JP2011523347A5 - - Google Patents
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Description
[試験17]
弱毒化を減じるが蚊の伝染力の欠損を維持する発現戦略
本発明の他の実施形態において、新規な発現戦略が設計され、弱毒化を減じるが蚊の伝染力の欠損を維持することができた。この戦略は、エンベロープ糖タンパク質遺伝子の下流にIRESを配置することを含んだ。このエンベロープ糖タンパク質遺伝子は、3’UTRのまさに上流のサブゲノム領域の3’末端にカプシド遺伝子を備えている(図9)。従って、カプシドタンパク質はIRES依存様式で翻訳されるが、エンベロープ糖タンパク質遺伝子はCAP依存様式で翻訳されるサブゲノムメッセージが作られた。BHK及びベロ細胞中のこの新規なIRES変異の複製は、再度効率的であったが、C710蚊細胞中では検出されなかった。20匹のAedes aegypti生体メス蚊の胸腔内接種は、複製の証拠を示さなかった。IRES2型がマウスをワクチン接種するために用いられた場合、10個体の全ては、通常のTC−83により誘導されるよりも約2倍低い平均力価で抗体陽転するとともに、IRES2型により致死的な皮下の暴露から保護された。従って、新規なIRES発現戦略は、より少ない弱毒化をもたらすと思われる一方、蚊機能不全表現型を保持する。
弱毒化を減じるが蚊の伝染力の欠損を維持する発現戦略
本発明の他の実施形態において、新規な発現戦略が設計され、弱毒化を減じるが蚊の伝染力の欠損を維持することができた。この戦略は、エンベロープ糖タンパク質遺伝子の下流にIRESを配置することを含んだ。このエンベロープ糖タンパク質遺伝子は、3’UTRのまさに上流のサブゲノム領域の3’末端にカプシド遺伝子を備えている(図9)。従って、カプシドタンパク質はIRES依存様式で翻訳されるが、エンベロープ糖タンパク質遺伝子はCAP依存様式で翻訳されるサブゲノムメッセージが作られた。BHK及びベロ細胞中のこの新規なIRES変異の複製は、再度効率的であったが、C710蚊細胞中では検出されなかった。20匹のAedes aegypti生体メス蚊の胸腔内接種は、複製の証拠を示さなかった。IRES2型がマウスをワクチン接種するために用いられた場合、10個体の全ては、通常のTC−83により誘導されるよりも約2倍低い平均力価で抗体陽転するとともに、IRES2型により致死的な皮下の暴露から保護された。従って、新規なIRES発現戦略は、より少ない弱毒化をもたらすと思われる一方、蚊機能不全表現型を保持する。
Claims (19)
- アルファウイルス核酸を含む、弱毒化、組換えアルファウイルスであって、
非構造タンパク質4(nsP4)コード配列の末端及び前記アルファウイルスのサブゲノムRNAコード配列の開始AUGとの間の(i)不活性化にしたサブゲノムプロモータ、及び(ii)内部リボソーム侵入部位(IRES)の挿入を有し、
前記アルファウイルスは弱毒化していることを特徴とする弱毒化、組換えアルファウイルス。 - 非構造タンパク質4(nsP4)コード配列の末端及びアルファウイルス核酸のサブゲノムRNAコード配列の開始AUGとの間のサブゲノムRNAの5’UTRの欠損により前記サブゲノムプロモータが不活性化されていることを特徴とする請求項1に記載の弱毒化アルファウイルス。
- 前記サブゲノムRNAの5’UTRに配されるアルファウイルス核酸への集合点突然変異によって前記サブゲノムプロモータが不活性化されていることを特徴とする請求項1記載の弱毒化アルファウイルス。
- 前記アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスであり、前記集合点突然変異が配列番号:1である5’ccccuauaacucucuacggcuaaccugaauggacuacg3’の5、8、11、12、14、17、20、22、24、25、26、27、28、29、又は30の位置で2以上の突然変異を含む同義の点突然変異であることを特徴とする請求項3記載の弱毒化アルファウイルス。
- サブゲノムプロモータの突然変異は、非構造タンパク質4のカルボキシ末端のアミノ酸配列を修飾しないことを特徴とする請求項3または4記載の弱毒化アルファウイルス。
- ウイルスの複製、放出及びウイルス力価を増加させるのに効果的な非構造タンパク質2(nsP2)における適応変異をさらに含むことを特徴とする請求項1記載の弱毒化アルファウイルス。
- 前記アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスであり、同義の適応変異は、TC−83ウイルスnsP2タンパク質においてY370をCに、K371をQに、P349をTに、D418をAに、K423をTに、又はこれらの組合せに対応する1以上のアミノ酸変化をもたらす核酸変異であることを特徴とする請求項6記載の弱毒化アルファウイルス。
- 前記アルファウイルスがチクングンヤ熱ウイルスであることを特徴とする請求項1記載の弱毒化アルファウイルス。
- 前記アルファウイルスが東部ウマ脳炎ウイルスであることを特徴とする請求項1記載の弱毒化アルファウイルス。
- 前記アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスであることを特徴とする請求項1記載の弱毒化アルファウイルス。
- 前記アルファウイルスが西部ウマ脳炎ウイルスであることを特徴とする請求項1記載の弱毒化アルファウイルス。
- 前記アルファウイルスが蚊及び蚊細胞において複製不可能であることを特徴とする請求項1記載の弱毒化アルファウイルス。
- a)エンベロープ糖タンパク質遺伝子の下流と、アルファウイルスのサブゲノムRNAの3’UTRの上流に位置付けられるカプシド遺伝子と、
b)エンベロープ糖タンパク質遺伝子の末端と、位置付けられたカプシド遺伝子との間に導入されたIRESと、
を含み、
前記アルファウイルスが弱毒化していることを特徴とする弱毒化、組換えアルファウイルス。 - 請求項1または13に記載の弱毒化、組換えアルファウイルスをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするベクター。
- 請求項14に記載のベクターを包含するとともに発現することを特徴とする宿主細胞。
- 請求項1または13に記載の弱毒化、組換えアルファウイルス及び薬学的に許容可能な担体を備えることを特徴とする医薬組成物。
- アルファウイルスへの曝露に起因する感染から被験体を保護する医薬組成物を製造するための、請求項1乃至13いずれかに記載の弱毒化アルファウイルスの使用。
- 前記被験体が人、馬、又は他の家畜であることを特徴とする請求項17記載の使用。
- 蚊に感染することができない弱毒化、組換えアルファウイルスを作製する方法であって、
該方法は、脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム侵入部位及び3’UTRのまさに上流側に位置するサブゲノム領域の3’末端においてカプシド遺伝子を有するエンベロープ糖タンパク質の下流側カプシド遺伝子と、をクローニングする段階を含み、
前記カプシドは、CAP非依存的様式で発現されるとともに前記エンベロープ糖タンパク質遺伝子はCAP依存的様式で翻訳されるが、カプシドタンパク質はIRES依存的様式で翻訳されることを特徴とする方法。
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