JP2011523347A5

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Publication number: JP2011523347A5
Application number: JP2010544350A
Authority: JP
Filing date: 2009-01-23
Publication date: 2014-06-19
Anticipated expiration: 2029-01-23

Description

［試験１７］
弱毒化を減じるが蚊の伝染力の欠損を維持する発現戦略
本発明の他の実施形態において、新規な発現戦略が設計され、弱毒化を減じるが蚊の伝染力の欠損を維持することができた。この戦略は、エンベロープ糖タンパク質遺伝子の下流にＩＲＥＳを配置することを含んだ。このエンベロープ糖タンパク質遺伝子は、３’ＵＴＲのまさに上流のサブゲノム領域の３’末端にカプシド遺伝子を備えている（図９）。従って、カプシドタンパク質はＩＲＥＳ依存様式で翻訳されるが、エンベロープ糖タンパク質遺伝子はＣＡＰ依存様式で翻訳されるサブゲノムメッセージが作られた。ＢＨＫ及びベロ細胞中のこの新規なＩＲＥＳ変異の複製は、再度効率的であったが、Ｃ_７１０蚊細胞中では検出されなかった。２０匹のＡｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ生体メス蚊の胸腔内接種は、複製の証拠を示さなかった。ＩＲＥＳ２型がマウスをワクチン接種するために用いられた場合、１０個体の全ては、通常のＴＣ−８３により誘導されるよりも約２倍低い平均力価で抗体陽転するとともに、ＩＲＥＳ２型により致死的な皮下の暴露から保護された。従って、新規なＩＲＥＳ発現戦略は、より少ない弱毒化をもたらすと思われる一方、蚊機能不全表現型を保持する。

Claims

アルファウイルス核酸を含む、弱毒化、組換えアルファウイルスであって、
非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）コード配列の末端及び前記アルファウイルスのサブゲノムＲＮＡコード配列の開始ＡＵＧとの間の（ｉ）不活性化にしたサブゲノムプロモータ、及び（ｉｉ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の挿入を有し、
前記アルファウイルスは弱毒化していることを特徴とする弱毒化、組換えアルファウイルス。
非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）コード配列の末端及びアルファウイルス核酸のサブゲノムＲＮＡコード配列の開始ＡＵＧとの間のサブゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲの欠損により前記サブゲノムプロモータが不活性化されていることを特徴とする請求項１に記載の弱毒化アルファウイルス。
前記サブゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲに配されるアルファウイルス核酸への集合点突然変異によって前記サブゲノムプロモータが不活性化されていることを特徴とする請求項１記載の弱毒化アルファウイルス。
前記アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスであり、前記集合点突然変異が配列番号：１である５’ｃｃｃｃｕａｕａａｃｕｃｕｃｕａｃｇｇｃｕａａｃｃｕｇａａｕｇｇａｃｕａｃｇ３’の５、８、１１、１２、１４、１７、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０の位置で２以上の突然変異を含む同義の点突然変異であることを特徴とする請求項３記載の弱毒化アルファウイルス。
サブゲノムプロモータの突然変異は、非構造タンパク質４のカルボキシ末端のアミノ酸配列を修飾しないことを特徴とする請求項３または４記載の弱毒化アルファウイルス。
ウイルスの複製、放出及びウイルス力価を増加させるのに効果的な非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）における適応変異をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の弱毒化アルファウイルス。
前記アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスであり、同義の適応変異は、ＴＣ−８３ウイルスｎｓＰ２タンパク質においてＹ_３７０をＣに、Ｋ_３７１をＱに、Ｐ_３４９をＴに、Ｄ_４１８をＡに、Ｋ_４２３をＴに、又はこれらの組合せに対応する１以上のアミノ酸変化をもたらす核酸変異であることを特徴とする請求項６記載の弱毒化アルファウイルス。
前記アルファウイルスがチクングンヤ熱ウイルスであることを特徴とする請求項１記載の弱毒化アルファウイルス。
前記アルファウイルスが東部ウマ脳炎ウイルスであることを特徴とする請求項１記載の弱毒化アルファウイルス。
前記アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスであることを特徴とする請求項１記載の弱毒化アルファウイルス。
前記アルファウイルスが西部ウマ脳炎ウイルスであることを特徴とする請求項１記載の弱毒化アルファウイルス。
前記アルファウイルスが蚊及び蚊細胞において複製不可能であることを特徴とする請求項１記載の弱毒化アルファウイルス。
ａ）エンベロープ糖タンパク質遺伝子の下流と、アルファウイルスのサブゲノムＲＮＡの３’ＵＴＲの上流に位置付けられるカプシド遺伝子と、
ｂ）エンベロープ糖タンパク質遺伝子の末端と、位置付けられたカプシド遺伝子との間に導入されたＩＲＥＳと、
を含み、
前記アルファウイルスが弱毒化していることを特徴とする弱毒化、組換えアルファウイルス。
請求項１または１３に記載の弱毒化、組換えアルファウイルスをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするベクター。
請求項１４に記載のベクターを包含するとともに発現することを特徴とする宿主細胞。
請求項１または１３に記載の弱毒化、組換えアルファウイルス及び薬学的に許容可能な担体を備えることを特徴とする医薬組成物。
アルファウイルスへの曝露に起因する感染から被験体を保護する医薬組成物を製造するための、請求項１乃至１３いずれかに記載の弱毒化アルファウイルスの使用。
前記被験体が人、馬、又は他の家畜であることを特徴とする請求項１７記載の使用。
蚊に感染することができない弱毒化、組換えアルファウイルスを作製する方法であって、
該方法は、脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム侵入部位及び３’ＵＴＲのまさに上流側に位置するサブゲノム領域の３’末端においてカプシド遺伝子を有するエンベロープ糖タンパク質の下流側カプシド遺伝子と、をクローニングする段階を含み、
前記カプシドは、ＣＡＰ非依存的様式で発現されるとともに前記エンベロープ糖タンパク質遺伝子はＣＡＰ依存的様式で翻訳されるが、カプシドタンパク質はＩＲＥＳ依存的様式で翻訳されることを特徴とする方法。