JP2011520441A - Dna鎖を合成する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
CGリッチな断片の高い融解温度に起因する二次構造、そして一本鎖状態のままで残ることの難しさが、プライマー伸長中にDNAポリメラーゼが伸長することを妨げる主な障害である。これが、効率の悪いプライマー伸長と低い増幅効率という結果を招く。
− 優性遺伝病であり、罹患患者が1つの非拡大対立遺伝子と1つの拡大対立遺伝子を持つ。
− CTG反復拡大が1000反復単位を超える長さになることがあり、そしてサンプル中において一部が複数の可変の拡大断片を持つことがある。
− 長い反復拡大にわたる効率的な増幅のためのPCRプロトコールが存在しない。
− サザンブロッティング分析が、元のサンプルの反復拡大の長さとその可変性の直接評価を可能にした。よって、増幅効率を、拡大対立遺伝子と非拡大対立遺伝子の間で評価するだけではなく、サイズがわずかに異なる複数の拡大断片の間でも評価することができた。
用語「CGリッチな反復」は、そのうちの60%超がC又はGのいずれかである短い反復単位(一般的に<20ヌクレオチドの長さ)を含んでなるゲノムのセグメントを指す。この反復単位は、連続して3回超、しばしば何十回又は何百回も一般的に複製される。
用語「拡大した反復」は、反復単位が連続して3回超、しばしば何十回又は数百回も複製されることを意味する。罹患者における反復数は、一般集団に見られるよりも高い。それは、前突然変異又は完全変異であることができる。
一般的に、CGリッチな反復を持つ一本鎖DNA鋳型の二次構造がDNAポリメラーゼを止め、プライマー伸長反応が鋳型鎖の末端に達するのを妨げることが想定される。DNAポリメラーゼは、堅固な二次構造によって止められる前に、このCGリッチな反復領域の一部しか伸長することができない。従来のPCR反応の次のサイクルの変性ステップにて、部分的に伸長した鎖と鋳型鎖が分離する。次のアニーリング・ステップ中に、この部分的に伸長した鎖は、一本鎖の鋳型DNAに再アニールする。しかしながら、これには2つの重大な問題がある。伸長が反復領域に達した場合に、特にその反復領域が数百塩基の長さであれば、3’末端の再アニーリングがその反復領域内のどこでも起こり得る。鋳型鎖に沿ったこのシフティングは、新しく合成された鎖の長さにおける可変性を結果的にもたらす。反復長の可変性を有する鎖がその後のPCRサイクルの鋳型としての役割を果たすので、可変性は、次のPCRサイクルのあいだ、一層強くなる。その増幅産物がゲル電気泳動で分析され、そして本来の反復長の正確な推定が非常に難しいときに、スメア化とスタッタリング(stuttering)が見られる。
1回の完全な伸長に達する前に複数回のPCRサイクルが必要であるなら、別の問題が低い増幅効率と関連する。拡大対立遺伝子が単独で存在していれば、非常に低い効率であってもCGリッチな反復拡大のPCR産物が形成されることがある。より短い鋳型DNAも持っている異型接合サンプル又はモザイク・サンプルでは、類似したサイズの拡大は増幅されない。この理由は、非常に短い反復領域を持つ対立遺伝子が顕著に高い増幅効率で増幅され、そして短い対立遺伝子が増幅反応を独占するからである。拡大対立遺伝子は、非常に不十分にしか増幅されない。低い増幅効率のために、当業者は、拡大対立遺伝子からのPCR産物の検出にサザンブロッティングを使用している(Gennarelli, M., Pavoni, M., Amicucci, P., Novelli, G. & Dallapiccola, B. 1998,「A single polymerase chain reaction-based protocol for detecting normal and expanded alleles in myotonic dystrophy」, Diagnostic molecular pathology: the American journal of surgical pathology, part B, vol. 7, no. 3, pp. 135-137, Brugnoni R, Morandi L, Briscioli V, Cornelio F, Mantegazza R; A new non-radioactive method for the screening and prenatal diagnosis of myotonic dystrophy patients. J Neurol (1998) 245: 289-93)。
C及びGヌクレオチドの高い含有率は、二本鎖DNAの融解温度を上げる。高いCG含有率は、その初期の頃からPCR増幅の一般的、且つ、周知の問題である。言うまでもなく、単により高い伸長温度を単独で使用するのはうまくいっていない;今日では、CGリッチな配列にわたる別の方法での増幅が簡単な日常業務になっている。
本発明のヒート・プッシュ法は、二次構造を形成する短いCGリッチな反復にわたる増幅効率と長いCGリッチな反復にわたる増幅効率とのあいだの相違を顕著に改善する。
本発明において使用されるプライマーを実際の反復と近接させすぎて配置しないことが重要である。できれば、プライマーは、増幅効率のバランスをとるために、いくつかのCGリッチな範囲もまた短い野性型対立遺伝子内に含まれるように配置されるべきである。プライマーは、通常より長く、且つ、比較的CGリッチなセグメント内に配置され、それにより、DNAポリメラーゼがすぐにプライマー伸長を開始するようにプライマーが比較的高い温度にてアニールする条件がもたらされる。1つの実施形態において、PCR添加物であるベタインが、そのPCRには含められる。
比較的短いCGリッチな反復(<1kb)が、1回の、非常にゆっくりとした加熱‐伸長ステップを用いて増幅できることがわかった。伸長温度は、アニーリング温度から80℃まで徐々に、そして非常にゆっくりと上げるように設定された。
同様のPCR条件が長いDM1反復の増幅に使用された場合、スタッタリングとポリメラーゼ・スリッピングが観察され、それにより、アガロースゲル上の増幅産物のスメア化がもたらされた。長いDM1拡大は増幅できなかった(図2)。
全ての伸長ステップの間、伸長温度を一定に維持する従来のPCR法と異なり、本発明のヒート‐プッシュPCR法では、伸長温度が連続的に変動する。1つの限定されない実験(図9を参照のこと)では、プログラムされた変性ステップは、最初に95℃にて45秒間、次に98℃にて10秒間であった。アニーリング・ステップは68℃にて30秒間であり、次に78℃まで加熱することによって伸長が開始し、その後に複数回の段階的な加熱及び冷却ステップが続いた。ヒート‐プッシュ・パルスは、78℃から83℃までのゆっくりとした上昇(約0.1℃/s.)とその後の78℃への素早い戻しを含んでなった。これらのヒーティング・パルスを、1PCRサイクル中に21回繰り返した。ヒート‐プッシュ・パルス数は、1サイクルにつきプログラムできるプログラム・ステップ数を制限しているサーモサイクラー(GeneAmp PCR System 9700、Applied Biosystems)のメモリによって制限された。
拡大対立遺伝子の増幅の成功は、鋳型DNAの質と量に依存している。多量すぎる鋳型DNAを使用すると、拡大対立遺伝子はわずかしか増幅されない(図6)。
脆弱Xのサンプルには、断片サイズにより大きな可変性があり、そして、CCG反復は二次構造を非常に形成しやすく、それが非常に高い融解温度を持っている。サイズが約3kbまでの明確なバンドを1つのX染色体しか持たない男性からのサンプルから得、そして女性からのサンプル中の1つの非拡大反復の存在は、拡大断片が増幅されるのを妨げなかった(図8)。
Claims (17)
- 以下のステップ:
‐ サンプルDNA、プライマー、熱安定性DNAポリメラーゼなどの元の核酸鎖に相補的な核酸鎖を合成できる1つ若しくは複数の酵素、dNTPsの混合物、及びバッファーを含む反応混合物を準備し、
‐ 変性ステップにおいてDNAを変性させ、
‐ アニーリング・ステップにおいてプライマーをアニーリングさせ、
‐ 伸長ステップにおいてアニールしたプライマーを伸長して、増幅されたDNAを得る、
を含んでなるDNAの構造非依存型増幅のためのプライマー伸長反応法であって、複数サイクルにわたって、伸長ステップにおいて、温度を、最初にアニーリング温度から70〜90℃の範囲内の第1伸長温度まで上げ、次に75〜95℃の範囲内のより高い第2伸長温度まで変動させ、そして、より低い第1伸長温度に戻して、伸長が可能になるようにDNA内の二次構造を不安定化させることを特徴とする、前記方法。 - 前記ステップが、複数サイクルにわたって繰り返されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記第1伸長温度が、70〜78℃の範囲内、例えば76〜78℃などであることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記第2伸長温度が、80〜83℃の範囲内であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 第1伸長温度と第2伸長温度との間の変動サイクルが、それぞれの伸長ステップにおいて、少なくとも3回、好ましくは20〜30回、たとえ数百回であっても繰り返されることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記伸長ステップにおいて、温度の変動速度が、0.01〜10℃/sの範囲内であり、好ましくは0.01〜1℃/sの範囲内であり、例えば約0.1℃/sであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAが、GC、CTG又はGCCリッチな反復を含んでいることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応混合物が、共溶媒、例えば、DMSO、グリセロール又はベタインなどを含んでいることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- DNAを増幅するために請求項1〜8のいずれか1項に記載のプライマー伸長反応を使用することを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応法。
- 定量的PCR法又は逆転写PCR法であることを特徴とする、請求項9に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 二次構造を形成する反復配列を含むDNAに関連する疾患又は障害の診断方法であって、請求項9に記載のポリメラーゼ連鎖反応法を使用して、診断目的で上記DNAを増幅することを特徴とする、前記方法。
- 上記疾患が脆弱X症候群であることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 上記疾患が筋強直性ジストロフィーであることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- DNAを増幅するために請求項9に記載のPCR反応を使用することを特徴とするDNAの配列決定法。
- DNAを増幅するために請求項9に記載のPCR反応を使用することを特徴とする、ハイブリダイゼーション・アッセイのための標識DNA断片の調製方法。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法を実施するようにプログラムされたサーマルサイクラー。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法を実施するように作動する、記憶されたコンピューター実行可能プログラムコードを備えているコンピューター読み取り可能データ記憶媒体。
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