＩＧＦ−１が含まれる。
使用することができる成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターには、それだけに限らないが、抗体（本明細書に記載されるような抗体断片を含む）、ポリペプチド、小分子、およびアプタマーが含まれる。ポリペプチドの例には、受容体断片（例えば、可溶性受容体、例えば、可溶性受容体断片のＦｃ融合物）、およびリガンド断片（例えば、可溶性受容体断片のＦｃ融合物）が含まれる。
成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの例として、それだけに限らないが、Ｓｃｈａｌｌｙ， Ａ．Ｖ．、２００８年、Ｎａｔ． Ｃｌｉｎ． Ｐｒａｃｔ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ４巻：３３〜４３頁、およびＳｃｈｕｌｚら ２００６年、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４２巻：２３９０〜２３９６頁に記載されているものなどの成長ホルモン放出ホルモンアンタゴニスト、ならびにＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）（ペグビソマント）などの成長ホルモン受容体アンタゴニストが挙げられる。
抗成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路成分は、以下のうちの１つまたは複数とすることができる：ヒト、ヒト化、非免疫原性、単離された、モノクローナル、および組換え型。
成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路成分には、各免疫グロブリン分子上に２つの独立した抗原性結合部位が存在する二機能性抗体を作るのに使用することができるモノクローナル抗体が含まれる。この技術は当技術分野で公知であり、文献に開示されている（Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ． Ｓｕｐｐｌ． Ｘ：８３頁、１９９０年）。さらに、二重特異性抗体は、単鎖抗体からも構築することができる。この技術は当技術分野で公知であり、例えば、Ａ． Ｇｅｏｒｇｅ（Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｎｎｕａｌ ＩＢＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９９１年１２月１６〜１８日、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．）によって開示されている。
成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路成分モジュレーターは、２つ以上の成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路成分を阻害することができる抗体のパネルとすることができる。本明細書で使用する場合、用語「パネル」は、様々な特異性を有する２つ以上の抗体の組合せを表す。抗体は、様々な抗原、または１つの抗原上の様々なエピトープに特異的となり得る。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）が好適である。
成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーター（例えば、抗受容体モノクローナル抗体）は、対象とする治療剤の化合物を送達するための標的化剤としても使用することができる。そのような化合物には、それだけに限らないが、毒素、細胞分裂停止化合物、またはプロ酵素が含まれ、プロ酵素の潜在的な機能は、内因性プロ酵素を活性化し、外因源から加えられたプロ酵素を活性化し、またはプロドラッグ上の酵素切断部位を活性化することである場合がある。
いくつかの実施形態では、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、成長ホルモン受容体類似体または断片、例えば、可溶性形態の成長ホルモン受容体とすることができ、例えば、可溶性形態の受容体は、成長ホルモン受容体に結合し、成長ホルモン受容体に結合している成長ホルモンをアンタゴナイズする。例えば、受容体断片はＦｃ融合タンパク質とすることができる。
例えば、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）（ペグビソマント）、ヒト成長ホルモン（ＧＨ）受容体アンタゴニストとして作用するように構造的に変更されたＧＨの類似体とすることができる。
ペグビソマントは、いくつかのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーが共有結合している（主に４〜６ＰＥＧ／タンパク質分子）、１９１個のアミノ酸残基を含有する組換えＤＮＡ起源のタンパク質である。ペグビソマントのタンパク質の分子量は２１，９９８ダルトンである。ペグビソマントのＰＥＧ部分の分子量は約５０００ダルトンである。したがって、ペグビソマントの支配的な分子量は、約４２，０００、４７，０００、および５２，０００ダルトンである。概略図は、ペグビソマントタンパク質のアミノ酸配列を示す（５つの最も起こりそうな結合部位に結合したＰＥＧポリマーが示されている）。ペグビソマントは、ＧＨ受容体アンタゴニストについての遺伝子を担持するプラスミドを添加することによって遺伝的に改変された、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌の特定の菌株によって合成される。生物学的効力は、細胞増殖バイオアッセイを使用して求められる。
追加の成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーター化合物には、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（登録商標）（酢酸オクトレオチド、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が含まれ、これは、ソマトスタチンを薬理学的に模倣する。
キット
本明細書に記載されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、例えば、キットの成分として、キットで提供することができる。例えば、キットは、（ａ）ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を含む組成物、および場合により（ｂ）情報資料を含む。情報資料は、本明細書に記載される方法および／または本明細書に記載される方法のためのＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の使用に関係する説明資料、教材、マーケティング資料、または他の資料とすることができる。
キットの情報資料は、その形態において限定されない。一実施形態では、情報資料は、化合物の製造についての情報、化合物の分子量、濃度、有効期限日、バッチまたは製造場所の情報などを含むことができる。一実施形態では、情報資料は、障害および状態、例えば、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）を治療、予防、または診断するための結合タンパク質の使用に関係する。
一実施形態では、情報資料は、本明細書に記載される方法を実施するのに適した様式で、例えば、適当な用量、剤形、または投与方法（例えば、本明細書に記載される用量、剤形、または投与方法）で、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を投与するための指示書を含むことができる。別の実施形態では、情報資料は、適当な対象、例えば、ヒト、例えば、本明細書に記載される障害または状態、例えば、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）を有するか、またはそのリスクのあるヒトにＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を投与するための指示書を含むことができる。例えば、資料は、本明細書に記載される障害または状態、例えば、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）を有する患者に、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を投与するための指示書を含んでいてもよい。キットの情報資料は、その形態において限定されない。多くの場合では、情報資料、例えば、指示書は、印刷して提供されるが、コンピューターで判読可能な資料などの他の形式とすることもできる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、任意の形態、例えば、液体、乾燥、または凍結乾燥形態で提供することができる。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、実質的に純粋かつ／または滅菌であることが好適である。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質が溶液で提供される場合、溶液は水溶液であることが好ましく、滅菌水溶液であることが好適である。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質が乾燥形態で提供される場合、再構成は一般に、適当な溶媒の添加によるものである。溶媒、例えば、滅菌水または緩衝液を、場合によりキット中に用意することができる。
キットは、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を含有する組成物のための１つまたは複数の容器を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、組成物および情報資料のために、別個の容器、仕切り、またはコンパートメントを含む。例えば、組成物は、瓶、バイアル、またはシリンジ中に入れることができ、情報資料は、容器に付随して含めることができる。他の実施形態では、キットの別個のエレメントを、１個の分割されていない容器内に入れることができる。例えば、組成物は、ラベルの形態で情報資料が添付された瓶、バイアル、またはシリンジ中に入れられる。いくつかの実施形態では、キットは、複数（例えば、パック）の個々の容器を含み、それぞれは、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の１つまたは複数の単位剤形（例えば、本明細書に記載される剤形）を含む。例えば、キットは、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、またはブリスターパックを含み、それぞれは、１単位用量のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を含む。キットの容器は、気密、防水（例えば、水分もしくは蒸発の変化に不浸透性）、および／または遮光とすることができる。
本明細書に記載されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの組合せを、例えば、キットの成分としてキットに提供することができる。例えば、キットは、（ａ）ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を含む組成物、（ｂ）成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーター、例えば、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを含む組成物；および場合により（ｃ）情報資料を含む。情報資料は、本明細書に記載される方法および／または本明細書に記載される方法のための組合せの使用に関係する説明資料、教材、マーケティング資料、または他の資料とすることができる。
キットの情報資料は、その形態において限定されない。一実施形態では、情報資料は、化合物の製造についての情報、化合物の分子量、濃度、有効期限日、バッチまたは製造場所の情報などを含むことができる。一実施形態では、情報資料は、障害および状態、例えば、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）を治療、予防、または診断するための組合せの使用に関する。
一実施形態では、情報資料は、本明細書に記載される方法を実施するのに適した様式で、例えば、適当な用量、剤形、または投与方法（例えば、本明細書に記載される用量、剤形、または投与方法）で、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを投与するための指示書を含むことができる。別の実施形態では、情報資料は、適当な対象、例えば、ヒト、例えば、本明細書に記載される障害または状態、例えば、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）を有するか、またはそのリスクのあるヒトにＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを投与するための指示書を含むことができる。例えば、資料は、本明細書に記載される障害または状態、例えば、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）を有する患者に、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを投与するための指示書を含んでいてもよい。キットの情報資料は、その形態において限定されない。多くの場合では、情報資料、例えば、指示書は、印刷して提供されるが、コンピューターで判読可能な資料などの他の形式とすることもできる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、任意の形態、例えば、液体、乾燥、または凍結乾燥形態で提供することができる。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、実質的に純粋かつ／または滅菌であることが好適である。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターが溶液で提供される場合、溶液は水溶液であることが好ましく、滅菌水溶液であることが好適である。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターが乾燥形態で提供される場合、再構成は一般に、適当な溶媒の添加によるものである。溶媒、例えば、滅菌水または緩衝液を、場合によりキット中に用意することができる。
キットは、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを含有する組成物のための１つまたは複数の容器を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、組成物および情報資料のために、別個の容器、仕切り、またはコンパートメントを含む。例えば、組成物は、瓶、バイアル、またはシリンジ中に入れることができ、情報資料は、容器に付随して含めることができる。他の実施形態では、キットの別個のエレメントを、１個の分割されていない容器内に入れることができる。例えば、組成物は、ラベルの形態で情報資料が添付された瓶、バイアル、またはシリンジ中に入れられる。いくつかの実施形態では、キットは、複数（例えば、パック）の個々の容器を含み、それぞれは、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの１つまたは複数の単位剤形（例えば、本明細書に記載される剤形）を含む。例えば、キットは、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、またはブリスターパックを含み、それぞれは、１単位用量のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを含む。キットの容器は、気密、防水（例えば、水分もしくは蒸発の変化に不浸透性）、および／または遮光とすることができる。
キットは、場合により組成物の投与に適したデバイス、例えば、シリンジ、吸入剤、点滴器（例えば、点眼器）、スワブ（例えば、綿スワブもしくは木製スワブ）、または任意のそのような送達デバイスを含む。一実施形態では、デバイスは、定量の結合タンパク質を供給する移植可能なデバイスである。本開示は、例えば、本明細書に記載される構成要素を組み合わせることによってキットを提供する方法も特徴とする。
治療
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥの両方に結合し、本明細書に記載される方法によって同定され、かつ／または本明細書に詳述されるタンパク質は、特にヒト対象において治療的および予防的有用性を有する。これらの結合タンパク質は、例えば、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）を含めた様々な障害を治療、予防、および／もしくは診断するために対象に、または例えば、インビトロもしくはエクスビボで培養物中の細胞にさえも投与される。治療は、障害、障害の症状、または障害へ向かう傾向を軽減し、緩和し、変更し、矯正し、回復させ、改善し、またはこれらに影響を及ぼすのに有効な量を投与するステップを含む。治療は、疾患または状態の発症を遅延させ、発症を予防し、または悪化を予防することもできる。
例示的な障害には、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）が含まれる。
本明細書で使用する場合、障害を予防するのに有効な標的結合剤の量、または結合剤の予防有効量は、１つまたは複数の用量を対象に投与すると、障害、例えば、本明細書に記載される障害の発症または再発の発生を予防し、または遅延させるのに有効である、標的結合剤、例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、例えば、本明細書に記載される抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ抗体の量を指す。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および他の作用剤の投与方法は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」にも記載されている。使用される分子の適当な投与量は、対象の年齢および体重、ならびに使用される特定の薬物に依存し得る。結合タンパク質は、例えば、天然または病理学的因子とＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥとの望ましくない相互作用を阻害、低減するための競合剤として使用することができる。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の用量は、患者において、特に疾患部位で、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥの活性の９０％、９５％、９９％、または９９．９％を遮断するのに十分な量とすることができる。疾患に応じて、これは、０．１、１．０、３．０、６．０、または１０．０ｍｇ／Ｋｇを必要とする場合がある。１５０，０００ｇ／モルの分子量を有するＩｇＧ（２つの結合部位）について、これらの用量は、５Ｌの血液量に対して、約１８ｎＭ、１８０ｎＭ、５４０ｎＭ、１．０８μＭ、および１．８μＭの結合部位に対応する。
一実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、細胞、例えば癌細胞の活性をインビボで阻害する（例えば、増殖、遊走、成長または生存能のうちの少なくとも１つの活性を阻害し、これらを低減する）のに使用される。結合タンパク質は、それ自体で使用し、または作用剤、例えば、細胞毒性薬、細胞毒性酵素、または放射性同位体に結合させることができる。この方法は、単独の、または作用剤（例えば、細胞毒性薬）に結合した結合タンパク質を、そのような治療を必要とする対象に投与するステップを含む。例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥを実質的に阻害しないＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、毒素などの作用剤を含有するナノ粒子を、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥに関連する細胞または組織、例えば、腫瘍に送達するのに使用することができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥの両方に結合し、本明細書に記載される方法によって同定され、かつ／または本明細書に詳述されるタンパク質は、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターと併用して、特にヒト対象において治療的および予防的有用性を有する。これらの結合タンパク質およびモジュレーターは、例えば、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）を含めた様々な障害を治療、予防、および／もしくは診断するために対象に、または例えば、インビトロもしくはエクスビボで培養物中の細胞にさえも投与される。治療は、障害、障害の症状、または障害へ向かう傾向を軽減し、緩和し、変更し、矯正し、回復させ、改善し、またはこれらに影響を及ぼすのに有効な量を投与するステップを含む。治療は、疾患または状態の発症を遅延させ、発症を予防し、または悪化を予防することもできる。
例示的な障害には、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）が含まれる。
本明細書で使用する場合、障害を予防するのに有効な標的結合剤の量、または結合剤の予防有効量は、１つまたは複数の用量を対象に投与すると、障害、例えば、本明細書に記載される障害の発症または再発の発生を予防し、または遅延させるのに有効である、標的結合剤、例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、例えば、本明細書に記載される抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ抗体、および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの量を指す。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーター、および他の作用剤の投与方法は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」にも記載されている。使用される分子の適当な投与量は、対象の年齢および体重、ならびに使用される特定の薬物に依存し得る。結合タンパク質は、例えば、天然または病理学的因子とＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ、および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターとの望ましくない相互作用を阻害、低減するための競合剤として使用することができる。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の用量は、患者において、特に疾患部位で、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥの活性の９０％、９５％、９９％、または９９．９％を遮断するのに十分な量とすることができる。疾患に応じて、これは、０．１、１．０、３．０、６．０、または１０．０ｍｇ／Ｋｇを必要とする場合がある。１５０，０００ｇ／モルの分子量を有するＩｇＧ（２つの結合部位）について、これらの用量は、５Ｌの血液量に対して、約１８ｎＭ、１８０ｎＭ、５４０ｎＭ、１．０８μＭ、および１．８μＭの結合部位に対応する。
ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）の例示的な治療有効投与量は、約５〜約５０Ｕの活性の範囲であり、対象に一日量で投与される。
ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（登録商標）の例示的な治療有効投与量は、一般に毎月投与される、１０、２０、および３０ｍｇの用量で利用可能なデポー製剤、ならびに一般に１日当たり２〜３回投与される、５０、１００、または５００ｍｃｇの用量の注射を含む。
ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）およびＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（登録商標）の両方についての投与量の考察は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、６２版（２００８年）に記載されている。
一実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、細胞、例えば癌細胞の活性をインビボで阻害する（例えば、増殖、遊走、成長または生存能のうちの少なくとも１つの活性を阻害し、これらを低減する）のに使用される。結合タンパク質は、それ自体で使用し、または作用剤、例えば、細胞毒性薬、細胞毒性酵素、または放射性同位体に結合させることができる。この方法は、単独の、または作用剤（例えば、細胞毒性薬）に結合した結合タンパク質を、そのような治療を必要とする対象に投与するステップを含む。例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥを実質的に阻害しないＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、毒素などの作用剤を含有するナノ粒子を、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥに関連する細胞または組織、例えば、腫瘍に送達するのに使用することができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ発現細胞を認識し、癌細胞、例えば、肺、肝臓、大腸、乳房、卵巣、表皮、喉頭、および軟骨の癌細胞、特にこれらの転移性細胞に関連する（例えば、近接する、または混じっている）細胞に結合することができるので、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、任意のそのような細胞を阻害し（例えば、少なくとも１つの活性を阻害し、成長および増殖を低減し、または死滅させる）、発癌を阻害するのに使用することができる。癌付近のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥの活性を低減することにより、転移に関するＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ活性、成長因子の活性化などに依存し得る癌細胞を間接的に阻害する（例えば、少なくとも１つの活性を阻害し、成長および増殖を低減し、または死滅させる）ことができる。
同様に、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路成分発現細胞を認識し、癌細胞、例えば、肺、肝臓、大腸、乳房、卵巣、表皮、喉頭、および軟骨の癌細胞、特にこれらの転移性細胞に関連する（例えば、近接する、または混じっている）細胞に結合することができるので、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、任意のそのような細胞を阻害し（例えば、少なくとも１つの活性を阻害し、成長および増殖を低減し、または死滅させる）、発癌を阻害するのに使用することができる。癌付近の成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路成分の活性を低減することにより、転移に関する活性、成長因子の活性化などに依存し得る癌細胞を間接的に阻害する（例えば、少なくとも１つの活性を阻害し、成長および増殖を低減し、または死滅させる）ことができる。あるいは、結合タンパク質は、癌性細胞の近傍における細胞に結合するが、癌性細胞に十分に近いことによって、癌細胞を直接または間接的に阻害する（例えば、少なくとも１つの活性を阻害し、成長および増殖を低減し、または死滅させる）。したがって、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質（例えば、毒素、例えば、細胞毒で修飾された）は、癌組織中の細胞（癌性細胞自体、および癌に関連するか、癌に侵入する細胞を含む）を選択的に阻害するのに使用することができる。
結合タンパク質は、作用剤（例えば、任意の様々な細胞毒性薬および治療薬）を、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥが存在する細胞および組織に送達するのに使用することができる。例示的な作用剤として、放射線を放出する化合物、植物、真菌、または細菌に由来する分子、生物学的なタンパク質、およびこれらの混合物が挙げられる。細胞毒性薬は、毒素、短距離放射線エミッター、例えば、短距離、高エネルギーαエミッターなどの細胞内に作用する細胞毒性薬とすることができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ発現細胞、特に癌性細胞を標的にするために、プロドラッグシステムを使用することができる。例えば、第１の結合タンパク質は、プロドラッグアクチベーターに近接している場合のみ活性化されるプロドラッグと結合される。プロドラッグアクチベーターは、第２の結合タンパク質、好ましくは標的分子上の非競合部位に結合するものと結合される。２つの結合タンパク質が、競合または非競合結合部位に結合するかどうかは、従来の競合的結合アッセイによって判定することができる。例示的な薬物プロドラッグの対は、Ｂｌａｋｅｌｙら、（１９９６年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５６巻：３２８７〜３２９２に記載されている。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、インビボで直接使用されることによって、天然の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して抗原発現細胞を排除することができる。本明細書に記載される結合タンパク質は、エフェクタードメインに結合している補体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ３に由来するＦｃ部分、または補体に結合するＩｇＭの対応部分などを含むことができる。一実施形態では、標的細胞の集団は、本明細書に記載される結合剤、および適切な効果細胞を用いてエクスビボで処置される。この処置は、補体または補体を含有する血清を添加することによって補うことができる。さらに、本明細書に記載される結合タンパク質でコーティングされた標的細胞の食作用は、補体タンパク質の結合によって改善され得る。別の実施形態では、標的である、補体結合エフェクタードメインを含む結合タンパク質でコーティングされた細胞は、補体によって溶解される。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの投与方法は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」に記載されている。使用される分子の適当な投与量は、対象の年齢および体重、ならびに使用される特定の薬物に依存する。結合タンパク質は、例えば、天然または病理学的因子とＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ、および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターとの望ましくない相互作用を阻害、低減するための競合剤として使用することができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、巨大分子およびマイクロ分子、例えば、遺伝子を内皮または上皮中の細胞中に、遺伝子療法目的で送達し、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥを発現する組織のみを標的にするのに使用することができる。結合タンパク質は、治療薬、放射線を放出する化合物、植物、真菌、または細菌に由来する分子、生物学的なタンパク質、およびこれらの混合物を含めた、様々な細胞毒性薬を送達するのに使用してもよい。細胞毒性薬は、本明細書に記載されるような、例えば、短距離、高エネルギーαエミッターを含めた短距離放射線エミッターなどの、細胞内に作用する細胞毒性薬とすることができる。
ポリペプチド毒素の場合では、組換え核酸技法を、結合タンパク質（例えば、抗体、またはその抗原結合性断片）、および翻訳融合物として細胞毒（またはそのポリペプチド成分）をコードする核酸を構築するのに使用することができる。その場合、組換え核酸が、例えば、細胞中で発現され、コードされた融合ポリペプチドが単離される。
あるいは、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、高エネルギー放射線エミッター、例えば、ａ γエミッターである１３１Ｉなどの放射性同位体と結合することができ、これは、部位に局在しているとき、いくつかの細胞直径の殺害をもたらす。例えば、Ｓ．Ｅ． Ｏｒｄｅｒ、「Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｓｕｌｔｓ， ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒ．Ｗ． Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３〜３１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５年）を参照。他の適当な放射性同位体には、ａエミッター、例えば、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、および２１１Ａｔなど、ならびにｂエミッター、例えば１８６Ｒｅおよび９０Ｙなどが含まれる。さらに、１７７Ｌｕも、画像化剤および細胞毒性薬の両方として使用することができる。
１３１Ｉ、９０Ｙ、および１７７Ｌｕで標識された抗体を使用する放射免疫療法（ＲＩＴ）は、熱心な臨床的研究が行われている。これらの３つの核種の物理的特徴には有意な差異があり、結果として、放射性核種の選択は、対象とする組織に最大放射線量を送達するために非常に重要である。９０Ｙのより高いβエネルギー粒子は、大きい腫瘍に良好となり得る。１３１Ｉの比較的低いエネルギーのβ粒子は、理想的であるが、放射ヨウ素標識された分子のインビボでの脱ハロゲン化は、内在している抗体にとっての主要な不利点である。対照的に、１７７Ｌｕは、わずか０．２〜０．３ｍｍの射程を伴う低エネルギーのβ粒子を有し、９０Ｙと比較してはるかに低い放射線量を骨髄に送達する。さらに、より長い物理的な半減期（９０Ｙと比較して）のために、滞留時間が長い。結果として、より高い活性（より多いｍＣｉ量）の１７７Ｌｕで標識された作用剤を、比較的少ない放射線量で骨髄に投与することができる。様々な癌の治療において１７７Ｌｕで標識された抗体を使用することが、いくつかの臨床試験で調査されている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ Ｔら、１９９５年、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． １巻：１４４７〜１４５４頁；Ｍｅｒｅｄｉｔｈ ＲＦら、１９９６年、Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ３７巻：１４９１〜１４９６頁；Ａｌｖａｒｅｚ ＲＤら、１９９７年、Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． ６５巻：９４〜１０１頁）。
例示的な疾患および状態
本明細書に記載されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥ活性が関係した疾患もしくは状態、例えば、本明細書に記載される疾患もしくは状態を治療する、またはこれらに関連する１つもしくは複数の症状を治療するのに有用である。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質（例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合ＩｇＧもしくはＦａｂ）は、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥ活性を阻害する。
そのような疾患および状態の例には、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）が含まれる。治療有効量のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ活性が関係する障害を有するか、または有する疑いのある対象に投与され、それによって障害を治療する（例えば、障害の症状または特徴を回復させ、または改善し、疾患の進行を遅延、安定化、または停止させる）。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、治療有効量で投与される。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の治療有効量は、対象に１つまたは複数の用量を投与すると、対象を治療する、例えば、そのような治療がない場合に予期される程度を超える程度に、対象における障害の少なくとも１つの症状を、治癒、緩和、軽減、または改善するのに有効な量である。組成物の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの要因、ならびに個体において所望の応答を誘発する化合物の能力によって変化し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が、組成物のいずれの毒性作用または有害作用にも勝るものである。
本明細書に記載されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、ＩＧＦ−ＩＩおよび／もしくはＩＧＦ−ＩＩＥ活性、ならびに成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路活性が関係する疾患もしくは状態、例えば、本明細書に記載される疾患もしくは状態を治療する、またはこれらに関連する１つもしくは複数の症状を治療するのに有用である。
そのような疾患および状態の例には、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）が含まれる。治療有効量のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ活性が関係する障害を有するか、または有する疑いのある対象に併用して投与され、それによって障害を治療する（例えば、障害の症状または特徴を回復させ、または改善し、疾患の進行を遅延、安定化、または停止させる）。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、治療有効量で投与される。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの治療有効量は、対象に１つまたは複数の用量を投与すると、対象を治療する、例えば、そのような治療がない場合に予期される程度を超える程度に、対象における障害の少なくとも１つの症状を、治癒、緩和、軽減、または改善するのに有効な量である。組成物の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの要因、ならびに個体において所望の応答を誘発する化合物の能力によって変化し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が、組成物のいずれの毒性作用または有害作用にも勝るものである。
一般に、対象に１つまたは複数の用量を投与すると、対象を治療する、例えば、そのような治療がない場合に予期される程度を超える程度に、対象における障害の少なくとも１つの症状を、治癒、緩和、軽減、または改善するのに有効な化合物の量である治療有効量を投与することができる。組成物の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの要因、ならびに個体において所望の応答を誘発する化合物の能力によって変化し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が、組成物のいずれの毒性作用または有害作用にも勝るものである。治療有効投与量により、好ましくは、測定可能なパラメータが、未治療の対象と比べて有利に調節される。測定可能なパラメータを阻害する化合物の能力は、ヒトの障害における有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整することができる。例えば、１回の大量瞬時投与を投与することができ、いくつかの分割量を経時的に投与することができ、または用量を、治療状況の要求によって示されるのに比例して低減もしくは増加させることができる。投与を容易にし、投与量を均一にするために、非経口組成物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。単位剤形は、本明細書で使用する場合、治療される対象にとって単位投与量として適した物理的に別個のユニットを指し、各ユニットは、必要な医薬担体とともに、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
癌
本開示は、有効量のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質（例えば、抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ ＩｇＧまたはＦａｂ）を投与することによって、癌（例えば、乳癌、頭頸部癌、口腔癌、喉頭癌、結腸直腸癌、肝癌、軟骨肉腫、卵巣癌、精巣癌、黒色腫、脳腫瘍（例えば、星細胞腫、グリア芽細胞腫、グリオーマ））を治療する（例えば、腫瘍成長を遅延させ、排除し、または逆行させ、数もしくはサイズにおいて転移を予防もしくは低減し、腫瘍細胞の侵襲性を低減もしくは排除し、腫瘍進行の間隔の増大をもたらし、または疾患のない生存時間を増加させる）方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ活性を阻害する。
ある特定の実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、単剤治療として投与される。他の実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、追加の抗癌剤と併用して投与される。
癌を発症するリスクのある対象に、有効量のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を投与し、それによって癌を発症する対象のリスクを低減することによって、癌を発症するリスクを予防または低減する方法も提供される。
本開示は、有効量のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を投与し、それによって腫瘍部位での血管新生を低減または予防することによって、腫瘍部位での血管新生を調節する（例えば、低減または予防する）方法をさらに提供する。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、単剤療法として、または追加の作用剤と併用して投与することができる。
開示される方法は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、およびこれらの転移の予防および治療において有用である。固形腫瘍には、様々な臓器系の悪性腫瘍（例えば、肉腫、腺癌、および癌）、例えば、肺、乳房、リンパ系、胃腸（例えば、大腸）、および尿生殖器（例えば、腎臓、尿路上皮、または精巣の腫瘍）路、咽頭、前立腺、および卵巣の悪性腫瘍などが含まれる。例示的な腺癌には、結腸直腸癌、腎細胞癌、肝癌、肺の非小細胞癌、および小腸の癌が含まれる。追加の例示的な固形腫瘍として、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃腸系癌、結腸癌、膵癌、乳癌、尿生殖器系癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、じゅう毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、内分泌系癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫が挙げられる。上述の癌の転移も本明細書に記載される方法に従って治療または予防することができる。
癌の治療に対する治療有効量の判定についてのガイダンスは、治療される癌のインビボモデルを参照して得ることができる。例えば、癌のげっ歯類またはＬｉｂｅｃｈｏｖミニブタモデルにおける治療有効量である、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の量を、治療有効量である用量の選択を誘導するのに使用することができる。ヒト癌のいくつかのげっ歯類モデルが利用可能であり、ヌードマウス／腫瘍異種移植片系（例えば、黒色腫異種移植片；例えば、Ｔｒｉｋｈａら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６２巻：２８２４〜２８３３頁（２００２年）を参照）、および乳癌またはグリオーマのマウスモデル（例えば、Ｋｕｐｅｒｗａｓｓｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６５巻、６１３０〜６１３８頁、（２００５年）；Ｂｒａｄｆｏｒｄら、Ｂｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ３巻（２号）：１９７〜２１０頁（１９８９年））が含まれる。メラニン芽細胞腫を有するＬｉｂｅｃｈｏｖミニブタ（ＭｅＬｉＭ）が、黒色腫の動物モデルとして利用可能である（例えば、Ｂｏｉｓｇａｒｄら、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ３０巻（６号）：８２６〜３４頁（２００３年））。
本開示は、有効量のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質（例えば、抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ ＩｇＧまたはＦａｂ）およびＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）などの成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを投与することによって、癌（例えば、乳癌、頭頸部癌、口腔癌、喉頭癌、軟骨肉腫、卵巣癌、精巣癌、黒色腫、脳腫瘍（例えば、星細胞腫、グリア芽細胞腫、グリオーマ））を治療する（例えば、腫瘍成長を遅延させ、排除し、もしくは逆行させ、数もしくはサイズにおいて転移を予防もしくは低減し、腫瘍細胞の侵襲性を低減もしくは排除し、腫瘍進行の間隔の増大をもたらし、または疾患のない生存時間を増加させる）方法を提供する。
癌を発症するリスクのある対象に、有効量のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを投与し、それによって癌を発症する対象のリスクを低減することによって、癌を発症するリスクを予防または低減する方法も提供される。
開示される方法は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、およびこれらの転移の予防および治療において有用である。固形腫瘍には、様々な臓器系の悪性腫瘍（例えば、肉腫、腺癌、および癌）、例えば、肺、乳房、リンパ系、胃腸（例えば、大腸）、および尿生殖器（例えば、腎臓、尿路上皮、または精巣の腫瘍）路、咽頭、前立腺、および卵巣の悪性腫瘍などが含まれる。例示的な腺癌には、結腸直腸癌、腎細胞癌、肝癌、肺の非小細胞癌、および小腸の癌が含まれる。追加の例示的な固形腫瘍として、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃腸系癌、結腸癌、膵癌、乳癌、尿生殖器系癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、じゅう毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、内分泌系癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫が挙げられる。上述の癌の転移も本明細書に記載される方法に従って治療または予防することができる。
癌の治療に対する治療有効量の判定についてのガイダンスは、治療される癌のインビボモデルを参照して得ることができる。例えば、癌のげっ歯類またはＬｉｂｅｃｈｏｖミニブタモデルにおける治療有効量である、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの量を、治療有効量である用量の選択を誘導するのに使用することができる。ヒト癌のいくつかのげっ歯類モデルが利用可能であり、ヌードマウス／腫瘍異種移植片系（例えば、黒色腫異種移植片；例えば、Ｔｒｉｋｈａら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６２巻：２８２４〜２８３３頁（２００２年）を参照）、および乳癌またはグリオーマのマウスモデル（例えば、Ｋｕｐｅｒｗａｓｓｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６５巻、６１３０〜６１３８頁、（２００５年）；Ｂｒａｄｆｏｒｄら、Ｂｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ３巻（２号）：１９７〜２１０頁（１９８９年））が含まれる。メラニン芽細胞腫を有するＬｉｂｅｃｈｏｖミニブタ（ＭｅＬｉＭ）が、黒色腫の動物モデルとして利用可能である（例えば、Ｂｏｉｓｇａｒｄら、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ３０巻（６号）：８２６〜３４頁（２００３年））。
併用療法
本明細書に記載されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、例えば、抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ ＦａｂまたはＩｇＧは、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ活性に関連する疾患または状態、例えば、本明細書に記載される疾患または状態を治療するために、１つまたは複数の他の療法と併用して投与することができる。例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を、手術、ＩＧＦ−ＩＩ阻害剤、例えば、小分子阻害剤、別の抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ ＦａｂもしくはＩｇＧ（例えば、本明細書に記載される別のＦａｂもしくはＩｇＧ）、別のＩＧＦ−ＩＩ阻害剤、ペプチド阻害剤、または小分子阻害剤とともに治療的または予防的に使用することができる。本明細書に記載されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質とともに併用療法で使用することができるＩＧＦ−ＩＩ阻害剤の例には、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩと交差反応する抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体（例えば、ＷＯ２００７１１８２１４、ＷＯ２００７０７０４３２、ＥＰ１５０５０７５、ＵＳ２００６０１６５６９５、ＷＯ２００５０２８５１５、ＷＯ２００５０２７９７０、ＷＯ２００５０１８６７１を参照）、ならびにＩＧＦ−ＩＩのみと反応する抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体（例えば、ＷＯ２００７１１８２１４を参照）が含まれる。
１つまたは複数の小分子ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ阻害剤は、本明細書に記載される１つまたは複数のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質と併用して使用することができる。例えば、併用により、必要とされる小分子阻害剤をより低用量にすることができ、その結果副作用が低減される。
本明細書に記載されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、それだけに限らないが、手術、放射線療法、および化学療法を含めた、１つまたは複数の癌を治療するための他の療法と併用して投与することができる。例えば、ＩＧＦ−ＩＩを阻害し、またはＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ活性の下流事象を阻害するタンパク質も、他の抗癌療法、例えば、放射線療法、化学療法、手術、または第２の薬剤の投与などと併用して使用することができる。例えば、第２の薬剤は、Ｔｉｅ−１阻害剤（例えば、Ｔｉｅ−１結合タンパク質；例えば、ともに２００５年８月９日に出願された米国出願第１１／１９９，７３９号およびＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２８４を参照）とすることができる。別の例として、第２の薬剤は、ＶＥＧＦシグナル伝達経路を標的にし、または負にレギュレートするものとすることができる。この後者のクラスの例には、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）、およびＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ受容体抗体）が含まれる。１つの特に好適な併用は、ベバシズマブを含む。この併用は、５−ＦＵ、およびロイコボリン、および／またはイリノテカンをさらに含むことができる。
さらに、本明細書に記載されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、例えば、癌を治療するために、１つまたは複数の上皮成長因子（ＥＧＦ）経路阻害剤と併用して投与することができる。ＥＧＦ経路阻害剤は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、例えば小分子阻害剤（エルロチニブ（例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））もしくはゲフィチニブ（例えば、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））など）など、またはＥＧＦＲに結合する抗体、例えば、セツキシマブ（例えば、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））などとすることができる。この経路の追加の阻害剤には、ＰＤｌ５３０３５、ＳＵ５２７１、およびＺＤｌ８３９が含まれる。いくつかの実施形態では、ＥＧＦ経路阻害剤はエルロチニブである。
用語「併用」は、同じ患者を治療するための２つ以上の薬剤または療法の使用を指し、薬剤または療法の使用または作用は遅れずに重なる。薬剤または療法は、同時に（例えば、患者に投与される単一製剤として、もしくは同時に投与される２つの別個の製剤として）、または任意の順序で順次投与することができる。逐次投与は、異なる時間で投与される投与である。１つの薬剤と別の薬剤の投与の間の時間は、数分、数時間、数日、または数週間とすることができる。本明細書に記載されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の使用は、例えば、投与されている別の薬剤に関連する副作用を低減するため、例えば、ベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体の副作用を低減するために、別の療法の投与量を低減するのにも使用することができる。したがって、併用は、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の非存在下で使用されるよりも少なくとも１０、２０、３０、または５０％低い投与量で第２の薬剤を投与するステップを含むことができる。
第２の薬剤または療法は、別の抗癌剤または療法とすることもできる。抗癌剤の非限定例として、例えば、血管新生阻害剤、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、インターカレート剤、シグナル伝達経路を妨害することができる薬剤、アポトーシスを促進する薬剤、放射線、ならびに他の腫瘍に関連する抗原に対する抗体（裸抗体、免疫毒素、および放射性コンジュゲートを含む）が挙げられる。特定のクラスの抗癌剤の例を以下のように詳細に提供する：血管新生阻害剤、例えば、ＶＥＧＦ阻害剤（例えば、ＶＥＧＦに結合するなどによってＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂ、もしくは−Ｃ）を直接阻害する薬剤（例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）などの抗ＶＥＧＦ抗体）、もしくはラニビズマブ、もしくは他の阻害剤、例えば、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ＮＥＯＶＡＳＴＡＴ（登録商標）、ＡＥ−９４１、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ、およびＰＩ−８８など））を含めたＶＥＧＦ経路アンタゴニスト（ＶＥＧＦシグナル伝達経路を標的にし、もしくは負にレギュレートする薬剤）、ＶＥＧＦ発現のモジュレーター（例えば、ＩＮＧＮ−２４１、経口テトラチオモリブデート、２−メトキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオールナノ結晶分散物、ベバシラニブナトリウム、ＰＴＣ−２９９、Ｖｅｇｌｉｎ）、ＶＥＧＦ受容体の阻害剤（例えば、ＫＤＲもしくはＶＥＧＦ受容体ＩＩＩ（Ｆｌｔ４）、例えば、抗ＫＤＲ抗体、ＶＥＧＦＲ２抗体、例えば、ＣＤＰ−７９１、ＩＭＣ−１１２１Ｂなど、ＣＴ−３２２などのＶＥＧＦＲ２遮断薬）、ＶＥＧＦＲ発現のモジュレーター（例えば、ＶＥＧＦＲ１発現モジュレーターＳｉｒｎａ−０２７）、またはＶＥＧＦ受容体下流シグナル伝達の阻害剤。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニスト薬剤は、ベバシズマブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ＮＥＯＶＡＳＴＡＴ（登録商標）、ＡＥ−９４１、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ、パゾパニブ、バンデタニブ、バタラニブ、セジラニブ、フェンレチニド、スクアラミン、ＩＮＧＮ−２４１、経口テトラチオモリブデート、テトラチオモリブデート、Ｐａｎｚｅｍ ＮＣＤ、２−メトキシエストラジオール、ＡＥＥ−７８８、ＡＧ−０１３９５８、ベバシラニブナトリウム、ＡＭＧ−７０６、アキシチニブ、ＢＩＢＦ−１１２０、ＣＤＰ−７９１、ＣＰ−５４７６３２、ＰＩ−８８、ＳＵ−１４８１３、ＳＵ−６６６８、ＸＬ−６４７、ＸＬ−９９９、ＩＭＣ−１１２１Ｂ、ＡＢＴ−８６９、ＢＡＹ−５７−９３５２、ＢＡＹ−７３−４５０６、ＢＭＳ−５８２６６４、ＣＥＰ−７０５５、ＣＨＩＲ−２６５、ＣＴ−３２２、ＣＸ−３５４２、Ｅ−７０８０、ＥＮＭＤ−１１９８、ＯＳＩ−９３０、ＰＴＣ−２９９、Ｓｉｒｎａ−０２７、ＴＫＩ−２５８、Ｖｅｇｌｉｎ、ＸＬ−１８４、またはＺＫ−３０４７０９；抗チューブリン剤／微小管阻害剤、例えば、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテル；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アムサクリン、エピルビシン、メルバロン、塩酸ピロキサントロン；代謝拮抗剤、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン／シトシンアラビノシド、トリメトレキセート、ゲムシタビン、アシビシン、アラノシン、ピラゾフリン、Ｎ−ホスホルアセチル（Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｃｅｔｙｌ）−Ｌ−アスパレート（Ａｓｐａｒａｔｅ）＝ＰＡＬＡ、ペントスタチン、５−アザシチジン、５−アザ ２’−デオキシシチジン、アデニンアラビノシド、クラドリビン、５−フルオロウリジン、ＦＵＤＲ、チアゾフリン、Ｎ−［５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル］−Ｌ−グルタミン酸；アルキル化剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ＢＣＮＵ＝カルムスチン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロランブシル、プリカマイシン、ダカルバジン、リン酸イホスファミド、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、ウラシルマスタード、ピポブロマン、４−イポメアノール；他の作用機序を介して作用する薬剤、例えば、ジヒドロレンペロン、スピロムスチン、およびデシペプチド；例えば、インターフェロンなどの抗腫瘍応答を増強するための生物学的応答調節剤；アクチノマイシンＤなどのアポトーシス剤；ならびに抗ホルモン、例えば、タモキシフェンなどの抗エストロゲン、または例えば、４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリドなどの抗アンドロゲンである。
追加の薬剤または療法は、血管破壊剤（ＶＤＡ）とすることもできる。本発明において有用なＶＤＡは、既存の血管系、特に、血管新生に関連する障害（例えば、新生物障害）に関連する異常血管系を破壊する。例示的なＶＤＡとして、コンブレタスタチンおよびコンブレタスタチン関連化合物、コルヒチンおよびコルヒチン関連化合物、フラボン関連化合物、ドラスタチン１０誘導体、他の微小管破壊剤、および異常血管系を標的にする薬剤が含まれる。
コンブレタスタチン関連化合物には、コンブレタスタチンＡ−４リン酸二ナトリウム（ＣＡ４Ｐ）、（Ｚ）−Ｎ−［２−メトキシ−５−［２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ビニル］フェニル］−Ｌ−セリンアミド塩酸塩（ＡＶＥ８０６２、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）などのコンブレタスタチン類似体、およびＣＡ−１−Ｐ（ＯＸＩ４５０３、Ｏｘｉｇｅｎｅとしても公知である）などのコンブレタスタチンＡ−１プロドラッグが含まれる。
コルヒチン関連化合物には、Ｎ−アセチルコルキノール（５Ｓ）−５−（アセチルアミノ）−９，１０，１１−トリメトキシ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｃ］シクロヘプテン−３−イル リン酸二水素塩（ＺＤ６１２６、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が含まれる。
フラボン関連化合物には、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ、ＡＳ１４０４、Ａｎｔｉｓｏｍａとしても公知である）などの、フラボン酢酸（ＦＡＡ）およびＦＡＡの三環式類似体が含まれる。
ドラスタチン１０関連化合物には、ソブリドチン（Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル）−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−メトキシ−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−［（２−フェニルエチル）］アミノ］プロピル］−１−ピロリジニル］−１−［（Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソブチル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド、ＴＺＴ１０２７としても公知である）が含まれる。
追加のＶＤＡには、ＢＮＣ１０５（Ｂｉｏｎｏｍｉｃｓ Ｌｔｄ．）、および微小管破壊剤、例えば、ＭＰＣ−６８２７（Ｍｙｒｉａｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＣＹＴ９９７（Ｃｙｔｏｐｉａ Ｌｔｄ．）が含まれる。
併用療法は、他の療法の副作用を低減する薬剤を投与するステップを含むことができる。この薬剤は、抗癌治療の副作用を低減する薬剤とすることができる。例えば、薬剤はロイコボリンであってもよい。
本明細書に記載されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、例えば、抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ ＦａｂまたはＩｇＧは、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ活性および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路活性に関連する疾患または状態、例えば、本明細書に記載される疾患または状態を治療するために、成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーター、および場合により１つまたは複数の他の療法と併用して投与される。例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを、手術、ＩＧＦ−ＩＩ阻害剤、例えば、小分子阻害剤、別の抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ ＦａｂもしくはＩｇＧ（例えば、本明細書に記載される別のＦａｂもしくはＩｇＧ）、別のＩＧＦ−ＩＩ阻害剤、ペプチド阻害剤、または小分子阻害剤とともに治療的または予防的に使用することができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、それだけに限らないが、手術、放射線療法、および化学療法を含めた、１つまたは複数の癌を治療するための他の療法と併用して投与することができる。例えば、ＩＧＦ−ＩＩを阻害し、またはＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ活性の下流事象を阻害するタンパク質も、他の抗癌療法、例えば、放射線療法、化学療法、手術、または第２の薬剤の投与などと併用して使用することができる。例えば、第２の薬剤は、Ｔｉｅ−１阻害剤（例えば、Ｔｉｅ−１結合タンパク質；例えば、ともに２００５年８月９日に出願された米国出願第１１／１９９，７３９号およびＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２８４を参照）とすることができる。別の例として、第２の薬剤は、ＶＥＧＦシグナル伝達経路を標的にし、または負にレギュレートするものとすることができる。この後者のクラスの例には、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）、およびＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ受容体抗体）が含まれる。１つの特に好適な併用は、ベバシズマブを含む。この併用は、５−ＦＵ、およびロイコボリン、および／またはイリノテカンをさらに含むことができる。
さらに、本明細書に記載されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターは、例えば、癌を治療するために、１つまたは複数の上皮成長因子（ＥＧＦ）経路阻害剤と併用して投与することができる。ＥＧＦ経路阻害剤は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、例えば小分子阻害剤（エルロチニブ（例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））もしくはゲフィチニブ（例えば、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））など）など、またはＥＧＦＲに結合する抗体、例えば、セツキシマブ（例えば、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））などとすることができる。この経路の追加の阻害剤には、ＰＤｌ５３０３５、ＳＵ５２７１、およびＺＤｌ８３９が含まれる。いくつかの実施形態では、ＥＧＦ経路阻害剤はエルロチニブである。
用語「併用」は、同じ患者を治療するための２つ以上の薬剤または療法の使用を指し、薬剤または療法の使用または作用は遅れずに重なる。薬剤または療法は、同時に（例えば、患者に投与される単一製剤として、もしくは同時に投与される２つの別個の製剤として）、または任意の順序で順次投与することができる。逐次投与は、異なる時間で投与される投与である。１つの薬剤と別の薬剤の投与の間の時間は、数分、数時間、数日、または数週間とすることができる。本明細書に記載される成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターと併用したＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の使用は、モジュレーターの投与量を低減するため（逆の場合も同様に）、または投与されているさらに別の薬剤に関連する副作用を低減するため、例えば、ベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体の副作用を低減するために使用することができる。したがって、併用は、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質および／または成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの非存在下で使用されるよりも少なくとも１０、２０、３０、または５０％低い投与量で第２の薬剤を投与するステップを含むことができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥおよび成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの併用に加えて、第３の薬剤または療法も、別の抗癌剤または療法となり得る。抗癌剤の非限定例として、例えば、血管新生阻害剤、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、インターカレート剤、シグナル伝達経路を妨害する薬剤、アポトーシスを促進する薬剤、放射線、ならびに他の腫瘍に関連する抗原に対する抗体（裸抗体、免疫毒素、および放射性コンジュゲートを含む）が挙げられる。特定のクラスの抗癌剤の例を以下のように詳細に提供する：血管新生阻害剤、例えば、ＶＥＧＦ阻害剤（例えば、ＶＥＧＦに結合するなどによってＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂ、もしくは−Ｃ）を直接阻害する薬剤（例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）などの抗ＶＥＧＦ抗体）、もしくはラニビズマブ、もしくは他の阻害剤、例えば、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ＮＥＯＶＡＳＴＡＴ（登録商標）、ＡＥ−９４１、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ、およびＰＩ−８８など））を含めたＶＥＧＦ経路アンタゴニスト（ＶＥＧＦシグナル伝達経路を標的にし、もしくは負にレギュレートする薬剤）、ＶＥＧＦ発現のモジュレーター（例えば、ＩＮＧＮ−２４１、経口テトラチオモリブデート、２−メトキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオールナノ結晶分散物、ベバシラニブナトリウム、ＰＴＣ−２９９、Ｖｅｇｌｉｎ）、ＶＥＧＦ受容体の阻害剤（例えば、ＫＤＲもしくはＶＥＧＦ受容体ＩＩＩ（Ｆｌｔ４）、例えば、抗ＫＤＲ抗体、ＶＥＧＦＲ２抗体、例えば、ＣＤＰ−７９１、ＩＭＣ−１１２１Ｂなど、ＣＴ−３２２などのＶＥＧＦＲ２遮断薬）、ＶＥＧＦＲ発現のモジュレーター（例えば、ＶＥＧＦＲ１発現モジュレーターＳｉｒｎａ−０２７）、またはＶＥＧＦ受容体下流シグナル伝達の阻害剤。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニスト薬剤は、ベバシズマブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ＮＥＯＶＡＳＴＡＴ（登録商標）、ＡＥ−９４１、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ、パゾパニブ、バンデタニブ、バタラニブ、セジラニブ、フェンレチニド、スクアラミン、ＩＮＧＮ−２４１、経口テトラチオモリブデート、テトラチオモリブデート、Ｐａｎｚｅｍ ＮＣＤ、２−メトキシエストラジオール、ＡＥＥ−７８８、ＡＧ−０１３９５８、ベバシラニブナトリウム、ＡＭＧ−７０６、アキシチニブ、ＢＩＢＦ−１１２０、ＣＤＰ−７９１、ＣＰ−５４７６３２、ＰＩ−８８、ＳＵ−１４８１３、ＳＵ−６６６８、ＸＬ−６４７、ＸＬ−９９９、ＩＭＣ−１１２１Ｂ、ＡＢＴ−８６９、ＢＡＹ−５７−９３５２、ＢＡＹ−７３−４５０６、ＢＭＳ−５８２６６４、ＣＥＰ−７０５５、ＣＨＩＲ−２６５、ＣＴ−３２２、ＣＸ−３５４２、Ｅ−７０８０、ＥＮＭＤ−１１９８、ＯＳＩ−９３０、ＰＴＣ−２９９、Ｓｉｒｎａ−０２７、ＴＫＩ−２５８、Ｖｅｇｌｉｎ、ＸＬ−１８４、またはＺＫ−３０４７０９；抗チューブリン剤／微小管阻害剤、例えば、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテル；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アムサクリン、エピルビシン、メルバロン、塩酸ピロキサントロン；代謝拮抗剤、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン／Ａｒａ−Ｃ、トリメトレキセート、ゲムシタビン、アシビシン、アラノシン、ピラゾフリン、Ｎ−ホスホルアセチル−Ｌ−アスパレート＝ＰＡＬＡ、ペントスタチン、５−アザシチジン、５−アザ ２’−デオキシシチジン、ａｒａ−Ａ、クラドリビン、５−フルオロウリジン、ＦＵＤＲ、チアゾフリン、Ｎ−［５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル］−Ｌ−グルタミン酸；アルキル化剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ＢＣＮＵ＝カルムスチン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロランブシル、プリカマイシン、ダカルバジン、リン酸イホスファミド、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、ウラシルマスタード、ピポブロマン、４−イポメアノール；他の作用機序を介して作用する薬剤、例えば、ジヒドロレンペロン、スピロムスチン、およびデシペプチド；例えば、インターフェロンなどの抗腫瘍応答を増強するための生物学的応答調節剤；アクチノマイシンＤなどのアポトーシス剤；ならびに抗ホルモン、例えば、タモキシフェンなどの抗エストロゲン、または例えば、４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリドなどの抗アンドロゲンである。
追加の薬剤または療法は、血管破壊剤（ＶＤＡ）とすることもできる。本発明において有用なＶＤＡは、既存の血管系、特に、血管新生に関連する障害（例えば、新生物障害）に関連する異常血管系を破壊する。例示的なＶＤＡとして、コンブレタスタチンおよびコンブレタスタチン関連化合物、コルヒチンおよびコルヒチン関連化合物、フラボン関連化合物、ドラスタチン１０誘導体、他の微小管破壊剤、および異常血管系を標的にする薬剤が含まれる。
コンブレタスタチン関連化合物には、コンブレタスタチンＡ−４リン酸二ナトリウム（ＣＡ４Ｐ）、（Ｚ）−Ｎ−［２−メトキシ−５−［２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ビニル］フェニル］−Ｌ−セリンアミド塩酸塩（ＡＶＥ８０６２、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）などのコンブレタスタチン類似体、およびＣＡ−１−Ｐ（ＯＸＩ４５０３、Ｏｘｉｇｅｎｅとしても公知である）などのコンブレタスタチンＡ−１プロドラッグが含まれる。
コルヒチン関連化合物には、Ｎ−アセチルコルキノール（５Ｓ）−５−（アセチルアミノ）−９，１０，１１−トリメトキシ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｃ］シクロヘプテン−３−イル リン酸二水素塩（ＺＤ６１２６、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が含まれる。
フラボン関連化合物には、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ、ＡＳ１４０４、Ａｎｔｉｓｏｍａとしても公知である）などのフラボン酢酸（ＦＡＡ）およびＦＡＡの三環式類似体が含まれる。
ドラスタチン１０関連化合物には、ソブリドチン（Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル）−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−メトキシ−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−［（２−フェニルエチル）］アミノ］プロピル］−１−ピロリジニル］−１−［（Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソブチル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド、ＴＺＴ１０２７としても公知である）が含まれる。
追加のＶＤＡには、ＢＮＣ１０５（Ｂｉｏｎｏｍｉｃｓ Ｌｔｄ．）、および微小管破壊剤、例えば、ＭＰＣ−６８２７（Ｍｙｒｉａｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＣＹＴ９９７（Ｃｙｔｏｐｉａ Ｌｔｄ．）が含まれる。
併用療法は、他の療法の副作用を低減する薬剤を投与するステップを含むことができる。この薬剤は、抗癌治療の副作用を低減する薬剤とすることができる。例えば、この薬剤はロイコボリンであってもよい。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質、または本明細書に記載される他の結合タンパク質、および成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを含む併用療法はまた、別の血管新生に関連する障害（例えば、癌以外の障害、例えば、望まれない内皮細胞増殖、または望ましくない炎症、例えば、関節リウマチを含む障害）を有するか、またはこれらのリスクのある対象を治療するのに使用することができる。
診断上の使用
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥに結合し、本明細書に記載される方法によって同定され、かつ／または本明細書に詳述されるタンパク質は、インビトロおよびインビボで診断上の有用性を有する。本明細書に記載されるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質（例えば、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥに結合し、これを阻害するタンパク質、またはＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥに結合するが、これを阻害しないタンパク質）は、例えば、ＩＧＦ−ＩＩおよび／もしくはＩＧＦ−ＩＩＥが活性である疾患もしくは状態、例えば、本明細書に記載される疾患もしくは状態を治療する過程の間、または本明細書に記載される疾患もしくは状態を診断する際に、インビボで画像化するために使用することができる。
一態様では、本開示は、インビトロまたはインビボでＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥの存在を検出する（例えば、対象におけるインビボ画像化）ための診断法を提供する。この方法は、対象内または対象に由来する試料内でＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥを局在化させるステップを含むことができる。試料評価に関して、この方法は、例えば、（ｉ）試料をＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質と接触させるステップと、（ｉｉ）試料中のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の位置を検出するステップとを含むことができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、試料中のＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥの発現の定性的または定量的レベルを求めるのに使用することもできる。この方法は、参照試料（例えば、対照試料）を結合タンパク質と接触させるステップ、および参照試料の対応する評価を求めるステップも含むことができる。変化、例えば、対照の試料または対象と比較した、試料または対象における複合体の形成の統計的に有意な変化は、試料中にＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥが存在することを示すことができる。一実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、別のメタロプロテイナーゼと交差反応しない。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、インビボで腫瘍を画像化するのにも有用である。より良好な臨床的エンドポイントには、酵素機能を遮断するように設計される薬物の有効性をモニターする必要がある（Ｚｕｃｋｅｒら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７巻：６５５〜６５６頁）。標識されたＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を使用してインビボで腫瘍を画像化することは、癌の診断、術中の腫瘍検出、ならびに薬物送達および腫瘍生理機能の研究のために、結合タンパク質の送達を腫瘍に標的とするのに役立つことができるであろう。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、侵襲性部位において、インビボで天然の酵素活性をモニターするのに使用することができる。別の例示的な方法は、（ｉ）ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を対象に投与するステップと、（ｉｉｉ）対象におけるＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質の位置を検出するステップとを含む。検出ステップは、複合体形成の位置または時間を求めるステップを含むことができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、検出可能な物質で直接または間接的に標識することによって、結合抗体または非結合抗体の検出を促進することができる。適当な検出可能な物質として、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセンス物質、および放射性物質が含まれる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質とＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥとの複合体形成は、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥに結合した結合タンパク質、または非結合の結合タンパク質を評価することによって検出することができる。従来の検出アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または組織の免疫組織化学を使用することができる。さらに、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を標識するために、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥの存在を、検出可能な物質で標識された標準物質、および非標識のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を利用する競合イムノアッセイによって、試料中でアッセイすることができる。このアッセイの一例では、生体試料、標識された標準物質、およびＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質が混合され、非標識の結合タンパク質に結合した標識された標準物質の量が求められる。試料中のＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥの量は、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質に結合した標識された標準物質の量に反比例する。
フルオロフォアおよび発色団で標識されたタンパク質を調製することができる。抗体および他のタンパク質は、最大約３１０ｎｍの波長を有する光を吸収するので、蛍光性部分は、３１０ｎｍを超え、好ましくは４００ｎｍを超える波長で実質的な吸収を有するように選択されるべきである。様々な適当な蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）および発色団は、Ｓｔｒｙｅｒ、１９６８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ １６２巻：５２６頁、およびＢｒａｎｄ， Ｌ．ら、１９７２年、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４１巻：８４３〜８６８頁によって記載されている。米国特許第３，９４０，４７５号、同第４，２８９，７４７号、および同第４，３７６，１１０号に開示されているものなどの従来の手順によって、タンパク質を蛍光性発色団基で標識することができる。上述したいくつかの望ましい特性を有する蛍光物質の１つの基は、キサンテン色素であり、これには、フルオレセインおよびローダミンが含まれる。蛍光化合物の別の基は、ナフチルアミンである。フルオロフォアまたは発色団で標識された後、タンパク質は、例えば、蛍光顕微鏡観察（共焦点またはデコンボリューション顕微鏡観察など）を使用して、試料中のＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥの存在または局在化を検出するのに使用することができる。
組織分析。本明細書に記載されるタンパク質を使用して、免疫組織化学を実施することができる。例えば、抗体の場合では、抗体は、標識（精製またはエピトープタグなど）を用いて合成することができ、または例えば、標識もしくは標識結合基を結合させることによって、検出可能な程度に標識することができる。例えば、キレーターを抗体に結合させることができる。次いで抗体は、組織標本、例えば、顕微鏡スライド上にある固定された組織切片に接触させられる。結合のためにインキュベートした後、標本は、非結合抗体を除去するために洗浄される。次いで標本は、例えば、顕微鏡観察を使用して分析されることによって、抗体が標本に結合しているかどうかが識別される。
もちろん、抗体（または他のポリペプチドもしくはペプチド）は、結合時に非標識であってもよい。結合および洗浄後に、抗体は、これを検出可能にするために標識される。
タンパク質アレイ。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、タンパク質アレイ上で固定化することもできる。タンパク質アレイは、例えば、医学的試料（単離された細胞、血液、血清、生検など）をスクリーニングするために診断ツールとして使用することができる。もちろん、タンパク質アレイは、例えば、ＩＧＦ−ＩＩおよび／もしくはＩＧＦ−ＩＩＥ、または他の標的分子に結合する他の結合タンパク質も含むことができる。
ポリペプチドアレイを作製する方法は、例えば、Ｄｅ Ｗｉｌｄｔら、２０００年、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８巻：９８９〜９９４頁；Ｌｕｅｋｉｎｇら、１９９９年、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０巻：１０３〜１１１頁；Ｇｅ、２０００年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８、ｅ３、Ｉ〜ＶＩＩ；ＭａｃＢｅａｔｈおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、２０００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９巻：１７６０〜１７６３頁；ＷＯ０１／４０８０３およびＷＯ９９／５１７７３Ａ１に記載されている。アレイのためのポリペプチドは、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓまたはＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓからの市販のロボット装置（ａｐｐａｒａｔｉ）を使用して高速でスポットすることができる。アレイ基質は、例えば、ニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば、表面修飾ガラスとすることができる。アレイは、多孔質基質、例えば、アクリルアミド、アガロース、または別のポリマーも含むことができる。
例えば、アレイは、Ｄｅ Ｗｉｌｄｔ、上記に記載されているように抗体のアレイとすることができる。タンパク質を産生する細胞は、アレイ形式でフィルター上に成長させることができる。ポリペプチド産生が誘導され、発現されたポリペプチドは、細胞の位置でフィルターに固定化される。タンパク質アレイを標識された標的と接触させることによって、各固定化されたポリペプチドへの結合の程度を求めることができる。アレイの各アドレスで結合する程度についての情報は、例えば、コンピューターデータベース中に、プロファイルとして記憶させることができる。タンパク質アレイは、反復して作製し、例えば、標的および非標的の結合プロファイルを比較するのに使用することができる。
ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分類）。ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、細胞、例えば、試料（例えば、患者試料）中の細胞を標識するのに使用することができる。結合タンパク質は、蛍光化合物にも結合される（または結合可能である）。次いで、細胞は、蛍光活性化細胞分類装置を使用して（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡから入手可能な分類装置を使用して；米国特許第５，６２７，０３７号、同第５，０３０，００２号、および同第５，１３７，８０９号を参照）分類することができる。細胞が分類装置を通過する際、レーザー光線が蛍光化合物を励起する一方で、検出器は、蛍光を検出することによって、通過する細胞をカウントし、蛍光化合物が細胞に結合しているかどうかを判定する。各細胞に結合した標識の量を定量化および分析することによって、試料を特徴づけることができる。
分類装置は、細胞の向きをそらし、結合タンパク質によって結合されていない細胞から、結合タンパク質によって結合された細胞を分離することができる。分離された細胞は、培養し、かつ／または特徴づけることができる。
インビボ画像化。インビボでＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥを発現する組織の存在を検出する方法も特徴とする。この方法は、（ｉ）検出可能なマーカーに結合した抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ抗体を、対象（例えば、癌（例えば、転移性癌、例えば、転移性乳癌）を有する患者）に投与するステップと、（ｉｉ）ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥを組織または細胞に対する前記検出可能なマーカーを検出する手段に対象を曝すステップとを含む。例えば、対象は、例えば、ＮＭＲまたは他の断層撮影手段によって画像化される。
画像診断に有用な標識の例として、放射標識、例えば、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、および１８８Ｒｈなど、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、核磁気共鳴活性の標識、ポジトロン放出断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナーによって検出可能なポジトロン放出同位体、ルシフェリンなどの化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、ならびにペルオキシダーゼまたはホスファターゼなどの酵素マーカーが挙げられる。短距離検出器プローブによって検出可能な同位体などの短距離放射線エミッターも使用することができる。タンパク質は、そのような試薬で標識することができる。例えば、抗体の放射標識に関係する技法についてのＷｅｎｓｅｌおよびＭｅａｒｅｓ、１９８３年、Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ならびにＤ． Ｃｏｌｃｈｅｒら、１９８６年、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １２１巻：８０２〜８１６頁を参照。
結合タンパク質は、放射性同位体（例えば、１４Ｃ、３Ｈ、３５Ｓ、１２５Ｉ、３２Ｐ、１３１Ｉ）で標識することができる。放射標識された結合タンパク質は、診断検査、例えば、インビトロアッセイに使用することができる。同位体で標識された結合タンパク質の比活性は、半減期、放射性標識の同位体の純度、および標識が抗体組み込まれる方法に依存する。
放射標識された結合タンパク質の場合では、結合タンパク質は、患者に投与され、結合タンパク質が反応する抗原を有する細胞に局在化され、例えば、γカメラまたは放出断層撮影を使用する放射性核走査などの公知の技法を使用してインビボで検出または「画像化」される。例えば、Ａ．Ｒ． Ｂｒａｄｗｅｌｌら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍａｇｉｎｇ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒ．Ｗ． Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、６５〜８５頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５年）を参照。あるいは、放射標識がポジトロン（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、および１３Ｎ）を放出する場合、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに位置したＰｅｔ ＶＩと呼ばれるものなどのポジトロン放出横断断層撮影スキャナーを使用することができる。
ＭＲＩ造影剤。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、生体の内部特徴を視覚化するのにＮＭＲを使用し、予後、診断、治療、および手術に有用である。ＭＲＩは、明白な利点として、放射性トレーサー化合物を用いることなく使用することができる。いくつかのＭＲＩ技法は、ＥＰ−Ａ−０５０２８１４において要約されている。一般に、様々な環境における水プロトンの緩和時定数Ｔ１およびＴ２に関係する差が、画像を作製するのに使用される。しかし、これらの差は、はっきりした高分解能画像をもたらすのに不十分である場合がある。
これらの緩和時定数の差は、造影剤によって増強することができる。そのような造影剤の例には、いくつかの磁性剤、常磁性剤（これらは主にＴ１を変化させる）、および強磁性体または超常磁性体（これらは主にＴ２応答を変化させる）が含まれる。キレート（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、およびＮＴＡキレート）は、いくつかの常磁性の物質（例えば、Ｆｅ＋３、Ｍｎ＋２、Ｇｄ＋３）を結合する（かつ、これらの毒性を低減する）のに使用することができる。他の薬剤は、例えば、直径が１０ｍｍ未満〜１０ｎＭの粒子の形態とすることができる。粒子は、強磁性、反強磁性、または超常磁性特性を有していてもよい。粒子として、例えば、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−Ｆｅ２Ｏ３、フェライト、および遷移元素の他の磁性鉱物化合物を挙げることができる。磁性粒子は、非磁性物質を有する、および有さない１つまたは複数の磁性結晶を含むことができる。非磁性物質は、合成または天然ポリマー（セファロース、デキストラン、デキストリン、デンプンなど）を含むことができる。
ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、ＮＭＲ活性の１９Ｆ原子、または複数のそのような原子を含有する指示基で標識することもでき、その理由は、（ｉ）実質的にすべての天然に豊富なフッ素原子は、１９Ｆ同位元素であり、したがって、実質的にすべてのフッ素含有化合物は、ＮＭＲ活性であり、（ｉｉ）トリフルオロ酢酸無水物（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）などの多くの化学的に活性なポリフッ素化化合物は、比較的低価格で市販されており、（ｉｉｉ）ヘモグロビンの代替として酸素を搬送するのに利用されるペルフッ素化ポリエーテルなど、ヒトにおいて使用することが医学的に許容されることが判明しているからである。インキュベーションのそのような時間の機会を与えた後、ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥを発現する組織を位置づけ、画像化するために、Ｐｙｋｅｔｔ、１９８２年、Ｓｃｉ． Ａｍ． ２４６巻：７８〜８８頁によって記載されたものの１つなどの装置を使用して全身ＭＲＩが実施される。
本発明を、以下の実施例によってさらに例示するが、これらは、限定的であると決して解釈されるべきではない。本願全体にわたって引用されるすべての参考文献、係属中の特許出願、および公開特許の内容は、参照により明白に本明細書に組み込まれている。
（実施例１）
ライブラリーからの抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ抗体の選択、およびスクリーニング
Ｆａｂをディスプレイするファージを、ストレプトアビジン磁気ビーズと接触させて最初に配置することによって、ストレプトアビジンビーズに結合し得るものを枯渇させた。次いで結合していないファージを、ストレプトアビジン磁気ビーズ上に固定化したビオチン化ＩＧＦ−ＩＩＥ（アミノ酸１〜１０４）と接触させて配置した。非結合ファージを洗い流し、結合したファージを有するビーズをＥ． ｃｏｌｉ細胞とともに配置してファージを増殖させた。増殖したファージを、枯渇目的で、ストレプトアビジン磁気ビーズ、およびストレプトアビジンビーズ上に固定化されたビオチン化ＩＧＦ−Ｉと接触させて配置した。非結合ファージを、以前と同様に、ストレプトアビジン磁気ビーズ上に固定化されたビオチン化ＩＧＦ−ＩＩＥ（アミノ酸１〜１０４）と接触させて配置した。非結合ファージを洗い流し、処理した全体をもう１サイクル繰り返した。次いで遺伝子ＩＩＩ除去（ｇｅｎｅ ＩＩＩ ｒｅｍｏｖａｌ）を、増殖して産生されたファージ上で実施した。次いで、標的としてＩＧＦ−ＩＩＥ（アミノ酸１〜１０４）、ＩＧＦ−ＩＩ（アミノ酸１〜６７）、ＩＧＦ−Ｉ、およびストレプトアビジンを使用してｓＦａｂ ＥＬＩＳＡを実施した。次いで、ＩＧＦ−ＩＩＥおよびＩＧＦ−ＩＩに結合しているが、ＩＧＦ−Ｉまたはストレプトアビジンに結合していないｓＦａｂを追求した。以下の物質および方法を使用して、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥに刺激されたＢａ／Ｆ３細胞増殖に対する阻害について、ｓＦａｂをスクリーニングした。
細胞培養および物質：
Ｂａ／Ｆ３細胞を、完全培地（９０％のＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３＋２ｍＭのＬ−アラニル−グルタミン＋１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で培養した。継代６〜１５代の細胞を、ハイスループット細胞増殖アッセイに使用した。ＩＧＦ−ＩＩ（６７ａａ）、ＩＧＦ−ＩＩＥ（１０４ａａ）は、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌであり、−７０℃で維持した。ＩＬ−４は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号：４０４−ＭＬから購入し、抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号：ＭＡＢ２９２から購入した。すべてＰＢＳ中の、中間規模の精製でのバッチ１およびバッチ２からの３４のｓＦａｂをスクリーニングした。
スクリーニング手順：
ＰＢＳ中で、ＩＧＦ−ＩＩを４００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＩＧＦ−ＩＩＥを８００ｎｇ／ｍｌで、ｓＦａｂを２００μｇ／ｍｌで調製した。ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥ ２５μｌを、５０μｌ／ウェルの全量で、室温で３０分間、各ｓＦａｂについて３通り、９６ウェルプレート中のｓＦａｂ ２５μｌとともにプレインキュベートした。細胞を以下のように調製した：
○１１００ｒｐｍで５分間遠心することによって、Ｂａ／Ｆ３細胞を収集する。
○上澄を除去し、ＰＢＳ ２０ｍｌ中で細胞を再懸濁する。
○細胞懸濁液１０μｌを、トリパンブルー溶液１０μｌと混合することによって細胞密度を計数し、血球計数器に１０μｌを装填して細胞密度および生存能を計数する。
○１１００ｒｐｍで５分間、細胞をＰＢＳ溶液から遠心沈殿する。
○上澄を除去し、２×１０６細胞／ｍｌでＩＬ−３を含まない培地中で細胞を再懸濁する。
○準備した９６ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液２５μｌを添加して、５×１０４細胞／ウェルの最終細胞密度にする。
○ＩＬ−３を含まない培地中２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４ ２５μｌを各ウェルに添加して、最終濃度を５０ｎｇ／ｍｌにする。
○全量は、１ウェル当たり１００μｌである。陽性対照として５０μｇ／ｍｌのＲ＆Ｄからの中和抗体；陰性対照として処置なし。ｓＦａｂの最終濃度：５０μｇ／ｍｌ（１μＭ）
○プレートを３７℃、５％のＣＯ２で、７２時間インキュベートする。
ＭＴＳアッセイは、以下のように実施した：
●各ウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ２０μｌを添加する
●３７℃、５％のＣＯ２で、さらに４時間インキュベートする。
●波長４９０ｎｍで、マイクロプレート分光光度計でプレートの吸光度を読み取る。
第１のバッチからの２つのＦａｂおよび第２のバッチからの６つのＦａｂが、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥで刺激されるＢａ／Ｆ３細胞増殖の両方に対して著しい阻害効果を示した。これらの８つのＦａｂ、すなわちＭ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００７２−Ｇ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、Ｍ００７０ Ｈ０８、Ｍ００６４−Ｅ０４、およびＭ００６３−Ｆ０２を、ＩＣ５０決定のためにさらに評価した。
（実施例２）
抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ ＦａｂのＩＣ５０決定
ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥで刺激されるＢａ／Ｆ３細胞増殖に対する阻害についての８つのｓＦａｂのＩＣ５０値を、以下のように求めた：
細胞培養および物質：
Ｂａ／Ｆ３細胞を、完全培地（９０％のＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３＋２ｍＭのＬ−アラニル−グルタミン＋１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で培養した。継代２４代の細胞を、細胞増殖アッセイに使用した。ＩＧＦ−ＩＩ（６７ａａ）、ＩＧＦ−ＩＩＥ（１０４ａａ）は、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌであり、−７０℃で維持した。ＩＬ−４は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号：４０４−ＭＬから購入し、抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号：ＭＡＢ２９２から購入した。実施例１からの８つのｓＦａｂを、ＰＢＳ中で中間規模の精製にかけた。
手順：
●ＰＢＳ中で、ＩＧＦ−ＩＩを４００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＩＧＦ−ＩＩＥを８００ｎｇ／ｍｌで、ｓＦａｂを２００μｇ／ｍｌで調製する。
●９６ウェルプレート中で、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥ ２５μｌを、１：２の連続希釈したｓＦａｂ ２５μｌ（５０μｇ／ｍｌから０まで）とともに、各ｓＦａｂの各用量について３通りプレインキュベートし、５０μｌ／ウェルの全量で、室温で３０分間インキュベートする。
●細胞の調製：
○１１００ｒｐｍで５分間遠心することによって、Ｂａ／Ｆ３細胞を収集する。
○上澄を除去し、ＰＢＳ ２０ｍｌ中で細胞を再懸濁する。
○細胞懸濁液１０μｌを、トリパンブルー溶液１０μｌと混合することによって細胞密度を計数し、血球計数器に１０μｌを装填して細胞密度および生存能を計数する。
○１１００ｒｐｍで５分間、細胞をＰＢＳ溶液から遠心沈殿する。
○上澄を除去し、２×１０６細胞／ｍｌでＩＬ−３を含まない培地中で細胞を再懸濁する。
○準備した９６ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液２５μｌを添加して、５×１０４細胞／ウェルの最終細胞密度にする。
○ＩＬ−３を含まない培地中２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４ ２５μｌを各ウェルに添加して、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌにする。
○全量は、１ウェル当たり１００μｌである。
○プレートを３７℃、５％のＣＯ２で、７２時間インキュベートする。
ＭＴＳアッセイ：
●各ウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ２０μｌを添加する
●３７℃、５％のＣＯ２で、さらに４時間インキュベートする。
●波長４９０ｎｍで、マイクロプレート分光光度計でプレートの吸光度を読み取る。
抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＩＥ ｓＦａｂの阻害効果を、用量依存様式で、細胞増殖に対して８つのＦａｂのうちの６つのＦａｂについて観察し、ＩＣ５０値を表２に示した。ＩＧＦ−ＩＩＥで刺激される細胞増殖において、Ｆａｂ ７２Ｅ０３はいくらかの阻害を示したが他ほど有意ではなかった。７２Ｅ０３のＩＣ５０値は、効力が低いために計算しなかった。Ｆａｂ ７０Ｈ０８は、有意な阻害を示さなかった。
ＩＧＦ−Ｉで刺激される細胞増殖に対して、５０μｇ／ｍｌで、ほとんどのｓＦａｂの阻害効果が観察された。Ｎｅｕ−ＩＧＦ−Ｉ抗体は強力な阻害を示した；Ｎｅｕ−ＩＧＦ−ＩＩ抗体、および７０Ｈ０８を除くすべての他のｓＦａｂも、約３０％の阻害を示した。
結論として、６つのｓＦａｂ（Ｍ００７２−Ｇ０６、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０、Ｍ００６８−Ｅ０３、およびＭ００７２−Ｃ０６）は、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥで刺激されるＢａ／Ｆ３細胞増殖の両方に対して有意な阻害効果を実証した。さらに、Ｍ００７０−Ｈ０８を除くすべての可溶性Ｆａｂは、５０μｇ／ｍｌで、ＩＧＦ−Ｉで刺激される細胞増殖に対して多少の阻害（約３０％）を示した。
（実施例３）
抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ ＦａｂのＤＮＡおよびアミノ酸配列
ヒトＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥの両方に結合する例示的なＦａｂを上述のように同定し、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、およびＭ００７２−Ｇ０６と命名した。
これらのＦａｂ軽鎖可変領域（ＬＶ）、軽鎖定常領域（ＬＣ）、重鎖可変領域（ＨＶ）、および重鎖定常領域（ＨＣ）のＤＮＡ配列を表３に示す：
そのＤＮＡ配列を表３に提供した、ヒトＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥに結合し、これらを阻害する例示的なＦａｂ ＬＶ、ＬＣ、ＨＶおよびＨＣ領域のアミノ酸配列を表４に示す：
（実施例４）
抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ ＩｇＧの生殖系列化および産生
２つのＩｇＧを生殖系列化した。この２つは、ＶＫ１＿０２ ＤＰＫ９／０２に由来した。Ｍ００６４−Ｅ０４は、全体で４つの変化を必要とし、軽鎖において３つが適切であり、ＪＫ５において１つが適切であり、Ｍ００６４−Ｆ０２は、軽鎖において適切であり、ＪＫ１において適切なものはない、３つの変化を必要とした。
生殖系列化において行われるアミノ酸変化を以下に例示する：
（実施例５）
選択された抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ ＦａｂおよびＩｇＧの親和性測定
（実施例６）
選択された抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ ＩｇＧのＩＣ５０決定
Ｍ００６３−Ｆ０２
この試験の目的は、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥで刺激されるＢａ／Ｆ３細胞増殖に対するその阻害、およびＩＣ５０決定のために、Ｍ００６３−Ｆ０２ ＩｇＧ（親）の大量生成を試験することであった。
細胞培養および物質：
Ｂａ／Ｆ３細胞を、完全培地（９０％のＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３＋２ｍＭのＬ−アラニル−グルタミン＋１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で培養した。継代４１代の細胞を、細胞増殖アッセイに使用した。ＩＧＦ−ＩＩ（６７ａａ）、ＩＧＦ−ＩＩＥ（１０４ａａ）は、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌであり、−７０℃で維持した。ＩＬ−４は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号：４０４−ＭＬから購入し、抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号：ＭＡＢ２９２から購入した。ＩｇＦ Ｍ００６３−Ｆ０２は６．１ｍｇ／ｍｌであった。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ、カタログ番号４０００−００４１を購入した。
手順：
●ＰＢＳ中で、ＩＧＦ−ＩＩを４００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＩＧＦ−ＩＩＥを８００ｎｇ／ｍｌで、ＩｇＧを１２０μｇ／ｍｌで調製する。
●９６ウェルプレート中で、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥ ２５μｌを、連続希釈したＩｇＧ ２５μｌ（３０μｇ／ｍｌから０までの最終濃度）とともに、各用量について３通り、５０μｌ／ウェルの全量で、室温で３０分間プレインキュベートする。
●細胞の調製：
○１１００ｒｐｍで５分間遠心することによって、Ｂａ／Ｆ３細胞を収集する。
○上澄を除去し、ＰＢＳ ２０ｍｌ中で細胞を再懸濁する。
○細胞懸濁液１０μｌを、トリパンブルー溶液１０μｌと混合することによって細胞密度を計数し、血球計数器に１０μｌを装填して細胞密度および生存能を計数する。
○１１００ｒｐｍで５分間、細胞をＰＢＳ溶液から遠心沈殿する。
○上澄を除去し、４×１０５細胞／ｍｌでＩＬ−３を含まない培地中で細胞を再懸濁する。
○準備した９６ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液２５μｌを添加して、１×１０４細胞／ウェルの最終細胞密度にする。
○ＩＬ−３を含まない培地中２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４ ２５μｌを各ウェルに添加して、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌにする。
○全量は、１ウェル当たり１００μｌである。
○プレートを３７℃、５％のＣＯ２で、４８時間インキュベートする。
Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ：
●９６ウェルプレートを遠心し、Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬２００μｌ中に細胞を再懸濁し、混合し、５分間インキュベートする。丸底９６ウェルプレート中に移す。
●Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ分析。
●Ｓｉｇｍａｐｌｏｔで以下の式を使用することによってＩＣ５０を計算する：
ｆ＝ｙ０−（（ａ＊ｘ）／（ＩＣ５０＋ｘ））。
Ｍ００６３−Ｆ０２ ＩｇＧは、用量依存様式で、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥで刺激されるＢａ／Ｆ３増殖に対する阻害を実証した。Ｍ００６３−Ｆ０２ ＩｇＧは、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥで刺激される細胞増殖の両方を阻害し、ＩＣ５０値は、それぞれ２および０．８５ｎＭであった。
Ｍ００６４−Ｅ０４ ＩｇＧおよびＭ００６３−Ｆ０２ ＩｇＧ（親）：
この試験の目的は、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥで刺激されるＢａ／Ｆ３細胞増殖に対する阻害およびＩＣ５０値の比較のために２つのＩｇＧ候補を試験することであった。
細胞培養および物質：
Ｂａ／Ｆ３細胞を、完全培地（９０％のＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３＋２ｍＭのＬ−アラニル−グルタミン＋１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で培養した。継代２２代の細胞を、増殖アッセイに使用した。
ＩＧＦ−ＩＩ（６７ａａ）、ＩＧＦ−ＩＩＥ（１０４ａａ）は、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌであり、−７０℃で維持した。ＩＬ−４は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号：４０４−ＭＬから購入し、抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号：ＭＡＢ２９２から購入した。抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体：Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号：ＭＡＢ２９２。
手順：
●ＰＢＳ中で、ＩＧＦ−ＩＩを４００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＩＧＦ−ＩＩＥを８００ｎｇ／ｍｌで、ＩｇＧを２００μｇ／ｍｌで調製する。
●９６ウェルプレート中で、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥ ２５μｌを、１：２の連続希釈したＩｇＧ ２５μｌ（５０μｇ／ｍｌから０まで）とともに、各用量について３通りプレインキュベートし、５０μｌ／ウェルの全量で、室温で３０分間インキュベートする。
●細胞の調製：
○１１００ｒｐｍで５分間遠心することによって、Ｂａ／Ｆ３細胞を収集する。
○上澄を除去し、ＰＢＳ ２０ｍｌ中で細胞を再懸濁する。
○細胞懸濁液１０μｌを、トリパンブルー溶液１０μｌと混合することによって細胞密度を計数し、血球計数器に１０μｌを装填して細胞密度および生存能を計数する。
○１１００ｒｐｍで５分間、細胞をＰＢＳ溶液から遠心沈殿する。
○上澄を除去し、２×１０６細胞／ｍｌで、ＩＬ−３を含まない培地中で細胞を再懸濁する。
○準備した９６ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液２５μｌを添加して、５×１０４細胞／ウェルの最終細胞密度にする。
○ＩＬ−３を含まない培地中２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４ ２５μｌを各ウェルに添加して、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌにする。
○全量は、１ウェル当たり１００μｌである。
○プレートを３７℃、５％のＣＯ２で、４８時間インキュベートする。
Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ：
●９６ウェルプレートの各ウェルを混合し、各ウェルからの細胞試料２０μｌを新しい９６ウェルプレートに移し、Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬１８０μｌを各ウェルに添加し、混合し、５分間インキュベートする。
●Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ分析。
両ＩｇＧｓは、用量依存様式で、ＩＧＦ−ＩＩ；ＩＧＦ−ＩＩＥで刺激されるＢａ／Ｆ３増殖に対する阻害を実証した。いずれのＩｇＧもＩＧＦ−Ｉで刺激される細胞増殖に対して有意な効果を示さなかった。Ｍ００６３−Ｆ０２ ＩｇＧは、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥで刺激される細胞増殖の両方を阻害し、ＩＣ５０値はそれぞれ約７および１０ｎＭであり、Ｍ００６４−Ｅ０４ ＩｇＧは、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥで刺激される細胞増殖の両方を阻害し、ＩＣ５０値はそれぞれ約１９および１３０ｎＭであった。
（実施例７）
抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を使用するインビトロ試験
ＭＣＦ−７細胞中のＩＧＦ−１Ｒリン酸アッセイ
本発明者らは、ＭＣＦ−７細胞株中のＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥで誘導されるＩＧＦ−１Ｒリン酸化に対するＭ００６３−Ｆ０２ ＩｇＧ（親）の阻害効果を試験した。
ＭＣＦ−７：乳癌細胞株細胞を、１０％のＦＢＳ、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、１ｍＭのＮａピルビン酸、０．０１ｍｇ／ｍｌのウシインスリン、および１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むＭＥＭ培地中で培養した。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ、カタログ番号０５−６５６から購入し、抗ホスホ−ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．カタログ番号３０２４から購入した。ＭＣＦ−７（Ｐ１５）は、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーターで、１×１０６細胞／ウェルで、６ウェルプレート中の完全培地中で一晩培養した。次いで細胞を、基本ＭＥＭ培地を用いて６時間飢餓させ、以下のようにバッチで処理した：
１．処理なし
２．細胞を、１０ｎＭのＩＧＦ−ＩＩで２０分間処理した
３．細胞を、１０ｎＭのＩＧＦ−ＩＩＥで２０分間処理した
４．細胞を、４０ｎＭのＭ００６３−Ｆ０２ ＩｇＧで３０分間前処理し、次いでＩＧＦ−ＩＩ １０ｎＭを２０分かけて添加した
５．細胞を、４０ｎＭのＭ００６３−Ｆ０２ ＩｇＧで３０分間前処理し、次いでＩＧＦ−ＩＩＥ １０ｎＭを２０分かけて添加した
６．Ｍ００６３−Ｆ０２ ４０ｎＭをＩＧＦ−ＩＩ １０ｎＭと３０分間予混合し、次いで細胞に添加した
７．Ｍ００６３−Ｆ０２ ４０ｎＭをＩＧＦ−ＩＩＥ １０ｎＭと３０分間予混合し、次いで細胞に添加した
８．Ｆ０２ ４０ｎＭ、ＩＧＦ−ＩＩ １０ｎＭを同時に細胞に添加し、２０分間処理した
９．Ｍ００６３−Ｆ０２ ４０ｎＭ、ＩＧＦ−ＩＩＥ １０ｎＭを同時に細胞に添加し、２０分間処理した
１０．細胞を、４０ｎＭのＡ０２ ＩｇＧで３０分間前処理し、次いでＩＧＦ−ＩＩ １０ｎＭを２０分かけて添加した
１１．細胞を、４０ｎＭのＡ０２ ＩｇＧで３０分間前処理し、次いでＩＧＦ−ＩＩＥ １０ｎＭを２０分かけて添加した
細胞を、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｖａｎａｄａｔｅ）を含有する氷冷ＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＲＩＰＡ緩衝液１ｍｌで溶解させ、氷上で１０分間インキュベートした。溶解産物を、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心することによって、細胞残骸を除去した。細胞可溶化物を、２μｇ／ｍｌの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、アガロースビーズ２０μｌを用いて、４℃で一晩免疫沈降させ、免疫沈降物を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液１ｍｌで３回洗浄した。２×電気泳動試料緩衝液１２μｌを添加した。
ウエスタンブロッティング：試料を７０℃で、水浴で１０分間加熱し、次いで試料を１５ウェル、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル中に装填した。溶解したタンパク質を０．４５μｍのＰＶＤＦ膜に移した。この膜を、５％のＢＳＡ−ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）を用いて室温で１時間ブロックし、３％のＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔ中１：１０００の希釈で、４０℃で一晩、抗ホスホ−ＩＧＦ−１Ｒ Ａｂを用いてプローブした（ｒｏｂｅｄ）。この膜をＰＢＳで３回洗浄した。引き続いて、ブロットを、３％のＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔ中１：５０００の希釈で、室温で１時間、抗ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰを用いてプローブし、ＰＢＳで３回洗浄した。このブロットを、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ １８５９０２２＆２３）を用いて展開した。膜をストリッピングし、室温で１時間、５％のＢＳＡ−ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）を用いてブロックした。これを、３％のＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔ中１：３０００の希釈で、４０℃で一晩、抗ＩＧＦ−１Ｒ Ａｂを用いてプローブした。この膜をＰＢＳで３回洗浄した。引き続いて、ブロットを、３％のＢＳＡ−ＰＢＳＴ中１：５０００の希釈で、室温で１時間、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを用いてプローブし、ＰＢＳで３回洗浄した。このブロットを、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ １８５９０２２＆２３）を用いて展開した。
予備結果は、血清のない条件下で、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥでＭＣＦ−７細胞を刺激することにより、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化が誘導されることを実証した。４０ｎＭのＭ００６３−Ｆ０２ ＩｇＧは、ＭＣＦ−７細胞中のＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥで誘発されるＩＧＦ−１Ｒリン酸化の両方に対する阻害効果を示した。同様の阻害活性が、３つの異なるプロトコール、すなわち、細胞の抗体とのプレインキュベーション、抗体とＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥとの予混合、ならびに細胞へのＩＧＦ−ＩＩ／ＩＩＥおよび抗体の同時添加において観察された。ＩｇＧ対照としてのＡ０２は、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥで誘発されるＩＧＦ−１Ｒリン酸化に対する効果をまったく示さなかった。
ＩＧＦ−１Ｒリン酸化アッセイにおけるＭ００６４−Ｅ０４およびＭ００６４−Ｆ０２ＩｇＧの比較
本発明者らは、ＭＣＦ−７細胞株中のＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＩＧＦ−ＩＩＥで誘発されるＩＧＦ−１Ｒのリン酸化に対するＭ００６４−Ｆ０２およびＭ００６４−Ｅ０４ ＩｇＧの比較による阻害効果を試験した。
ＭＣＦ−７乳癌細胞株細胞を、１０％のＦＢＳ、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、１ｍＭのＮａピルビン酸、０．０１ｍｇ／ｍｌのウシインスリン、および１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むＭＥＭ培地中で培養した。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ、カタログ番号０５−６５６から購入し、抗ホスホ−ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．カタログ番号３０２４から購入した。ＭＣＦ−７（Ｐ２０）は、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーターで、１×１０６細胞／ウェルで、６ウェルプレート中の完全培地中で一晩収集し、播種した。次いで細胞を、基本ＭＥＭ培地を用いて６時間飢餓させた。細胞を、以下のようにバッチで処理した：
●処理なし
●細胞を、１０ｎＭのＩＧＦ−ＩＩで２０分間処理した
●細胞を、ＩＧＦ−ＩＩ １０ｎＭ、および４０ｎＭから０．１６ｎＭまでの様々な用量のＭ００６４−Ｅ０４で２０分間処理した
●細胞を、ＩＧＦ−ＩＩ １０ｎＭ、および４０ｎＭから０．１６ｎＭまでの様々な用量のＭ００６４−Ｆ０２で２０分間処理した
●細胞を、ＩＧＦ−ＩＩ １０ｎＭ、および陰性対照としてのＩｇＧ Ａ２ ４０ｎＭで２０分間処理した。
細胞を、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムを含有する氷冷ＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＲＩＰＡ緩衝液１ｍｌで溶解させ、氷上で１０分間インキュベートした。溶解産物を、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心することによって、細胞残骸を除去した。細胞可溶化物を、２μｇ／ｍｌの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、アガロースビーズ２０μｌを用いて、４℃で一晩免疫沈降させ、免疫沈降物を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液１ｍｌで３回洗浄した。２×電気泳動試料緩衝液１２μｌを添加した。
ウエスタンブロッティング：試料を７０℃で、水浴で１０分間加熱し、次いで試料を１５ウェル、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル中に装填した。溶解したタンパク質を０．４５μｍのＰＶＤＦ膜に移した。この膜を、５％のＢＳＡ−ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）を用いて室温で１時間ブロックし、３％のＢＳＡ−ＰＢＳＴ中１：１０００の希釈で、４０℃で一晩、抗ホスホ−ＩＧＦ−１Ｒ Ａｂを用いてプローブした。この膜をＰＢＳで３回洗浄した。引き続いて、ブロットを、３％のＢＳＡ−ＰＢＳＴ中１：５０００の希釈で、室温で１時間、抗ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰを用いてプローブし、ＰＢＳで３回洗浄した。このブロットを、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ １８５９０２２＆２３）を用いて展開した。膜をストリッピングし、室温で１時間、５％のＢＳＡ−ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）を用いてブロックし、３％のＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔ中１：３０００の希釈で、４０℃で一晩、抗ＩＧＦ−１Ｒ Ａｂを用いてプローブした。この膜をＰＢＳで３回洗浄した。引き続いて、ブロットを、３％のＢＳＡ−ＰＢＳＴ中１：５０００の希釈で、室温で１時間、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを用いてプローブし、ＰＢＳで３回洗浄した。このブロットを、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ １８５９０２２＆２３）を用いて展開した。
予備結果は、血清のない条件下で、ＩＧＦ−ＩＩでＭＣＦ−７細胞を刺激することにより、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化が誘導されることを実証した。Ｍ００６４−Ｅ０４およびＭ００６４−Ｆ０２ ＩｇＧは、用量依存様式で、ＭＣＦ−７細胞中のＩＧＦ−ＩＩで誘発されるＩＧＦ−１Ｒリン酸化に対する阻害効果を示した。同様の阻害性効力は、これらの２つの抗体間で観察された。ＩｇＧ陰性対照としてのＡ０２は、ＩＧＦ−ＩＩで誘発されるＩＧＦ−１Ｒリン酸化に対する効果をまったく示さなかった。
（実施例８）
結晶学およびエピトープマッピング
Ｍ００６４−Ｆ０２を有するＩＧＦ−ＩＩの結晶構造を求めることによって、抗体が結合するＩＧＦ２のエピトープ領域を特徴づけた。結晶は、添加剤としてＣａ＋＋またはＬｉ＋＋を用いて、ｐＨ約５、中間重量のＰＥＧ条件下で２：１のモル比のＭ００６４−Ｆ０２を有する１〜１０ｍｇ／ｍＬのＩＧＦ−ＩＩを使用して得た。
結晶化の統計データは以下の通りであった：
格子：５０．２２ １０６．６７ １１０．８９ ９０．００ ９０．００ ９０．００
空間群：Ｐ２１２１２１
原子数：４０５０（２３３個の水分子）
％溶媒：５２．６７
原子モデルについての＜Ｂ＞：３３．８５
σ（Ｂ）：９．２１
分解能：４９．２１〜２．４０
Ｒ因子の報告値：０．１８５
Ｒフリー：０．２６１
可能な最大反射数：２４０１０ 実測値：２２７７５
完全性：９４．９％
相関係数：０．９２５４
Ｆａｂ構造は、ｐｄｂ＃１ｉｇｆを用いた分子置換を使用して解析し、ＩＧＦ−ＩＩ構造は、ｐｄｂ ２ｖ５ｐを使用して解析した。
構造の図を図１Ａおよび１Ｂに表す。１つの谷（ｖａｌｌｅｙ）は、ＩＧＦ−ＩＩに結合するためのＦａｂ表面において重要であると思われる。１つは、Ｇｌｙ１１を介して残基Ｃｙｓ９を包含し、Ｃｙｓ９−Ｃｙｓ４７ジスルフィド架橋を覆い隠し、隆起（ｂｕｍｐ）はまた残基Ｐｈｅ４８である。第２の谷は、Ｔｙｒ１０３Ｈバルジの反対側上にあり、ここでの残基は、谷の頂部に並ぶが、その中の深部には見出されない。この谷は負の静電ポテンシャルを有するが、この電荷を相殺する正に帯電した残基は、この範囲に深く入ってもまったく存在しない。側鎖が空間に向き、Ａｓｐ１０２Ｈならびに別の埋まったＧｌｕ１０６ＨおよびＡｓｐ９９Ｈ残基とＨ結合もイオン相互作用もしない２つのＡｒｇ残基（３７および３８）が存在する。最も近い接触は、４．４ＡでのＶａｌ３５主鎖窒素、および４．７ＡでのＡｓｐ１０２のカルボン酸基へのＡｒｇ３４のＮεであると思われる。
Ｍｅｔ５７Ｈ残基は、大部分は帯電した残基（Ｇｌｕ４４、Ｇｌｕ４５、Ａｒｇ４９）によって３つの側部で覆われていると思われるが、電荷はすべてＭｅｔからそれて向いており、脂肪族炭素のみが結合表面に寄与しているように思われ、この表面は無電荷のＰｈｅ４８も含む。
Ｆａｂに対する最も顕著な特徴は、Ｔｙｒ１０３Ｈによって作られたフィンガーバルジである。これは、フィンガーのようにＩＧＦ−ＩＩに少し突っ込んでいるが、２つの分子表面間にギャップまたはホールが依然として残されており、これは、Ｔｒｐなどのより大きい残基によってある程度満たされる場合がある。これは、Ｔｙｒ５９、Ｐｈｅ２６、Ｌｅｕ１７、Ｌｅｕ１３、Ｖａｌ４３、Ｖａｌ１４で構成されるＩＧＦ−ＩＩ表面上の疎水性ポケットである。
以下の表７は、ＩＧＦ−ＩＩの部分配列を示し、太字のアミノ酸は、結晶学的な研究によって、Ｆａｂの結合に関与することが示されたものである：
この部分配列を読むと、ＩＧＦ−ＩＩに由来する残基は、結合表面に寄与し、Ｔ７、Ｃ９、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｌ１３、Ｖ１４、Ｌ１７、Ｆ２６、Ｐ３１、Ｒ３４、Ｖ３５、Ｒ３７、Ｓ３９、Ｒ４０、Ｇ４１、Ｖ４３、Ｅ４４、Ｅ４５、Ｃ４７、Ｆ４８、Ｒ４９、Ｙ５９と命名されていることが分かる。
重鎖（Ｈ）とＩＧＦ−ＩＩ（Ｄ）の間に見られる水素結合（オングストロームでの距離が２．６０Åと３．８４Åの間である）は、以下の通りである：
Ｈ：Ｓ５３−Ｄ：Ｅ４４
Ｈ：Ｒ５９−Ｄ：Ｃ９
Ｈ：Ｒ５９−Ｄ：Ｃ４７
Ｈ：Ｒ５９−Ｄ：Ｔ７
Ｈ：Ｙ１０３−Ｄ：Ｙ５９
Ｈ：Ｎ３１−Ｄ：Ｒ４０
Ｈ：Ｇ５６−Ｄ：Ｒ４９
Ｈ：Ｙ１０３−Ｄ：Ｇ１０
重鎖から結合表面に寄与する残基は、以下の通りである：
Ｓ３０、Ｎ３１、Ｉ３３、Ｖ５０、Ｉ５１、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ５４、Ｇ５６、Ｍ５７、Ｔ５８、Ｒ５９、Ｄ１０２、Ｙ１０３、Ｖ１０４、Ｇ１０５、Ｅ１０６
軽鎖（Ｌ）とＩＧＦ−ＩＩ（Ｄ）の間に見られる水素結合（２．８８Å〜３．５２Åの距離）は、以下の通りである：
Ｌ：Ｙ３３−Ｄ：Ｄ１５
Ｌ：Ｓ９２−Ｄ：Ｇ１１
Ｌ：Ｙ９３−Ｄ：Ｇ１１
Ｌ：Ｙ９３−Ｄ：Ｅ１２
軽鎖から結合表面に寄与する残基：
Ｓ３１、Ｎ３２、Ｙ３３、Ｓ９２、Ｙ９３、Ｎ９４、Ｓ９５、Ｗ９７
（実施例９）
ＦａｂのＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥへの結合についての溶液測定における親和性
１）ファージディスプレイライブラリーから単離されたＦａｂ断片が、固定化された全長ヒトインスリン受容体−Ａ外部ドメイン（ｈｕＩＲ−Ａ ＥＣＤ）への結合を特異的に阻害することを実証し、
２）これらのＦａｂの溶液親和性を推定するために
競合ＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））分析を利用した。
方法
記載された方法（Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ． １９９９年３月；１２５巻（１号）：１１〜８頁）のように、Ｃ末端ｍｙｃエピトープタグと一緒に成熟タンパク質の残基１〜９１４を含むヒトＩＲ−Ａ ＥＣＤを、安定にトランスフェクトされたＬｅｃ ８細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞に由来するグリコシル化突然変異体）のバイオリアクター培養物から単離および精製した。
以前に記載された方法（Ｎｉｅｂａら、１９９６年）に従って、部分的に質量輸送に制限された条件の条件下で、競合ＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））を実施した。ｈｕＩＲ−Ａ（−エクソン１１）外部ドメインの約１６，７００の関連する応答ユニット（ＲＵ）を、標準的なアミン化学反応によって、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＣＭ５チップセンサーに結合させた。コーティングされていないフローセル表面を参照として使用した。ＩＧＦ−ＩＩリガンドと固定化されたｈｕＩＲ−Ａ ＥＣＤの間の各結合／再生サイクルは、ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニング緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）中、３０μｌ／分の一定流速で、２５℃で実施した。表面の再生は、ＮａＣｉｔｒａｔｅ／ＮａＣｌ ｐＨ４．５を３０μｌ注入することによって実現した。最初に、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中に、漸増量のＩＧＦ−ＩＩ（またはＩＧＦ−ＩＩＥ）リガンド（一般に０．５〜８ｎＭから２倍の増加）を含有する試料６０μｌを、固定化されたｈｕＩＲ−Ａ ＥＣＤに注入し、その全体的な結合応答（注入して５秒後）を使用することによって標準結合曲線を確立した。Ｆａｂ断片によるＩＧＦ−ＩＩ結合の阻害を実証し、溶液値（ＫＤ）での親和性を得るために、ＩＧＦ−ＩＩ（またはＩＧＦ−ＩＩＥ）リガンドを、一定の最終的な量１２０μｌ中、様々な濃度のＦａｂ断片とともに、注入前に、２５℃で少なくとも１時間プレインキュベートした。これらの平衡化した混合物の試料６０μｌを、固定化したｈｕＩＲ−Ａ ＥＣＤに注入し、遊離ＩＧＦ−ＩＩリガンドがｈｕＩＲ−Ａ ＥＣＤに結合することによって生じる全体的な結合応答を、注入を停止して５秒後に記録した。結合データを、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して評価し、それによって、上述した検量線と一緒にこれらの全体的な結合応答を使用して、平衡状態での溶液中の遊離ＩＧＦ−ＩＩリガンドの濃度（Ｒｅｑ）を得た。引き続いて、これらのＲｅｑ推定値をＦａｂの全濃度に対してプロットし、得られた阻害曲線を利用することによって解離定数（ＫＤ）を計算した。
結果：
結果は、ほとんどのこれらのＦａｂｓは、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの、ｈｕＩＲ−Ａ ＥＣＤ受容体への結合を阻害することを実証した。ここに示した２つのＦａｂ（Ｍ００８０−Ｇ０３およびＭ００７３−Ｃ１１）は、ＩＧＦ−ＩＩＥの結合のみを阻害する一方で、ＩＧＦ−ＩＩ結合の阻害はまったく観察されず、したがって、これらの２つのＦａｂの結合は、ＩＧＦ−ＩＩＥに特異的であったことを実証している。
（実施例１０）
結合タンパク質（ＢＰ２およびＢＰ４）に対する抗ＩＧＦＩＩ（およびＩＧＦ−ＩＩＥ）抗体競合アッセイ
ＩＧＦ結合タンパク質（ＢＰ）は、細胞上のＩＧＦ−ＩならびにＩＧＦ−ＩＩ（およびＩＧＦ−ＩＩＥ）の作用の調節において主要な役割を果たす。これらは、細胞上のＩＧＦの作用を増強または阻害することができる。ＩＧＦ ＢＰ２は、ＩＧＦ−ＩよりもＩＧＦ−ＩＩに選択的に結合し、様々な細胞によって分泌される。同様に、ＩＧＦ ＢＰ４は、ＩＧＦのスカベンジャーとして作用し、ＩＧＦ作用の阻害剤である。
この実施例では、ＢＰ２およびＢＰ４との候補ＩｇＧの相互作用、ならびにＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥへのその競合的結合を調査した。
方法：
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００、およびプロテインＧでコーティングされたＣＭ５チップを、以下のアッセイを設定するのに利用した。約１０００ＲＵのプロテインＧ’を標準的なアミン化学反応固定化法を使用してＣＭ５チップ上に固定化した。
アッセイ全体は、以下の４つの試薬の３回の連続した注入からなっていた：
１）候補ＩｇＧ（親）を、１０μｇ／ｍｌで、５μｌ／分で１８０秒間、プロテインＧ’上に注入した。これは一般に、約３０００ＲＵのＩｇＧの捕獲をもたらした。
２）次いでＩＧＦ−ＩＩリガンド（５０ｎＭで）を、５μｌ／分で９０秒間注入した。これは、捕獲された抗体へのＩＧＦ−ＩＩの結合を可能にした。
３）次いでＢＰ２またはＢＰ４（やはり５０ｎＭで）を、３０μｌ／分で９０秒間注入した。ＢＰを注入した後の有意な結合応答は、候補抗体およびＢＰが非競合的様式でＩＧＦ−ＩＩに結合したことを示した。
４）プロテインＧ’表面は、３０μｌ／分で６０秒間注入した、ｐＨ１．５の１０ｍＭのグリシンの注入によって最終的に再生した。
図２Ａは、候補抗体の１つについて得られた、一般的な結合プロファイルを示す。これらの実験条件下で、Ｍ００６３−Ｆ０２は、ＢＰ４に関して非競合的な様式でＩＧＦＩＩに結合するように思われた。
図２Ｂは、これらの条件下でのＭ００６４−Ｅ０４候補抗体についての競合結合データを示す。これらの結合結果を確認するために、以下の対照を含めた（左下の差込の説明文を参照）。
１）ＩＧＦ−ＩＩを注入しなかった（代わりにＢｉａｃｏｒｅランニング緩衝液のみを注入）
ＢＰ２／ＢＰ４は、捕獲された抗体に結合しないことを確認した
２）ＩＧＦ−ＩＩを捕獲した後、ＢＰ２もＢＰ４も注入しなかった
抗体からのＩＧＦ−ＩＩの解離についてのベースラインを確立した
３）ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＢＰ２／ＢＰ４は、プロテインＧ’またはチップ表面と有意に相互作用しないことを確認するための、ＩＧＦ−ＩＩに結合しない対照抗体（ｗ０２マウス抗体）
以下の表に、これらの実験条件下で、ＢＰ２、ＢＰ４に関して、ＩＧＦ−ＩＩリガンドに対する候補抗体についてのこれらの競合結合結果を要約したものを示す。
要約：
ＩＧＦＩＩリガンド競合：
試験した実験条件下では、Ｍ００６４−Ｅ０４ ＩｇＧは、ＩＧＦＩＩリガンドへの結合に関して、ＢＰ２およびＢＰ４との最良の競合抗体であるように思われる一方で、Ｍ００６４−Ｆ０２およびＭ００７２−Ｅ０３は、次善の２つの抗体である。
（実施例１１）
異種移植片モデルにおける、抗ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ ＩｇＧおよびＧＨ受容体アンタゴニストの併用試験
免疫無防備状態のマウスに、Ｃｏｌｏ２０５癌細胞の単離された細胞懸濁液または腫瘍断片に由来するＣｏｌｏ２０５を移植した。腫瘍を約１００ｍｍ３のサイズに成長させた。腫瘍を有するマウスを、４群（１群当たり８〜１２匹のマウス）に分け、表１０に列挙した処置および処置スケジュールを試験した：
腫瘍体積は、毎週２回ノギスで測定することによって求めた。動物を計量することによって、任意の薬物関連毒性をモニターした。この癌モデルを使用して試験した処置条件およびスケジュール下で、有意な腫瘍成長阻害はまったく観察されなかった。
同様の実験を、ＨＴ−２９細胞を使用して実施した。表１１に列挙した処置および処置スケジュールを試験した：
この癌モデルを使用して試験した処置条件およびスケジュール下で、有意な腫瘍成長阻害はまったく観察されなかった。
さらに、本発明者らは、移植されたＳＫＵＴ−１細胞（平滑筋肉腫細胞株）を使用して、マウス異種移植片試験を行う。これらの腫瘍を有するマウスを、抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体を単剤療法として使用される１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ ｑ２ｄで処置する。
（実施例１２）
例示的なＩＧＦ ＩＩ／ＩＧＦ ＩＩＥ阻害性結合タンパク質
ＤＸ−２６４７
ＤＸ−２６４７は、例示的なＩＧＦ ＩＩ／ＩＧＦ ＩＩＥ阻害性抗体である。ＤＸ−２６４７は、５６６Ａ−Ｍ００６４−Ｆ０２の親クローンから生殖系列化される。ＤＸ−２６４７のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、以下の通りである。
軽鎖および重鎖フレームワーク、ＣＤＲ、ならびに定常領域の配列は、以下の通りである。ＤＸ−２６４７に由来する６つのＣＤＲを含有するタンパク質を、本明細書に記載される組成物および方法において使用することができる。
生殖系列化ＬＶ−ＦＲ３領域と非生殖系列化ＬＶ−ＦＲ３領域との差を以下に示す。
ＤＸ−２６５５
ＤＸ−２６５５は、例示的なＩＧＦ ＩＩ／ＩＧＦ ＩＩＥ阻害性抗体である。ＤＸ−２６５５は、５６６Ａ−Ｍ００６４−Ｅ０４の親クローンから生殖系列化される。ＤＸ−２６５５のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、以下の通りである。
生殖系列化ＬＶ−ＦＲ３領域と非生殖系列化ＬＶ−ＦＲ３領域との差を以下に示す。
生殖系列化ＬＶ−ＦＲ４領域と非生殖系列化ＬＶ−ＦＲ４領域との差を以下に示す。
（実施例１３）
コロニー形成アッセイにおける、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に対するＩＧＦ ＩＩ／ＩＧＦ ＩＩＥ阻害性結合タンパク質の効果
Ｈｅｐ３Ｂ細胞のコロニー形成を阻害する、ＤＸ−２６４７の能力を試験した。ＤＸ−２６４７を、２つの濃度で試験した。結果を図３に示す。ＤＸ−２６４７は、用量依存様式でコロニー形成を阻害した。
足場依存コロニー形成アッセイ：１０％のＦＢＳおよび様々な濃度のＤＸ−２６４７を含有する培地中、１ウェル当たり５００〜１０００細胞の細胞密度で、６ウェルプレートに細胞を播種し、５％のＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター内に１週間配置することによってコロニーを形成した。５０細胞を超えるコロニーは、それぞれ３通りの皿を用いて、３つの独立した実験においてスコアをつけた。
（実施例１４）
横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｃｒｏｍａ）異種移植片モデルにおける、ＩＧＦ ＩＩ／ＩＧＦ ＩＩＥ阻害性結合タンパク質の効果
ＤＸ−２６４７を３つの横紋筋肉腫（Ｒｈ１０、Ｒｈ２８、およびＲｈ４１）に対して評価する。これらの３つの横紋筋肉腫は、現在、臨床試験において使用されており、インスリン様成長因子−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）に向けられている抗体を用いて以前に試験された。ＩＧＦ−ＩＲは、ＩＧＦ−Ｉだけでなく、ＩＧＦ−ＩＩにも結合する。Ｒｈ２８は、この抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体に対して最良の応答を示す一方で、Ｒｈ１０およびＲｈ４１は、中程度の応答を示した。「負」の対照として、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体に対してまったく応答を示さないＥＷ−８異種移植片を使用する。
インビボ腫瘍成長阻害試験：ＣＢ１７ＳＣ−Ｍ ｓｃｉｄ−／−メスのマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ ＮＹ）を使用することによって、皮下に移植した肉腫（ユーイング、横紋筋肉腫）を増殖させる。すべてのマウスをバリア条件下で維持し、実験は、施設内動物管理使用委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって認可されたプロトコールおよび条件を使用して行う。１処置群当たり１０（１０）匹のマウスを使用する。腫瘍体積（ｃｍ３）および応答は、以下のような活性尺度を使用して求める。
ＲＭＳ異種移植片モデルについての応答および事象の定義。個々の腫瘍について、進行性疾患（ＰＤ）は、試験期間中、初期体積から５０％未満の後退、および試験期間の最後で初期体積の２５％超の増加として定義される。安定疾患（ＳＤ）は、試験期間中、初期体積から５０％未満の後退、および試験期間の最後で初期体積の２５％以下の増加として定義される。部分奏効（ＰＲ）は、測定可能な腫瘍（０．１０ｃｍ３以上）であるが、少なくとも一時点で５０％以上の腫瘍体積後退として定義される。完全奏効（ＣＲ）は、少なくとも一時点について、測定可能な腫瘍塊の消滅（０．１０ｃｍ３未満）として定義される。腫瘍体積が試験期間の最後で０．１０ｃｍ３未満であった場合、完全奏効は維持された（ＭＣＲ）とみなされる。処置群のみについて、腫瘍反応がＰＤである場合、そのときＰＤは、腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）値（以下に説明する）に基づいてＰＤ１またはＰＤ２にさらに分類する。
無事象生存期間：異種移植片モデルにおける事象は、初期腫瘍体積からの４倍の腫瘍体積として定義される。無事象生存期間は、試験開始から最初の事象まで、または体積が４倍にならなかった腫瘍については、試験期間の最後までの時間間隔として定義される。事象までの時間は、補間法を使用して求める（以下に説明する）。
要約統計量および分析方法。処置群のみについて、腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）値を使用することによって、ＰＤを有するマウスをＰＤ１またはＰＤ２としてさらに分類する。ＴＧＤ値は、事象までの日数に基づいて計算する。ＰＤを有し、処置群において事象を有する各個々のマウスについて、ＴＧＤ値は、そのマウスについての事象までの時間を、それぞれの対照群における事象までの平均時間で除することによって計算する。事象間での平均時間は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ無事象生存期間分布に基づいて推定する。マウスのＴＧＤ値が１．５以下である場合、そのマウスをＰＤ１とみなす。ＴＧＤ値が１．５超である場合、このマウスをＰＤ２とみなす。ＰＤを有するが、試験期間の最後で事象を有さないマウスは、ＰＤ２とコード化する。
腫瘍体積Ｔ／Ｃ値：対照（Ｃ）および処置（Ｔ）マウスについての相対腫瘍体積（ＲＴＶ）を、２１日目に、または対照群および処置群中のすべてのマウスが測定可能な腫瘍体積を依然として有するときに（２１日未満の場合）計算する。次いで、各試験に対する対象および処置マウスについての平均相対腫瘍体積を計算する。Ｔ／Ｃ値は、対照群についての平均ＲＴＶで除した処置群についての平均ＲＴＶである。腫瘍体積Ｔ／Ｃ応答測定について、１５％以下のＴ／Ｃを生じる薬剤は、非常に活性であるとみなされ、４５％以下であるが１５％超の平均腫瘍体積Ｔ／Ｃを有する薬剤は、中間の活性を有するとみなされ、４５％超の平均Ｔ／Ｃ値を有する薬剤は、低レベルの活性を有するとみなされる。
ＥＦＳ Ｔ／Ｃ値：ＥＦＳ Ｔ／Ｃ値は、処置群の事象までの平均時間と、それぞれの対照群の事象までの平均時間との比によって定義される。すべての対照ＲＭＳ異種移植片は、６週間以内に事象を起こす。ＥＦＳ Ｔ／Ｃ測定について、薬剤または併用が３つの判定基準、すなわちａ）ＥＦＳ Ｔ／Ｃ＞２、ｂ）ＥＦＳ分布の有意な差（ｐ≦０．０５０）、およびｃ）処置開始時と比較した、処置の最後での処置群における動物の平均腫瘍体積の正味の低減を満たす場合、これらは非常に活性であるとみなされる。
補間法：固形腫瘍異種移植片についての事象までの時間の補間公式を式（１）に示す
ｔｘ＝ｔ１＋（ｔ２−ｔ１）ｌｎ（Ｖｅ／Ｖ１）／ｌｎ（Ｖ２／Ｖ１） （１）
式中、ｔｘは、事象までの補間される日であり、ｔ１は、ひとくくりの事象の早い観察日であり、ｔ２は、ひとくくりの事象の遅い観察日であり、
Ｖ１はｔ１日目の腫瘍体積であり、
Ｖ２はｔ２日目の腫瘍体積であり、
Ｖｅは、事象閾値（固形腫瘍異種移植片についての初期腫瘍体積の４倍）である。
統計的方法：ＳＡＳについてＰＲＯＣ ＳＴＡＴＸＡＣＴ（登録商標）を使用して実行されるような正確なログランク検定を使用することによって、処置群と対照群の間の無事象生存期間分布を比較する。Ｐ値は両側であり、試験の探索的性質を与えられる多重比較について調整しない。
薬物および製剤：ＤＸ−２６４７を、１日おきに（Ｑ２Ｄ×Ｎ）、２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰで投与し、対照として、無関係（ｉｒｒｌｅｖａｎｔ）ＩｇＧ１抗体（ＤＸ−２６４７はＩｇＧ１抗体である）も、１日おきに（Ｑ２Ｄ×Ｎ）、２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰで投与する。
（実施例１５）
ＩＧＦ−ＩＩに対するファージ由来ヒトモノクローナル抗体の単離および特徴づけ
緒言
インスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）は、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、および選択的にスプライスされた形態のインスリン受容体（ＩＲ−Ａ）の両方を通じて、分裂促進性シグナルを送達することができる、母系的に刷り込まれた胚成長因子である。成熟形態のＩＧＦ−ＩＩは、Ｏ−グリコシル化および細胞内タンパク質分解を含めた、プロ−ＩＧＦ−ＩＩ前駆体の翻訳後プロセシングの後に生じる（図４）。部分的には刷り込みの喪失の結果である、ＩＧＦ−ＩＩ発現の上昇は、乳房、大腸、および肝臓の癌を含めた様々なヒト悪性腫瘍において観察される。これは、いくつかの腫瘍型による、新規特性を有する異常にプロセシングされたプロ−ＩＧＦ−ＩＩアイソフォームの分泌を伴う場合がある。
ＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦ−ＩＲおよびＩＲ−Ａの両方に結合し、これらを活性化することによってその生物学的効果を発揮するので、この成長因子の生物活性を直接を直接中和することは、魅力的な治療選択肢である。ここでは、本発明者らは、ＩＧＦ−ＩＩに対するファージ由来ヒトモノクローナル抗体の単離および特徴づけを説明する。
結果
ヒトＦａｂオンファージ（Ｆａｂ−ｏｎ−ｐｈａｇｅ）ディスプレイライブラリーを、ビオチン化ＩＧＦ−ＩＩＥを用いてスクリーニングした。２００を超える個々のクローンを単離し、引き続いて、特異性（ＩＧＦ−ＩＩ対ＩＧＦ−ＩＩＥ）、親和性、ならびに受容体（ＩＧＦ−ＩＲおよびＩＲ−Ａ）へのリガンド結合を遮断する能力について特徴づけた。リードＦａｂ（Ｌｅａｄ Ｆａｂ）を再フォーマットし、全長ＩｇＧ１タンパク質を一過性に発現させ、さらなる特徴づけにかけた。１つのＩｇＧをコドン最適化および生殖系列し、Ｈ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクター、ｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）中に引き続いてクローン化した。ＤＸ−２６４７と命名されたこのタンパク質をコードするコンストラクトを、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）をトランスフェクトし、メチオニンスルホキシイミンの存在下で選択した後、安定に発現させた。
ＤＸ−２６４７は、高い親和性を伴ってＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥに結合する
ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの組換えアイソフォームに対するＤＸ−２６４７の親和性は、抗ヒトＦｃ Ｉｇが結合したチップ上に「捕獲された」ＩｇＧ、その後のリガンド分析物の注入とともに、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して立証した。親和性測定により、ＤＸ−２６４７は、非常に高い親和性を伴ってＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの両方に結合することが明らかになった（それぞれ２３ｐＭおよび２３ｐＭ未満のＫＤ値、データは示していない）。
ＩＧＦ−Ｉについての結合データは：
１：１の結合モデル
ｋａ＝１．０６ Ｅ６ Ｍ−１ｓ−１
ｋｄ＝２．３８Ｅ−５ ｓ−１
Ｋｄ＝２２．６Ｐｍ
Ｃｈｉ２＝１．３４
であった。
ＩＧＦ−ＩＩＥについての結合データは：
１：１の結合モデル
ｋａ＝２．０６Ｅ６ Ｍ−１ｓ−１
２Ｅ−５ｓ−１未満のｋｄ
２３ｐＭ未満のＫｄ
Ｃｈｉ２＝１．０３
であった。
ＩＧＦ−Ｉについての結合データは：
１：１の結合モデル
ｋａ＝５．８Ｅ６ Ｍ−１ｓ−１
ｋｄ＝０．１ｓ−１
ＫＤ＝１７ｎＭ
であった。
ＩＧＦ−ＩＩおよび関連成長因子であるＩＧＦ−Ｉは、アミノ酸レベルで７０％の相同性を共有する。ＳＰＲを使用することによって、ＤＸ−２６４７はＩＧＦ−Ｉに結合するが、これは、ＩＧＦ−ＩＩより３桁弱いＫＤ値で結合することを実証した（２３ｐＭ対２８ｎＭ、データは示していない）。
ＤＸ−２６４７は、他のタンパク質と複合体を形成するとき、ＩＧＦ−ＩＩに結合しない
ＩＧＦ−ＩＲおよびＩＲ−Ａは、ＩＧＦ−ＩＩの生物活性の主なメディエーターであるが、このタンパク質は、６つの血清ＩＧＦ−結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１〜６）のファミリー、および細胞表面マンノース−６−リン酸受容体（ＩＧＦ−ＩＩＲ）を含むいくつかの他のタンパク質に、高い親和性を伴って結合することができる。ＳＰＲを使用するいくつかの異なるアッセイ形式を使用することによって、ＤＸ−２６４７は、他のタンパク質と複合体を形成したとき、依然としてＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−ＩＩＥに結合することができるかどうかを、または逆の場合も同様に評価した。示した実施例（図５Ａ）では、Ｆｃに捕獲されたヒト抗体は、遊離ＩＧＦ−ＩＩに結合するが、予め形成したＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦＢＰ−１の複合体、またはＩＧＦＢＰ−１単独には結合しない。図５Ｂに結果を要約する。
図５Ａおよび５Ｂに提供した要約から、使用した実験条件下では、ＤＸ−２６４７は、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの両方の、ＩＧＦ−ＩＩの３つの細胞表面受容体すべてへの結合を遮断するが、両リガンドに結合するその能力は、アッセイしたＩＧＦＢＰとこれらが複合体を形成すると阻害されることが分かる。この後者の知見は、インビボでのＤＸ−２６４７薬物動態学的プロファイルに関して有利となり得る。
ＤＸ−２６４７は、コロニー形成を阻害し、細胞死の誘導を増強する
予備試験において、本発明者らは、ＤＸ−２６４７は、いくつかの細胞型において、リガンドに誘導される受容体活性化および細胞増殖を遮断することを見出した。次いで本発明者らは、ＤＸ−２６４７が、インビトロでの腫瘍細胞成長、すなわち足場に依存しない条件下で成長する能力についてのベンチマークアッセイにおいて阻害性であるかどうかを尋ねた。
図６Ａに表したように、ＤＸ−２６４７は、軟寒天中で成長させたとき、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞がコロニーを形成する能力を強く阻害した。漸増濃度の抗体の存在下で、軟寒天中の成長培地と１０％のＦＣＳの中に細胞を播種した。２週間後に、５０細胞を超えるコロニーをカウントした。漸増濃度の抗体の存在下で、軟寒天中の成長培地と１０％のＦＣＳの中に細胞を播種した。２週間後に、５０細胞を超えるコロニーをカウントした。ＤＸ−２６４７は、ＨｅｐＧ２細胞の足場に依存しない成長を阻害した。図６Ｂに示した実験についての平均ＩＣ５０値は、１．５ｎＭ±０．７４の標準誤差であった。
さらに、ＤＸ−２６４７は、２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で成長させたヒトＳＫＵＴ−１筋肉腫細胞におけるシスプラチン（ＣＤＤＰ）で誘発される細胞毒性を強力に増強した（図７）。漸増濃度のＣＤＤＰ、および指定した濃度のＤＸ−２６４７または対照抗体の存在下で、９６ウェルプレート全体にわたって、成長培地と２０％のＦＣＳ中にＳＫＵＴ−１細胞を播種した。細胞生存能を、ＣｅｌｌＴｉｔｒｅＢｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して４８時間後に測定した。％値は、ＣＤＤＰ単独に対して細胞死の減少を示す。
ＤＸ−２６４７の親ＦａｂとＩＧＦ−ＩＩの結晶複合体の分析
この研究の過程の間に、本発明者らは、ＤＸ−２６４７が得られた親の非生殖系列化ＦａｂであるＭ００６４−Ｆ０２との複合体でＩＧＦ−ＩＩを結晶化した。このＦａｂは、ＤＸ−２６４７の７分の１の親和性（０．１４ｎＭ）を伴ってＩＧＦ−ＩＩに結合する。この共結晶複合体を２．４Åの分解能で解析した。図１Ａおよび１Ｂを参照。
（実施例１６）
肝細胞癌モデルにおけるＤＸ−２６４７の試験
単独での、またはＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）および／もしくはエルロチニブと併用したＤＸ−２６４７の効果を評価する。試験は、以下のプロトコールの１つにつき、ＨｅｐＧ２またはＨｅｐ３Ｂ細胞異種移植片中で実施する。併用処置については、所与の薬剤を用いた単剤療法と同様に、各薬剤について同じ用量およびタイミングを使用する。
１．細胞株：ＰＢＳ ０．１ｍｌ中２×１０６細胞として移植したＨｅｐＧ２ ＨＣＣ細胞
マウス：メスＢａｌｂ／Ｃヌード
群：１．ビヒクル ＩＰ Ｑ２Ｄ×Ｎ
２．ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標） ６０ｍｇ／ｋｇ ＳＣ Ｑ２Ｄ×Ｎ
３．ＤＸ−２６４７ ２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ２Ｄ×Ｎ
４．ドキソルビシン ３ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ２Ｄ×Ｎ
５．ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）＋ＤＸ−２６４７
７．エルロチニブ＋ＤＸ−２６４７
８．エルロチニブ＋ＤＸ−２６４７＋ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）
２．細胞株：ＰＢＳ ０．１ｍｌ中５×１０６細胞として移植したＨｅｐ３Ｂ ＨＣＣ細胞
マウス：メスＢａｌｂ／Ｃヌード
群：１．ビヒクル ＩＰ Ｑ２Ｄ×Ｎ
２．ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標） ６０ｍｇ／ｋｇ ＳＣ Ｑ２Ｄ×Ｎ
３．ＤＸ−２６４７ ２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ２Ｄ×Ｎ
４．ドキソルビシン ３ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ２Ｄ×Ｎ
５．Ｓｏｍａｖｅｒｔ＋ＤＸ−２６４７
６．エルロチニブ ５０ｍｇ／ｋｇ ＰＯ ＱＤ×１４
７．エルロチニブ＋ＤＸ−２６４７
８．エルロチニブ＋ＤＸ−２６４７＋ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）
３．細胞株：１ｍｍ３の腫瘍断片として移植したＨｅｐ３Ｂ ＨＣＣ細胞
マウス：メス胸腺欠損ヌード（ｎｕ／ｎｕ、Ｈａｒｌａｎ）
群：１．ビヒクル ＩＰ Ｑ２Ｄ×Ｎ
２．ＤＸ−２６４７ ２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ２Ｄ×Ｎ
３．Ａ２ Ａｂ ２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ２Ｄ×Ｎ
４．ドキソルビシン ３ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ４Ｄ×３
Ａ２ Ａｂは、アイソタイプ（ＩｇＧ１）陰性対照抗体である。
（実施例１７）
ＤＸ−２６４７は、Ｃｏｌｏ２０５細胞の増殖を阻害する
腫瘍細胞増殖に対するＤＸ−２６４７の効果をさらに実証するために、Ｃｏｌｏ２０５細胞を、１０％のＦＢＳを含有する完全成長培地中で成長させ、ＤＸ−２６４７またはアイソタイプ対照抗体を用いて、またはこれらを用いずに処置した。Ｃｏｌｏ２０５細胞を、２μＭのＤＸ−２６４７またはアイソタイプ対照抗体（対照ＩｇＧ）を含むか、または含まない完全培地中、１ウェル当たり８×１０３で９６ウェルプレート中に播種した。プレートを、５％のＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター内に４日間置いた。増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した。２μＭのＤＸ−２６４７は、完全成長培地中でＣｏｌｏ２０５増殖を有意に阻害した（図８）。Ｃｏｌｏ２０５細胞は、培養容器中で２つの細胞集団を有する。本発明者らはここで、ＤＸ−２６４７は、接着細胞集団および浮遊細胞集団の両方の増殖を阻害することを実証した。
本発明者らは、ＤＸ−２６４７は、ＩＧＦ−ＩＩで誘導されるＣｏｌｏ２０５細胞増殖を阻害することも実証した（図９）。この実験では、２ｎＭのＩＧＦ−ＩＩを含有する無血清培地中で細胞を培養した。細胞は、ＤＸ−２６４７を用いて、またはこれを用いずに９６時間処置した。中和ＩＧＦ−ＩＩ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、陽性対照として３３３ｎＭで使用した。ＤＸ−２６４７は、１０ｎＭもの低い濃度でＩＧＦ−ＩＩで刺激されるＣｏｌｏ２０５増殖の阻害において最大の効力を示した。この実験では、Ｃｏｌｏ２０５細胞を、２ｎＭのＩＧＦ−ＩＩの存在または非存在下で、無血清培地中、１ウェル当たり８×１０３で９６ウェルプレート中に播種し、１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度でＤＸ−２６４７を用いて、またはこれを用いずに処置した。Ｒ＆ＤからのＩＧＦ−ＩＩ中和抗体を、陽性対照として３３３ｎＭで使用した。プレートを、５％のＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター内に４日間置いた。増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した。
（実施例１８）
ＤＸ−２６４７は、外因性ＩＧＦ−ＩＩで誘導されるＩＧＦ−１Ｒリン酸化（ｐｈｏｓｐｌｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する
リガンド結合すると、ＩＧＦ−１Ｒは、２つのβ−サブユニットのチロシン残基上で自己リン酸化を受ける。ＤＸ−２６４７がＩＧＦ−ＩＩに結合し、したがってＩＧＦ−ＩＩで誘導されるＩＧＦ−１Ｒリン酸化を遮断するかどうかを判定するために、本発明者らは、２つの肝細胞癌細胞株、すなわち、ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ、ならびに１つの結腸直腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５を含むいくつかの細胞株を試験した。ＨＴ−２９およびＭＣＦ−７も、ＤＸ−２６４７の非生殖系列化対応物とともに試験した（実施例７、データは示していない）。
ＤＸ−２６４７は、用量依存様式で、ＩＧＦ−ＩＩ（２．６ｎＭ）で誘導されるＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害した。ＨｅｐＧ２細胞中で、０．３ｎＭのＤＸ−２６４７処置で部分的な阻害が観察され、３ｎＭで完全な阻害が観察された（データは示していない）。実験を実施するために、ＨｅｐＧ２細胞を播種し、２４時間培養し、次いで血清を一晩飢餓させ、その後、ＤＸ−２６４７とＩＧＦ−ＩＩを用いて１０分間処置した。１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎｉｄａｔｅ）を含有する氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を溶解し、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体用いて免疫沈降させた。免疫沈降させたタンパク質を４〜１２％のＢｉｓ−ｔｒｉｓゲル中に溶解させ、ＰＶＤＦ膜に移した。この膜を、最初に抗ホスホ−ＩＧＦ−ＩＲ（ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ）抗体を用いてプローブし、次いでストリッピングし、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて再プローブして全ＩＧＦ−１Ｒタンパク質を検出した。
Ｈｅｐ３Ｂ細胞中でも同様の結果が観察され、０．１ｎＭで部分的な阻害であり、１ｎＭで完全な阻害であった（データは示していない）。ＩＧＦ−ＩＲリン酸化に対するＤＸ−２６４７の阻害効果は、１０ｎＭというより高い有効濃度で、Ｃｏｌｏ２０５細胞中でも観察された（データは示していない）。ＤＸ−２６４７は、ＢＩＡｃｏｒｅ分析に基づいてＩＧＦ−ＩＩへの結合と比較すると、はるかに低い親和性でＩＧＦ−Ｉに結合する。結果として、１０ｎＭのＤＸ−２６４７は、ＩＧＦ−Ｉで誘導されるＩＧＦ−ＩＲリン酸化に対して有意な阻害を示すことができなかった。ＩＧＦ−Ｉに対して阻害効果を得るには、より高い濃度のＤＸ−２６４７を必要とする場合がある。実験を実施するために、
Ｈｅｐ３Ｂ細胞を播種し、２４時間培養し、次いで血清を一晩飢餓させ、その後、ＤＸ−２６４７とＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを用いて１０分間処置した。１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムを含有する氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を溶解し、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体用いて免疫沈降させた。免疫沈降させたタンパク質を４〜１２％のＢｉｓ−ｔｒｉｓゲル中に溶解させ、ＰＶＤＦ膜に移した。この膜を、最初に抗ホスホ−ＩＧＦ−ＩＲ（ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ）抗体を用いてプローブし、次いでストリッピングし、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて再プローブして全ＩＧＦ−１Ｒタンパク質を検出した。
（実施例１９）
ＤＸ−２６４７は、内因性ＩＧＦ−ＩＩで誘導されるＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する
Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、自己分泌様式でＩＧＦ−ＩＩを合成および分泌し、これは次にＩＧＦ−１Ｒに結合し、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化を誘導する。自己分泌ＩＧＦ−ＩＩで誘導されるＩＧＦ−１Ｒリン酸化は、細胞を４８時間血清飢餓させた後、ＩＰ／ＷＢ分析によって検出することができる。１０ｎＭのＤＸ−２６４７は、自己分泌ＩＧＦ−ＩＩで誘導されるＩＧＦ−１Ｒリン酸化に対して有意な阻害効果を示した（データは示していない）。同様の結果が、ＤＸ−２６４７を２４時間処置しても観察された（データは示していない）。実験を実施するために、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を播種し、２４時間培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＦＢＳをまったく含有しない新鮮培地を、１０ｎＭのＤＸ−２６４７とともに、または伴わずに添加し、次いで細胞をさらに４８時間インキュベートした。１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムを含有する氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を溶解し、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体用いて免疫沈降させた。免疫沈降させたタンパク質を４〜１２％のＢｉｓ−ｔｒｉｓゲル中に溶解させ、ＰＶＤＦ膜に移した。この膜を、最初に抗ホスホ−ＩＧＦ−ＩＲ（ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ）抗体を用いてプローブし、次いでストリッピングし、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて再プローブして全ＩＧＦ−１Ｒタンパク質を検出した。
（実施例２０）
ＤＸ−２６４７は、ＨｅｐＧ２細胞の足場依存コロニー形成を阻害する
１ｎＭのＤＸ−２６４７は、ＨｅｐＧ２細胞のコロニー形成能力を有意に阻害した。ＨｅｐＧ２細胞を、１０％のＦＢＳを含有する培地２ｍｌ中、１０００細胞／ウェルで６ウェルに播種した。細胞を、ＤＸ−２６４７を用いて、または用いずに７日間処置した。アイソタイプ対照ＩｇＧ（対照ＩｇＧ）を１００ｎＭで使用した。インキュベーション後、細胞を固定し、結晶バイオレットブルー（ｖｉｏｌｅｔ ｂｌｕｅ）で染色した。各ウェルからランダムに５枚の写真を撮り、データをＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを使用して分析した。結果を図１０にグラフで要約する。
（実施例２１）
Ｈｅｐ３Ｂ肝細胞癌モデルにおけるＤＸ２６４７の試験
腫瘍モデルにおけるＤＸ−２６４７の効果を評価した。試験は、以下のプロトコールにつき、Ｈｅｐ３Ｂ細胞異種移植片中で実施した。併用処置については、所与の薬剤を用いた単剤療法と同様に、各薬剤について同じ用量およびタイミングを使用する。
細胞株：０．１ｍｌ中５×１０６細胞で移植したＨｅｐ３Ｂ ＨＣＣ細胞
マウス：メスＢａｌｂ／Ｃヌード
群：１．ＰＢＳビヒクル ＩＰ Ｑ２Ｄ×Ｎ
２．ペグビソマント ６０ｍｇ／ｋｇ ＳＣ Ｑ２Ｄ×Ｎ
３．ＤＸ−２６４７ ２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ２Ｄ×Ｎ
４．ドキソルビシン ３ｍｇ／ｋｇ ＩＶ Ｑ４Ｄ×３
５．ペグビソマント＋ＤＸ−２６４７
６．エルロチニブ ５０ｍｇ／ｋｇ ＰＯ ＱＤ×１４
７．エルロチニブ＋ＤＸ−２６４７
８．エルロチニブ＋ＤＸ−２６４７＋ペグビソマント
図１１は、上記に列挙した処置についての結果を示す。図１１に示した結果は、データ異常値（平均から２標準偏差を超えるもの）を排除した調整データに基づく。
参考文献
本願全体にわたって引用した参照文献、発行済み特許、公開または未公開特許出願、ならびに以下に列挙したものを含むすべての引用参考文献の内容は、その全体が参照により本明細書に明白に組み込まれている。矛盾する場合には、本明細書の任意の定義を含めて、本願が支配する。
均等物
本発明のいくつかの実施形態を説明してきた。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変を行うことができることが理解されよう。したがって、他の実施形態も、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。

Claims (20)

  1. ＩＧＦ ＩＩおよび／またはＩＧＦ ＩＩＥに結合する単離されたタンパク質であって、前記結合が少なくとも１０９Ｍ−１の親和性を特徴とする、タンパク質。
  2. 重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質であって、前記重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、またはＭ００７２−Ｇ０６の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含み、前記軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、またはＭ００７２−Ｇ０６の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含み、前記タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの両方に結合し、これらを阻害する、タンパク質。
  3. 重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質であって、前記重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、Ｍ００８０−Ｇ０３およびＭ００７３−Ｃ１１の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含み、前記軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、Ｍ００８０−Ｇ０３およびＭ００７３−Ｃ１１の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含み、前記タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩＥに結合し、これを阻害するが、ＩＧＦ−ＩＩには結合せず、これを阻害しない、タンパク質。
  4. 以下：
    のコンセンサス配列、またはその機能的な断片に特異的に結合することができる単離されたタンパク質であって、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である、タンパク質。
  5. 以下：
    のコンセンサス配列、またはその機能的な断片に特異的に結合することができる、請求項４に記載の単離されたタンパク質。
  6. 対象における癌を治療するための方法であって、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  7. 成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質が、前記成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを投与する前の期間に投与される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質が、前記成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターの最初の投与の後に投与される、請求項７に記載の方法。
  10. 前記ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質が抗体である、請求項６に記載の方法。
  11. 前記ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質が、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、前記重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、またはＭ００７２−Ｇ０６の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含み、前記軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、またはＭ００７２−Ｇ０６の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含み、前記タンパク質がＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの両方に結合し、これらを阻害する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記対象をモニターするステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
  13. 前記モニターするステップが、腫瘍サイズの低減；癌マーカーの低減；新規病変の出現の低減；新規疾患関連症状の出現の低減；軟部組織塊のサイズの減少；軟部組織塊のサイズの安定化；または臨床的な結果における改善に関係する任意のパラメータのうちの１つまたは複数についてのものである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記対象が哺乳動物である、請求項６に記載の方法。
  15. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１４に記載の方法。
  16. （ａ）ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質と、
    （ｂ）成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターと、
    （ｃ）対象における癌を治療するための方法に従って使用するための指示書と
    を含むキット。
  17. 対象における癌を治療するための方法であって、
    有効量のＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質を、癌を有する対象に投与するステップを含み、前記ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦ−ＩＩＥ結合タンパク質は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、前記重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、またはＭ００７２−Ｇ０６の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含み、前記軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、Ｍ００３３−Ｅ０５、Ｍ００６３−Ｆ０２、Ｍ００６４−Ｅ０４、Ｍ００６４−Ｆ０２、Ｍ００６８−Ｅ０３、Ｍ００７０−Ｈ０８、Ｍ００７２−Ｃ０６、Ｍ００７２−Ｅ０３、またはＭ００７２−Ｇ０６の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含み、前記タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＥの両方に結合し、これらを阻害する、方法。
  18. 有効量の成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターを前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記成長ホルモン／成長ホルモン放出ホルモン経路モジュレーターが成長ホルモン受容体アンタゴニストである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記成長ホルモン受容体アンタゴニストがＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）である、請求項１９に記載の方法。
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