JP2011519266A - 免疫反応の調節 - Google Patents
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Abstract
インビボ及びインビトロにおけるIL−17産生T細胞(TH17)の生成を増加させる方法、並びに例えば感染症及び癌等の、免疫反応の誘導又は増強により利益を得る疾患を治療するためのTH17細胞に富む集団。
【選択図】図1G
【選択図】図1G
Description
優先権の主張
本願は、2008年3月21日出願の米国仮特許出願第61/070,410号及び2008年11月10日出願の国際特許出願PCT/US2008/083016号の利益を主張し、これらの全文を参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、2008年3月21日出願の米国仮特許出願第61/070,410号及び2008年11月10日出願の国際特許出願PCT/US2008/083016号の利益を主張し、これらの全文を参照により本明細書に組み込まれる。
研究又は開発に対する連邦の支援
本発明は、国立衛生研究所により与えられた助成金番号AI435801、AI043458、及びNS38037の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所により与えられた助成金番号AI435801、AI043458、及びNS38037の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、インビボ及びインビトロにおけるIL−17産生T細胞(TH17)の数を増加させる及び/又は活性を高めることにより、対象の免疫反応を増強するための方法及び組成物に関する。
制御性T細胞(Treg)は、免疫系の自己反応性成分を支配する。Tregの発生は、IL−17を産生する炎症促進性T細胞(TH17)の発生と相互に関連している。TH17細胞は、転写因子レチノイン酸関連オーファン受容体γt(RORγt)を発現し(Ivanov et al.,Nat.Immunol.,8:345−50,2007(非特許文献1))、これは細胞外病原体の支配に関与し、ヒト及び実験的自己免疫において重要な役割を果たしている(Bettelli et al.,Nat.Immunol.,8:345−350,2007(非特許文献2);O’Quinn and Palmer,Adv.Immunol.,99:115−163(2008)(非特許文献3))。
両方の細胞型は種々の免疫学的状態に寄与していると考えられるが、これら細胞型の生成及び/又は活性化を導く生理学的経路又は機構についてはほとんど知られていない。例えばTGFβ1はTregの分化を誘導する(Chen et al.,J.Exp.Med.,198:1875−1886,2003(非特許文献4))。対照的に、TGFβ1はIL−6(Veldhoen et al.,Immunity,24:179−189,2006(非特許文献5))又はIL−21(Korn et al.,Nature,448:484−7,2007(非特許文献6))と共にTH17細胞を分化させる。
病原体に対する免疫反応においてTreg及びTH17が中心的役割を果たしているため、例えばTH17細胞の生成(例えば細胞のTH17細胞への分化)を促進するために、又はTH17細胞の活性増加を促進するために、関与する経路の特徴付け及びこれら経路を調節することができる化合物の同定が、例えば感染症及び癌等の治療にとって重要である。
Ivanov et al.,Nat.Immunol.,8:345−50,2007
Bettelli et al.,Nat.Immunol.,8:345−350,2007
O’Quinn and Palmer,Adv.Immunol.,99:115−163(2008)
Chen et al.,J.Exp.Med.,198:1875−1886,2003
Veldhoen et al.,Immunity,24:179−189,2006
Korn et al.,Nature,448:484−7,2007
本発明は、少なくとも部分的に、アリール炭化水素受容体(AHR)の発現及び/又は活性を調節する(例えば、増加させる又は減少させる)ことができる化合物が、免疫反応を増強するために有用な標的を提供するという発見に基づいている。2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシン(TCDD)によるAHRの活性化は、TGF−b1−依存性機構により実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を抑制するTreg細胞を誘導し、一方6−ホルミルインドロ[3,2−b]カルバゾール(FICZ)又はβ−ナフトフラボン(bNF)によるAHRの活性化は、Treg細胞分化に干渉し、TH17細胞の分化を促進し、EAEを悪化させた。したがって、AHRはリガンド特異的方式でTreg及びTH17細胞の分化を制御している。それ故本発明は、特に、不完全な免疫反応(例えば免疫反応の非存在又は不十分な免疫反応)により惹起される疾患を予防又は治療する組成物及び方法を提供する。
1つの態様では、本発明はT細胞の集団におけるIL−17産生T細胞(TH17)の数を増加させる又は活性を高める方法を特徴とする。この方法は、任意的に生体適合性ナノ粒子に結合している、Foxp3の発現を低下させるAHRリガンド、例えば6−ホルミルインドロ[3,2−b]カルバゾール(FICZ)又はβ−ナフトフラボン(bNF)を含む十分な量の組成物を細胞の集団と接触させることと、任意的に集団中のIL−17発現細胞の存在及び/又は数を評価することとを含む。この方法により、TH17細胞の数が増加する及び/又は活性が高まる。
幾つかの実施形態では、T細胞の初期集団はナイーブT細胞又はCD4+CD62リガンド+T細胞の一方又は両方を含む。T細胞の集団は、単離されていてもよく(すなわちインビトロ)、生存哺乳類対象、例えば腫瘍に罹患している、感染症に罹患している、又は免疫抑制されている対象内に存在してもよい。細胞集団はまた、例えば小児又は高齢者においてアジュバントとして投与されて、ワクチンに対する免疫反応を促進することもできる。具体的には、本方法は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に感染した結果として免疫抑制されている対象、TH17細胞の欠損に関連することが多い状態において使用することができる。T細胞が生存対象内に存在する場合の実施形態では、この方法は1種以上のリガンドを経口、粘膜、又は静脈内投与することを含んでもよい。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて生成又は活性化されるTH17細胞は、腫瘍若しくは感染症に罹患している、又は免疫抑制されている対象に、障害の症状を改善する又は寛解させるのに十分な量投与される。
また、TH17細胞の生成を増加させる又は活性を高める候補化合物を同定する方法も本明細書に提供される。この方法は、哺乳類のFoxp3プロモータ配列中にアリール炭化水素受容体(AHR)に対する結合配列を含むレポーターコンストラクトを発現する細胞を提供する段階であって、前記結合配列が、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、及びこれらの変異体から成る群から選択されるレポーター遺伝子等のレポーター遺伝子に機能的に連結している、段階と;該細胞を試験化合物と接触させる段階と;レポーター遺伝子の発現に対する該試験化合物の効果を評価する段階とを含む。レポーター遺伝子の発現を増加させる又は減少させる試験化合物は、TH17細胞の生成を調節する候補化合物である。
前記方法は、Foxp3の発現を低下させるAHRリガンド、例えばFICZ又はbNFの存在下でレポーターコンストラクトの発現を測定する段階と;候補化合物が、AHRに対する結合について既知の化合物と競合するかどうかを決定する段階と;候補化合物が既知の化合物と競合的にAHRに結合する場合、その候補化合物を選択する段階と、を任意的に含んでもよい。
更なる態様では、本発明は、IL−17産生T細胞(TH17)の生成を調節する候補化合物を同定する方法を提供する。これらの方法は、レポーター遺伝子に機能的に連結しているAHRに対する結合配列を含むレポーターコンストラクトを発現する細胞を提供する段階を含む。次いで細胞を試験化合物と接触させ、レポーター遺伝子の発現に対する試験化合物の効果を評価する。レポーター遺伝子の発現を増加させる又は減少させる試験化合物は、TH17細胞の生成を調節する候補化合物である。
別の態様では、本発明はTH17細胞の生成を調節する候補化合物を同定する方法を提供する。これらの方法は、例えば産卵30分後の生存ゼブラフィッシュ、例えばゼブラフィッシュ胚を提供する段階と;例えばゼブラフィッシュが生活している水中に試験化合物を入れる、又は化合物を胚に微量注入することにより、ゼブラフィッシュを試験化合物と接触させる段階と;ゼブラフィッシュにおけるFoxp3発現に対する試験化合物の効果を評価する段階とを含み、ゼブラフィッシュにおけるFox−3発現を増加させる又は減少させる試験化合物がTH17細胞の生成を調節する候補化合物である。
更なる態様では、本発明は、Foxp3遺伝子の発現、活性、又は発現及び活性の両方の増加を促進することができる転写因子リガンドを含む組成物を提供する。
更に別の態様では、本発明は、T細胞の集団におけるTH17細胞の数を増加させる方法を提供する。これらの方法は、Foxp3の発現を低下させる1種以上のAHRリガンド、例えば6−ホルミルインドロ[3,2−b]カルバゾール(FICZ)又はβ−ナフトフラボン(bNF)と細胞を接触させることを含み、この方法により制御性IL−17産生T細胞(TH17)の数が増加する及び/又は活性が高まる。
更なる態様では、本発明は、対象におけるTH17細胞の数を増加させる方法を提供する。これらの方法は、1種以上のAHRリガンド、例えば6−ホルミルインドロ[3,2−b]カルバゾール(FICZ)又はβ−ナフトフラボン(bNF)を、治療のために選択された対象に投与する段階を含み、この方法によりIL−17産生T細胞(TH17)の数が増加する及び/又は活性が高まる。
別の態様では、本発明は、T細胞の初期集団からIL−17産生T細胞(TH17)に富む集団を調製する方法を提供する。この方法は、T細胞の初期集団を提供する段階と、該細胞集団を、AHRリガンド、例えば6−ホルミルインドロ[3,2−b]カルバゾール(FICZ)又はβ−ナフトフラボン(bNF)を含む十分な量の組成物と接触させる段階と、任意的に集団中のTH17細胞の存在及び/又は数を評価する段階とを含む。この方法により集団中の制御性TH17細胞の数が増加する。
幾つかの実施形態では、T細胞の初期集団はナイーブT細胞及び/又はCD4+CD62リガンド+T細胞を含む。
幾つかの実施形態では、T細胞の集団はインビトロで存在し、前記方法は、有効量のインターロイキン−6(IL−6)及び形質転換成長因子(TGF)−βの一方又は両方を細胞と接触させることを更に含む。
幾つかの実施形態では、前記方法は、T細胞、B細胞、樹状細胞、又はマクロファージ上に存在する抗原に選択的に結合する1種以上の抗体を細胞と接触させることを更に含む。幾つかの実施形態では、抗体は生体適合性ナノ粒子に結合している。抗体及びAHRリガンドの両方がナノ粒子に結合している実施形態では、それらは同じナノ粒子上に存在してもよく、別個のナノ粒子上に存在してもよい。
幾つかの実施形態では、前記方法は、対象に投与するための富化集団を調製することを更に含む。幾つかの実施形態では、前記方法は、TH17媒介性免疫反応の増強により利益を得る障害に罹患している対象に、前記障害の症状を改善する又は寛解させるのに十分な量のTH17細胞を投与することを更に含む。
別の態様では、本発明は、TH17媒介性免疫反応の増強により利益を得る疾患、例えば腫瘍、又は例えばウイルス、真菌、細菌、若しくは原生動物の病原体への感染に罹患している対象を治療する方法を特徴とする。この方法は、例えば免疫反応の増加により利益を得る疾患に罹患していることに基づいて対象を選択する等の、免疫反応を増加させる治療を必要としている対象を同定する段階と;治療有効量のAHRリガンド、例えば6−ホルミルインドロ[3,2−b]カルバゾール(FICZ)又はβ−ナフトフラボン(bNF)を含む組成物を対象に投与する段階とを含み、それにより対象を治療する。
幾つかの実施形態では、対象は、ウイルス、細菌、真菌、及び原生動物から成る群から選択される病原体に感染している。幾つかの実施形態では、対象は癌に罹患している。
幾つかの実施形態では、FICZ又はbNFは生体適合性ナノ粒子に結合している。
幾つかの実施形態では、前記方法は、T細胞、B細胞、樹状細胞、又はマクロファージ上に存在する抗原に選択的に結合する1種以上の抗体を対象に投与することを更に含む。幾つかの実施形態では、抗体は生体適合性ナノ粒子に結合している。抗体及びAHRリガンドの両方がナノ粒子に結合している実施形態では、それらは同じナノ粒子上に存在してもよく、別個のナノ粒子上に存在してもよい。
幾つかの実施形態では、前記方法は、対象の疾患に関連する抗原、例えば腫瘍関連抗原、又は対象がどの病原体に感染しているかに応じてウイルス、細菌、真菌、及び原生動物から成る群から選択される病原体に関連している抗原を投与することを含む。
1つの態様では、本発明は、例えば生体適合性ナノ粒子に結合している、アリール炭化水素受容体(AHR)転写産物に特異的に結合して、Foxp3の発現を低下させるリガンドを含む組成物を特徴とする。リガンドは、例えば6−ホルミルインドロ[3,2−b]カルバゾール(FICZ)又はβ−ナフトフラボン(bNF)であってもよい。
幾つかの実施形態では、組成物はまた、T細胞、B細胞、樹状細胞、又はマクロファージ上に存在する抗原に選択的に結合する抗体を含む。抗体は、同じナノ粒子上に存在(すなわち結合)してもよく、(同じ又は異なる種類の)異なるナノ粒子に結合していてもよく、または溶液中に遊離していてもよい。
幾つかの実施形態では、組成物はまた、リガンドの分解阻害剤、例えばトラニルシプロミン等のモノアミンオキシダーゼ阻害剤を含む。阻害剤は、同じナノ粒子上に存在(すなわち結合)してもよく、(同じ又は異なる種類の)異なるナノ粒子に結合していてもよく、または溶液中に遊離していてもよい。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物は、アリール炭化水素受容体(AHR)転写因子に特異的に結合し、Foxp3の発現を低下させるリガンド、及び、例えばその分解阻害剤の使用を含み、それらは両方又は一方がナノ粒子に結合していてもよく、両方共ナノ粒子に結合していなくてもよい。
本明細書で使用するとき、「治療」は、疾患又は障害の1種以上の症状を寛解させる、又はさもなければ有利に変化させる方法のいずれかを意味する。本明細書で使用するとき、特定の障害の症状の寛解は、永続的であろうと一時的であろうと、持続性であろうと一過性であろうと、本発明の組成物及び方法による治療に起因し得る、又はそれらに関連し得る、いかなる症状の軽減も指す。
本明細書で使用するとき「有効量」及び「治療に有効な」という用語は、意図する効果又は生理学的結果を惹起するために組成物の投与状況において有効である、一定期間利用される(急性又は慢性投与、及び断続的又は連続投与を含む)本明細書に記載される組成物の1種以上の量又は濃度を指す。
「対象」という用語は、本明細書全体を通して、本発明の方法に係る治療を提供する対象となる動物、ヒト又は非ヒト、げっ歯類又は非げっ歯類を記載するために用いられる。獣医学的及び非獣医学的応用が考えられる。この用語には、哺乳類、例えばヒト、他の霊長類、ブタ、マウス及びラット等のげっ歯類、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、及びヤギが含まれるが、これらに限定されない。典型的な対象としては、ヒト、家畜、並びにネコ及びイヌ等のペットが挙げられる。
本明細書で使用するとき、遺伝子という用語は単離又は精製遺伝子を指す。「単離」又は「精製」という用語は、核酸分子又は遺伝子に適用するとき、核酸分子の天然源中に存在する他の核酸分子を含む他の物質から分離された核酸分子を含む。mRNA又はcDNA分子等の「単離」核酸分子は、組み換え技術により産生されるとき他の細胞物質若しくは培養培地を実質的に含まない可能性がある、又は化学合成されるとき化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まないことが可能である。
「単離」又は「精製」ポリペプチド、ペプチド、又はタンパク質は、タンパク質が由来する細胞又は組織源に由来する細胞物質又は他の夾雑タンパク質を実質的に含まず、又は化学合成されるとき化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。「実質的に含まない」とは、選択されたタンパク質の調製物が約30乾燥重量%未満(例えば20%、10%、又は5%未満)の、非選択タンパク質又は化学前駆体を含むことを意味する。かかる非選択タンパク質はまた本明細書では「夾雑タンパク質」とも称される。単離治療用タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドが組み換えで産生されるとき、それは培養培地を実質的に含まない可能性がある、すなわち培養培地はタンパク質調製物の体積の約20%未満(例えば約10%又は5%未満)を表す。本発明は、少なくとも0.01、0.1、1.0、及び10ミリグラム(乾燥重量)の単離又は精製調製物を含む。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明で用いるための方法及び材料を本明細書に記載するが、当該技術分野で既知である他の好適な方法及び材料を用いてもよい。材料、方法、及び実施例は、例示目的のためだけのものであり、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、及び他の参考文献は、その全文を参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含み、本明細書が優先である。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
詳細な説明
腫瘍及び病原体に対する炎症及び免疫反応におけるIL−17産生T細胞(TH17)の中心的役割が重要であるため、例えばTH17細胞の生成(例えば細胞のTH17細胞への分化)を促進するために、又はTH17細胞の活性増加を促進するために、経路の特徴付け及びこれら経路を調節することができる化合物の同定が、例えば感染症及び癌等の治療にとって重要である。
腫瘍及び病原体に対する炎症及び免疫反応におけるIL−17産生T細胞(TH17)の中心的役割が重要であるため、例えばTH17細胞の生成(例えば細胞のTH17細胞への分化)を促進するために、又はTH17細胞の活性増加を促進するために、経路の特徴付け及びこれら経路を調節することができる化合物の同定が、例えば感染症及び癌等の治療にとって重要である。
本発明は、特に、治療的免疫調節にとって有用な組成物及び方法を提供する。
したがって、本発明は、少なくとも部分的に、本明細書に記載される特定の高親和性リガンドによるAhRの調節を用いて、インビトロ及びインビボでTH17細胞を調節する(例えば数及び/又は活性を増加させる又は減少させる)ことができるという発見に基づいている。興味深いことに、T等の他のAHR特異的リガンドも制御性T細胞(Treg)の分化を制御しているため(国際特許出願PCT/US2008/083016号、及び2007年11月20日出願の米国特許仮出願第60/989,309号、両方共その全文を参照により本明細書に組み込まれる)、AHRは免疫に基づく治療法の有用な標的となる。
幾つかの実施形態では、本発明は、インビトロ及びインビボにおけるTH17分化(例えば生成)及び/又は活性の制御因子としての、リガンド活性化転写因子アリール炭化水素受容体(AHR)の同定に基づく。また、TH17細胞の分化及び/又は活性化を促進するのに有用なAHRのリガンドについても本明細書に記載される。より具体的には、本明細書に提示されるデータは、Foxp3の発現を低下させるAHR特異的リガンド、例えば6−ホルミルインドロ[3,2−b]カルバゾール(FICZ)又はβ−ナフトフラボン(bNF)の使用が、IL−17産生T細胞(TH17)の数及び/又は活性増加を促進することを示し、これは免疫反応が異常に低いことに関連する疾患若しくは障害、又は免疫反応の増強により利益を得る障害、例えば感染症又は癌の治療において、免疫反応を抑制するために有用である。幾つかの実施形態では、有効用量のリガンド、例えばFICZ又はbNFを静脈内又は経口投与してもよい。
本明細書に提示されるデータは、Foxp3の発現を低下させるAHRリガンド、例えば6−ホルミルインドロ[3,2−b]カルバゾール(FICZ)又はβ−ナフトフラボン(bNF)の使用が、TH17免疫調節細胞の数及び/又は活性増加を促進することを示し、これは免疫反応の非存在又は不十分な免疫反応により惹起される疾患又は障害(例えば癌及び感染症)の治療において、免疫反応を高める又は促進するのに有用である。
T H 17細胞の生成及び/又は活性を増加させる化合物
本明細書で記載する、Foxp3の発現を低下させるAHRリガンド、例えばFICZ又はbNFは、TH17細胞の生成及び/又は活性を増加させるため、免疫反応を増強する方法において有用である。AHRに対してFICZ又はbNFと同じ作用を有する他の化合物を用いることもでき、AHRに結合する多数の他の化合物が知られており、簡単なアッセイを用いてそれらもTH17細胞の生成及び/又は活性を増加させるかどうかを決定することができる。
本明細書で記載する、Foxp3の発現を低下させるAHRリガンド、例えばFICZ又はbNFは、TH17細胞の生成及び/又は活性を増加させるため、免疫反応を増強する方法において有用である。AHRに対してFICZ又はbNFと同じ作用を有する他の化合物を用いることもでき、AHRに結合する多数の他の化合物が知られており、簡単なアッセイを用いてそれらもTH17細胞の生成及び/又は活性を増加させるかどうかを決定することができる。
本明細書に記載される方法の幾つかの実施形態では、Foxp3の発現を低下させるAHRリガンド、例えば6−ホルミルインドロ[3,2−b]カルバゾール(FICZ)又はβ−ナフトフラボン(bNF)を含む組成物は、インビボで対象に投与される、又はインビトロで細胞集団に接種される。幾つかの実施形態では、リガンドは生体適合性ナノ粒子に結合している。
幾つかの実施形態では、組成物はまた、T細胞、B細胞、樹状細胞、又はマクロファージ上に存在する抗原に選択的に結合する抗体を含む。抗体は、同じナノ粒子上(すなわちナノ粒子に結合)に存在してもよく、(同じ又は異なる種類の)異なるナノ粒子に結合していてもよく、溶液中に遊離していてもよい。
幾つかの実施形態では、例えばリガンドがインビボで投与されるとき、組成物はまた、抗原特異的反応を誘導するために特定の抗原を含む。抗原は、例えば腫瘍又は病原体特異的抗原であってもよい。
AHR
代表的なヒトAHRmRNA配列は当該技術分野で既知であり、Genbankアクセッション番号NM_001621.3が挙げられ;そのタンパク質のアミノ酸配列はGenbankアクセッション番号NP_001612.1である。AHRの活性断片は、転写活性を有するDNA結合断片であり、少なくとも1つのPAS領域を含み、例えばNP_001612.1のアミノ酸122〜224、又は282〜381である。AHRに結合する共通認識配列としては、配列TNGCGTGが挙げられる。
代表的なヒトAHRmRNA配列は当該技術分野で既知であり、Genbankアクセッション番号NM_001621.3が挙げられ;そのタンパク質のアミノ酸配列はGenbankアクセッション番号NP_001612.1である。AHRの活性断片は、転写活性を有するDNA結合断片であり、少なくとも1つのPAS領域を含み、例えばNP_001612.1のアミノ酸122〜224、又は282〜381である。AHRに結合する共通認識配列としては、配列TNGCGTGが挙げられる。
幾つかの実施形態では、アッセイは、ヒトAHR配列と少なくとも80%同一である、例えば本明細書に記載されるヒト配列と少なくとも80%、85%、90%、又は95%同一である核酸又はポリペプチドの使用を含む。
2つの配列の同一性の割合を決定するために、最適な比較目的のために配列を整列させる(例えば、最適な整列のために第1及び第2のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップを入れてもよく、比較目的のために非相同配列を無視してもよい)。比較目的のために整列させるリファレンス配列の長さは、リファレンス配列の長さの少なくとも60%、例えば少なくとも70%、80%、90%、100%である。次いで対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第1配列のある位置が第2配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドを共有しているとき、分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性の割合は、2つの配列の最適な整列のために入れる必要のあるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列が共有している同一位置の数の関数である。
配列の比較及び2つのアミノ酸配列間の同一性の割合決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成できる。現在の方法では、2つの配列間の同一性の割合は、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラム(www.gcg.comで入手可能)に組み込まれているNeedleman及びWunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444−453)アルゴリズムを用いて決定され、これはギャップペナルティ:12、ギャップ伸長ペナルティ:4、及びフレームシフトギャップペナルティ:5を用いたBlossum62スコアリングマトリクスを用いるものである。
試験化合物
本明細書に記載される方法で使用するための試験化合物は限定されず、有機源の粗製物、又は部分的若しくは実質的に精製された抽出物、例えば植物(例えば草本)及び藻類抽出物、無機元素又は化合物、並びに部分的若しくは実質的に精製された又は合成化合物、例えば小分子、ポリペプチド、抗体、及びポリヌクレオチド、並びにこれらのライブラリを挙げることができる。
本明細書に記載される方法で使用するための試験化合物は限定されず、有機源の粗製物、又は部分的若しくは実質的に精製された抽出物、例えば植物(例えば草本)及び藻類抽出物、無機元素又は化合物、並びに部分的若しくは実質的に精製された又は合成化合物、例えば小分子、ポリペプチド、抗体、及びポリヌクレオチド、並びにこれらのライブラリを挙げることができる。
本明細書に記載される方法によりスクリーニングされ、本明細書においてTH17細胞のレベル及び/又は活性を増加させると決定された試験化合物は、免疫反応の増強により利益を得る障害、例えば癌又は感染症を治療するための候補化合物と見なすことができる。例えば癌又は感染症等のかかる障害のインビボモデルにおいてスクリーニングされ、障害、例えば障害の1種以上の症状に対して所望の効果を有すると決定された候補化合物は、候補治療剤と見なすことができる。候補治療剤は、一旦スクリーニングされ、臨床状況で検証されると、治療剤となる。候補治療剤及び治療剤は、任意的に最適化及び/又は誘導体化され、生理学的に許容できる賦形剤と共に配合されて、医薬組成物を形成することができる。
幾つかの実施形態では、試験化合物はAHRに結合することが知られている。AHR転写因子リガンドは、Denison and Nagy,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.,43:309−34,2003及び本明細書に引用される参考文献に記載されており、これらは全て全文が本明細書に組み込まれる。他のかかる分子としては、平面状疎水性HAH(ポリハロゲン化ジベンゾパラダイオキシン、ジベンゾフラン、及びビフェニル等)及びPAH(3−メチルコラントレン、ベンゾ(a)ピレン、ベンズアントラセン、及びベンゾフラボン等)、並びに関連化合物が挙げられる(Denison and Nagy,2003、上掲)。Nagy et al.,Toxicol.Sci.65:200−10(2002)には、他のリガンドを同定し、確認するために有用な高速スクリーニングについて記載されている。Nagy et al.,Biochem.41:861−68(2002)も参照。幾つかの実施形態では、本発明で有用なこれらリガンドは、FICZ又はbNFと競合して結合するリガンドである。
治療化合物の同定方法
化合物がTH17細胞の生成及び/又は活性を増加させるかどうかを評価する多くの方法が当該技術分野で既知である。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法で有用な化合物はAHRに結合する、例えばAHRの結合についてFICZ又はbNFと競合し、TH17細胞の生成及び/又は活性を増加させる。幾つかの実施形態では、好適な化合物はまた、TH17細胞の分化に関連する転写因子であるRORγtのレベルを増加させる。幾つかの実施形態では、好適な化合物はまた、IL−17のレベルを増加させる。
化合物がTH17細胞の生成及び/又は活性を増加させるかどうかを評価する多くの方法が当該技術分野で既知である。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法で有用な化合物はAHRに結合する、例えばAHRの結合についてFICZ又はbNFと競合し、TH17細胞の生成及び/又は活性を増加させる。幾つかの実施形態では、好適な化合物はまた、TH17細胞の分化に関連する転写因子であるRORγtのレベルを増加させる。幾つかの実施形態では、好適な化合物はまた、IL−17のレベルを増加させる。
結合を評価する方法は、当該技術分野で既知であり、例えばGoodrich and Kugel,Binding and Kinetics for Molecular Biologists(Cold Spring Harbor Laboratory Press;1st edition(November 30,2007));及びOdell and Franchimont,Principles of Competitive Protein Binding Assays(John Wiley&Sons Inc;2nd edition(November 1982))参照。mRNAレベルを評価する方法は当該技術分野で周知であり、ノーザン分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、リアルタイムPCR、及びRNAインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられるが、これらに限定されない(例えばSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)参照)。タンパク質及びペプチドのレベルは、例えばウエスタン分析、免疫アッセイ、インサイチュハイブリダイゼーション、又は細胞内染色/FACS分析によりモニタできる(例えばIvanov et al.,Nat.Immunol.,8:345−50,2007参照)。転写因子活性、例えばプロモータ結合性の変化及び/又は転写活性は、例えば電気泳動移動度シフト解析、DNAフットプリンティング、レポーター遺伝子アッセイ、又はセリン、スレオニン、若しくはチロシンリン酸化アッセイにより決定することができる。幾つかの実施形態では、発現、レベル、又は活性に対する試験化合物の効果は、細胞、細胞抽出物、共培養物、外植片、又は対象の耐糖能又はインスリン分泌の変化として観察される。幾つかの実施形態では、転写因子の発現、レベル、又は活性に対する試験化合物の効果は、耐糖能又はインスリン分泌の変化している、形質転換細胞、又は非ヒト動物、若しくは外植片、組織、又はそれらに由来する細胞において評価され、対照、例えば野性型動物、又は外植片、若しくはそれらに由来する細胞と比較することができる。
発現、レベル、又は活性に対する試験化合物の効果は、細胞、例えば培養哺乳類細胞、初代細胞、細胞溶解物、又は対象、例えばラット、マウス、若しくはウサギ等のげっ歯類等の非ヒト実験哺乳類、又は細胞、組織、若しくは器官外植片、例えば脾臓若しくは脾臓細胞において評価することができる。
幾つかの実施形態では、TH17細胞の生成及び/又は活性を増加させる試験化合物の能力は、動物、例えば実験動物において更に評価される。これらの方法では、本明細書に記載されるインビトロ法により同定された化合物が、検証のために動物に投与される。TH17細胞のレベルは、既知の方法を用いて決定することができる。或いは又は更に、IL−17、IL−21、又はIL−22のレベルはまた、当該技術分野で既知である例えばELISA、ELISPOT、又はRT−PCRアッセイを用いて評価することもできる(例えばO’Quinn and Palmer,Adv.Immunol.,99:115−163(2008)参照)。TH17由来サイトカイン、例えばIL−17、IL−21(Spolski and Leonard,Curr.Op.Immunol.20:295−301(2008))、又はIL−22のレベルを増加させる化合物は、有用な化合物である。
治療方法
上記のように、本発明は、少なくとも部分的に、TH17細胞のレベル及び/又は活性を増加させる化合物として特定のAHRリガンドを同定することに基づいている。したがって、本発明は、免疫反応の増強により利益を得る状態、例えばTH17媒介性免疫反応の非存在若しくは不十分なTH17媒介性免疫反応に惹起される、又はそれらに関連する状態を有する対象(例えばヒト)を治療する組成物及び方法を提供する。この方法は、治療を必要としている対象を選択する段階(例えば対象がTH17媒介性免疫反応の増強により利益を得る1種以上の状態を有することに基づいて対象を選択すること)と、TH17細胞のレベル又は活性を増加させるAHRリガンドを治療(活性)剤として含む本明細書に記載される1種以上の組成物を対象に投与する段階とを含んでもよい。治療を必要としている対象は、例えばその対象の主治医が同定することができる。
上記のように、本発明は、少なくとも部分的に、TH17細胞のレベル及び/又は活性を増加させる化合物として特定のAHRリガンドを同定することに基づいている。したがって、本発明は、免疫反応の増強により利益を得る状態、例えばTH17媒介性免疫反応の非存在若しくは不十分なTH17媒介性免疫反応に惹起される、又はそれらに関連する状態を有する対象(例えばヒト)を治療する組成物及び方法を提供する。この方法は、治療を必要としている対象を選択する段階(例えば対象がTH17媒介性免疫反応の増強により利益を得る1種以上の状態を有することに基づいて対象を選択すること)と、TH17細胞のレベル又は活性を増加させるAHRリガンドを治療(活性)剤として含む本明細書に記載される1種以上の組成物を対象に投与する段階とを含んでもよい。治療を必要としている対象は、例えばその対象の主治医が同定することができる。
TH17媒介性免疫反応の非存在又は不十分なTH17媒介性免疫反応により惹起される障害
免疫反応の非存在又は不十分な免疫反応は、例えば免疫系に影響を与える疾患(例えばHIV及び癌)、侵入病原体による宿主の免疫反応の回避、又は免疫反応に対する耐性により惹起される場合がある。本明細書に記載される組成物及び方法を用いる治療から利益を得ることができる免疫反応の非存在若しくは不十分な免疫反応により惹起される又はそれらに起因する疾患としては、感染症(例えば細菌(例えば肺炎桿菌)、ウイルス、真菌(例えばカンジダアルビカンス)及び原生動物の感染)が挙げられるが、これらに限定されない。TH17媒介性免疫反応を誘発することが知られている多くの感染症が当該技術分野で既知であり、例えばO’Quinn and Palmer,Adv.Immunol.,99:115−163(2008)参照。
免疫反応の非存在又は不十分な免疫反応は、例えば免疫系に影響を与える疾患(例えばHIV及び癌)、侵入病原体による宿主の免疫反応の回避、又は免疫反応に対する耐性により惹起される場合がある。本明細書に記載される組成物及び方法を用いる治療から利益を得ることができる免疫反応の非存在若しくは不十分な免疫反応により惹起される又はそれらに起因する疾患としては、感染症(例えば細菌(例えば肺炎桿菌)、ウイルス、真菌(例えばカンジダアルビカンス)及び原生動物の感染)が挙げられるが、これらに限定されない。TH17媒介性免疫反応を誘発することが知られている多くの感染症が当該技術分野で既知であり、例えばO’Quinn and Palmer,Adv.Immunol.,99:115−163(2008)参照。
またこの方法を用いて免疫不全である対象、例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)に感染している対象を治療することができる。HIVに感染している対象では、TH17細胞の欠損がしばしば見られ、特にAIDSに進行している対象で見られる(例えばBrenchley et al.,Blood,112:2826−2835(2008);Douek et al.,Annu.Rev.Med.60:471−84(2009);Brenchley and Douek,Muc.Immunol.1(1):23−30(2008);Cecchinato et al.,Muc.Immunol.1(4):279−288(2008)参照)。本方法は、これらの対象に加えて他の理由で免疫不全である対象、例えば栄養不良である対象、高齢者若しくは小児(例えば12月齢未満の乳児)(例えばSiegrist and Aspinall,Nat.Rev.Immunol.9:185−194(2009)参照)、又は化学療法を受けた結果免疫が抑制された対象で特に有用である。遺伝子突然変異に起因する免疫不全である一部の対象、例えばSTAT3における突然変異に関連している常染色体優性高IgE症候群(HIES、「Job症候群」)(例えばMilner et al.,Nature452:773−777(2008)参照)もまた、本明細書に記載される方法を用いて治療することができる。活性化合物の直接投与が不十分な対象では、方法は本明細書に記載される方法を用いてインビトロで得られたTH17細胞集団を投与することを含んでもよい。
更に、本明細書に記載される方法を用いて、癌に罹患している対象、例えば癌腫(皮膚又は内部器官を裏打ちしている若しくは被覆している組織から発現し始める癌と定義される);肉腫(骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、又は他の結合組織若しくは支持組織から発現し始める癌と定義される);白血病(骨髄等の血液形成組織から発現し始め、多数の異常な血液細胞を産生させ、血液にも転移する癌と定義される);リンパ腫及び骨髄種(免疫系細胞から発現し始める癌と定義される);又は中枢神経系癌(脳及び脊髄組織から発現し始める癌と定義される)に罹患している対象を治療することができる。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて、以下の1種以上に罹患している対象を治療することができる:鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、咽頭、気管、気管支、肺、顎骨、皮膚、耳、骨、甲状腺、前立腺、卵巣、バルトリン腺、外陰部、膣、卵管、子宮体、子宮、子宮頸部、乳、膀胱、腎臓、胆嚢、直腸、結腸、虫垂、小腸、胃、食道、又は唾液腺の悪性腫瘍。
本明細書に記載されるように、免疫反応の非存在若しくは不十分な免疫反応より惹起される疾患又は障害は、インビトロ及び/又はインビボでTH17細胞の数又は活性の増加を促進することができる、Foxp3の発現を低下させる治療有効量の1種以上のAHRリガンド(例えば6−ホルミルインドロ[3,2−b]カルバゾール(FICZ)又はβ−ナフトフラボン(bNF)及びAHRシグナル伝達に対してFICZ又はbNFと同じ効果を有する化合物)を用いて、対象におけるTH17細胞の数を増加させる及び/又はTH17細胞の活性を高めることにより治療することができる。
幾つかの実施形態では、治療を必要としている対象に、インビトロ及び/又はインビボでTH17細胞の数又は活性の増加を促進することができる、Foxp3の発現を低下させる薬学的有効用量の1種以上のAHRリガンド(例えばFICZ又はbNF)を投与してもよい。
或いは又は更に、TH17細胞に分化し得る細胞集団(例えばナイーブT細胞及び/又はCD4+CD62リガンド+T細胞)を、インビトロでAHRリガンド(例えばFICZ若しくはbNF、又はAHRシグナル伝達に対してFICZ若しくはbNFと同じ効果を有する化合物)と接触させて、それにより集団中のTH17細胞の数の増加を有効に促進することができる。或いは又は更に、TH17細胞を含有している細胞集団(例えば単離TH17細胞(例えば100%))、又は少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、95、又は99%のTH17細胞を含有している細胞の集団)を、FICZ若しくはbNF、又はAHRシグナル伝達に対してFICZ若しくはbNFと同じ効果を有する化合物と接触させて、それにより集団中のTH17細胞の活性の上昇を有効に促進することができる。インビトロで投与されるとき、AHRリガンド(例えばFICZ又はbNF)は、一般的にIL−6及びTGF−βの一方又は両方と同時投与される。(これらの化合物はインビボで存在するため、AHRリガンド(例えばFICZ又はbNF)がインビボで投与されるとき投与する必要はないが、任意的に投与してもよい。)次いでこれらの集団由来の1つ以上の細胞を、単独で、又はインビトロ及び/若しくはインビボでTH17細胞の数若しくは活性の増加を促進することができる1種以上のAHRリガンド(例えばFICZ若しくはbNF、又はAHRシグナル伝達に対してFICZ若しくはbNFと同じ効果を有する化合物)と組み合わせて投与してもよい。
治療の検証/治療の有効性のモニタ
治療中及び/又は治療後、例えば疾患又はその症状の重篤度を評価するための当該技術分野で既知である方法を用いて、1つ以上の時点で対象を評価して、治療の効果を決定してもよい。幾つかの実施形態では、IL−17産生T細胞(TH17)のレベルを評価してもよい。次いで、修正することなく治療を継続してもよく、修正を行って進行又は結果を改良してもよく(例えば投与量、投与頻度、医薬組成物の量を増やす、及び/又は投与方法を変える等)、或いは治療を中止してもよい。
治療中及び/又は治療後、例えば疾患又はその症状の重篤度を評価するための当該技術分野で既知である方法を用いて、1つ以上の時点で対象を評価して、治療の効果を決定してもよい。幾つかの実施形態では、IL−17産生T細胞(TH17)のレベルを評価してもよい。次いで、修正することなく治療を継続してもよく、修正を行って進行又は結果を改良してもよく(例えば投与量、投与頻度、医薬組成物の量を増やす、及び/又は投与方法を変える等)、或いは治療を中止してもよい。
有効性を評価するための多くの方法、例えばRT−PCR又は細胞内染色/FACS分析を用いて、例えば(RORγt)TH17細胞の分化に関連する転写因子のレベルの検出等を用いることができ(例えばIvanov et al.,Nat.Immunol.,8:345−50,2007参照);或いは又は更に、例えば当該技術分野で既知である細胞内サイトカイン染色、ELISA、ELISPOT、又はRT−PCRアッセイを用いて、IL−17、IL−21、又はIL−22のレベルを評価することもできる。臨床的パラメータ、例えば腫瘍の大きさ又は成長、存在する病原体の感染支配又はレベル(「量(load)」としても知られている)を評価することもできる。
投与
治療有効量の本明細書に記載される1種以上の組成物を、標準的な方法により、例えば1種以上の投与経路により、例えば米国食品医薬品局(FDA;例えばアドレスwww.fda.gov/cder/dsm/DRG/drg00301.hrm参照)により現在承認されている1種以上の投与経路により、例えば経口、局所、粘膜、静脈内、又は筋肉内に投与することができる。
治療有効量の本明細書に記載される1種以上の組成物を、標準的な方法により、例えば1種以上の投与経路により、例えば米国食品医薬品局(FDA;例えばアドレスwww.fda.gov/cder/dsm/DRG/drg00301.hrm参照)により現在承認されている1種以上の投与経路により、例えば経口、局所、粘膜、静脈内、又は筋肉内に投与することができる。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される1種以上のリガンドの経口投与は驚くべき効果をあげることができる。
AHRリガンド−ナノ粒子
本明細書に示すように、AHRリガンド(例えばFICZ又はbNF)に結合しているナノ粒子を含む組成物は、経口及び注入の両方によるリガンドの送達において、また生存動物におけるTreg反応の誘導において驚くべき効果を有する。したがって、本発明は、任意的に選択された細胞又は組織をナノ粒子の標的にさせる抗体と共に、生体適合性ナノ粒子に結合しているAHRリガンドを含む組成物を更に含む。
本明細書に示すように、AHRリガンド(例えばFICZ又はbNF)に結合しているナノ粒子を含む組成物は、経口及び注入の両方によるリガンドの送達において、また生存動物におけるTreg反応の誘導において驚くべき効果を有する。したがって、本発明は、任意的に選択された細胞又は組織をナノ粒子の標的にさせる抗体と共に、生体適合性ナノ粒子に結合しているAHRリガンドを含む組成物を更に含む。
生体適合性ナノ粒子
本明細書に記載される方法及び組成物で有用なナノ粒子は、(i)生体適合性である、すなわち薬学的に関連する量で用いられるとき、生存動物において著しい有害反応を惹起せず;(ii)それに対して結合部分が共有結合し得る官能基を特徴とし;(iii)相互作用部分のナノ粒子への非特異的結合が少なく;且つ(iv)溶液中で安定である、すなわちナノ粒子が沈殿しない物質から作製される。ナノ粒子は、単分散性(ナノ粒子当たり、物質、例えば金属結晶が1種)であっても、多分散性(ナノ粒子当たり、複数種の結晶、例えば2、3、又は4種)であってもよい。
本明細書に記載される方法及び組成物で有用なナノ粒子は、(i)生体適合性である、すなわち薬学的に関連する量で用いられるとき、生存動物において著しい有害反応を惹起せず;(ii)それに対して結合部分が共有結合し得る官能基を特徴とし;(iii)相互作用部分のナノ粒子への非特異的結合が少なく;且つ(iv)溶液中で安定である、すなわちナノ粒子が沈殿しない物質から作製される。ナノ粒子は、単分散性(ナノ粒子当たり、物質、例えば金属結晶が1種)であっても、多分散性(ナノ粒子当たり、複数種の結晶、例えば2、3、又は4種)であってもよい。
多くの生体適合性ナノ粒子が当該技術分野で既知であり、例えば有機又は無機ナノ粒子である。リポソーム、デンドリマー、カーボンナノ粒子、及び高分子ミセルは有機ナノ粒子の例である。量子ドットを用いることもできる。無機ナノ粒子としては、例えばAu、Ni、Pt、及びTiO2ナノ粒子等の金属ナノ粒子が挙げられる。また例えばデキストラン又はPEG分子に取り囲まれているFe2+及び/又はFe3+コアを有する10〜20nmの球形ナノ結晶等の磁性ナノ粒子を用いてもよい。幾つかの実施形態では、例えばQian et al.,Nat.Biotechnol.26(1):83−90(2008);米国特許第7060121号;同第7232474号;及び米国特許出願公開第2008/0166706号に記載されているように、コロイド金ナノ粒子が用いられる。好適なナノ粒子、及び多官能性ナノ粒子の構築及び使用法は、例えばSanvicens and Marco,Trends Biotech.,26(8):425−433(2008)で論じられている。
全ての実施形態において、ナノ粒子は官能基を介して本明細書に記載されるAHRリガンドに付着(結合)している。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は官能基を含むポリマーと会合しており、また金属酸化物が互いに分散しているよう機能する。ポリマーは、ポリエチレングリコール又はシラン等であるがこれらに限定されない合成ポリマー、天然ポリマー、又は合成ポリマー若しくは天然ポリマーのいずれかの誘導体、又はこれらの組み合わせであってもよい。有用なポリマーは親水性である。幾つかの実施形態では、ポリマー「コーティング」は磁性金属酸化物の周囲の連続フィルムではなく、金属酸化物に結合し、金属酸化物を取り囲んでいる延伸ポリマー鎖の「網目(mesh)」又は「雲(cloud)」である。ポリマーは、多糖類及び誘導体を含んでもよく、デキストラン、プルラン、カルボキシデキストラン、カルボキシメチルデキストラン、及び/又は還元カルボキシメチルデキストランが挙げられる。金属酸化物は、互いに接触している、又はポリマーに個々に捕捉されている若しくはポリマーに取り囲まれている1つ以上の結晶の集合体であってもよい。
他の実施形態では、ナノ粒子は非ポリマー官能基組成物と会合している。ポリマーの会合なしに安定化された官能化ナノ粒子を合成する方法は既知であり、これも本発明の範囲内である。かかる方法は、例えばHalbreich et al.,Biochimie,80(5−6):379−90,1998に記載されている。
幾つかの実施形態では、ナノ粒子は直径約1〜100nm未満、例えば25〜75nm、例えば約40〜60nm、又は約50〜60nmの外形寸法を有する。ポリマー成分は、幾つかの実施形態では、例えば約5〜20nm以上の厚さのコーティングの形態であってもよい。ナノ粒子の外形寸法は、約15〜200nm、例えば約20〜100nm、約40〜60nm、又は約60nmである。
ナノ粒子の合成
ナノ粒子を調製できる種々の方法が存在するが、全ての方法において、結果は、ナノ粒子を結合部分に結合させるために用いることができる官能基を有するナノ粒子でなければならない。
ナノ粒子を調製できる種々の方法が存在するが、全ての方法において、結果は、ナノ粒子を結合部分に結合させるために用いることができる官能基を有するナノ粒子でなければならない。
例えば、AHRリガンドは、官能化ポリマーへの共有結合を通して金属酸化物に、又は非ポリマー表面官能化金属酸化物に結合することができる。後者の方法では、ナノ粒子はAlbrecht et al.,Biochimie,80(5−6):379−90,1998の変法に従って合成することができる。ジメルカプトコハク酸はナノ粒子にカップリングし、カルボキシル官能基を提供する。官能化とは、ナノ粒子に所望の部分、例えば本明細書に記載されるAHRリガンド又は抗体を付着させるために用いることができるアミノ又はカルボキシル又は他の反応基の存在を意味する。
別の実施形態では、AHRリガンドは、ナノ粒子に会合している官能化ポリマーを介してナノ粒子に結合している。幾つかの実施形態では、ポリマーは親水性である。特定の実施形態では、コンジュゲートは、末端アミノ、スルフヒドリル、又はリン酸基を有するオリゴヌクレオチドと、親水性ポリマー上にアミノ基又はカルボキシ基を備える超常磁性酸化鉄ナノ粒子とを用いて作製される。カルボキシ及びアミノ誘導体化ナノ粒子を合成する方法が幾つか存在する。官能化、コーティングナノ粒子を合成する方法について以下に詳述する。
カルボキシ官能化ナノ粒子は、例えばGormanの方法(国際公開第00/61191号参照)に従って作製することができる。カルボキシ官能化ナノ粒子はまた、強塩基中でブロモ酸又はクロロ酢酸と反応させてカルボキシル基を結合させることにより、多糖類でコーティングされたナノ粒子から作製することもできる。更に、カルボキシ官能化粒子は、無水コハク酸又は無水マレイン酸等の試薬を用いることにより、アミノ基をカルボキシ基に変換することによりアミノ官能化ナノ粒子から作製することもできる。
ナノ粒子の大きさは、例えば米国特許第5,262,176号に記載されているような温度の変更等、反応条件を調整することにより制御できる。均一な粒径の物質はまた、例えば米国特許第5,492,814号に記載されているように、遠心分離、限外濾過、又はゲル濾過を用いて粒子を分画することにより作製することもできる。
ナノ粒子はまた、過ヨウ素酸塩で処理してアルデヒド基を形成することもできる。次いでアルデヒド含有ナノ粒子はジアミン(例えばエチレンジアミン又はヘキサンジアミン)と反応し、これはシッフ塩基を形成し、続いて水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムにより還元される。
デキストランでコーティングされたナノ粒子はまた、例えばエピクロロヒドリンを用いて作製することができ、またそれと架橋することができる。アンモニアの添加によりエポキシ基と反応して、アミン基を生成させる、例えばHogemann et al.,Bioconjug.Chem.2000.11(6):941−6、及びJosephson et al.,Bioconjug.Chem.,1999,10(2):186−91参照。
カルボキシ官能化ナノ粒子は、水溶性カルボジイミド及びエチレンジアミン又はヘキサンジアミン等のジアミンの使用によりアミノ官能化磁性粒子に変換することができる。
アビジン又はストレプトアビジンは、オリゴヌクレオチド又はポリペプチド等のビオチン化結合部分と共に用いるためにナノ粒子に付着させることができる。例えば、Shen et al.,Bioconjug.Chem.,1996,7(3):311−6参照。同様にビオチンは、アビジン標識結合部分と共に用いるためにナノ粒子に付着させることができる。
これらの方法全てにおいて、低分子量化合物は、限外濾過、透析、磁気分離、又は他の手段によりナノ粒子から分離することができる。未反応AHRリガンドは、例えばサイズ排除クロマトグラフィーにより、リガンド−ナノ粒子コンジュゲートから分離することができる。
幾つかの実施形態では、コロイド金ナノ粒子は、例えばQian et al,Nat.Biotechnol.26(1):83−90(2008);米国特許第7060121号;同第7232474号;米国特許出願公開第2008/0166706号に記載されているような、当該技術分野で既知である方法を用いて作製される。
幾つかの実施形態では、例えば米国特許第7291598号;同第5145684号;同第6270806号;同第7348030号その他に記載されているように、ナノ粒子はペグ化される。
抗体
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される組成物はまた、選択的に細胞を標的とする抗体を含み;幾つかの実施形態では、抗体は例えばAHRリガンドと同じ又は異なるナノ粒子に結合している。本明細書で使用するとき、「抗体」という用語は、完全長、2本鎖免疫グロブリン分子、並びにその抗原結合部分及び断片を指し、合成変異体を含む。典型的な完全長抗体は、2つの重(H)鎖可変領域(本明細書ではVHと略す)及び2つの軽(L)鎖可変領域(本明細書ではVLと略す)を含む。本明細書で使用するとき、抗体の「抗原結合断片」という用語は、標的に特異的に結合する能力を保持している完全長抗体の1種以上の断片を指す。抗原結合断片の例としては、(i)Fab断片、VL、VH、CL、及びCH1ドメインから成る一価断片;(ii)F(ab’)2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合している2つのFab断片を含む二価断片;(iii)VH及びCH1ドメインから成るFd断片;(iv)抗体の単一腕部のVL及びVHドメインから成るFv断片;(v)dAb断片(Ward et al.,Nature 341:544−546(1989))、VHドメインから成る;並びに(vi)単離相補性決定領域(CDR)が挙げられるが、これらに限定されない。更に、Fv断片の2つのドメイン、VL及びVHは、別々の遺伝子にコードされているが、組み換え法を用いて、VL及びVH領域を単一タンパク質鎖(そこでVL及びVH領域が対合して一価分子が形成される)として作製することを可能にする合成リンカーにより、VL及びVHを接合させることができる(単鎖Fv(scFv)として知られている;例えばBird et al.Science 242:423−426(1988);及びHuston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883(1988)参照)。かかる単鎖抗体もまた、「抗原結合断片」という用語に包含される。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される組成物はまた、選択的に細胞を標的とする抗体を含み;幾つかの実施形態では、抗体は例えばAHRリガンドと同じ又は異なるナノ粒子に結合している。本明細書で使用するとき、「抗体」という用語は、完全長、2本鎖免疫グロブリン分子、並びにその抗原結合部分及び断片を指し、合成変異体を含む。典型的な完全長抗体は、2つの重(H)鎖可変領域(本明細書ではVHと略す)及び2つの軽(L)鎖可変領域(本明細書ではVLと略す)を含む。本明細書で使用するとき、抗体の「抗原結合断片」という用語は、標的に特異的に結合する能力を保持している完全長抗体の1種以上の断片を指す。抗原結合断片の例としては、(i)Fab断片、VL、VH、CL、及びCH1ドメインから成る一価断片;(ii)F(ab’)2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合している2つのFab断片を含む二価断片;(iii)VH及びCH1ドメインから成るFd断片;(iv)抗体の単一腕部のVL及びVHドメインから成るFv断片;(v)dAb断片(Ward et al.,Nature 341:544−546(1989))、VHドメインから成る;並びに(vi)単離相補性決定領域(CDR)が挙げられるが、これらに限定されない。更に、Fv断片の2つのドメイン、VL及びVHは、別々の遺伝子にコードされているが、組み換え法を用いて、VL及びVH領域を単一タンパク質鎖(そこでVL及びVH領域が対合して一価分子が形成される)として作製することを可能にする合成リンカーにより、VL及びVHを接合させることができる(単鎖Fv(scFv)として知られている;例えばBird et al.Science 242:423−426(1988);及びHuston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883(1988)参照)。かかる単鎖抗体もまた、「抗原結合断片」という用語に包含される。
抗体及び抗体断片の産生はこの分野で数多く報告されている。例えば、Harlow and Lane,1988.Antibodies,A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory参照。例えば、Jones et al.,Nature 321:522−525(1986)は、ヒト抗体CDRの、マウス抗体のCDRでの置換について開示している。Marx,Science 229:455−456(1985)は、マウス可変領域及びヒト定常領域を有するキメラ抗体について論じている。Rodwell,Nature 342:99−100(1989)は、抗体のCDR情報に由来する低分子量認識エレメントについて論じている。Clackson,Br.J.Rheumatol.3052:36−39(1991)は、Fv断片誘導体、単鎖抗体、融合タンパク質キメラ抗体、及びヒト化げっ歯類抗体を含む、遺伝子操作されたモノクローナル抗体について論じている。Reichman et al.,Nature 332:323−327(1988)は、ラット超可変領域がグラフトされているヒト抗体を開示している。Verhoeyen, et al.,Science 239:1534−1536(1988)は、ヒト抗体へのマウスの抗原結合部位のグラフトについて教示している。
本明細書に記載される方法では、化合物がT細胞、B細胞、樹状細胞、及び/又はマクロファージを標的とすることが望ましく、したがってこれら細胞型の1種以上に対して選択的な抗体を用いることができる。例えばT細胞では、抗CXCR4、抗CD28、抗CD8、抗TTLA4、又は抗CD3抗体を用いることができ;例えばB細胞では、CD20、CD19、又はB細胞受容体に対する抗体を用いることができ;樹状細胞を標的とする場合、CD11c、DEC205、MHCクラスI若しくはクラスII、CD80、又はCD86に対する代表的な抗体を用いることができ;マクロファージでは、CD11b、MHCクラスI若しくはクラスII、CD80、又はCD86に対する代表的な抗体を用いることができる。他の好適な抗体も当該技術分野で既知である。
病原体及び腫瘍特異的抗原
例えば細胞集団が対象に投与される幾つかの実施形態では、方法は特異的抗原を同時投与して、抗原特異的反応を誘導することを含む。したがって、例えば対象が腫瘍に罹患している場合、1種以上の腫瘍特異的抗原、例えば対象が有する腫瘍の種類に関連する抗原を投与してもよい。
例えば細胞集団が対象に投与される幾つかの実施形態では、方法は特異的抗原を同時投与して、抗原特異的反応を誘導することを含む。したがって、例えば対象が腫瘍に罹患している場合、1種以上の腫瘍特異的抗原、例えば対象が有する腫瘍の種類に関連する抗原を投与してもよい。
特異的抗原は精製されていてもよく、例えば単離及び精製ポリペプチド又はグリコペプチドであり、例えばナイーブ又は組み換えであり、同様に抗原断片を含んでもよい。対象が腫瘍又はウイルス以外の感染症に罹患しており、抗原が腫瘍細胞、細菌、真菌、又は原生動物に由来する場合、すなわち細胞関連抗原である場合、全細胞又はその断片を投与してもよい。
特異的抗原を選択及び調製する方法は当該技術分野で周知である。例えば、ワクチンとして潜在的に有用であると同定されている任意の抗原を用いることができる。この場合、方法は、ワクチン接種プロトコルの一部として、例えばワクチン抗原に対する免疫反応を促進するためのアジュバントとして、AHRリガンド、又は本明細書に記載される方法により調製されたTH17細胞を投与することを含んでもよい。したがって、本方法は、アジュバントとして投与するために、任意の既知のワクチン接種プロトコルに組み込んでもよい。
本組成物及び方法で有用な代表的な腫瘍関連抗原(TAA)としては、以下のうち1つに分類され得るものが挙げられる:
1.突然変異癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子の産物;
2.他の突然変異遺伝子の産物;
3.過剰発現又は異常発現細胞タンパク質;
4.発癌ウイルスにより産生される腫瘍抗原;
5.癌胎児抗原;
6.改変細胞表面糖脂質及び糖タンパク質;又は
7.細胞型特異的分化抗原。
1.突然変異癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子の産物;
2.他の突然変異遺伝子の産物;
3.過剰発現又は異常発現細胞タンパク質;
4.発癌ウイルスにより産生される腫瘍抗原;
5.癌胎児抗原;
6.改変細胞表面糖脂質及び糖タンパク質;又は
7.細胞型特異的分化抗原。
TAAの例としては、以下のものが挙げられる:生殖細胞腫瘍ではαフェトプロテイン(AFP);消化管の癌では癌胎児抗原(CEA);卵巣癌ではCA−125;乳癌ではMUC−1;乳癌では上皮腫瘍抗原(ETA);悪性黒色腫ではチロシナーゼ;悪性黒色腫では黒色腫関連抗原(MAGE);前立腺癌では前立腺酸性ホスファターゼ又は前立腺特異的抗原(PSA);又は悪性黒色腫ではMelan−A/MART−1。他のものとしては、ras又はp53の異常産物;ホルモン、例えばACTH、カルシトニン、及びヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG);腫瘍関連糖タンパク質CA125、CA19−9、CA72−4、及びCA15−3が挙げられる。
代表的な病原体関連抗原としては、例えば髄膜炎等の疾患の原因物質から小児及び高齢者を保護するために、例えばペプチド担体に結合している、FICZと共に投与され得る(タンパク質担体にコンジュゲート化し得る)抗原性多糖類が挙げられ、例えばAmir−Kroll et al.,J.Immunol.170:6165−6171(2003)参照。代表的な多糖類としては、肺炎連鎖球菌;髄膜炎菌;及びヘモフィルスインフルエンザb菌(Hib)の表面多糖類が挙げられる。
他の代表的な抗原としては、例えば培地から細胞を除去した後の百日咳菌ホルマリン不活化百日咳毒素(無細胞百日咳、aP);破傷風菌ホルマリン不活化毒素;ジフテリア菌ホルマリン不活化毒素;B型肝炎ウイルス抗原(HBsAg);及び種々の不活化ウイルス/細菌が挙げられる。多くの他の抗原が当該技術分野で既知である。
医薬製剤
治療有効量の1種以上の本明細書に記載される組成物(すなわち、単独又はナノ粒子に結合している、例えばFICZ又はbNF等のAHRリガンドを活性(治療)剤として含む)は、例えばヒト等の対象に投与するのに好適な医薬組成物に組み込むことができる。かかる組成物は、典型的には組成物と、薬学的に許容できる担体とを含む。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容できる担体」という用語は、薬学的投与に適合する任意の且つ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等を含むことを意図する。薬学的活性物質にかかる媒体及び剤を用いることは既知である。任意の従来の媒体又は剤が活性化合物に不適合である場合を除いて、かかる媒体を本発明の組成物で用いることができる。補助的活性化合物、例えばリガンドの分解阻害剤を組成物に組み込んでもよい。
治療有効量の1種以上の本明細書に記載される組成物(すなわち、単独又はナノ粒子に結合している、例えばFICZ又はbNF等のAHRリガンドを活性(治療)剤として含む)は、例えばヒト等の対象に投与するのに好適な医薬組成物に組み込むことができる。かかる組成物は、典型的には組成物と、薬学的に許容できる担体とを含む。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容できる担体」という用語は、薬学的投与に適合する任意の且つ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等を含むことを意図する。薬学的活性物質にかかる媒体及び剤を用いることは既知である。任意の従来の媒体又は剤が活性化合物に不適合である場合を除いて、かかる媒体を本発明の組成物で用いることができる。補助的活性化合物、例えばリガンドの分解阻害剤を組成物に組み込んでもよい。
医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するよう配合され得る。非経口、皮内、又は皮下適用で用いられる溶液又は懸濁液は、以下の成分を含んでもよい:注入用水等の滅菌希釈剤、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒;ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗細菌剤;アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤;酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩等の緩衝剤;及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の張度調整剤。pHは、塩酸又は水酸化ナトリウム等の酸又は塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラス又はプラスチックで作製されるアンプル、使い捨てシリンジ、又は多用量バイアルに封入されていてもよい。
注入用途に好適な医薬組成物としては、滅菌水溶液(水溶性である場合)若しくは分散液、及び滅菌注入溶液若しくは分散液の即時調整用滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、CREMOPHOR EL(商標)(ポリエトキシ化ヒマシ油;BASF,Parsippany,NJ)、又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌されていなくてはならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等)、及びこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。例えばレシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合必要な粒径を維持することにより、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物作用の阻止は、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成できる。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注入組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収遅延剤を組成物中に含むことによりもたらされ得る。
滅菌注入溶液は、必要に応じて、上に列挙する成分の1種又は組み合わせと共に、適切な溶媒中に必要な量の組成物(例えば本明細書に記載される剤)を組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製できる。一般的に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒と上に列挙したものの中から必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌注入溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これらにより、既に滅菌濾過されているその溶液から活性成分と任意の追加の所望成分の粉末が得られる。
経口組成物は一般的に、不活性希釈剤又は可食性担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよい。経口治療投与の目的のために、活性化合物を賦形剤とともに組み込んで、錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤の形態で用いてもよい。経口組成物はまた、洗口液として用いるために液体担体を用いて調製してもよく、ここで液体担体中の化合物は経口で適用され、含嗽(swish)され、吐き出される又は飲み込まれる。薬学的適合性結合剤、及び/又はアジュバント物質は、組成物の一部として含まれてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、任意の以下の成分又は類似の性質を有する化合物を含有してもよい:微結晶性セルロース、トラガカントガム、又はゼラチン等の結合剤;デンプン又はラクトース等の賦形剤;アルギン酸、PRIMOGEL(商標)(カルボキシメチルスターチナトリウム)、又はコーンスターチ等の崩壊剤;ステアリン酸マグネシウム又はSTEROTES(商標)等の潤滑剤;コロイド二酸化ケイ素等の流動促進剤;スクロース又はサッカリン等の甘味剤;又はペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ香料等の着香剤。
全身投与はまた、経粘膜又は経皮手段によるものであってもよい。経粘膜又は経皮投与では、浸透する障壁に対して適切な浸透剤が製剤中に用いられる。かかる浸透剤は一般的に既知であり、例えば経粘膜投与の場合、洗剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻薬又は坐薬の使用を通して達成できる。経皮投与の場合、活性化合物は、一般的に当該技術分野で既知である軟膏、硬膏、ゲル、又はクリームに配合される。
1つの実施形態では、活性化合物は、移植片及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤等の、化合物が体内から急速に排泄されるのを防ぐ担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。かかる製剤の調製方法は、当業者に明らかである。物質はまた、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals,Inc.から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的とするリポソームを含む)もまた、薬学的に許容できる担体として用いることができる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号に記載されているように、当業者に既知の方法に従って調整することができる。
核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして用いてもよい。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注入、局所投与(米国特許第5,328,470号参照)により、又は定位注入(例えばChen et al.,PNAS 91:3054−3057,1994参照)により、対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容できる希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含んでもよく、或いは遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリクスを含んでもよい。或いは、例えばレトロウイルスベクター等の完全遺伝子送達ベクターを組み換え細胞からインタクトな状態で産生する場合、医薬製剤は遺伝子送達系を産生する1つ以上の細胞を含んでもよい。
医薬組成物は、投与説明書と共に容器、パック、又はディスペンサに収容されてもよい。1つの態様では、医薬組成物はキットの一部として含まれてもよい。
一般的に、医薬組成物を投与するために用いられる投与量は、毒性、炎症、又はアレルギー反応等の不所望の副作用なしに、予防及び/又は治療のための意図される目的を促進する。個々の要件は変化してもよいが、製剤の有効量の最適な範囲の決定は当該技術分野の技能の範囲内である。ヒトの用量は、動物実験から容易に推定され得る(Katocs et al.,Chapter 27 In:“Remington’s Pharmaceutical Sciences”,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990)。一般的に、当業者が容易に調整できる、有効量の製剤を提供するために必要な投与量は、年齢、健康、体調、体重、レシピエントの疾患又は障害の種類及び程度、治療頻度、併用療法の性質、並びに必要に応じて所望の効果(1又は複数)の性質及び範囲を含む、幾つかの要因に依存して変化する(Nies et al.,Chapter 3,In:Goodman&Gilman’s “The Pharmacological Basis of Therapeutics”,9th Ed.,Hardman et al.,eds.,McGrawHill,New York,N.Y.,1996)。
キット
本発明はまたキットを含む。幾つかの実施形態では、キットは1以上の用量の本明細書に記載される組成物を含む。導入レジメン及び維持レジメンのための剤形の組成、形状、及び種類は、対象の要件に応じて変化してもよい。例えば、剤形は、非経口剤形、経口剤形、遅延放出又は制御放出剤形、局所及び粘膜剤形(これらの任意の組み合わせを含む)であってもよい。
本発明はまたキットを含む。幾つかの実施形態では、キットは1以上の用量の本明細書に記載される組成物を含む。導入レジメン及び維持レジメンのための剤形の組成、形状、及び種類は、対象の要件に応じて変化してもよい。例えば、剤形は、非経口剤形、経口剤形、遅延放出又は制御放出剤形、局所及び粘膜剤形(これらの任意の組み合わせを含む)であってもよい。
特定の実施形態では、キットは包装又は容器内に以下の1種以上を備えてもよい:(1)1以上の投与量の本明細書に記載される組成物;(2)1種以上の薬学的に許容できるアジュバント又は賦形剤(例えば薬学的に許容できる塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、及びクラスレート);(3)用量を投与するための1種以上のビヒクル;(5)投与説明書。構成要素(1)〜(5)のうち2種以上(全種を含む)を同じ容器に入れた実施形態を用いてもよい。
キットを供給するとき、含まれる組成物の異なる成分を別々の容器に包装し、使用直前に混合してもよい。成分をこのように別々に包装することは、活性成分の機能を失わせることなしに長期間保存することを可能にする。2種以上の生物活性剤が特定のキットに含まれるとき、生物活性剤は、(1)別々に包装され、使用直前に適切な(類似の異なるものであるが適合性である)アジュバント又は賦形剤と別々に混合してもよく、(2)一緒に包装され、使用直前に一緒に混合されてもよく、又は(3)別々に包装され、使用直前に一緒に混合されてもよい。選択された化合物が混合後も安定な状態を保つ場合、例えば数分前、数時間前、数日前、数ヶ月前、数年前、及び製造時を含む、使用直前以外の使用前のある時点で化合物を混合してもよい。
本発明の特定のキットに含まれる組成物は、異なる成分の寿命が最適に保たれ、容器の材料に吸収又は変質されないように、いかなる種類の容器に入れて供給することもできる。これら容器に好適な材料としては、例えばガラス、有機ポリマー(例えばポリカーボネート及びポリスチレン)、セラミック、金属(例えばアルミニウム)、合金、又は類似の試薬を収容するために典型的に使用されている任意の他の材料を挙げることができる。代表的な容器としては、限定するものではないが、試験管、バイアル、フラスコ、瓶、シリンジ等を挙げることができる。
上述のように、キットはまた説明書と共に供給されてもよい。これらの説明書は、印刷されていてもよく、及び/又は限定するものではないが、フロッピーディスク、CD−ROM、DVD、Zipディスク、ビデオカセット、オーディオテープ、およびフラッシュメモリーデバイス等の電子可読媒体として供給されてもよい。或いは、説明書はインターネットウェブサイトに公開されてもよく、電子メールとしてユーザに配布されてもよい。
本発明は、以下の実施例において更に記載されるが、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1:インビトロにおけるT H 17分化に対するAHRの役割
UVB光に曝露されたケラチノサイトが表面のRANKLレベルをアップレギュレートし、表皮樹状細胞にシグナルを送ってTreg増殖を補助することが近年報告されている(Loser et al.,Nat.Med.,12:1372−1379,2006)。UVBはインビトロでAHRリガンドFICZの形成を触媒し、皮膚でFICZを生成させると考えられている(Fritsche et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,104:8851−8856,2007)。Tregに対するAHRの役割を鑑みて(国際特許出願PCT/US2008/083016号、及び米国特許仮出願第60/989,309号参照(2007年11月20日出願)、両方共その全文を参照により本明細書に組み込まれる)、及びTreg増殖に対するUVBの報告されている効果を鑑みて(Loser et al.,Nat.Med.,12:1372−1379,2006)、Tregに対するFICZの効果を調べた。
UVB光に曝露されたケラチノサイトが表面のRANKLレベルをアップレギュレートし、表皮樹状細胞にシグナルを送ってTreg増殖を補助することが近年報告されている(Loser et al.,Nat.Med.,12:1372−1379,2006)。UVBはインビトロでAHRリガンドFICZの形成を触媒し、皮膚でFICZを生成させると考えられている(Fritsche et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,104:8851−8856,2007)。Tregに対するAHRの役割を鑑みて(国際特許出願PCT/US2008/083016号、及び米国特許仮出願第60/989,309号参照(2007年11月20日出願)、両方共その全文を参照により本明細書に組み込まれる)、及びTreg増殖に対するUVBの報告されている効果を鑑みて(Loser et al.,Nat.Med.,12:1372−1379,2006)、Tregに対するFICZの効果を調べた。
図1A及び1Bに示すように、驚くべきことにCD4+Foxp3:GFP−T細胞のCD4+Foxp3:GFP−Tregへの変換を促進するのではなく、FICZはインビトロでTGF−β1により誘発されるTregの分化を干渉した。TH17とTreg細胞との間に存在する、報告されている相互関係(Bettelli et al.,Nature,441:235−238,2006)及び本明細書に記載されるTreg分化に対するFICZの阻害効果に基づいて、FICZ及びAHRのTH17分化に対する役割を調べた。
図1Cに示すように、AHR発現は、TGF−β1及びIL−6による活性化によってインビトロで誘導されたTH17T細胞内で、非常にアップレギュレートされる。更に、AHR発現はまた、TH17分化がTGF−β1、IL−6、及びIL−23により促されたとき、又はIL−21をIL−6の代わりに用いたときにもアップレギュレートされた(図1D参照)。
次に、インビトロにおけるTH17分化に対する、FICZによるAHR活性化の効果を、TH17分化マーカーとしてTH17転写因子であるRORγtを用いて調べた。図1Eに示すように、FICZは単独ではTH17転写因子RORγtの発現量をそれ程アップレギュレートしなかった。しかし、図1F〜1Hに示すように、FICZはTGFβ1、IL−6、及びIL−23と協同して、インビトロでTH17分化を促した。この相乗作用は、図1Iに示すようにAHR拮抗剤レスベラトロールによりブロックされ得る。この観察結果は、AHRがFICZ媒介性TH17分化にとって重要であることを示す。まとめると、これらの結果は、FICZがインビトロでTH17分化を促進することを示す。
実施例2:インビボにおけるT H 17分化に対するAHRの役割
国際特許出願PCT/US2008/083016号、及び米国特許仮出願第60/989,309号(2007年11月20日出願)に記載のEAEモデルを用いて、FICZの効果をインビボで評価した。図2A及び表1に示すように、FICZ投与によりEAEが有意に悪化した。図2B〜2Dに示すように、FICZ投与はまた、IL−17+CD4+及びCD4+IFNγ+T細胞の頻度増加、並びにMOG35〜55によるインビトロ刺激後のIL−17及びIFNγの分泌増加にも関連していた(図2B参照)。TH17とTregとの間に存在する相互関係と一致して、FICZ処置マウスはCD4+Foxp3+Tregの頻度低下を示した(図2E)。まとめると、これらの結果はFICZがインビボでTH17分化を促進することを示す。
国際特許出願PCT/US2008/083016号、及び米国特許仮出願第60/989,309号(2007年11月20日出願)に記載のEAEモデルを用いて、FICZの効果をインビボで評価した。図2A及び表1に示すように、FICZ投与によりEAEが有意に悪化した。図2B〜2Dに示すように、FICZ投与はまた、IL−17+CD4+及びCD4+IFNγ+T細胞の頻度増加、並びにMOG35〜55によるインビトロ刺激後のIL−17及びIFNγの分泌増加にも関連していた(図2B参照)。TH17とTregとの間に存在する相互関係と一致して、FICZ処置マウスはCD4+Foxp3+Tregの頻度低下を示した(図2E)。まとめると、これらの結果はFICZがインビボでTH17分化を促進することを示す。
実施例3:肝細胞癌のインビボモデルにおけるFICZの効果
この実施例では、肝細胞癌に対するFICZ投与の効果を癌のマウスモデルにおいて評価した。
この実施例では、肝細胞癌に対するFICZ投与の効果を癌のマウスモデルにおいて評価した。
本研究は、実験用マウスの1種であり、無毛で正常胸腺が欠損しており、遺伝子変異のために免疫系の不全を有する、胸腺欠損ヌードマウス(N=7)を用いた。胸腺欠損ヌードマウスは癌の研究で用いられることが多く、その理由はマウス又は他の種由来の腫瘍細胞を拒絶しないためである。
100μgの凍結FICZ(BIOMOL International,Plymouth Meeting,PA)を、5mLのCREMOPHOR(商標)(ポリエトキシ化ヒマシ油:エタノールのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液に溶解させ、20μg/mLの希釈標準溶液を作製した。250μL(合計5μg)のHB抗原を処置群Cに注入した。実験は、以下のように実施した。
Vernierノギスを用いて腫瘍の大きさを3次元で測定し、腫瘍体積は、半径が平均腫瘍寸法の半分である球形であると仮定して計算した:TV(mm3)=d2×D/2。腫瘍を週2回測定し、マウスを日常的にモニタして処置効果を評価した。結果は、FICZの投与が腫瘍の成長を抑制することを示した。
更に、血清AFP濃度をモニタした;AFPはHCCの認められた腫瘍マーカーである。結果を図3A及び3Bに示す。処置開始7日後(図3A)及び14日後(図3B)にAFP濃度を測定したところ、FICZは腫瘍の成長を著しく抑制している。更に、FICZの投与とHBsAGの投与とを含む併用処置は、FICZ単独より若干良好な結果をもたらし、これは腫瘍関連抗原の同時投与により相乗作用が得られることを示す。
6週目に動物を屠殺し、脾臓から得られた細胞に対してFACS選別を実施してT細胞を単離及び精製し、以下を測定する:Hep3B及びHCC溶解物に対する脾細胞の増殖;サイトカイン:IFN、IL17、TGF IL6、IL2、IL10;HBsAgに対するT細胞の細胞傷害性;並びにCD4及びCD8中のパーフォリン。
実施例4:硬骨魚類ゼブラフィッシュにおけるT H 17
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)のような硬骨魚類の免疫系は、幾つかの面で哺乳類の免疫系に類似している。哺乳類の自己免疫病態に関連しているマクロファージ、T細胞、B細胞(Langenau and Zon,Nat Rev Immunol.5,307−317(2005))、並びにサイトカインIL−17(Gunimaladevi et al.,Fish Shellfish Immunol 21,393−403(2006))、IFNg(Robertsen,Fish Shellfish Immunol 20,172−191(2006))及びTNFa(Clay et al.,Immunity 29,283−294(2008))、及び転写因子T−bet(Takizawa et al.,Mol Immunol 45,127−136(2008))、及びレチノイド関連オーファン受容体(Flores et al.,Gene Expr Patterns 7,535−543(2007))が硬骨魚類で報告されている。哺乳類と同様に、硬骨魚類の免疫レパートリは、組み換え及び突然変異機構により生成される(Boehm,Cell 125,845−858(2006);Boehm and Bleul,Immunol 8,131−135(2007);Cooper and Alder,Cell 124,815−822(2006);Langenau and Zon,Nat Rev Immunol.5,307−317(2005);Pancer and Cooper,Annu Rev Immunol.24,497−518(2006))。しかしながら、これらのプロセスは潜在的に有害な自己反応性免疫受容体を生成する恐れがあるが、適応自己免疫及び免疫調節機構の可能性は低級顎口類では未だ特徴付けされていない。実際Foxp3にドライブされる末梢性トレランスは、脊椎動物の進化において最近適応したものであると仮定されている(Boehm,Cell 125,845−858(2006))。
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)のような硬骨魚類の免疫系は、幾つかの面で哺乳類の免疫系に類似している。哺乳類の自己免疫病態に関連しているマクロファージ、T細胞、B細胞(Langenau and Zon,Nat Rev Immunol.5,307−317(2005))、並びにサイトカインIL−17(Gunimaladevi et al.,Fish Shellfish Immunol 21,393−403(2006))、IFNg(Robertsen,Fish Shellfish Immunol 20,172−191(2006))及びTNFa(Clay et al.,Immunity 29,283−294(2008))、及び転写因子T−bet(Takizawa et al.,Mol Immunol 45,127−136(2008))、及びレチノイド関連オーファン受容体(Flores et al.,Gene Expr Patterns 7,535−543(2007))が硬骨魚類で報告されている。哺乳類と同様に、硬骨魚類の免疫レパートリは、組み換え及び突然変異機構により生成される(Boehm,Cell 125,845−858(2006);Boehm and Bleul,Immunol 8,131−135(2007);Cooper and Alder,Cell 124,815−822(2006);Langenau and Zon,Nat Rev Immunol.5,307−317(2005);Pancer and Cooper,Annu Rev Immunol.24,497−518(2006))。しかしながら、これらのプロセスは潜在的に有害な自己反応性免疫受容体を生成する恐れがあるが、適応自己免疫及び免疫調節機構の可能性は低級顎口類では未だ特徴付けされていない。実際Foxp3にドライブされる末梢性トレランスは、脊椎動物の進化において最近適応したものであると仮定されている(Boehm,Cell 125,845−858(2006))。
これらの動物における自己免疫反応は、完全フロイントアジュバント(CFA)中に乳化させたゼブラフィッシュ脳ホモジネート(zCNS)で腹腔内(ip)免疫化された6ヶ月齢のゼブラフィッシュで研究された。
zCNS及びその誘導ペプチドに対するzCNS免疫誘導自己抗体の存在(ゼブラフィッシュミエリンマイクロアレイを用いて検出された(Quintana et al.,Proc Natl Acad Sci USA 101 Suppl 2,14615−14621(2004);Robinson et al.,Nat Biotechnol.21,1033−1039(2003)))、並びにzCNSで免疫化されたゼブラフィッシュの脳におけるCD3、IFNγ及びIL−17発現細胞の蓄積により証明されるように、自己免疫脳脊髄炎が検出された(図4A〜4C)。
これらの結果は、ゼブラフィッシュが、適応抗原特異的自己免疫反応を開始させ得ることを示す。
ゼブラフィッシュにおけるzFoxp3の機能を更に調べるために、zFoxp3を過剰発現させた、或いはゼブラフィッシュの発生中の胚においてノックアウトした。
メーカの説明書に従ってTOPO(登録商標)PCRクローニングキット(Invitrogen,CA,USA)を用いることにより、ゼブラフィッシュの腎臓から調製したcDNAからzFoxp3をクローニングした。
ゼブラフィッシュの卵を産卵後1時間以内に回収し、精製プラスミド又はモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを、自動注入器に接続されているガラス細針で微量注入した。zFoxp3
及び5塩基が不一致である対照オリゴヌクレオチド
の翻訳をブロックするよう設計されたモルホリノオリゴヌクレオチドを設計し、Gene Tools(Philomath,OR)により合成した。各モルホリノヌクレオチドを、1〜4細胞期で胚の卵黄に注入した。
及び5塩基が不一致である対照オリゴヌクレオチド
の翻訳をブロックするよう設計されたモルホリノオリゴヌクレオチドを設計し、Gene Tools(Philomath,OR)により合成した。各モルホリノヌクレオチドを、1〜4細胞期で胚の卵黄に注入した。
zFoxp3発現コンストラクトの微量注入により、zFoxp3レベルがアップレギュレートされ、同時にIL−17レベルはダウンレギュレートされた。反対に、zFoxp3の翻訳をブロックするよう設計されたモルホリノオリゴヌクレオチドの微量注入は、IL−17発現のアップレギュレーションを導き、これは5塩基が不一致である陰性対照モルホリノの注入では見られなかった(図4D)。
更に、哺乳類細胞で述べたように、発生中のゼブラフィッシュ胚を高親和性AHRリガンドである2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシン(TCDD)で処理すると、zFoxp3発現が用量依存的に増加し;この増加は同時にIL−17発現をダウンレギュレートした。
全体として、これらの結果は、zFoxp3が哺乳類におけるFoxp3のゼブラフィッシュ機能的相同体であることを示す。zFoxp3の増加はTregを増加させ、一方Foxp3発現の減少によりIL−17レベルは増加する。
実施例4:FICZ担持(loaded)ナノ粒子の投与はEAEを悪化させる
上述のように、AHRリガンドであるFICZを1μg/マウスの単一用量投与するとEAEが悪化する。金コロイドは、関節リウマチの治療に50年以上用いられており、これら金コロイドナノ粒子は長期毒性又は有害作用をほとんど有しないことが示されている(Paciotti et al.,Drug Deliv.11,169(May−Jun,2004))。金コロイドナノ粒子は寸法が小さいため(直径10〜100nm)、その上に複数の小さいタンパク質又は他の分子がコンジュゲートすることができる大きな表面積を有する(Paciotti et al.,Drug Deliv.11,169(May−Jun,2004))。金コロイドナノ粒子のPEG化は、共有結合している分子の全体的安定性を著しく高める(Qian et al.,Nat Biotechnol.26,83(Jan,2008))。更に、近年ではPEG化金コロイドナノ粒子が特定の抗体に結合して、その抗体が特定の細胞型を標的とするようにできることが示されている(Qian et al.,Nat Biotechnol.26,83(Jan,2008))。したがって、FICZの半減期を増加させるため、またFICZによる特定の細胞型のターゲティングを促進するために、AHRリガンドを担持した、ポリエチレングリコールでコーティングされた(PEG化)金コロイドナノ粒子を構築した(図5)。
上述のように、AHRリガンドであるFICZを1μg/マウスの単一用量投与するとEAEが悪化する。金コロイドは、関節リウマチの治療に50年以上用いられており、これら金コロイドナノ粒子は長期毒性又は有害作用をほとんど有しないことが示されている(Paciotti et al.,Drug Deliv.11,169(May−Jun,2004))。金コロイドナノ粒子は寸法が小さいため(直径10〜100nm)、その上に複数の小さいタンパク質又は他の分子がコンジュゲートすることができる大きな表面積を有する(Paciotti et al.,Drug Deliv.11,169(May−Jun,2004))。金コロイドナノ粒子のPEG化は、共有結合している分子の全体的安定性を著しく高める(Qian et al.,Nat Biotechnol.26,83(Jan,2008))。更に、近年ではPEG化金コロイドナノ粒子が特定の抗体に結合して、その抗体が特定の細胞型を標的とするようにできることが示されている(Qian et al.,Nat Biotechnol.26,83(Jan,2008))。したがって、FICZの半減期を増加させるため、またFICZによる特定の細胞型のターゲティングを促進するために、AHRリガンドを担持した、ポリエチレングリコールでコーティングされた(PEG化)金コロイドナノ粒子を構築した(図5)。
AHRリガンドであるFICZ、ITE、又はTCDDを備えるPEG化金コロイドナノ粒子は、典型的な光吸収スペクトルを示した(図6A〜6B)。更に、FICZ、ITE、又はTCDD担持ナノ粒子は、AHRレポーター細胞株におけるルシフェラーゼ発現を、10nMのTCDDにより得られるレベルと同程度まで活性化した。
AHRリガンド担持ナノ粒子のインビボにおける機能を調べるために、ナイーブC57BL/6マウスでEAEを誘導し、0日目から開始して、45フェントモルのナノ粒子で毎週該マウスを処置した。上記結果と同様に、TCDDによる処置は、EAEを完全に抑制し、一方AHRリガンドであるFICZは疾患を悪化させた(図7)。ITE担持ナノ粒子の毎週投与により、EAE発達が著しく阻害された(図7)。
実施例5:AHRの調節因子を同定するためのAHRレポーター系
Renillaルシフェラーゼ(Ren)に融合しているFoxp3をコードしているコンストラクトを作製して、AHRの発現を増加させ(延いては対照と比べてルシフェラーゼ発現及び蛍光を増加させる)、又はAHRの発現を減少させる(延いては対照と比べてルシフェラーゼ発現及び蛍光を減少させる)化合物を同定するための簡単なアッセイを提供する。記載されているように(Bettelli et al.,Proc Natl Acad Sci USA 102,5138−5143(2005))、AHRレポータールシフェラーゼコンストラクト及び正規化するためのTK−RenillaルシフェラーゼコンストラクトでHEK293細胞をトランスフェクトした。
Renillaルシフェラーゼ(Ren)に融合しているFoxp3をコードしているコンストラクトを作製して、AHRの発現を増加させ(延いては対照と比べてルシフェラーゼ発現及び蛍光を増加させる)、又はAHRの発現を減少させる(延いては対照と比べてルシフェラーゼ発現及び蛍光を減少させる)化合物を同定するための簡単なアッセイを提供する。記載されているように(Bettelli et al.,Proc Natl Acad Sci USA 102,5138−5143(2005))、AHRレポータールシフェラーゼコンストラクト及び正規化するためのTK−RenillaルシフェラーゼコンストラクトでHEK293細胞をトランスフェクトした。
細胞を様々な濃度のAHRリガンドTCDDと共にインキュベートし、dual luciferaseアッセイキット(New England Biolabs,Ipswich,MA)を用いてAHRレポーターの活性化をアッセイした。Tk−Renillaを標準化に用いた。図8に示す結果は、予想された通りコンストラクトはAHRリガンドTCDDに応答し、レポーターの発現が用量依存的に増加することを示す。
実施例6:bNFによるT細胞のT H 17細胞への分化
T細胞のTH17細胞への分化に対して同じ効果を有する他のAHRリガンドが存在するかどうかを決定するために、AHRリガンドβ−ナフトフラボン(bNF、Sigma−Aldrich)を評価した。
T細胞のTH17細胞への分化に対して同じ効果を有する他のAHRリガンドが存在するかどうかを決定するために、AHRリガンドβ−ナフトフラボン(bNF、Sigma−Aldrich)を評価した。
簡潔に述べると、bNF又はFICZ(100nM)が存在してもしなくても、記載されているように(Nature 2008;454(7202):350−2)TGF−β及びIL−21の存在下で、T細胞はCD3及びCD28に対する抗体によるインビトロ活性化によりTH17細胞に分化した。IL−17産生はリアルタイムPCRにより測定した。
図9に示す結果は、bNFがT細胞のTH17細胞への分化に対して同じ効果を有することを示す。
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前述の記載は添付の特許請求の範囲により規定されている本発明の範囲を例示することを意図し、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内
である。
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前述の記載は添付の特許請求の範囲により規定されている本発明の範囲を例示することを意図し、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内
である。
Claims (17)
- T細胞の初期集団を提供する段階と、
該細胞集団を、6−ホルミルインドロ[3,2−b]カルバゾール(FICZ)又はβ−ナフトフラボン(bNF)を含む十分な量の組成物と接触させる段階と、
任意で集団中のTH17細胞の存在及び/又は数を評価する段階と
を含む、T細胞の初期集団からIL−17産生T細胞(TH17)に富む集団を調製する方法であって、
前記方法により集団中の制御性TH17細胞の数が増加する、方法。 - T細胞の初期集団がナイーブT細胞又はCD4+CD62リガンド+T細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- TH17媒介性免疫反応の増強により利益を得る障害に罹患している対象に、前記障害の症状を改善する又は寛解させるのに十分な量のTH17細胞を投与することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- T細胞集団がインビトロで存在する方法であって、有効量のインターロイキン−6(IL−6)及び形質転換成長因子(TGF)−βの一方又は両方を細胞と接触させることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 対象に投与するための富化集団を調製することを更に含む、請求項4に記載の方法。
- TH17媒介性免疫反応の増強により利益を得る疾患に罹患している対象を治療する方法であって、
免疫を増加させる治療を必要としている対象を同定する段階と、
治療有効量の6−ホルミルインドロ[3,2−b]カルバゾール(FICZ)又はβ−ナフトフラボン(bNF)を含む組成物を対象に投与する段階と
を含み、
それにより対象を治療する方法。 - 対象が、ウイルス、細菌、真菌、及び原生動物から成る群から選択される病原体に感染している、請求項6に記載の方法。
- 対象が癌に罹患している、請求項6に記載の方法。
- FICZ又はbNFが生体適合性ナノ粒子に結合している、請求項1または6に記載の方法。
- T細胞、B細胞、樹状細胞、又はマクロファージ上に存在する抗原に選択的に結合する抗体を細胞と接触させることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 抗体が生体適合性ナノ粒子に結合している、請求項10に記載の方法。
- T細胞、B細胞、樹状細胞、又はマクロファージ上に存在する抗原に選択的に結合する抗体を投与することを更に含む、請求項6に記載の方法。
- 抗体が生体適合性ナノ粒子に結合している、請求項12に記載の方法。
- FICZ又はbNFと抗体とが同じナノ粒子上に共存している、請求項13に記載の方法。
- 対象の疾患に関連する抗原を投与することを更に含む、請求項6に記載の方法。
- 抗原が腫瘍関連抗原である、請求項8に記載の方法。
- 抗原が、ウイルス、細菌、真菌、及び原生動物から成る群から選択される病原体に関連している、請求項7に記載の方法。
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