JP2023526453A - 膵炎の治療及び膵臓がんの予防のための方法 - Google Patents

Abstract

膵炎の治療及び／又は膵臓がんの予防のための方法が本明細書において提供される。治療は、腺房－導管異形成（ＡＤＭ）の誘導物質、例えばマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路のアゴニスト、例えばＢＲＡＦ阻害剤、又はエピジェネティック修飾因子、例えばブロモドメイン余剰末端モチーフ（ＢＥＴ）阻害剤の投与を含み得る。【選択図】なし

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２０年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０２７，２０９号の優先権の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

［技術分野］
本発明は、全般に、薬理学及び医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、膵炎の治療及び／又は膵臓がんの予防のための組成物及び方法に関する。

腫瘍と炎症との間の関連は、旧来の臨床的に観察されてきた（Ｖｉｒｃｈｏｗ，１８６３）。多くの研究は、炎症性微小環境ががん細胞における生存及び増殖のプログラムの活性化を介して腫瘍成長を促進し得ることを実証したが（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｇｒｉｖｅｎｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、損傷時に組織の完全性を再確立することを目的とした、損傷に対する進化的に保存された応答である炎症が腫瘍形成に不可欠であり得る理由は依然として不明である。

予後不良を特徴とする腫瘍であるＰＤＡＣ（Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）は、炎症と活性化がん遺伝子との間の協働の特徴的な例である。慢性膵炎に関連して頻繁に発症するＰＤＡＣは、炎症性微小環境と関係がある（Ｓｔｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。多数の実験モデルにわたる実質的な証拠によって裏付けられるように、発がん性ＫＲＡＳを発現する膵臓組織における炎症の誘導は、腫瘍進行を加速させ（Ｇｉｄｅｋｅｌ Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｇｕｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、浸潤性腫瘍に進展し得る腫瘍性前駆病変、例えば腺房－導管異形成（ＡＤＭ）及び膵上皮内腫瘍性病変（ＰａｎＩＮ）の出現を誘導する（Ｋｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｌｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）が、ＰａｎＩＮ非依存性進行の代替モデルが仮定されている（Ｎｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｒｅａｌ，２００３）。興味深いことに、新生物発生前の膵臓変化、特にＡＤＭは、明らかにがん遺伝子活性化の非存在下で急性及び慢性膵炎において以前に同定されている（Ｓｔｏｒｚ，２０１７；Ｍｉｙａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｐｒｅｖｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｓａｎｄｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ＡＤＭは、腺房細胞のアイデンティティのリプログラミングの結果としての膵臓酵素の発現の迅速な遮断にあるので、それは組織損傷を制限することを目的とした炎症に対する適応応答を表し得る。この概念的フレームワークでは、ＫＲＡＳの活性化変異など、ＡＤＭを促進又は安定化することができる任意の遺伝的事象及びエピジェネティック事象は、炎症組織内の変異細胞の排除の障害及びポジティブセレクションをもたらし得る。したがって、膵炎の治療及び膵臓がんの予防のためのより良好な療法を開発するために、炎症過程と膵臓腫瘍形成との間の関係をよりよく理解するという未だ満たされないニーズがある。

本開示の態様は、膵炎を治療するための方法及び組成物に関する。膵臓がんを予防するための方法及び組成物も開示される。本開示は、腺房－導管異形成（ＡＤＭ）誘導物質、例えばＭＡＰＫアゴニスト及びエピジェネティック修飾因子を含む組成物、並びに膵炎の治療及び／又は膵臓がんの予防におけるその使用方法を含む。

本開示の実施形態は、膵炎を治療する方法、膵炎を予防する方法、膵臓がんを予防する方法、膵臓がんを治療する方法、膵臓の炎症を軽減する方法、膵臓の組織損傷を抑制する方法、疼痛を軽減する方法、ＡＤＭを誘導する方法、ＭＡＰＫシグナル伝達を活性化する方法、及びＡＤＭ誘導物質を含む組成物を含む。本開示の方法は、以下の工程の少なくとも１、２、３、又はそれ以上を含み得る：ＡＤＭ誘導物質を対象に投与する工程、ＭＡＰＫアゴニストを対象に投与する工程、エピジェネティック修飾因子を対象に投与する工程、対象においてＡＤＭを検出する工程、対象を膵炎を有すると診断する工程、対象を膵臓がんを有すると診断する工程、対象にがん療法を投与する工程、及び対象に抗炎症剤を投与する工程。前述の工程のいずれか１つ又は複数は、本開示のある特定の実施形態から除外されてもよい。本開示の組成物は、以下の成分の少なくとも１、２、３、又はそれ以上を含み得る：ＡＤＭ誘導物質、ＭＡＰＫアゴニスト、エピジェネティック修飾因子、サイトカイン、ＢＲＡＦ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＢＥＴ阻害剤、及びＢＲＤ４阻害剤。前述の成分のいずれか１つ又は複数は、本開示のある特定の実施形態から除外されてもよい。

一実施形態では、本開示は、対象において膵炎を治療及び／又は膵臓がんを予防する方法であって、有効量の腺房－導管異形成（ＡＤＭ）の誘導物質を対象に投与することを含む方法を提供する。特定の態様では、対象はヒトである。

いくつかの態様では、本方法は、膵炎を治療することを含む。いくつかの態様では、本方法は、膵炎を予防することを含む。いくつかの態様では、本方法は、有効量のＡＤＭ誘導物質を対象に投与することを含む、対象において膵炎を治療又は予防することを含む。いくつかの態様では、本方法は、有効量のＡＤＭ誘導物質を対象に投与することを含む、対象において膵臓がんを予防することを含む。

特定の態様では、膵臓がんは、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）である。

いくつかの態様では、ＡＤＭの誘導物質はエピジェネティック修飾因子である。特定の態様では、エピジェネティック修飾因子は、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、又はＢＲＤＴ阻害剤などのブロモドメイン余剰末端（ｅｘｔｒａ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）モチーフ（ＢＥＴ）阻害剤である。特定の態様では、ＢＥＴ阻害剤はＢＲＤ４阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤である。例えば、ＢＲＤ４阻害剤は、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＧＳＫ５２５７６２Ａ／Ｉ－ＢＥＴ７６２、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＡＢＢＶ－０７５、ＯＴＸ０１５／ＭＫ－８６２８、ＧＳＫ２８２０１５１／Ｉ－ＢＥＴ１５１、ＰＬＸ５１１０７、ＡＢＢＶ－７４４、又はＡＺＤ５１５３である。いくつかの態様では、エピジェネティック修飾因子は、小分子、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）又はデグロンである。

ある特定の態様では、ＡＤＭ誘導物質はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）アゴニストである。いくつかの態様では、ＭＡＰＫアゴニストは、ＢＲＡＦ阻害剤、ＴＧＦα、又はＥＧＦである。特定の態様では、ＭＡＰＫアゴニストはＴＧＦα又はＥＧＦである。いくつかの態様では、ＭＡＰＫアゴニストは、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ）、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０、ソラフェニブ、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６）、ＡＺ６２８、ＬＧＸ８１８、ＮＶＰ－ＢＨＧ７１２などのＢＲＡＦ阻害剤である。特定の態様では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ＳＯＳ活性化因子及び／又はＧＥＦ阻害剤である。いくつかの態様では、ＢＲＡＦ阻害剤はＰＬＸ４０３２である。

いくつかの態様では、対象はＲＡＦ野生型であると判定される。ある特定の態様では、対象には、トラメチニブなどのＭＥＫ阻害剤は投与されない。

ある特定の態様では、ＭＡＰＫアゴニストを投与することによりＫＲＡＳ変異を防止する。特定の態様では、ＡＤＭ誘導物質を投与することが、ＡＤＭ誘導物質を投与されていない対象と比較して、膵臓細胞における組織損傷及び／又は炎症を予防又は減少させる。特定の態様では、炎症の減少は、炎症浸潤、血清炎症性生化学マーカー、浮腫及び疼痛の減少によって測定される。いくつかの態様では、組織損傷の減少は、リパーゼ、アミラーゼ、トリプシノーゲン及び／又は乳酸デヒドロゲナーゼなどの血清生化学マーカーによって測定される。

追加の態様では、本方法は、少なくとも第２の療法を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、少なくとも第２の療法は抗炎症剤及び／又は免疫療法である。ある特定の態様では、少なくとも第２の療法は、ＡＤＭ誘導物質と同時に投与される。特定の態様では、少なくとも第２の療法は、ＡＤＭ誘導物質と連続して投与される。特定の態様では、少なくとも第２の療法は抗炎症剤である。いくつかの態様では、抗炎症剤は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）及び／又はステロイドである。ある特定の態様では、ＡＤＭ誘導物質は、経口投与、脂肪内投与、皮内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、腹腔内投与、直腸内投与、静脈内投与、リポソーム投与、局所投与、粘膜投与、非経口投与、直腸投与、皮下投与、舌下投与、バッカル投与、経皮投与、カテーテルを介して、洗浄液を介して、連続注入を介して、注入を介して、吸入を介して、注射を介して、又は局所送達を介して投与される。いくつかの態様では、ＡＤＭ誘導物質は、対象に１回投与される。他の態様では、ＡＤＭ誘導物質は、対象に２回以上投与される。

さらなる実施形態は、対象において膵炎の治療及び／又は膵臓がんの予防に使用するための有効量のＡＤＭ誘導物質を含む組成物を提供する。

いくつかの態様では、ＡＤＭ誘導物質はＭＡＰＫアゴニストである。特定の態様では、ＭＡＰＫアゴニストは、ＢＲＡＦ阻害剤、ＴＧＦα、又はＥＧＦである。特定の態様では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ）、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０、ソラフェニブ、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６）、ＡＺ６２８、ＬＧＸ８１８、又はＮＶＰ－ＢＨＧ７１２である。一態様では、ＢＲＡＦ阻害剤はＰＬＸ４０３２である。

ある特定の態様では、ＡＤＭの誘導物質はエピジェネティック修飾因子である。いくつかの態様では、エピジェネティック修飾因子は、ブロモドメイン余剰末端モチーフ（ＢＥＴ）阻害剤である。ある特定の態様では、ＢＥＴ阻害剤は、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＧＳＫ５２５７６２Ａ／Ｉ－ＢＥＴ７６２、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＡＢＢＶ－０７５、ＯＴＸ０１５／ＭＫ－８６２８、ＧＳＫ２８２０１５１／Ｉ－ＢＥＴ１５１、ＰＬＸ５１１０７、ＡＢＢＶ－７４４、又はＡＺＤ５１５３などのＢＲＤ４阻害剤である。ある特定の態様では、エピジェネティック修飾因子は、小分子、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＰＲＯＴＡＣ又はデグロンである。

特定の態様では、対象はヒトである。いくつかの態様では、膵炎は、慢性膵炎又は急性膵炎である。特定の態様では、膵臓がんはＰＤＡＣである。

いくつかの態様では、ＡＤＭ誘導物質は、ＫＲＡＳ変異、組織損傷及び／又は炎症を予防する。

追加の態様では、本方法は、少なくとも第２の療法をさらに含む。いくつかの態様では、少なくとも第２の療法は抗炎症剤及び／又は免疫療法である。ある特定の態様では、少なくとも第２の療法は抗炎症剤である。特定の態様では、抗炎症剤はステロイド及び／又はＮＳＡＩＤである。

別の実施形態は、対象において膵臓の組織損傷及び／又は炎症を阻害する方法であって、有効量のＡＤＭ誘導物質を該対象に投与することを含む方法を提供する。

いくつかの態様では、ＡＤＭの誘導物質はエピジェネティック修飾因子である。特定の態様では、エピジェネティック修飾因子は、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、又はＢＲＤＴ阻害剤などのブロモドメイン余剰末端モチーフ（ＢＥＴ）阻害剤である。特定の態様では、ＢＥＴ阻害剤はＢＲＤ４阻害剤である。例えば、ＢＲＤ４阻害剤は、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＧＳＫ５２５７６２Ａ／Ｉ－ＢＥＴ７６２、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＡＢＢＶ－０７５、ＯＴＸ０１５／ＭＫ－８６２８、ＧＳＫ２８２０１５１／Ｉ－ＢＥＴ１５１、ＰＬＸ５１１０７、ＡＢＢＶ－７４４、又はＡＺＤ５１５３である。いくつかの態様では、エピジェネティック修飾因子は、小分子、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＰＲＯＴＡＣ又はデグロンである。

ある特定の態様では、ＡＤＭ誘導物質はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）アゴニストである。いくつかの態様では、ＭＡＰＫアゴニストは、ＢＲＡＦ阻害剤、ＴＧＦα、又はＥＧＦである。特定の態様では、ＭＡＰＫアゴニストはＴＧＦα又はＥＧＦである。いくつかの態様では、ＭＡＰＫアゴニストは、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ）、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０、ソラフェニブ、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６）、ＡＺ６２８、ＬＧＸ８１８、ＮＶＰ－ＢＨＧ７１２などのＢＲＡＦ阻害剤である。特定の態様では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ＳＯＳ活性化因子及び／又はＧＥＦ阻害剤である。いくつかの態様では、ＢＲＡＦ阻害剤はＰＬＸ４０３２である。

本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は、１又は複数を意味し得る。本明細書において（１又は複数の）特許請求の範囲で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と併せて使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」という単語は、１又は複数を意味し得る。

本明細書及び（１又は複数の）特許請求の範囲で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などのｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（並びに「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」などのｈａｖｉｎｇの任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇの任意の形態）又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（並びに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などのｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの任意の形態）は、包括的又はオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素又は方法工程を排除するものではない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の文脈で本明細書に記載される実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語の文脈でも実施され得ることが企図される。

特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すことが明示的に示されない限り、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は代替物のみと、「及び／又は」とを指すという定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２又はそれ以上を意味し得る。

「本質的に」という用語は、方法又は組成物が特定の工程又は材料のみと、それらの方法及び組成物の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものとを含むことを理解されたい。

本明細書で使用される場合、特定の物質又は材料を「実質的に含まない」組成物又は媒体は、３０％以下、２０％以下、１５％以下、より好ましくは１０％以下、さらにより好ましくは５％以下、又は最も好ましくは１％以下の該物質又は材料を含有する。

本明細書で使用される「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、関連する基本機能に変化をもたらすことなく許容範囲で変化し得る任意の定量的比較、値、測定、又は他の表現を修飾するために適用され得る。

本出願を通して、「約」という用語は、値が測定又は定量方法の誤差の固有の変動を含むことを示すために使用される。

本明細書で使用する場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」は、特定の成分が意図的に組成物に配合されておらず、及び／又は汚染物質として、若しくは微量でのみ存在することを意味するために本明細書で使用される。したがって、組成物の意図しない汚染から生じる特定の成分の総量は、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは０．０１％を下回る。最も好ましいのは、特定の成分の量が標準的な分析方法で検出できない組成物である。

治療的、診断的、又は生理学的な目的又は効果の文脈における任意の方法はまた、記載された治療的、診断的、又は生理学的な目的又は効果を達成又は実施するための本明細書で論じられる任意の化合物、組成物、又は薬剤の「使用」などの「使用」請求項の文言に記載され得る。

様々な実施形態が本出願を通して論じられる。一態様に関して論じられた任意の実施形態は、他の態様にも適用され、その逆も同様である。本明細書に記載の各実施形態は、すべての態様に適用可能な実施形態であると理解される。本明細書で論じられる任意の実施形態は、任意の方法又は組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であることが企図される。さらに、組成物及びキットを使用して、本明細書に開示の方法を達成することができる。

本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになると思われる。しかし、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の精神及び範囲内のさまざまな変更及び修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるため、単なる例示として示されていることを理解されたい。

特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの（１又は複数の）図面を伴うこの特許又は特許出願公開の写しは、請求及び必要な料金の支払いに応じて特許庁によって提供される。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに明示するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１又は複数を参照することにより、よりよく理解することができる。

一過性炎症は、消散後長時間にわたり腫瘍進行を促進する。 （図１Ａ） 図１Ａは、実験計画を表す概略図である。簡単に述べると、ｉＫＲＡＳマウスを２日間（－Ｄ２－Ｄ１）、セルレイン（ｃａｅｒｕｌｅｉｎ）（ＣＡＥ）で処置して急性膵炎を誘導し、次いで４週間モニターする。膵臓が膵炎から完全に回復したら（Ｄ２８）、ＣＡＥ処置マウス及び対照マウスをドキシサイクリンに供して、変異したＫＲＡＳの発現を誘導し、腫瘍発生を追跡する。 （図１Ｂ） 図１Ｂは、膵炎誘導後の異なる時点での膵臓試料の組織学的分析の図である。浮腫及び浸潤がＣＡＥ処置の終了時に現れ、１日目に増加し（Ｄ１）、膵臓が正常な構造を再獲得する７日目（Ｄ７）までに完全に消散する（スケールバー－１００μｍ）。 （図１Ｃ） 図１Ｃは、膵炎誘導後の異なる時点での、膵臓試料のＣＤ４５及びＫｉ６７についての免疫染色の図である。ＣＡＥ処置後１日目（Ｄ１）にＣＤ４５陽性細胞の強い小葉内浸潤が存在し、７日目（Ｄ７）までにシグナルが消失する。同様に、Ｋｉ６７染色は、多くの異なる細胞が陽性を示す１日目（Ｄ１）に強く増加し、次いでシグナルは経時的に減少し、２８日目（Ｄ２８）までに消失する（スケールバー－１００μｍ）。 （図１Ｄ） 図１Ｄは、異なる時点での膵臓試料のＮＦｋＢ（ｐ－Ｓｅｒ５３６、赤）、管マーカーＤＢＡ（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）の免疫蛍光を示す図である。１日目（Ｄ１）にのみ、異なる細胞型、主に上皮の核がＮＦｋＢについて陽性であり、炎症がその後の時点で分子的に消散されることを示唆している（スケールバー－５０μｍ）。 （図１Ｅ） 図１Ｅは、ＫＲＡＳ誘導後の、炎症に以前に曝露されたマウス（セルレイン、ｎ＝２１）又は対照マウス（未処置、ｎ＝１０）のカプランマイヤー生存率の図である。 （図１Ｆ） 図１Ｆは、２匹の動物の、腫瘍（Ｔ）、胃（Ｓ）、腸（Ｂ）及び腎臓（Ｋ）のＭＲＩスキャンを示す図である。 （図１Ｇ） 図１Ｇは、以前にセルレインに曝露された動物に由来する腫瘍の組織像である（スケールバー－１００μｍ）。 （図１Ｈ） 図１Ｈは、ｇと同じ腫瘍のサイトケラチン－１９（ＫＲＴ１９）及びアミラーゼ（ＡＭＹ２Ａ）についての免疫染色の図である（スケールバー－１００μｍ）。

消散した炎症の細胞自律的効果。 （図２Ａ） 図２Ａは、蛍光に基づいた、Ｄｃｌｋ１－ＤＴＲ－ＺｓＧｒｅｅｎマウスから単離した膵臓の単一細胞懸濁液から選別した細胞：ＺｓＧｒｅｅｎ陽性（Ｄｃｌｋ１＋）、ＺｓＧｒｅｅｎ陰性（Ｄｃｌｋ１－）（ｎ＝３）の相対的な器官形成能を示す図である。 （図２Ｂ） 図２Ｂは、ｐ４８Ｃｒｅ－ｍＴ／ｍＧマウス由来の緑色オルガノイドを、ＣＡＥ処置の４８時間後に動物の膵臓に同所移植した図である。移植の４週間後に屠殺したマウス由来の膵臓の凍結切片では、ＧＦＰ陽性小葉が明らかである。ＧＦＰ（緑色）、ＤＡＰＩ（青色）。 （図２Ｃ） 図２Ｃは、実験計画を表す概略図である。簡潔には、膵炎から回復したｉＫＲＡＳ膵臓（４週間で回復）及び対照動物に由来するオルガノイドを、炎症に曝露されたことがないレシピエント動物に同所注射する。次いで、ＫＲＡＳ発現を誘導し、マウスの腫瘍発生を追跡する。 （図２Ｄ） 図２Ｄは、炎症（ＣＡＥ）から回復したマウス又は対照（ＣＴＲＬ）の膵臓由来のオルガノイドの、ピクセルｌｏｇ１０スケールで評価したオルガノイドサイズの定量化（各条件について９つの視野；ＣＡＥ ｎ＝６９、ＣＴＲＬ ｎ＝５８；ｐ＜０．０１）及び代表的な写真である。 （図２Ｅ） 図２Ｅは、ＫＲＡＳ誘導後の、膵炎（セルレイン、ｎ＝７）から回復した膵臓に由来するｉＫＲＡＳオルガノイドを移植したマウス及び対照マウス（未処置、ｎ＝５）のカプランマイヤー生存率を示す図である。 （図２Ｆ） 図２Ｆは、回復した炎症に由来するオルガノイドを注射した動物から発生した同所腫瘍及び対応する肝臓転移の組織像である（左パネル）。原発病巣及び二次病巣のＧＦＰ及びＣＤ４５についての免疫染色の図（中央及び右パネル）（スケールバー－１００μｍ）。 （図２Ｇ） 図２Ｇは、回復した炎症に由来するオルガノイドを注射した動物から発生した同所腫瘍のＤｃｌｋ１（赤色）、ＣＤ４５（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）についての免疫蛍光を示す図である（スケールバー－５０μｍ）。データは平均±標準偏差である。

炎症から回復した上皮細胞における広範な転写調節解除。 （図３Ａ） 図３Ａは、ＣＡＥによる処置後の８５７個の差次的発現遺伝子の正規化発現値を示すヒートマップである。青色及びオレンジ色は、それぞれダウンレギュレートされた遺伝子及びアップレギュレートされた遺伝子を示す。 （図３Ｂ） 図３Ｂは、膵臓細胞における発生及び発がんの間に同時制御される遺伝子を含む、ホールマークシグネチャのＫｒａｓシグナル伝達並びにＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ及びＰｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎシグネチャを示すＧＳＥＡエンリッチメントプロットである（１９）。ダウンレギュレートされた遺伝子が濃縮されているｐ５３ Ｐａｔｈｗａｙシグネチャも示されている。遺伝子は、符号付きｐ値に基づいて左から右にランク付けされ、左側の遺伝子は、ＣＡＥ処置後に有意に高い発現を示す。ＮＥＳ、正規化エンリッチメントスコア；ＦＤＲ、偽発見率。 （図３Ｃ） 図３Ｃは、疾患又は生物学的機能（Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）に関連する経路のＩＰＡ分析である。最高ランクの用語が示されている。 （図３Ｄ） 図３Ｄは、ＣＡＥ処置動物対対照動物におけるゲノム領域での差次的なＨ３Ｋ２７Ａｃエンリッチメントを示す散布図である。低アセチル化領域及び高アセチル化領域は、それぞれ青色及び赤色のドットとして表される。他の全てのアセチル化領域は、灰色のドットとして表される。 （図３Ｅ） 図３Ｅは、プロモーター及び遠位領域におけるＴＦ結合部位の過剰提示（ｏｖｅｒ－ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の図である。すべてのＲｅｆｓｅｑ遺伝子と比較して、アップレギュレートされた遺伝子のプロモーター（Ｕｐ－Ｐ）及びダウンレギュレートされた遺伝子のプロモータ（Ｄｏｗｎ－Ｐ）におけるＴＦの過剰提示ファミリーを左側に示す。右側のパネルは、（エンハンサーのＦＡＮＴＯＭ５コレクションをバックグラウンドとして使用して）差次的にアセチル化されたＴＳＳ遠位領域における過剰提示されたＴＦファミリーを示す。ヒートマップは、両側ウェルチのｔ検定によって決定されたエンリッチメントＰ値の負の対数を示す。 （図３Ｆ） 図３Ｆは、野生型動物における炎症誘導後の異なる時点（１日目Ｄ１、２８日目Ｄ２８）での管マーカーＤＢＡ（緑色）、ＤＡＰＩ（青色）及びＥｇｒ１（赤色、上部パネル）又はＳｏｘ９（赤色、下パネル）についての免疫蛍光を示す図である（スケールバー－２０μｍ）。ＥＧＲ１（右上）及びＳＯＸ９（右下）についてのｐｉｘｅｌ ｌｏｇ１０強度としての核シグナルの定量化。各実験群の３～５匹のマウス由来の膵臓組織の少なくとも７つの４０倍視野から平均３，８００個の核を計数し、解析に使用した。

Ｉｌ６は、上皮記憶のメディエーターである。 （図４Ａ） 図４Ａは、実験計画を表す概略図である。簡潔には、ｉＫＲＡＳマウス由来のオルガノイドを、急性膵炎から単離されたＣＤ４５陽性細胞の存在下又は非存在下で共培養する。１週間後、馴化オルガノイドを従来の培地にさらに４週間移し、次いでレシピエントマウスに同所移植し、ＫＲＡＳを誘導した。 （図４Ｂ） 図４Ｂは、ＫＲＡＳ誘導後の馴化オルガノイド（ＣＤ４５、ｎ＝５）、又は非馴化オルガノイド（ＣＴＲＬ、ｎ＝７）を移植したマウスのカプランマイヤー生存率の図である。 （図４Ｃ） 図４Ｃは、ＣＤ４５で１日間又は７日間馴化した培地のサイトカインアレイ、異なる抗体の吸光度を報告する図である。 （図４Ｄ） 図４Ｄは、示された時点においてＣＤ４５馴化培地（上のパネル）又はＨｙｐｅｒ－ＩＬ６ ２００ｎｇ／ｍｌ（下のパネル）に曝露したオルガノイドのｐＳｔａｔ３（蛍光体Ｔｙｒ７０５）、Ｓｔａｔ３及びＶｉｎｃｕｌｉｎのイムノブロット法の図である。 （図４Ｅ） 図４Ｅは、セルレイン処理後１日目の膵臓試料のＩＬ６（赤色）、ｐＳＴＡＴ３（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）の免疫蛍光を示す図であり（スケールバー－５０μｍ）、ＩＬ６陽性細胞の間に散在する多くの腺房構造（黄色破線）を含む多数のｐＳＴＡＴ３核陽性細胞を示す。 （図４Ｆ） 図４Ｆは、急性膵炎の間に膵臓に浸潤したＣＤ４５陽性細胞のＣｙＴＯＦ免疫表現型検査であり、ＣＤ６８、ＣＤ１１、Ｆ４／８０及びＩＬ６についてのｔＳＮＥプロットを報告する図である。 （図４Ｇ） 図４Ｇは、２００ｎｇ／ｍｌのＨｙｐｅｒ－ＩＬ６に２４時間曝露し、次いで、Ｈｙｐｅｒ－ＩＬ６を洗い流した後に指示された時点でサンプリングしたｐＳｔａｔ３（蛍光体Ｔｙｒ７０５）、Ｓｔａｔ３、Ｅｇｒ１、Ｒｕｎｘ１、Ｅｔｓ１、Ｓｏｘ９及びＶｉｎｃｕｌｉｎの免疫ブロットの図である。データは平均±標準偏差である。

組織損傷を制限するための生理学的かつ可逆的適応としてのＡＤＭ。 （図５Ａ） 図５Ａは、実験計画を表す概略図である。上皮記憶の役割を調べるために、野生型マウス又はｉＫＲＡＳマウスを、以前の急性膵炎からの完全な回復後に２回目の急性膵炎を再チャレンジした。マウスを、セルレインの２回目の投与の前日にＥＧＦ、ＭＥＫ阻害剤又はドキシサイクリン（ＫＲＡＳ誘導）で処置することによって、ＡＤＭ又はＫＲＡＳ誘導の薬理学的調節を得た。 （図５Ｂ） 図５Ｂは、ＷＴマウスにおいて急性膵炎の誘導後２４時間（－Ｄ１）で末梢血中に検出されたアミラーゼレベルを示す図である；未処置マウス（ＣＴＲＬ、ｎ＝２）、単回炎症後の記憶なしマウス（Ｓｉｎｇｌｅ、ｎ＝２）、再チャレンジ後の記憶ありマウス（Ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ、ｎ＝２）。 （図５Ｃ） 図５Ｃは、ＷＴマウスにおいて急性膵炎の誘導後２４時間（－Ｄ１）で末梢血中に検出されたＬＤＨレベルを示す図である；未処置マウス（ＣＴＲＬ、ｎ＝２）、単回炎症後の記憶なしマウス（Ｓｉｎｇｌｅ、ｎ＝２）、再チャレンジ後の記憶ありマウス（Ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ、ｎ＝２）。 （図５Ｄ） 図５Ｄは、急性膵炎の誘導後２４時間（－Ｄ１）の、記憶あり（Ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）又は記憶なし（Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）のＷＴマウスの膵臓の組織像（左パネル、スケールバー－５０μｍ）であり；前述と同じ設定の切断型カスパーゼ３（ＣＣ３－赤色）及びＤＡＰＩ（青色）についての免疫蛍光を示す図である、（右パネル、スケールバー－５０μｍ）。緑色チャネル（ＢＧ）は、染色されていないが、取得され、組織構造及び血管を強調するために使用された。 （図５Ｅ） ２日間の炎症後２４時間（１日目）の、記憶あり（Ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）又は記憶なし（Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）の野生型マウスにおけるサイトケラチン－１９（ＫＲＴ１９－赤色）、アミラーゼ（ＡＭＹ２Ａ－緑色）及びＤＡＰＩ（青色）による免疫蛍光の図である（スケールバー－５０μｍ）。 （図５Ｆ） 図５Ｆの上段のパネルは、ＥＧＦ、ＭＥＫ阻害剤又はＫＲＡＳの誘導による薬理学的処置の存在下／非存在下での再チャレンジの２４時間後（１日目）におけるｉＫＲＡＳマウスの膵臓の組織像である（スケールバー－１００μｍ）。図５Ｆの下の段のパネルは、ｉＫＲＡＳ再チャレンジマウスにおける損傷評価であり、ＥＧＦ、ＭＥＫ阻害剤又はＫＲＡＳの誘導による薬理学的処置の存在下／非存在下での再チャレンジの２４時間後（１日目）における切断型カスパーゼ３（ＣＣ３－赤色）及びＤＡＰＩ（青色）の免疫蛍光を示す図である。緑色チャネル（ＢＧ）は、染色されていないが、取得されており、組織構造及び血管を強調するために使用された（スケールバー－１００μｍ）。 （図５Ｇ） 図５Ｇは、ｆの上のパネルと同じ設定でのＡＤＭ相対面積定量化である；再チャレンジ（ＣＴＲＬ、ｎ＝４）、再チャレンジ＋ＥＧＦ（ＥＧＦ、ｎ＝４）、再チャレンジ＋ＭＥＫ阻害剤（ＭＥＫｉ、ｎ＝４）、再チャレンジ＋ＫＲＡＳ誘導（ＫＲＡＳ、ｎ＝４）。 （図５Ｈ） 図５Ｈは、ｆの下のパネルと同じ設定での切断型カスパーゼ３陽性面積（Ｌｏｇ１０スケール）としての膵臓損傷定量化である；再チャレンジ（ＣＴＲＬ、ｎ＝８）、再チャレンジ＋ＥＧＦ（ＥＧＦ、ｎ＝９）、再チャレンジ＋ＭＥＫ阻害剤（ＭＥＫｉ、ｎ＝７）、再チャレンジ＋ＫＲＡＳ誘導（ＫＲＡＳ、ｎ＝６）。データは平均±標準偏差である。

（図６Ａ） 図６Ａは、Ｋｉ６７陽性細胞の異なる性質を示す、ＣＡＥ処理後１日目（Ｄ１）の膵臓試料のＫｉ６７についての免疫染色の図である（スケールバー－１００μｍ）：腺房間質（１）、腺房（２）、腺房中心（３）。 （図６Ｂ） 図６Ｂは、Ｋｉ６７陽性細胞の異なる性質を示す、ＣＡＥ処置後１日目（Ｄ１）の膵臓試料又は対照膵臓（ＣＴＲＬ）のＫｉ６７（白色）、ＤＢＡ（緑色）及びＤＡＰＩ（赤色）についての免疫蛍光を示す図である（スケールバー－２０μｍ）：管（４）、腺房（２）。 （図６Ｃ） 図６Ｃは、組織に浸潤する活性化ＣＤ４５陽性細胞を示す、ＣＡＥ処置後１日目（Ｄ１）の膵臓試料のＫｉ６７（白色）、ＤＢＡ（緑色）及びＣＤ４５（赤色）についての免疫蛍光を示す図である（スケールバー－１００μｍ）。 （図６Ｄ） 図６Ｄは、炎症誘導後の異なる時点での膵臓試料のｐＳＴＡＴ３（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）についての免疫蛍光を示す図である。１日目（Ｄ１）にのみ、細胞は強い核シグナルを示す（スケールバー－５０μｍ）。 （図６Ｅ） （図６Ｅ） 図１Ｅと同じマウスのカプランマイヤー生存率の図である。炎症誘導前にＫＲＡＳ発現が誘導されたマウス（在来型、ｎ＝７）をさらに示す。

（図７Ａ） 図７Ａは、Ｄｃｌｋ１－ＤＴＲ－ＺｓＧｒｅｅｎマウスモデルを作製するための構築物の図である。 （図７Ｂ） 図７Ｂは、Ｄｃｌｋ１－ＤＴＲ－ＺｓＧｒｅｅｎ動物から単離された膵臓細胞の選別ゲートを表す密度プロットである。 （図７Ｃ） 図７Ｃは、炎症から回復した野生型マウス（ＣＡＥ、ｎ＝３）又は対照（ＣＴＲＬ、ｎ＝３）の膵臓からプレーティングした１０５細胞あたりのオルガノイド数の定量化の図である。 （図７Ｄ） 図７Ｄは、対照動物又はＣＡＥ回復動物に由来するオルガノイドのカドヘリンＥ（ＣＤＨ１、赤色）、サイトケラチン１９（ＫＲＴ１９、緑色）及びＤＡＰＩ（青色）についての免疫蛍光を示す図である（共焦点顕微鏡法）。 （図７Ｅ） 図７Ｅは、ＤＢＡ（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）で染色した共焦点顕微鏡法におけるオルガノイドの３Ｄ再構成の図であり、対応するサイズを報告している（右パネル）。 （図７Ｆ） 図７Ｆは、回復した炎症及び対応する肝臓転移に由来するオルガノイドを注射した動物からの同所腫瘍のサイトケラチン１９（ＫＲＴ１９）及びアミラーゼ（ＡＭＹ２Ａ）についての免疫染色の図である（スケールバー－１００μｍ）。 （図７Ｇ） 図７Ｇは、回復した炎症に由来するオルガノイドを注射した動物からの同所腫瘍のＤｃｌｋ１についての免疫染色の図である（スケールバー－１００μｍ）。データは平均±標準偏差である。

（図８Ａ） 図８Ａは、５９個の差次的に発現されたＴＦの正規化発現値を示すヒートマップである。青色及びオレンジ色は、それぞれダウンレギュレートされた遺伝子及びアップレギュレートされた遺伝子を示す。 （図８Ｂ） 図８Ｂは、野生型マウスにおける炎症誘導後２８日目（Ｄ２８）の膵臓のＳＯＸ９（赤色）、管マーカーＤＢＡ（緑色）、ＤＡＰＩ（青色）についての免疫染色の図である（スケールバー－２０μｍ）。 （図８Ｃ－８Ｄ）野生型マウスにおける炎症誘導後の異なる時点（１日目Ｄ１、２８日目Ｄ２８）でのＲＵＮＸ１（図８Ｃ）及びＥＴＳ１（図８Ｄ）（赤色）、ＤＡＰＩ（青色）についての免疫染色の図である。緑色チャネル（ＢＧ）は、染色されていないが、取得されており、組織構造を強調するために使用された（スケールバー－２０μｍ）。ＲＵＮＸ１（図８Ｃ）及びＥＴＳ１（図８Ｄ）についてのピクセルｌｏｇ１０強度での核シグナルの定量化の図である（下のパネル）。各実験群の３～５匹のマウス由来の膵臓組織の少なくとも７つの４０倍視野から平均３，８００個の核を計数し、解析に使用した。

図９は、慢性膵臓炎症のヒト試料に対するＥＧＲ１、ＳＯＸ９、ＲＵＮＸ１及びＥＴＳ１（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）についての免疫蛍光を示す図である。緑色チャネル（ＢＧ）は、染色されていないが、取得されており、組織構造を強調するために使用された（スケールバー－５０μｍ）。

（図１０Ａ－図１０Ｂ）ＣＤ４５馴化オルガノイドを注射した動物から発生した腫瘍の組織像である（スケールバー－１００μｍ）。 （図１０Ｃ） 図１０Ｃは、ＣＤ４５陽性細胞で順化した後の培地中に存在するサイトカインを定量するために使用されたサイトカインアレイの写真である。 （図１０Ｄ） 図１０Ｄは、急性膵炎の間に膵臓に浸潤したＣＤ４５陽性細胞のＣｙＴＯＦ免疫表現型検査であり、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０及びＮＫ１．１についてのｔＳＮＥプロットを報告する図である。

（図１１Ａ） 図１１Ａは、急性膵炎の誘導後２４時間（－１日目）の、記憶あり又は記憶なし（それぞれＲｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ又はＳｉｎｇｌｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）の野生型膵臓の組織像である（スケールバー－１００μｍ）。 （図１１Ｂ） 図１１Ｂは、急性膵炎の誘導後２４時間の、記憶あり又は記憶なし（それぞれＲｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ又はＳｉｎｇｌｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）の野生型膵臓の切断型カスパーゼ３（ＣＣ３－赤色）及びＤＡＰＩ（青色）についての免疫蛍光を示す図である（スケールバー－５０μｍ）。緑色チャネル（ＢＧ）は、染色されていないが、取得されており、組織構造及び血管を強調するために使用された。 （図１１Ｃ） 図１１Ｃは、２日間のセルレイン処置の前及び後（１日目及び７日目）の、記憶あり又は記憶なし（それぞれＲｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ又はＳｉｎｇｌｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）の野生型膵臓の組織像である（スケールバー－１００μｍ）。 （図１１Ｄ） 図１１Ｄは、２日間のセルレイン処置の前及び後（１日目及び７日目）の、記憶あり又は記憶なし（それぞれＲｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ又はＳｉｎｇｌｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ））の野生型膵臓のサイトケラチン－１９（ＫＲＴ１９、緑色）、アミラーゼ（ＡＭＹ２Ａ、赤色）及びＤＡＰＩ（青色）についての免疫蛍光を示す図である（スケールバー－５０μｍ）。 （図１１Ｅ） 図１１Ｅは、再チャレンジマウスにおけるセルレイン処置後１日目の野生型膵臓のサイトケラチン－１９（ＫＲＴ１９－緑色）、アミラーゼ（ＡＭＹ２Ａ－赤色）及びＤＡＰＩ（青色）についての免疫染色の詳細である（倍率６０倍）。 （図１１Ｆ） 図１１Ｆは、ＥＧＦ又はＭＥＫ阻害剤による薬理学的処置後の炎症消散から２８日目のｉＫＲＡＳ膵臓の代表的な組織像である（スケールバー－５０μｍ）。

（図１２Ａ） 図１２Ａは、スリンダク又はＥＧＦによる薬理学的処置の存在下／非存在下でのセルレイン処置の２４時間後にＣＤ４５について免疫組織化学を用いて評価した炎症性浸潤の図である。各処置について、２つの異なる低倍率視野及び１つの高倍率視野が示されている。赤い星印は、染色のための内部陽性対照としてリンパ組織を強調している。 （図１２Ｂ） 図１２Ｂは、ＣＤ４５＋細胞の定量化であり、対照（ＣＴＲＬ）に対して正規化された１視野当たりのＣＤ４５＋細胞のカウントを示す図である。平均＋／－ＳＤ（ｎ＝５）。

（図１３Ａ） 図１３Ａは、セルレイン誘導性膵炎に関連したＥＧＦ又はベムラフェニブ処置の評価の図である。上段のパネル：ＥＧＦ又はベムラフェニブによる薬理学的処置の存在下／非存在下でのセルレイン投与後２４時間の膵臓の代表的な組織像である。中段のパネル：ＥＧＦ又はベムラフェニブによる薬理学的処置の存在下／非存在下でのセルレイン投与後２４時間の膵臓のｐ－ＥＲＫについての免疫蛍光を示す図である。下段のパネル：ＥＧＦ又はベムラフェニブによる薬理学的処置の存在下／非存在下でのセルレイン投与後２４時間の膵臓のＣＤ４５についての免疫蛍光を示す図である。 （図１３Ｂ） 図１３Ｂは、ＣＤ４５＋細胞の定量化であり、対照（ＣＴＲＬ）に対して正規化された１視野当たりのＣＤ４５＋細胞のカウントを示す図である。平均＋／－ＳＤ（ｎ＝５）。

（図１４Ａ）図１４Ａは、セルレイン誘導性膵炎に関連したＥＧＦ又はＢｒｄ４阻害剤（ＩＮＣＢ０５４３２９）処置の評価の図である。上段のパネル：ＥＧＦ又はＢｒｄ４阻害剤による薬理学的処置の存在下／非存在下でのセルレイン投与後２４時間の膵臓の代表的な組織像である。下段のパネル：ＥＧＦ又はＢｒｄ４阻害剤による薬理学的処置の存在下／非存在下でのセルレイン処置の２４時間後にＣＤ４５について免疫組織化学を用いて評価した炎症性浸潤の図である。 （図１４Ｂ） 図１４Ｂは、ＣＤ４５＋細胞の定量化であり、対照（ＣＴＲＬ）に対して正規化された１視野当たりのＣＤ４５＋細胞のカウントを示す図である。平均＋／－ＳＤ（ｎ＝５）。

本研究では、急性膵臓損傷に応答した炎症事象の長期効果、及び正常な上皮細胞において消散した炎症がどのように活性化がん遺伝子と協働して腫瘍進行を推進するかを調べた。本開示は、少なくとも部分的には、腺房－導管異形成（ＡＤＭ）が膵臓の組織損傷から保護し、（例えば、ＭＡＰＫアゴニスト又はエピジェネティック修飾因子などのＡＤＭ誘導物質の投与を介しての）ＡＤＭの誘導が膵臓の炎症を軽減するのに有効であるという驚くべき発見に基づく。

炎症は、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）の主要なリスク因子の１つである。膵炎に関連して生じる場合、膵臓がんの最も頻繁なドライバー発がん遺伝子であるＫＲＡＳの変異は、ＡＤＭ、異形成病変、及び最終的に明白なＰＤＡＣの連続的な発生を介して腫瘍発生の加速をもたらす。本研究は、ＫＲＡＳの活性化変異が不可逆的なＡＤＭを維持し、したがって細胞及び組織の損傷を制限するので、再発性膵炎の状況において有益であり、強力なポジティブセレクション下にあることを実証した。ＡＤＭが、繰り返される膵炎の有害効果を制限する生理学的な、迅速かつ可逆的な適応であることを実証するために、ＡＤＭの薬理学的調節の効果を評価した。

この目的のために、異なる薬理学的モダリティ及び分子のクラスを使用して、ＡＤＭを誘導した。第１に、ＡＤＭはＭＡＰＫシグナル伝達の活性化を介して媒介されるので、ＥＧＦをＭＡＰＫ活性化因子の代用として使用した。本研究は、膵炎の誘導前の薬理学的用量でのＥＧＦの投与が、ＡＤＭ形成を大きく促進したことを実証した。ＥＧＦ処置動物では、ＮＳＡＩＤ（例えばスリンダク）などの現在の標準的なケアと比較して、炎症の周知のマーカーであるＣＤ４５浸潤の有意な減少があった（図１２Ａ～Ｂ）。重要なことに、これらの知見は、切断型カスパーゼ３陽性細胞の数として評価される組織損傷の強力な減少を伴った。

ＡＤＭを誘導するための別の戦略では、ＢＲＡＦ野生型細胞においてＭＡＰＫシグナル伝達を活性化することが公知であるＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ）などのＲＡＦ阻害剤を使用した。小分子阻害剤は、膵炎の発症前に投与された場合、ＥＧＦと比較して炎症をさらに制限するＡＤＭを誘導することができた（図１３Ａ～Ｂ）。

次に、エピジェネティックアプローチを使用してＡＤＭを誘導した。開示された研究は、上皮記憶が、遺伝子プロモーター（例えば、エンハンサー）から主に遠位に位置する領域におけるヒストンアセチル化（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ）などの広範かつ持続的なクロマチン修飾によって媒介されることを示した（図３Ｄ～Ｅ）ので、ブロモドメイン余剰末端モチーフ（ＢＥＴ）阻害剤をＡＤＭ誘導物質として試験した。図１４Ａ～図１４Ｂに示されるように、Ｂｒｄ４阻害剤（例えば、ＩＮＣＢ０５４３２９）の投与は、有意なＡＤＭ誘導及び膵炎の薬理学的誘導時のＣＤ４５浸潤の測定によって評価される炎症の強い抑制をもたらした（図１４Ａ～図１４Ｂ）。まとめると、これらのデータは、腺房のアイデンティティの維持を担う遺伝子プログラムに干渉するＭＡＰＫアゴニスト及び／又はクロマチン修飾因子などのＡＤＭを誘導することができる薬剤を使用して、炎症事象中の腺房チモーゲンの産生を遮断することによって組織損傷を最小限に抑え、同時にＫＲＡＳを変異させる強い選択圧を緩和して、膵臓がんの発症を予防するモデルを支持する。

したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、膵炎の治療及び／又は膵臓がん発症の予防のための方法を提供する。膵炎を有する対象に、ＭＡＰＫアゴニスト（例えば、ＴＧＦα、ＥＧＦ、又はＭＡＰＫを活性化することができる任意の薬理学的化合物、例えばＲＡＦ阻害剤）などのＡＤＭ誘導物質、並びにブロモドメイン及び余剰末端（ＢＥＴ）タンパク質の阻害剤（例えば、ＢＲＤ４阻害剤）などの、腺房細胞のアイデンティティの維持に関与する転写プログラムを乱すことができるエピジェネティック薬物を投与することができる。本研究で実証されるように、これらのＡＤＭ誘導物質のいずれかを使用して、膵臓細胞を組織損傷から保護すると同時に、ＫＲＡＳを変異させるほうへのポジティブな圧力を低下させて、最終的にＰＤＡＣへの進行へのポジティブな圧力を低下させることによって、膵炎を改善することができる。

膵炎と診断された患者に対する現在の治療選択肢は対症療法であり、抗炎症剤（例えば、ステロイド及び／又は非ステロイド系抗炎症薬、ＮＳＡＩＤ）及び支持療法に基づく。可逆的腺房－導管異形成（ＡＤＭ）の誘導を介して腺房細胞の酵素含有量を迅速に減少させることができる本アプローチは、膵臓酵素のさらなる放出に由来する膵臓損傷を予防及び制限し、併せて臓器の機能性を維持することによって治癒的である。

（Ｉ．ＡＤＭ誘導物質）
ある特定の実施形態では、本開示は、膵炎及び／又は膵臓がんの治療又は予防のためのＡＤＭ誘導物質を提供する。本明細書で使用される「ＡＤＭ誘導物質」（「ＡＤＭの誘導物質」とも）という用語は、腺房の同一性の維持に関与する遺伝子プログラムを抑制し、可逆的に腺房－導管異形成（ＡＤＭ）を誘導する任意の薬剤を指す。ＡＤＭ誘導物質の例は、下記及び本明細書の他の箇所に提供される。

（Ａ．ＭＡＰＫアゴニスト）
いくつかの実施形態では、ＡＤＭ誘導物質はＭＡＰＫアゴニストである。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、アミノ酸のセリン及びスレオニンに特異的なプロテインキナーゼ（すなわち、セリン／スレオニン特異的プロテインキナーゼ）の一種である。ＭＡＰＫは、マイトジェン、浸透圧ストレス、ヒートショック及び炎症誘発性サイトカインなどの多様な刺激に対する細胞応答の指示に関与している。それらは、増殖、遺伝子発現、分化、有糸分裂、細胞生存及びアポトーシスを含む細胞機能を調節する。

「ＭＡＰＫシグナル伝達経路」という用語は、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼに起因する下流シグナル伝達事象を説明するために使用される。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）経路は、成長因子、ストレス、サイトカイン及び炎症などの刺激によって活性化される相互に関連するシグナル伝達カスケードを構成し、４つの主要なグループと多数の関連タンパク質からなる。ＧＰＣＲ及び成長因子受容体（例えば、受容体型チロシンキナーゼ又はＲＴＫ）などの細胞表面受容体からのシグナルは、直接的に、又はＲａｓ及びＲａｃなどの低分子量Ｇタンパク質を介して、これらのシグナルを増幅し、及び／又は互いに調節する複数段のプロテインキナーゼに伝達される。マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼは、ある一定範囲の刺激によって活性化されるシグナル伝達経路において重要な役割を果たしており、細胞機能におけるいくつかの生理学的及び病理学的変化を媒介する。ＭＡＰＫファミリーには、ＥＲＫ、ｐ３８、及びＪＮＫ／ＳＡＰＫの３つの主要なサブグループがある。ＥＲＫは主に分裂促進刺激によって活性化されるが、ｐ３８及びＪＮＫ／ＳＡＰＫは主にストレス刺激又は炎症性サイトカインによって活性化される。ＭＡＰキナーゼは三段階リン酸化カスケードの一部であり、キナーゼサブドメインＶＩＩＩの活性化ループ内に位置するスレオニン及びチロシン残基に対するＭＡＰキナーゼのリン酸化が活性化をもたらす。しかし、この過程は、活性化刺激の継続的な存在下でも可逆的であり、タンパク質ホスファターゼがＭＡＰキナーゼ制御のための重要な機序を提供することを示している。チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）遺伝子スーパーファミリー由来の二重特異性ホスファターゼ（ＤＳＰ）は、ＭＡＰキナーゼ内の重要なホスホスレオニン残基及びホスホチロシン残基の脱リン酸化に対して選択的である。ＭＡＰＫホスファターゼ（ＭＫＰ）と呼ばれる、ＭＡＰＫに特異的に作用する二重特異性ホスファターゼの１０個のメンバーが報告されている。それらは配列相同性を共有し、ＭＡＰＫに非常に特異的であるが、基質特異性、組織分布、細胞内局在性、及び細胞外刺激による誘導性が異なる。ＭＫＰは、ＭＡＰＫファミリーの機能の調節において重要な役割を果たすことが示されている。ＤＳＰ遺伝子発現は、様々な成長因子及び／又は細胞ストレスによって強く誘導される。ＣＬｌＯＯ／ＭＫＰ－１、ｈＶＨ－２／ＭＫＰ－２及びＰＡＣｌを含むいくつかの遺伝子ファミリーメンバーの発現は、ＭＡＰキナーゼ活性化に少なくとも部分的に依存し、ＭＡＰキナーゼの誘導又は並行するＭＡＰキナーゼ経路間の調節性クロストークに対する負のフィードバックを提供する。ＤＳＰは、異なる細胞内区画に局在し、ある特定のファミリーメンバーは、異なるＭＡＰキナーゼアイソフォームを不活性化するために高度に選択的であるようである。この酵素特異性は、そのアミノ末端が標的ＭＡＰキナーゼに強固に結合した後のＤＳＰホスファターゼの触媒活性化に起因する。したがって、ＤＳＰホスファターゼは、選択されたＭＡＰキナーゼ活性の標的化された不活性化のための精巧な機序を提供する。ｐ３８ ＭＡＰＫは、様々な環境ストレス及び炎症性サイトカインによって活性化されるＭＡＰＫファミリーのメンバーである。ストレスシグナルは、Ｒｈｏファミリーの低分子量ＧＴＰアーゼのメンバー（Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２）によってこのカスケードに送達される。他のＭＡＰＫカスケードと同様に、ＭＡＰＫＫＫ、典型的にはＭＥＫＫ又は混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）は、ｐ３８ ＭＡＰＫキナーゼであるＭＫＫ３／５をリン酸化して、活性化する。ＭＫＫ３／６はまた、アポトーシス刺激によって刺激されるＡＳＫｌによって直接活性化され得る。Ｐ３８ ＭＡＫは、Ｈｓｐ２７及びＭＡＰＫＡＰ－２並びにＡＴＦ２、ＳＴＡＴ１、Ｍａｘ／Ｍｙｃ複合体、ＭＥＦ－２、ＥＬＫ－Ｉ及びＭＳＫ１の活性化を介して間接的にＣＲＥＢを含むいくつかの転写因子の調節に関与している。

ある特定の実施形態では、本開示は、ＭＡＰＫアゴニスト化合物に関する。本明細書で使用される「ＭＡＰＫアゴニスト」という用語は、ＭＡＰＫ並びに／又はそれらの上流及び／若しくは下流シグナル伝達経路の活性化を増加させる、増強する、又は正に調節する任意の薬剤を指す。薬剤は、薬物、化学的実体などの小分子、ペプチド、タンパク質、成長因子（例えば、ＴＧＦα、ＥＧＦを含む）、キメラ分子、抗体、抗体断片又は他のそのような薬剤などであり得る。ＭＡＰＫのアゴニストである薬剤としては、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼなどを挙げることができる。ある特定の実施形態では、アゴニストは、小分子、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＰＲＯＴＡＣ又はデグロンである。例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムを使用して、ＭＡＰＫ経路を活性化することができる。

「アゴニスト」という用語は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに結合し、該ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性又は発現を刺激し、増加させ、活性化し、促進し、活性化を増強し、感作し、又はアップレギュレートする薬剤を指す。アゴニストは、その作用によりシグナル伝達経路を阻害又は活性化し得る。アゴニストは、例えば、ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの発現を誘導若しくは活性化する、又はＤＮＡ結合若しくは酵素活性を刺激し、調節し、増加させ、開始させ、活性化し、促進し、活性化を増強するために結合し、ポリペプチド若しくはポリヌクレオチド、例えばアゴニストの活性を感作若しくはアップレギュレートする作用物質である「活性化因子」と呼ぶこともできる。活性化は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性値が対照と比較して有意に高い場合、例えば、少なくとも１１０％、１５０％、２００～５００％若しくは１０００～３０００％高い場合、又はその中で導き出せる任意の範囲若しくは値である場合に達成される。

本方法で使用するための例示的なＭＡＰＫアゴニストには、限定するものではないが、ＴＧＦα、ＥＧＦ、又はＭＡＰＫを活性化するか、又はＭＡＰＫシグナル伝達を正に調節することができる任意の薬理学的化合物が含まれる。例えば、ＭＡＰＫアゴニストは、ＭＡＰＫシグナル伝達を正に調節するＲＡＦ阻害剤であり得、例えば、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ）、ソラフェニブ（例えば、ソラフェニブトシレート）、ＰＬＸ－４７２０、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６）、ＧＤＣ－０８７９、ＡＺ６２８、ＬＧＸ８１８、及びＮＶＰ－ＢＨＧ７１２、並びにＲＡＳ活性の任意の正のモジュレーター／エンハンサー（例えば、Ｓｏｎ ｏｆ Ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ（ＳＯＳ）活性化因子及び／又はグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）阻害剤）である。いくつかの実施形態では、ＲＡＦ阻害剤はＰＬＸ７９０４又はＰＬＸ８３９４ではない。

いくつかの実施形態では、ＭＡＰＫアゴニストはベムラフェニブである。いくつかの実施形態では、ベムラフェニブは、少なくとも、最大で、又は約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００若しくは２０００ｍｇ、又はその中で導き出せる任意の範囲若しくは値の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、ベムラフェニブは、２００ｍｇ～３００ｍｇの間の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、ベムラフェニブは、４５０ｍｇ～６００ｍｇの間の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、ベムラフェニブは、７００ｍｇ～８００ｍｇの間の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、ベムラフェニブは、９００ｍｇ～１０００ｍｇの間の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、ベムラフェニブは、約９６０ｍｇの用量で対象に投与される。

（Ｂ．エピジェネティック修飾因子）
いくつかの態様では、ＡＤＭ誘導物質は、ＤＮＡメチル化、ヒストンメチル化、アセチル化を変化させることができるエピジェネティック修飾因子であり、又は、腺房細胞のアイデンティティの維持に関与する転写プログラムを乱すことができるクロマチンライター、リーダー若しくはイレーザーと干渉することができるエピジェネティック修飾因子である。

「エピジェネティック修飾因子」は、ＤＮＡ配列の変化以外の機序により、細胞のエピジェネティック状態、例えば表現型又は遺伝子発現を改変させる薬剤を指す。細胞のエピジェネティックな状態には、例えば、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾及びＲＮＡ関連サイレンシングが含まれる。

エピジェネティック修飾因子の非限定的な例としては、以下が挙げられる：（ａ）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（例えば、アザシチジン、デシタビン又はゼブラリン）；（ｂ）限定するものではないが、ＥＰＺ００４７７７（７－［５－デオキシ－５－［［３－［［［［４－（１，１－ジメチルエチル）フェニル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロピル］（１－メチルエチル）アミノ］－β－Ｄ－リボフラノシル］－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－４－アミン）、ＥＺＨ１阻害剤、ＥＺＨ２阻害剤又はＥＰＸ５６８７などのＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含むヒストン及びタンパク質メチルトランスフェラーゼ；（ｃ）ヒストンデメチラーゼ；（ｄ）限定するものではないが、ボリノスタット、ロミデプシン、キダミド、パノビノスタット、ベリノスタット、バルプロ酸、モセチノスタット、アベキシノスタット、エンチノスタット、レスミノスタット、ジビノスタット、又はキシノスタットを含むヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）；（ｅ）限定するものではないが、Ｃ－６４６、（４－［４－［［５－（４，５－ジメチル－２－ニトロフェニル）－２－フラニル］メチレン］－４，５－ジヒドロ－３－メチル－５－オキソ－１Ｈ－ピラゾール－１－イル］安息香酸）、ＣＰＴＨ２（シクロペンチリデン－［４－（４’－クロロフェニル）チアゾール－２－イル］ヒドラジン）、ＣＴＰＢ（Ｎ－（４－クロロ－３－トリフルオロメチル－フェニル）－２－エトキシ－６－ペンタデシル－ベンズアミド）、ガーシノール（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ）－３－（３，４－ジヒドロキシベンジオール（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｏｌ））－４－ヒドロキシ－８，８－ジメチル－１，７－ビス（３－メチル－２－ブテン－１－イル）－５－［（２Ｓ）－５－メチル－２－（１－メチルエテニル）－４－ヘキセン－１－イル］ビシクロ［３．３．１］ノナ－３－エン－２，９－ジオン）、アナカルド酸、ＥＭＬ４２５（５－［（４－ヒドロキシ－２，６－ジメチルフェニル）メチレン］－１，３－ビス（フェニルメチル）－２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）－ピリミジントリオン）、ＩＳＯＸ ＤＵＡＬ（［３－［４－［２－［５－（ジメチル－１，２－オキサゾール－４－イル）－１－［２－（モルホリン－４－イル）エチル］－１Ｈ－１，３－ベンゾジアゾール－２－イル］エチル］フェノキシ］プロピル］ジメチルアミン）、Ｌ００２（４－［Ｏ－［（４－メトキシフェニル）スルホニル］オキシム］－２，６－ジメチル－２，５－シクロヘキサジエン－１，４－ジオン）、ＮＵ９０５６（５－（１，２－チアゾール－５－イルジスルファニル）－１、２－チアゾール）、ＳＩ－２塩酸塩（１－（２－ピリジニル）エタノン２－（１－メチル－１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－イル）ヒドラゾン塩酸塩）を含むヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＨＡＴ阻害剤とも呼ばれる）；又は（ｆ）他のクロマチンリモデラー。いくつかの態様では、エピジェネティック修飾因子は、ボリノスタット、ロミデプシン、ベリノスタット又はパノビノスタットである。

いくつかの態様では、エピジェネティック修飾因子はヒストン修飾を調節する（例えば、ＨＤＡＣモジュレーター）。いくつかの態様では、エピジェネティック修飾因子は、ＢＲＤ２、ＢＲＤ４、又はＥＧＬＮ１に関与する経路を調節する。いくつかの態様では、エピジェネティック修飾因子は、（＋）－ＪＱ１；Ｓ）－ＪＱ１；ベリノスタット（例えば、ＰＸＤ１０１）；ＭＳ－２７５（例えば、エンチノスタット；ＭＳ－２７－２７５）；ボリノスタット（例えば、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）；ゾリンザ）；モセチノスタット（例えば、ＭＧＣＤ０１０３）；Ｉ－ＢＥＴ（例えば、ＧＳＫ５２５７６２Ａ）；ＳＢ９３９（例えば、プリノスタット；ＰＦＩ－１）；１２１５）；Ｉ－ＢＥＴ１５１（例えば、ＧＳＫ１２１０１５１Ａ）；ＩＯＸ２；又はその誘導体、塩、代謝産物、プロドラッグ、及び立体異性体である。いくつかの態様では、エピジェネティック修飾因子はボリノスタットである。エピジェネティック修飾因子は、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、及び／又はＢＲＤＴ阻害剤などのＢＥＴ阻害剤であり得る。いくつかの実施形態では、エピジェネティック修飾因子はＢＲＤ４阻害剤である。ＢＲＤ４阻害剤は、例えば、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＧＳＫ５２５７６２Ａ／Ｉ－ＢＥＴ７６２、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＡＢＢＶ－０７５、ＯＴＸ０１５／ＭＫ－８６２８、ＧＳＫ２８２０１５１／Ｉ－ＢＥＴ１５１、ＰＬＸ５１１０７、ＡＢＢＶ－７４４又はＡＺＤ５１５３などである。ある特定の実施形態では、エピジェネティック修飾因子は、小分子、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＰＲＯＴＡＣ又はデグロンである。例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムを使用して、クロマチンを選択的に修飾することができる（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ｄＣａｓ ９－ＫＲＡＢ）。

本明細書中に記載の化合物は、１又は複数の不斉置換された炭素原子又は窒素原子を含有する場合があり、光学活性形態又はラセミ形態で単離される場合がある。したがって、特定の立体化学又は異性体形態が具体的に示されていない限り、化学式の全てのキラル、ジアステレオマー、ラセミ体、エピマー体、及び全ての幾何異性体が意図される。化合物は、ラセミ体及びラセミ混合物、単一エナンチオマー、ジアステレオマー混合物及び個々のジアステレオマーとして存在し得る。いくつかの実施形態では、単一のジアステレオマーが得られる。本開示の化合物のキラル中心は、（Ｓ）又は（Ｒ）配置を有することができる。

本明細書に記載の化合物はまた、プロドラッグ形態で存在し得る。プロドラッグは、医薬品の多くの望ましい品質（例えば、溶解度、バイオアベイラビリティ、製造など）を高めることが知られているので、本開示のいくつかの方法で使用される化合物は、所望により、プロドラッグ形態で送達され得る。したがって、本開示は、本開示の化合物のプロドラッグ、並びにプロドラッグを送達する方法を企図する。本明細書に記載の化合物のプロドラッグは、通常の操作又はインビボのいずれかで修飾が親化合物へと切断されるような方法で、化合物中に存在する官能基を修飾することによって調製され得る。したがって、プロドラッグには、例えば、ヒドロキシ、アミノ、又はカルボキシ基が任意の基に結合されていて、プロドラッグが対象に投与された場合に切断されて、それぞれヒドロキシ、アミノ、又はカルボン酸を形成する本明細書に記載の化合物が含まれる。

（Ｃ．製剤）
本開示のいくつかの実施形態では、化合物は医薬製剤として含まれる。ミクロスフェア及び／又はマイクロカプセルの調製に使用するための材料は、例えば、ポリガラクチン、ポリ－（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－ｌ－グルタミン）及びポリ（乳酸）などの生分解性／生体分解可能なポリマーである。徐放性非経口製剤を製剤化するときに使用可能な生体適合性担体は、炭水化物（例えば、デキストラン）、タンパク質（例えば、アルブミン）、リポタンパク質、又は抗体である。インプラントに使用するための材料は、非生分解性（例えば、ポリジメチルシロキサン）又は生分解性（例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）若しくはポリ（オルトエステル）又はそれらの組み合わせ）であり得る。

経口使用のための製剤には、（１又は複数の）活性成分（例えば、本明細書中に記載の化合物）を、非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に含有する錠剤が含まれる。そのような製剤は当業者に公知である。賦形剤は、例えば、不活性希釈剤又は増量剤（例えば、スクロース、ソルビトール、砂糖、マンニトール、微結晶セルロース、ジャガイモデンプンを含むデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム又はリン酸ナトリウム）；造粒及び崩壊剤（例えば、微結晶セルロースを含むセルロース誘導体、ジャガイモデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩、又はアルギン酸）；結合剤（例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶セルロース、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はポリエチレングリコール）；並びに滑沢剤、流動促進剤、及び粘着防止剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油、又はタルク）であり得る。他の薬学的に許容され得る賦形剤は、着色剤、香味剤、可塑剤、保湿剤、緩衝剤などであり得る。

錠剤は、コーティングされていなくてもよく、又は任意選択的に消化管における崩壊及び吸収を遅延させ、それによってより長期間にわたる持続作用を提供するために、公知の技術によってコーティングされていてもよい。コーティングは、所定のパターンで活性薬物を放出するように（例えば、徐放性製剤を達成するために）適合されてもよく、又は胃の通過後まで活性薬物を放出しないように適合されてもよい（腸溶コーティング）。コーティングは、糖コーティング、フィルムコーティング（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレートコポリマー、ポリエチレングリコール及び／又はポリビニルピロリドンに基づく）、又は腸溶コーティング（例えば、メタクリル酸コポリマー、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセテートフタレート、シェラック及び／又はエチルセルロースに基づく）であり得る。さらに、例えばモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を使用することができる。

（Ｄ．細胞標的化部分（Ｃｅｌｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｍｏｉｅｔｉｅｓ））
いくつかの態様では、本開示は、ＰＲＯＴＡＣ及びデグロンなどの細胞標的化部分に直接又はリンカーを介してコンジュゲートされる化合物、並びに／又はエキソソーム及びリポソームなどの小胞を介して送達される薬剤を提供する。いくつかの実施形態では、細胞標的化部分／小胞への化合物のコンジュゲーション／包含は、疾患又は障害の治療における化合物の有効性を増加させる。本実施形態による細胞標的化部分／小胞は、例えば、抗体、成長因子、ホルモン、ペプチド、アプタマー、薬物、小分子、ホルモン、造影剤、補因子、サイトカイン、又は小胞（例えば、エキソソーム及び／又はリポソーム）であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の化合物は、がん細胞によって発現されるが正常組織では発現されない特異的抗原に対する抗体とのコンジュゲートに使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示の化合物は、膵臓細胞によって発現されるが他の細胞型によっては発現されない特異的抗原に対する抗体とのコンジュゲートにおいて使用することができる。

多数の細胞表面受容体が様々な系統の造血細胞において同定されているので、これらの受容体に特異的なリガンド又は抗体を細胞特異的標的化部分として使用することができる。ＩＬ－２を、キメラタンパク質の細胞特異的標的化部分として使用して、ＩＬ－２Ｒ＋細胞を標的化することもできる。あるいは、Ｂ７－１、Ｂ７－２及びＣＤ４０などの他の分子を使用して、活性化Ｔ細胞を特異的に標的化することができる。さらに、Ｂ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ４０及びＩＬ－４受容体を発現し、これらの受容体に結合する部分、例えばＣＤ４０リガンド、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６及びＣＤ２８によって標的化することができる。Ｔ細胞及びＢ細胞などの免疫細胞の除去は、リンパ系腫瘍の治療に特に有用である。

特定の細胞サブセットを標的化するために使用され得る他のサイトカインとしては、インターロイキン（ＩＬ－１～ＩＬ－１５）、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、白血病阻害因子、腫瘍壊死因子、トランスフォーミング成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、及び／又は線維芽細胞成長因子が挙げられる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（ｅｄ．），１９９４，Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。いくつかの態様では、標的化ポリペプチドは、Ｆｎ１４受容体に結合するサイトカイン、例えばＴＷＥＡＫである。

当業者は、様々な公知のサイトカイン、例えば、ヘマトポエチン（４つのヘリックスバンドル）［例えば、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、ＩＬ－２（Ｔ細胞増殖因子）、ＩＬ－３（マルチコロニーＣＳＦ）、ＩＬ－４（ＢＣＧＦ－１、ＢＳＦ－１）、ＩＬ－５（ＢＣＧＦ－２）、ＩＬ－６ ＩＬ－４（ＩＦＮ－β２、ＢＳＦ－２、ＢＣＤＦ）、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３（Ｐ６００）、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１５（Ｔ細胞成長因子）、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＯＳＭ（ＯＭ、オンコスタチンＭ）、及びＬＩＦ（白血病抑制因子）］；インターフェロン［ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、及びＩＦＮ－βなど）；免疫グロブリンスーパーファミリー（Ｂ７．１（ＣＤ８０）、及びＢ７．２（Ｂ７０、ＣＤ８６）］；ＴＮＦファミリー［ＴＮＦ－α（カケクチン）、ＴＮＦ－β（リンホトキシン、ＬＴ、ＬＴ－α）、ＬＴ－β、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ２７Ｌ）、ＣＤ３０リガンド（ＣＤ３０Ｌ）、及び４－１ＢＢＬなど］；並びに特定のファミリーに割り当てられていないもの［例えば、ＴＧＦ－β、ＩＬ１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１０（サイトカイン合成阻害剤Ｆ）、ＩＬ－１２（ＮＫ細胞刺激因子）、ＭＩＦ、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７（ｍＣＴＬＡ－８）及び／又はＩＬ－１８（ＩＧＩＦ、インターフェロン－γ誘導因子）］が存在することを認識している。さらに、抗体の重鎖のＦｃ部分は、肥満細胞及び好塩基球を標的化するためのＩｇＥ抗体のＦｃ部分の使用など、Ｆｃ受容体発現細胞を標的化するために使用することができる。

さらに、いくつかの態様では、細胞標的化部分は、ペプチド配列又は環状ペプチドであり得る。実施形態に従って使用され得る細胞及び組織標的化ペプチドの例は、例えば、米国特許第６，２３２，２８７号、同第６，５２８，４８１号、同第７，４５２，９６４号、同第７，６７１，０１０号、同第７，７８１，５６５号、同第８，５０７，４４５号、及び同第８，４５０，２７８号明細書に提供されており、当該特許はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。

したがって、いくつかの実施形態では、細胞標的化部分は抗体又はアビマー（ａｖｉｍｅｒ）である。抗体及びアビマーは、実質的に任意の細胞表面マーカーに対して作製することができ、したがって、実質的に任意の目的の細胞集団へのＧｒＢの送達を標的とする方法を提供する。細胞標的化部分として使用され得る抗体を作製するための方法を以下に詳述する。所与の細胞表面マーカーに結合するアビマーを作製する方法は、米国特許出願公開第２００６／０２３４２９９号及び同第２００６／０２２３１１４号明細書に詳述されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。

さらに、本明細書に記載の化合物は、ナノ粒子又は他のナノ材料にコンジュゲート可能であることが企図される。ナノ粒子のいくつかの非限定的な例としては、金若しくは銀ナノ粒子などの金属ナノ粒子、又はポリ－Ｌ－乳酸若しくはポリ（エチレン）グリコールポリマーなどのポリマーナノ粒子が挙げられる。本化合物にコンジュゲート可能なナノ粒子及びナノ材料としては、米国特許出願公開第２００６／００３４９２５号、同第２００６／０１１５５３７号、同第２００７／０１４８０９５号、同第２０１２／０１４１５５０号、同第２０１３／０１３８０３２号及び同第２０１４／００２４６１０号明細書並びにＰＣＴ公開第２００８／１２１９４９号、同第２０１１／０５３４３５号及び同第２０１４／０８７４１３号パンフレットに記載のものが挙げられ、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。

（ＩＩ．使用方法）
本開示の実施形態は、膵炎又は膵臓がんを治療又は予防するための１又は複数のＡＤＭ誘導物質の使用方法に関する。開示される方法は、治療有効量の１又は複数のＡＤＭ誘導物質を対象に投与すること、それによって、対象において膵炎又は膵臓がんを治療又は予防することを含み得る。いくつかの実施形態では、有効量のＡＤＭ誘導物質を対象に投与することを含む、膵炎の治療方法が開示される。いくつかの実施形態では、有効量のＡＤＭ誘導物質を対象に投与することを含む、膵臓がんを予防する方法が開示される。

疾患又は状態を「治療すること」又はその治療は、疾患の兆候又は症状を軽減するために、患者に１又は複数の薬物を投与することを含み得るプロトコルを実行することを指す。治療の望ましい効果には、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は軽減、及び寛解又は予後の改善が含まれる。緩和は、疾患又は状態の兆候又は症状が現れる前に行われても、並びにそれらが現れた後に行われてもよい。したがって、「治療すること」又は「治療」は、疾患又は望ましくない状態を「予防すること」又はその「予防」を含み得る。さらに、「治療すること」又は「治療」は、兆候又は症状の完全な緩和を必要とせず、治癒を必要とせず、及び具体的には、患者にわずかな影響しか及ぼさないプロトコルを含む。

本明細書で使用される場合、「患者」又は「対象」という用語は、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、又はそれらのトランスジェニック種などの生きている哺乳動物生物を指す。ある特定の実施形態では、患者又は対象は霊長類である。ヒト患者の非限定的な例は、成人、若年者、乳児及び胎児である。

「有効な」という用語は、その用語が本明細書及び／又は特許請求の範囲で使用される場合、所望の、予想される、又は意図された結果を達成するのに十分であることを意味する。「有効量」、「治療有効量」又は「薬学的有効量」は、患者又は対象を化合物で治療する文脈で使用される場合、疾患を治療又は予防するために対象又は患者に投与される場合、疾患のそのような治療又は予防に影響を及ぼすのに十分な量である化合物の量を意味する。

（Ａ．膵炎の治療）
本開示の態様は、膵炎を治療するための組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、１又は複数のＡＤＭ誘導物質を対象に投与することを含む、膵炎に関して対象を治療する方法が開示される。いくつかの実施形態では、膵炎は急性膵炎である。いくつかの実施形態では、膵炎は慢性膵炎である。いくつかの実施形態では、本開示の対象は、膵炎を有することが疑われる。いくつかの実施形態では、本開示の対象は、膵炎を有すると診断されている。対象は、当技術分野で公知の試験及び診断方法を使用して膵炎と診断されてもよい。例えば、対象を膵炎の１又は複数の症状について試験することによって、対象が膵炎を有すると判定されてもよい。別の例では、対照又は健康な対象と比較して、対象における１又は複数の膵臓酵素（例えば、アミラーゼ、リパーゼ）のレベル上昇を検出することによって、対象が膵炎を有すると判定される。
Ｂ．がんの治療及び予防

本開示の態様は、がんを治療及び予防するための組成物及び方法に関する。本明細書で使用される「がん」という用語は、固形腫瘍、転移性がん、又は非転移性がんを説明するために使用され得る。ある特定の実施形態では、がんは、血液、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌又は子宮に起源を有するものであり得る。

いくつかの実施形態では、膵臓がんを治療又は予防する方法が開示される。いくつかの実施形態では、膵臓がんを予防する方法が開示される。いくつかの実施形態では、膵臓がんは、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）である。膵臓がんを予防するための方法は、膵臓がんを発症するリスクがある対象への１又は複数のＡＤＭ誘導物質の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、対象は、膵臓がんと診断されていない。

（Ｃ．医薬製剤及び投与経路）
臨床用途が企図される場合、意図される用途に適した形態の医薬組成物を調製することが必要と思われる。いくつかの実施形態では、本開示の化合物を含むそのような製剤が企図される。一般に、これは、発熱物質、並びにヒト又は動物に有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴うであろう。

送達ベクターを安定にし、標的細胞による取り込みを可能にするために、適切な塩及び緩衝液を使用することが一般に望まれる。組換え細胞を患者に導入する場合、緩衝液も使用される。本開示の水性組成物は、薬学的に許容される担体又は水性媒体に溶解又は分散された、細胞に対して有効量のベクターを含む。このような組成物は、接種材料とも呼ばれる。「薬学的又は薬理学的に許容される」という句は、動物又はヒトに投与されたときに副作用、アレルギー反応、又は他の有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が本開示のベクター又は細胞と適合しない場合を除き、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助活性成分も組成物に組み込むことができる。

本開示の活性組成物は、古典的な医薬調製物を含み得る。本開示によるこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般的な経路を介することになる。そのような経路には、経口、経鼻、バッカル、直腸、膣又は局所経路が含まれる。あるいは、投与は、同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内注射によるものであり得る。そのような組成物は、通常、上記の薬学的に許容される組成物として投与される。

活性化合物はまた、非経口的又は腹腔内に投与され得る。遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中及び油中で調製することもできる。保存及び使用の通常の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含有する。

注射用途に適した医薬形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。すべての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に使用することによってもたらされ得る。

滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙した他の成分のいくつかと共に適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基礎分散媒及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分＋任意の追加の所望の成分の粉末を、あらかじめ滅菌濾過されたその溶液から得る真空乾燥及び凍結乾燥技術である。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。薬学的活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性成分と適合しない場合を除き、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助活性成分も組成物に組み込むことができる。

経口投与のために、本明細書中に記載される化合物を賦形剤と一緒に組み込み、摂取不可能なマウスウォッシュ及び歯磨き剤の形態で使用することができる。マウスウォッシュは、ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ’ｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの適切な溶媒中に必要量の活性成分を組み込んで調製することができる。あるいは、有効成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリン及び重炭酸カリウムを含有する消毒洗浄剤に組み込まれてもよい。有効成分は、ゲル、ペースト、粉末及びスラリーを含む歯磨き剤に分散させてもよい。活性成分は、水、結合剤、研磨剤、香味剤、発泡剤、及び湿潤剤を含み得るペースト状歯磨き剤に治療有効量で添加することができる。

本開示の組成物は、中性形態又は塩形態で製剤化することができる薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が含まれ、これは、無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸により形成される。遊離カルボキシル基で形成された塩は、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化第二鉄など、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。

製剤化に際して、溶液は、投与製剤と適合する様式で、治療上有効な量で投与される。製剤は、注射溶液、薬物放出カプセルなどの様々な剤形で容易に投与される。水溶液での非経口投与の場合、例えば、溶液は、必要に応じて適切に緩衝化されなければならず、液体希釈剤は、まず十分な生理食塩水又はグルコースで等張性にされなければならない。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知である。例えば、１回の投与量を１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍＬの皮下注入液に添加するか、又は提案された注入部位に注射することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８及び１５７０－１５８０を参照されたい）。治療される対象の状態に応じて、投与量のいくらかの変動が必然的に生じるであろう。いずれにせよ、投与の責任者が、個々の対象に対する適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、医薬品の安全性のために適切な規制当局によって要求される無菌性、発熱原性、並びに一般的な安全性及び純度の基準を満たさなければならない。

特に、使用され得る組成物は、本明細書に開示されている。上記の組成物は、好ましくは有効量、すなわち治療された対象において望ましい結果（例えば、ＡＤＭを誘導すること）をもたらすことができる量で哺乳動物（例えば、げっ歯類、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ネコなど）に投与される。本開示の方法で利用される組成物の毒性及び治療有効性は、標準的な薬学的手順によって決定することができる。医学及び獣医学分野で周知のように、任意の１つの動物に対する投与量は、対象の大きさ、体表面積、体重、年齢、投与される特定の組成物、投与時間及び投与経路、全身の健康状態、感染又はがんの臨床症状、並びに同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。本明細書に記載の組成物は、典型的には、血液学的パラメータ（全血球数－ＣＢＣ、酵素及び炎症指数）の減少、臨床（疼痛）又はイメージングパラメータ（浮腫、血管新生、サイズ）の改善を同定することによってアッセイされるような、薬理学的効果（例えば、ＡＤＭ）を誘導する投与量で投与される。いくつかの実施形態では、所望の効果を誘導するために使用される化合物の量は、約０．０１ｍｇ～約１０，０００ｍｇ／日であると計算される。いくつかの実施形態では、その量は、約１ｍｇ～約１，０００ｍｇ／日である。いくつかの実施形態では、これらの投与量は、特定の患者の生物学的因子、例えば、経口投与された場合、薬物の代謝分解の増加若しくは減少、又は消化管による取り込みの減少に基づいて減少又は増加され得る。さらに、化合物はより有効であり得、したがって、同様の効果を達成するために必要な用量はより少ない。そのような用量は、典型的には、数週間又は十分な臨床的改善が達成されるまで１日１回投与される。

本開示の治療方法（予防的処置を含む）は、一般に、治療有効量の本明細書に記載の組成物を、それを必要とする哺乳動物、特にヒトを含む対象に投与することを含む。そのような治療は、疾患、障害、又はその症状に罹患している、それを有する、それにかかりやすい、又はそのリスクがある対象、特にヒトに適切に投与される。これらの対象の「リスクあり」の決定は、診断試験又は対象若しくは医療提供者の意見（例えば、遺伝子検査、酵素又はタンパク質マーカー、（本明細書で定義される）マーカー、家族歴など）による任意の客観的又は主観的な決定によって行うことができる。

（Ｄ．併用療法）
本開示のある特定の実施形態は、疾患を治療又は予防するための１又は複数の二次形態の治療の投与又は適用を提供する。例えば、疾患は、がんなどの過剰増殖性疾患であり得る。別の例では、疾患は膵炎である。

療法の二次形態は、がんの治療又は予防に適用することができる１又は複数の二次薬理学的薬剤の投与であり得る。二次療法が薬理学的薬剤である場合、二次療法は、本化合物の投与前、投与と同時に、又は投与後に投与することができる。

本化合物の投与と二次療法との間の間隔は、当業者によって決定される任意の間隔であってよい。例えば、間隔は、数分から数週間であってもよい。薬剤が別に患者に提供される実施形態では、一般に、各治療薬が対象に対して有利な併用効果を依然として発揮できるように、それぞれの送達時間の間にかなりの期間が過ぎて効力を失うことがないことを確実にしなければならない。例えば、治療薬の間隔は、互いに約１２時間～約２４時間、より好ましくは互いに約６時間～約１２時間以内であり得る。しかし、状況によっては、治療期間を延長して、それぞれの投与の間を数日間（２、３、４、５、６又は７）～数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８）経過させてもよい。いくつかの実施形態では、二次治療薬の投与のタイミングは、ナノ粒子に対する対象の応答に基づいて決定される。

さまざまな組み合わせを採用することができる。下の例では、ＭＡＰＫアゴニストが「Ａ」であり、抗がん療法が「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ

本開示の任意の化合物又は療法の患者への投与は、薬剤に毒性がある場合はそれを考慮して、そのような化合物の投与のための一般的なプロトコルに従う。したがって、いくつかの実施形態では、併用療法に起因する毒性をモニターする工程が存在する。治療サイクルを繰り返してもよいことが予想される。様々な標準的な療法、並びに外科的介入が、記載された療法と組み合わせて適用され得ることも企図される。

特定の態様では、標準的な療法が、膵炎のための抗炎症剤及び／又は鎮痛剤を含み、本明細書に記載のＡＤＭの誘導物質と組み合わせて使用可能であることが企図される。

当業者は、ＫＲＡＳ変異細胞のクローン増殖を根絶するように、免疫療法を本実施形態の方法（例えばＡＤＭ誘導物質）と組み合わせて、又は併せて使用できることを理解すると思われる。がん予防との関連において、免疫療法剤は、免疫エフェクター細胞及び分子の使用によって、ＫＲＡＳ変異細胞を標的化し、破壊し、及び／又は拡大を制限し、ＫＲＡＳ変異細胞のポジティブセレクションを打ち消す。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体が単独で治療のエフェクターとして機能する場合もあれば、他の細胞を動員して実際に細胞殺滅に影響を与える場合もある。抗体はまた、薬物又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）とコンジュゲートすることができ、標的化剤として役立つ。又は、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的又は間接的に相互作用する表面分子を運ぶリンパ球であってもよい。さまざまなエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。

免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的化に適した、すなわち他の細胞の大部分に存在しない何らかのマーカーを持つことができる。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれも、本実施形態に関連して標的化に適している可能性がある。一般的な腫瘍マーカーには、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ及びｐ１５５が含まれる。免疫療法の代替の態様は、抗がん効果と免疫刺激効果とを組み合わせることである。ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ガンマ－ＩＦＮなどのサイトカイン、ＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８などのケモカイン、及びＦＬＴ３リガンドなどの成長因子を含む免疫刺激分子もまた存在する。

使用され得る免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、プラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ジニトロクロロベンゼン、及び芳香族化合物；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β及びγ、ＩＬ－１、ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ；遺伝子療法、例えばＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２及びｐ５３；並びにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、及び抗ｐ１８５である。１又は複数の抗がん療法を、本明細書に記載の抗体療法とともに使用可能であることが企図される。

いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば、共刺激分子）を上げたり、又はシグナルを下げたりする免疫系の分子である。免疫チェックポイント遮断により標的となり得る抑制性免疫チェックポイント分子には、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても公知）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４、別名ＣＤ１５２）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）並びにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）が含まれる。特に、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－１軸及び／又はＣＴＬＡ－４を標的とする。

免疫チェックポイント阻害剤は、小分子、リガンド又は受容体の組換え形態などの薬物であり得るか、又は特に、ヒト抗体などの抗体である。免疫チェックポイントタンパク質又はその類似体の公知の阻害剤を使用してもよく、特にキメラ化抗体、ヒト化抗体又はヒト型抗体を使用してもよい。当業者であればわかるように、本開示において言及されるある特定の抗体について、代替及び／又は同等の名称が使用されている場合がある。そのような代替及び／又は同等の名称は、本開示の文脈において交換可能である。例えば、ランブロリズマブは、ＭＫ－３４７５及びペンブロリズマブの代替及び同等の名称でも知られていることが公知である。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１とそのリガンド結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１及び／又はＰＤＬ２である。別の実施形態では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１とその結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ－１及び／又はＢ７－１である。別の実施形態では、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２とその結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤＬ２結合パートナーはＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドであり得る。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ及びＣＴ－０１１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤＬ１又はＰＤＬ２の細胞外又はＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストはＡＭＰ－２２４である。ニボルマブは、ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても公知であり、国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットに記載の抗ＰＤ－１抗体である。ペンブロリズマブは、ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）及びＳＣＨ－９００４７５としても公知であり、国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットに記載の抗ＰＤ－１抗体である。ＣＴ－０１１はｈＢＡＴ又はｈＢＡＴ－１としても公知であり、国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレットに記載の抗ＰＤ－１抗体である。ＡＭＰ－２２４はＢ７－ＤＣＩｇとしても公知であり、国際公開第２０１０／０２７８２７号及び同第２０１１／０６６３４２号パンフレットに記載のＰＤＬ２－Ｆｃ融合可溶性受容体である。

本明細書において提供される方法で標的とすることができる別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。ヒトＣＴＬＡ－４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ－４はＴ細胞の表面にあり、抗原提示細胞の表面のＣＤ８０又はＣＤ８６に結合すると「オフ」スイッチとして機能する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面に発現し、抑制シグナルをＴ細胞に伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４はＴ細胞共刺激タンパク質ＣＤ２８に似ており、両方の分子が抗原提示細胞上のＣＤ８０及びＣＤ８６（それぞれＢ７－１及びＢ７－２とも呼ばれる）に結合する。ＣＤ２８は刺激シグナルを伝達するのに対し、ＣＴＬＡ４はＴ細胞に抑制シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４は制御性Ｔ細胞にも見られ、その機能に重要である可能性がある。Ｔ細胞受容体及びＣＤ２８を介したＴ細胞の活性化により、Ｂ７分子の抑制性受容体であるＣＴＬＡ－４の発現が増加する。

いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドである。

本方法での使用に適した抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（又はそれに由来するＶＨ及び／又はＶＬドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して作製することができる。あるいは、当技術分野で認識されている抗ＣＴＬＡ－４抗体を使用することができる。例えば、米国特許第８，１１９，１２９号明細書、国際公開第０１／１４４２４号、国際公開第９８／４２７５２号、国際公開第００／３７５０４号パンフレット（トレメリムマブ；旧名称チシリムマブとしても知られるＣＰ６７５，２０６）、米国特許第６，２０７，１５６号明細書に開示されている抗ＣＴＬＡ－４抗体は、本明細書に開示の方法で使用することができる。前述の刊行物のそれぞれの教示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＴＬＡ－４への結合について、これらの技術分野で承認されている抗体のいずれかと競合する抗体も使用することができる。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ－４抗体は、米国特許第８，０１７，１１４号明細書に記載されており、すべてが参照により本明細書に組み込まれる。

例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１及びＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても公知）又はそれらの抗原結合断片及び変異体である。他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖及び軽鎖のＣＤＲ又はＶＲを含む。したがって、一実施形態では、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、並びにイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、上記の抗体と同じＣＴＬＡ－４上のエピトープとの結合に競合する、及び／又はそれに結合する。別の実施形態では、抗体は、上記の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％又は９９％の可変領域同一性）を有する。

ＣＴＬＡ－４を調節するための他の分子には、米国特許第５８４４９０５号、第５８８５７９６号明細書、及び国際特許出願番号第１９９５００１９９４号及び同第１９９８０４２７５２号パンフレットなどに記載のＣＴＬＡ－４リガンド及び受容体が含まれ、（これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）、並びに参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８３２９８６７号明細書などに記載のイムノアドヘシン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ）が含まれる。

治療の治療有効性を改善するために、他の薬剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用可能であることが企図される。したがって、さらなる例を企図することができる。これらの追加の薬剤には、細胞表面受容体及びギャップ結合のアップレギュレーションに影響を与える薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を高める薬剤、又は他の生物学的薬剤が含まれる。ギャップ結合の数を増やすことによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増加させる。他の実施形態では、治療の抗過剰増殖有効性を改善するために、細胞増殖抑制剤又は分化剤を、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用することができる。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の有効性を改善することが企図されている。細胞接着阻害剤の例は、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。治療有効性を改善するために、抗体ｃ２２５などの、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる他の薬剤を、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用可能であることがさらに企図される。

（ＩＩＩ．実施例）
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態を明示するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明者により本発明の実施において良好に機能することが発見された技術を表し、したがって、その実施のためのある特定の様式を構成すると見なし得ることが当業者により理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態では多くの変更を行うことができ、なおかつ本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を得ることができることを理解すべきである。

（実施例１－消散した炎症の上皮記憶は、膵臓腫瘍形成を促進しながら組織損傷を制限する）
一過性炎症は、その消散後も長く腫瘍形成を促進する：
正常な膵臓上皮細胞のトランスフォーメーションに対する炎症の長期効果を調べるために、コレシストキニンのデカペプチド類似体であるセルレイン（以下、ＣＡＥ）（Ｂｏｗｉｅ，２０１３）を使用して、ドキシサイクリン投与を介して膵臓において発がん性ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｄ発現が誘導されるよく特徴付けられたＰＤＡＣマウスモデル（ｉＫＲＡＳモデル）において損傷及びその後の炎症を誘発した（Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｖｉａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｋａｐｏｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。間質及び微小環境リモデリングなどの慢性ＣＡＥ投与に関連する大きな交絡効果を回避するために、２日間のＣＡＥ投与からなる急性炎症のプロトコルを使用した（Ｍａｙｅｒｌｅ、２０１３年）（図１Ａ）。ＣＡＥ投与直後に、浮腫及び炎症細胞の小葉間／小葉内浸潤を伴う一過性の膵臓炎症が認められ、その後、７日目までに組織完全性の急速な回復が認められた（図１Ｂ）。免疫染色は組織学的分析と一致し、ＣＡＥ処置後１日目（Ｄ１）に存在する炎症性浸潤（ＣＤ４５^＋細胞）及び増殖（Ｋｉ６７染色）が７日後にＣＡＥ前レベルに戻ったことを明らかにし（図１Ｃ及び図６Ａ～Ｃ）、組織学的消散の完全な再確立が示された。加えて、炎症の主要な転写活性化因子ＮＦ－ｋＢ（Ｈａｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）及びＳＴＡＴ３（Ｐａｒｄｏｌｌ ａｎｄ Ｊｏｖｅ，２００９）の強い核染色が、膵炎の誘導直後に上皮細胞及び間質細胞において認められた。これらの２つの転写因子の正常化は、正常な膵臓組織像の回復と共に、炎症応答がＣＡＥ処置の１週間後に消失したことを示唆した（図１Ｄ及び図６Ｄ）。したがって、この単回の炎症事象の消散後に、発がん性ＫＲＡＳの効果を、膵炎の２８日後にその発現を誘導し、腫瘍発生をモニターすることによって調べた（図１Ａ）。ＣＡＥ処置マウスは、高い浸潤性を有する腫瘍を発生させ、未処置動物よりも早く疾患に屈した（ＣＡＥ処置動物における１９０日の生存率の中央値対未処置動物における未定義の生存率の中央値；ｐ＝０．０１）（図１Ｅ）。この観察は、核磁気共鳴（図１Ｆ）及び組織学的分析（図１Ｇ～Ｈ）によっても確認された。重要なことに、炎症から回復した動物の生存率は、炎症の誘導前にＫＲＡＳが活性化されたマウスの生存率と重複していた（図６Ｅ）。全体として、これらのデータは、一過性の炎症事象が正常な上皮細胞に持続的な影響を及ぼし、それらの消散後長時間にわたってがん遺伝子活性化と協働し得ることを示す。

消散した炎症の長期効果は細胞自律的である：
ＣＡＥ処置動物と未処置動物との間の転帰の違いが、上皮細胞自律的効果に起因するのか、又は永続的に活性化される間質の影響に起因するのかを判定するために、急性ＣＡＥ処置の４週間後のマウスの膵臓から、並びに未処置対照動物から、上皮培養物を確立した。野生型膵臓に由来する二次元（２Ｄ）培養物はインビトロでの増殖が限定的であるため、上皮細胞を３Ｄオルガノイドとして培養した。３Ｄオルガノイドは、インビボで膵臓再生を維持することができる前駆細胞の集団によって維持される十分に確立された培養系である（Ｗｅｓｔｐｈａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。これらの実験条件下で、上皮オルガノイドが前駆細胞に由来することが初めて確認された。膵臓前駆細胞は、Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｋｉｎａｓｅ １（ＤＣＬＫ１）に対して陽性であることが記載されている。したがって、Ｄｃｌｋ１プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質が発現されるマウスモデル（Ｄｃｌｋ１－ＤＴＲ－ＺｓＧｒｅｅｎ）（図７Ａ）を使用すると、オルガノイドを生成することができる膵臓細胞だけが、以前に報告されたように（Ｗｅｓｔｐｈａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、ＺｓＧｒｅｅｎ陽性画分にあることが見出された（図２Ａ及び図７Ｂ）。

オルガノイドが機能的膵臓前駆体の供給源であることをさらに確証するために、移植時に正常な膵臓組織を再生するそれらの能力を評価した。この目的のために、それらの上皮起源を追跡するために、Ｐ４８－Ｃｒｅ；Ｒ２６－ｍＴ／ｍＧ動物由来のＧＦＰ陽性オルガノイドを、膵臓がＣＡＥ処置によって損傷された同系レシピエントに同所移植した。移植４週間後、移植動物においてＧＦＰ陽性小葉が明確に検出された（図２Ｂ）。次に、オルガノイドを、炎症から回復した動物及び一致する対照（図２Ｃ）から得た。数値的及び形態学的に類似していたが（図７Ｃ～図７Ｄ）、炎症に事前に曝露されたマウスに由来するオルガノイドは、対照と比較してサイズの増加を示し（図２Ｄ及び図７Ｅ）、予め炎症に曝露された上皮細胞がインビトロでより効率的に拡大し得ることを示唆した。培養５週間後、ｉＫＲＡＳオルガノイドを炎症未経験レシピエントに同所移植し、ＫＲＡＳを誘導した（図２Ｃ）。ＣＡＥ処置された膵臓に由来するオルガノイドを受容したマウスは、対照と比較して、高い浸潤性を有する腫瘍を発生させた（図２Ｅ）。これらの腫瘍は、肝臓の二次局在及び低分化組織像の両方によって示されるように、非常に侵攻性であった（図２Ｆ、左パネル）。ＣＫ１９及びアミラーゼなどの膵臓外分泌分化のマーカーについての局所的陽性（図７Ｆ）、ＧＦＰについての陽性及びＣＤ４５免疫反応性の排除により、これらの腫瘍の膵臓起源が累積的に確認された（図２Ｆ、中央右パネル）。特に、分化の欠如を説明するＤｃｌｋ１の広範な陽性（図２Ｇ及び図７Ｇ）は、この実験設定において腫瘍が、膵臓オルガノイドを維持する前駆細胞のトランスフォーメーションに由来することを示唆する。

これらのデータは、発がん性シグナル伝達と協働する長期持続性上皮修飾が細胞自律性であり、膵臓再生及び腫瘍形成を維持することができる前駆細胞のプールによって経時的に維持されることを示す。

一過性炎症事象は上皮細胞における持続的なトランスクリプトーム調節解除を誘導する：次に、炎症後及び対照野生型オルガノイドのトランスクリプトーム分析をＣＡＥ処置の９週間後に実施した（これは、インビボでの４週間の回復とその後のエクスビボでの５回の毎週の継代とを含んでいた）。４４１個のアップレギュレートされた遺伝子及び４１６個のダウンレギュレートされた遺伝子（ＦＤＲ≦０．０５、Ｌｏｇ２ ＦＣ≧０．８）が同定された（図３Ａ）。Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＧＳＥＡ）及びＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ（ＩＰＡ）解析は、特にＣＡＥ処置動物に由来するオルガノイドにおいて、発生、細胞遊走、創傷治癒及びがんに関与する遺伝子発現プログラムの活性化を示した（図３Ｂ、Ｃ）。ＲＡＳ及びｐ５３などのＰＤＡＣに関与する重要なシグナル伝達経路も同様に調節解除された（図３Ｂ）。注目すべきことに、膵臓胚発生及び腫瘍形成中に同時制御される一組の遺伝子（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ／Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）は、炎症を起こした膵臓に由来するオルガノイドにおいて有意に濃縮された（図３Ｂ）。これらの所見は、上皮細胞が、がん進行中に再活性化される胚性プログラムを含む複数の遺伝子発現プログラムの持続的活性化を含む、組織損傷に対する適応応答を維持するという考えを裏付ける。

この持続的な転写シグネチャを担う調節ネットワークを同定するために、オルガノイド発現データを最初に調べ、急性炎症事象後に発現が持続的に変化した５９個の転写因子（２０個のアップレギュレーション及び３９個のダウンレギュレーション）を同定した（図８Ａ）。Ｅ２ｆファミリーメンバーなどの増殖に関与する転写因子に加えて、Ｓｏｘ９、Ｒｕｎｘ１、Ｅｔｓ１及びＭｙｃなどの転写因子が腫瘍進行における重要なプレイヤーであることが見出され、膵臓がんに特異的に関連することが公知である（Ｓｃｈｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｄｉｔｔｍｅｒ，２０１５；Ｍａｚｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｇｅｎｏｖｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。

以前の炎症によって誘導された持続的な調節変化のより包括的な説明を得るために、活性なエンハンサー領域及びプロモーター領域を検出するＨ３Ｋ２７Ａｃに対する抗体を使用して、炎症膵臓及び非炎症膵臓からのペアリングされたオルガノイドに対してＣｈＩＰ配列決定実験を行った。遺伝子発現変化と同様に、未処置マウス及びＣＡＥ処置マウス由来のオルガノイド間では、ヒストンアセチル化（３，５２０個の過剰アセチル化領域及び２，９１３個の低アセチル化領域、その９０％が遺伝子プロモーターから遠位に位置していた）において多数の持続的な差異が見出された（図３Ｄ）。

次に、他のすべてのＲｅｆＳｅｑ遺伝子と比較して、調節解除された遺伝子のプロモーターにおいて、同様にまた、遠位の差次的にアセチル化された領域において、統計的に過剰に提示されるＤＮＡ配列モチーフを同定した（図３Ｅ）。プロモーター領域では、早期成長応答遺伝子ファミリー（Ｔｈｉｅｌ ａｎｄ Ｃｉｂｅｌｌｉ，２００２）の転写調節因子であるＥＧＲ１によって認識されるモチーフの過剰提示が見出され、その発現もまた、ＣＡＥ処置マウス由来のオルガノイドにおいて持続的にアップレギュレートされた。さらに、ＳＯＸ及びＯＮＥＣＵＴファミリーメンバーによって認識されるモチーフの過剰提示は、低アセチル化領域において見出されたが、ＦＯＸＡ３及びＮＫ関連因子、例えばＮＫＸ２－２、ＮＫＸ６－１及びＢＡＲＸ２のモチーフは、高アセチル化セットにおいて過剰提示された（図３Ｅ）。

以前の分析から同定された転写因子の役割可能性を検証するために、免疫染色実験を実施したところ、ＥＧＲ１、ＥＴＳ１、ＲＵＮＸ１及びＳＯＸ９は正常な膵臓で発現されなかったか、又はＳＯＸ９のような管細胞でのみ発現されたが、代わりにＣＡＥ投与後に大部分の上皮細胞の核で高度に発現されたことが示された（Ｄ１）。それほど強くないにもかかわらず、それらの異所性発現は、後期時点（Ｄ２８）で腺房細胞において持続した（図３Ｆ及び図８Ｂ～図８Ｄ）。特に、免疫染色によって分析したヒト慢性膵炎の試料では、同じ転写因子がアップレギュレートされた（図９）。

まとめると、これらのデータは、正常な膵臓上皮細胞が炎症の一過性エピソードから組織学的に回復した後、持続的な転写リプログラミングによって維持される長期持続性の適応応答を獲得することを実証している。

ＩＬ－６は炎症事象の際に上皮リプログラミングを媒介する：
上皮リプログラミングが炎症細胞の活性に依存するかどうかを試験するために、急性膵炎から単離されたＣＤ４５陽性細胞によって馴化された培地を用いて、ｉＫＲＡＳ膵臓から誘導された上皮オルガノイドを培養した。１週間後、オルガノイドを従来の培地に移し、サイトカイン曝露の急性効果を最小限に抑えるためにさらに４週間培養を続けた（図４Ａ）。次いで、ＣＤ４５馴化培地に曝露したオルガノイド又は対照オルガノイドをレシピエントマウスに同所移植し、ＫＲＡＳ発現を誘導した。ＣＤ４５馴化細胞を注射したマウスのみが、ＣＡＥ処置膵臓に由来するオルガノイドの移植から得られたものに組織学的に類似する腫瘍を発生させた（図４Ｂ及び図１０Ａ）。これらの腫瘍の上皮起源は、ＧＦＰマーカーの陽性によって確認された（図１０Ｂ）。

この実験により、上皮細胞が、膵臓上皮における炎症誘発性変化を媒介する炎症細胞によって放出される可溶性分子を介してエクスビボでリプログラミングされることが確認される。ＣＤ４５馴化培地のＥＬＩＳＡ分析により、高レベルのＩＬ－６及びＧ－ＣＳＦの存在が明らかになった（図４Ｃ及び図１０Ｃ）。Ｇ－ＣＳＦ受容体はデータセットにより膵臓細胞では発現されないので、ＩＬ－６は、ＰＤＡＣ進行におけるその役割が多くの証拠によって裏付けられており（Ｇｒｉｖｅｎｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｋａｒｉｎ ａｎｄ Ｃｌｅｖｅｒｓ，２０１６；Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｌｅｓｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、最も可能性の高いプレイヤーであると見なされた。オルガノイドをＣＤ４５馴化培地に、並びにｇｐ１３０トランスシグナル伝達に関与することができる強力なキメラ分子である組換えＨｙｐｅｒ－ＩＬ６に曝露することにより、Ｔｙｒ７０５におけるＳｔａｔ３リン酸化の強い誘導が確認された（図４Ｄ）。一貫して、インビボ免疫染色分析により、ＣＡＥ処置（Ｄ１）の直後に膵臓試料中の実質的にすべての腺房細胞においてＩＬ－６陽性浸潤細胞と核リン酸化ＳＴＡＴ３シグナルとの同時検出が明らかにされた（図４Ｅ）。

急性ＣＡＥ曝露（Ｄ１）時に膵臓に動員されたＣＤ４５細胞のマスサイトメトリー免疫表現型検査により、リンパ系細胞（ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、ＮＫ１．１）のごくわずかな寄与（図１０Ｄ）を伴うマクロファージ（ＣＤ６８＋、Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１＋）の大規模な浸潤（図４Ｆ）が明らかにされた。さらに、ＩＬ－６に対する免疫反応性のｔＳＮＥ提示は、インビボでのＩＬ－６産生の主要な供給源としてマクロファージを同定するＣＤ６８、Ｆ４／８０及びＣＤ１１マーカーと完全に重なっていた（図４Ｆ）。ＩＬ－６が上皮リプログラミングのメディエーターであることを明確に実証するために、ＩＬ－６処理オルガノイドを、膵炎の際にインビボで調節解除されることが見出された主要な転写因子の発現について測定した。ＥＧＲ１、ＲＵＮＸ１、ＥＴＳ１及びＳＯＸ９の免疫ブロット法により、オルガノイドをＨｙｐｅｒ－ＩＬ６に２４時間曝露すると、それらの強いアップレギュレーションが見られることが明らかにされた（図４Ｇ）。

腺房－導管異形成は、組織損傷を制限するための上皮記憶によって促進される：
適応過程として、以前の炎症の上皮記憶は進化的利点を付与するはずである。インビボでの主に腺房区画における異所性転写因子の調節解除のために、そのような記憶が再発性炎症事象の場合に防御機序を提供する可能性があり、そうでなければ膵臓酵素の反復放出及び累積的な組織損傷をもたらすと思われる。個別の炎症エピソードがその後の炎症事象にどのように影響し得るかを理解するために、ＣＡＥ誘導性急性膵炎から回復した動物に、２回目の炎症を再チャレンジした（図５Ａ）。膵炎誘導後２４時間の野生型マウスの血液中の膵臓酵素（図５Ｂ）並びに乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ、細胞溶解のマーカー）（図５Ｃ）の初期評価では、再チャレンジ群の両酵素が対照動物とほぼ同等であることが明らかになった。この結果は、第１の炎症事象によって引き起こされる持続的な適応応答が、第２の急性炎症によって誘導される膵臓損傷を軽減したことを示唆している。実際、組織学的レベルでは、第１の炎症のトリガーを受けた動物の膵臓のみが広範な腺房損傷の存在を示し（図５Ｄ、左パネル）、このことは、切断型カスパーゼ３（ＣＣ３）についての免疫染色によってさらに確認される（図５Ｄ、右パネル）。予想外に、再チャレンジされた動物の膵臓は、ＣＡＥ投与後４８時間以内に完全に現れた広範な腺房－導管異形成（ＡＤＭ）を起こすことによって、第２の炎症事象に応答した（図５Ｅ及び図１１Ｃ～Ｅ）。さらに、機能的膵臓組織の完全な回復によって実証されるように、ＡＤＭ事象はＣＡＥ投与後７日目までに完全に消散した（図１１Ｃ、図１１Ｄ）。

このように、急性炎症事象によって膵臓上皮において引き起こされた持続的な適応応答は、その後の炎症エピソードに対する著しく軽減された応答をもたらした。このような組織損傷の減少は、刺激の長さにわたって持続した腺房細胞の急速な脱分化を伴い、それによって組織が迅速かつ明白に完全に回復した。ＡＤＭが、繰り返される膵炎の有害効果を制限する上皮記憶によって媒介される生理学的、迅速かつ可逆的な適応であるという仮説を探求するために、ＡＤＭの薬理学的調節の効果を、繰り返される炎症に供されたｉＫＲＡＳ動物において評価した。ＡＤＭはＭＡＰＫシグナル伝達の活性化によって媒介されるので（Ｈａｌｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、臨床ＭＥＫ１－２阻害剤（トラメチニブ）又はＥＧＦ（ＭＡＰＫ活性化因子）によりそれぞれＡＤＭ形成が打ち消されるか又は促進された（図５Ａ）。ＣＡＥ再チャレンジの前及び最中にＥＧＦで前処置されたマウスは、ＣＡＥ単独で再チャレンジされた対照マウスと比較して、ＡＤＭ形成のさらなる増大を有し（約３倍の相対面積増加、ｐ＜０．０１）（図５Ｆ、図５Ｇ及び図１１Ｆ）、ＣＣ３免疫染色によって示されるように、組織損傷が減少した（約８倍、ｐ＜０．０１）（図５Ｆ、５Ｈ）。逆に、トラメチニブで前処置した動物は、最小のＡＤＭを発症し（図５Ｆ、図５Ｇ及び図１１Ｆ）、大量のアポトーシス及び広範囲の腺房喪失を伴う非常に重度の膵炎を伴った（図５Ｆ～Ｈ）。まとめると、これらのデータは、炎症に応答した持続的な上皮適応がＡＤＭの促進を伴うモデルを支持する。連続する炎症事象の際に腺房チモーゲンの産生を遮断することにより、ＡＤＭの促進が組織損傷からの強力な保護をもたらす。

ＡＤＭは膵臓損傷に対する保護効果を有するので、ＭＡＰＫシグナル伝達の構成的活性化を付与する変異（例えば、ＫＲＡＳの変異）の選択が有益であり、強い進化的圧力下にあり得ると仮定される。この可能性の初期評価に向けて、第２の炎症事象の前に変異ＫＲＡＳを誘導する影響を試験した。実際、上皮記憶を有する動物では、２回目のＣＡＥ曝露前のＫＲＡＳシグナル伝達を構成的に活性化すると、大規模なＡＤＭをもたらし（図５Ｆ、５Ｇ）、実質的に組織損傷をもたらさなかった（図５Ｆ、５Ｇ）。

これらの強力な証拠に照らして、ＭＡＰＫの活性化を介したＡＤＭの薬理学的調節の使用は、組織損傷を抑制し、炎症を消散させ、繰り返される膵炎の際に膵臓がんの発症をもたらすであろうＫＲＡＳの変異の獲得を防止する手段として本明細書で提案される。

膵炎によって誘発される損傷を最小限に抑えるために動物において進化した機構であるＭＡＰＫシグナル伝達経路の薬理学的ポジティブモジュレーションに基づくアプローチが、膵臓の炎症を制限するための現在のアプローチよりも優れていることを実証するために、セルレイン投与による膵炎の誘導前に、強力な抗炎症薬であるスリンダク（６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．セルレイン処置の２４時間前から開始して１日に１回、合計４日間の注射）又はＭＡＰＫアゴニストのＥＧＦ（１．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、１日２回、合計４日間の注射）でマウスを前処置した。図１２に示すように、活性炎症の十分に確立されたマーカーであるＣＤ４５細胞の浸潤は、ＥＧＦ前処置によってほぼ完全に抑制され、この仮説の妥当性及びスリンダクなどの従来の薬剤に対する本アプローチの優位性が実証された。

最後に、この知見のトランスレーショナルな適用性を明確に実証するために、膵炎に対する小分子ＭＡＰＫ活性化因子及びエピジェネティック修飾因子などのＡＤＭ誘導物質の影響を評価した。

ＭＡＰＫ活性化因子：ＭＡＰＫシグナル伝達の選択的かつ強力な活性化因子であるように設計された小分子薬物は、現在市販されていない。ＭＡＰＫ活性化因子として逆説的活性を有すると報告された唯一のものは、ＲＡＦ野生型遺伝的状況に特異的に適用された場合のＲＡＦ阻害剤である（Ｊｏｓｅｐｈ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｃａｒｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。実際、野生型マウスを膵炎の誘導前及び誘導中（７５ｍｇ／ｋｇ、強制経口投与、セルレイン処置の４８時間前から開始して１日に２回の注射、合計８回の注射）にベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２、Ｖ６００Ｅ変異体ＢＲＡＦの選択的阻害剤である）で前処置した場合、ＥＲＫリン酸化の増加によって検証されるように、ＭＡＰＫシグナル伝達の顕著な活性化が膵臓組織で観察された。ＡＤＭが膵炎の有害効果を改善し得るという観察結果と一致して、ＣＤ４５染色及び定量化によって実証されるように、免疫細胞浸潤物の大幅な減少も検出された（図１３Ａ～１３Ｂ）。この場合もやはり、ＭＡＰＫ活性化を介したＡＤＭの薬理学的調節は、組織損傷を最小限に抑え、膵臓炎症を消散させ、腫瘍開始ＫＲＡＳ変異を獲得するための選択圧を潜在的に無効にするための有益な治療選択肢であることが証明された。具体的には、ベムラフェニブ及び他のＲＡＦ阻害剤は、既に許容され得る安全性プロファイルで膵炎を消散させる臨床グレードの可能性を有する第一世代の小分子ＭＡＰＫ活性化因子を構成する。

エピジェネティック修飾因子：近年、エピジェネティック調節の新たな役割により、血液悪性腫瘍及び固形腫瘍の前臨床モデルにおいて現在評価中のブロモドメイン及び余剰末端（ＢＥＴ）タンパク質ファミリーを選択的に標的化する広範囲の小分子の開発がもたらされている（Ａｓａｎｇａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｄｅｌｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。急性炎症事象によって誘導された持続性クロマチン修飾を利用して、繰り返される膵炎の有害効果を制限する可能性を、進行した悪性腫瘍を有する患者における現在第Ｉ～ＩＩ相臨床試験中（Ｆａｌｃｈｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１９）のＢＲＤ４阻害剤であるＩＮＣＢ０５４３２９の投与によって試験した。繰り返される膵炎の状況においてＡＤＭを誘導する化合物の能力を評価するために、４０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｉ．ｄのＩＮＣＢ０５４３２９を、セルレイン処置の前及び最中に強制経口投与によって投与した。セルレイン注射終了２４時間後に収集した膵臓組織の組織学的評価により、ＢＲＤ４ｉ（ＩＮＣＢ０５４３２９）処置マウスにおける大量のＡＤＭ誘導が明らかになった。以前のデータと一致して、拡張されたＡＤＭは、ＣＤ４５免疫染色によって実証されるように、炎症性浸潤の劇的な減少を伴い、炎症事象の際の組織完全性の維持におけるＡＤＭの保護的役割を強調した。

（実施例２－材料及び方法）
マウス：ｉＫＲＡＳマウスモデル（ＴｅｔＯ－ＬＳＬ－Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；ＲＯＳＡ２６－ＬＳＬｒｔＴａ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ；ｐ４８＿Ｃｒｅ）を以前に記載されたように作製した（Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＤＣＬＫ１－ＤＴＲ－ｚｓＧｒｅｅｎマウスモデルは、本明細書に記載のＤｒ．Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｃｒａｉｇ Ｗａｎｇの研究室で作製された。ＤＴＲ－２Ａ－Ｚｓｇｒｅｅｎ－ｐＡ－ＦｒｔＮｅｏＦｒｔカセットをｐＬ４５１プラスミドに連結した。Ｄｃｌｋ１遺伝子コード領域（ＣＨＯＲＩ）の約５０ｋｂの５′配列を含むＢＡＣクローンＲＰ２３－２８３Ｄ６を単離し、ＳＷ１０５コンピテントセルに移入した。目的の領域において制限酵素消化及びＰＣＲを行い、正しい配列を確認した。マウスＤｃｌｋ１遺伝子のエクソン２のＡＴＧのすぐ上流及び下流のＢＡＣ配列に相同な７５ｂｐ配列を含むプローブを有する精製ＤＴＲ－２Ａ－Ｚｓｇｒｅｅｎ－ｐＡ－ＦｒｔＮｅｏＦｒｔを、ＳＷ１０５ Ｄｃｌｋ１－ＢＡＣ含有細胞にエレクトロポレーションした。ＢＡＣ ＤＮＡを単離し、直鎖化し、次いで、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｒｅ施設で、受精したＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ卵母細胞の前核にマイクロインジェクションした。１つの陽性の創始体を同定し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに戻し交配した。

Ｂ６．１２９（Ｃｇ）－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ^{ｔｍ４（ＡＣＴＢ－ｔｄＴｏｍａｔｏ、－ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ}／Ｊ（Ｒ２６＿ｍＴ／ｍＧと呼ばれる）マウスをＤｒ．Ｌｉｑｕｎ Ｌｕｏの研究室で作製し、並びにＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型動物と共にＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＮＣＲ－ＮＵ免疫不全マウスはＴａｃｏｎｉｃから購入した。マウスを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＤＡＣＣ）の病原体フリーの施設に収容した。すべての操作を、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルのもとで行った。

ヒト試料：急性及び慢性の膵臓炎症の症例を含むヒト組織スライドを、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ，Ｉｎｃ．から購入し、下記のプロトコルに従って免疫蛍光染色に使用した。

（インビボ実験）
急性膵炎の誘導。４～６週齢の動物を１２時間絶食させた後、セルレイン（５０μｇ／ｋｇ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を連続した２日にわたって１６回注射した（Ｍａｙｅｒｌｅ，２０１３）。対照マウスには、発熱物質非含有ＰＢＳを注射した。マウスを健康状態について毎日調べ、示された時点でＣＯ２窒息及び頸椎脱臼によって屠殺した。

生存試験。炎症から回復したマウス又は同所移植を受けたマウスにおけるＫＲＡＳ発現は、ドキシサイクリン投与（４ｕｇ／ｇの１回のＩＰ注射）によって誘導及び維持され、その後、スクロース（２０ｇ／ｌ）を補充した飲料水でドキシサイクリン（２ｇ／ｌ）をマウスに与えた。次いで、マウスを、磁気共鳴画像法（下記参照）によって腫瘍発生について経時的にモニターした。

同所移植。６～９週齢の雌ＮＣＲ－ＮＵマウスに、イソフルランで麻酔した後、改変ＰＤＥＣ培地及びＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）（１：１の比）に再懸濁した、ｉＫＲＡＳオルガノイド由来の２．５×１０^５個の上皮細胞を同所移植した（下記のオルガノイド培養を参照のこと）。移植直後にＫＲＡＳ発現を誘導し、次いで、マウスを磁気共鳴画像法によって腫瘍発生についてモニターした。

組織病理学、免疫組織化学及び免疫蛍光法：組織標本を４％緩衝ＰＦＡで一晩固定し、７０％エタノールに移し、次いでＬｅｉｃａ ＡＳＰ３００Ｓプロセッサを使用してパラフィンに包埋した。組織病理学的分析のために、膵臓を切片化し（Ｌｅｉｃａ ＲＭ２２３５）、連続スライドを収集した。シリーズごとに、１つの切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、残りの切片を免疫蛍光分析又は免疫組織化学分析のいずれかのために保存した。組織学的試料を前述のように処理した（Ｖｉａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。簡単に記載すると、切断、焼成及び脱パラフィン処理の後、切片を、仕様に従ってＣｉｔｒａ－Ｐｌｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）を使用して抗原賦活化（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）に供した。免疫組織化学染色のために、内因性ペルオキシダーゼを３％過酸化水素によって不活性化し、非特異的シグナルを、３％ ＢＳＡ、１０％ヤギ血清及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎを使用して遮断した。一次抗体を適用し、４℃において一晩インキュベートした。二次抗体としてＩｍｍＰｒｅｓｓ ＨＲＰ ＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）を使用し、検出にはＩｍｍＰａｃｔ Ｎｏｖａ ＲＥＤ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）を使用した。広視野Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ－Ｃｉ顕微鏡を使用して、Ｎｉｋｏｎ ＤＳ－Ｆｉ１デジタルカメラで画像をとらえた。免疫蛍光染色のために、Ａｌｅｘａ－４８８及びＡｌｅｘａ－５５５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とコンジュゲートした二次抗体を使用した。フルオレセイン標識されたＤｏｌｉｃｈｏｓ Ｂｉｆｌｏｒｕｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＤＢＡ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用して、示された場合に管細胞を検出した。ＤＡＰＩ核対比染色も行った。広視野Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ－Ｎｉ顕微鏡を使用して、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃ１１４４０デジタルカメラで画像を撮影した。オルガノイドの特性評価画像は、Ｎｉｋｏｎ高速多光子共焦点顕微鏡Ａ１ Ｒ ＭＰを使用して取得した。

以下の一次抗体を使用した：α－アミラーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＫ１９（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ）、ＧＦＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＮＦ－ｋＢ ｐ６５（ｐｈｏｓｐｈｏ Ｓｅｒ ５３６）（Ａｂｃａｍ）、切断型カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｅｇｒ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｒｕｎｘ１（Ａｂｃａｍ）、Ｅｔｓ１（Ａｂｃａｍ）、ＣＤ４５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｋｉ６７（Ａｂｃａｍ）、Ｓｏｘ９（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＩＬ－６（Ａｂｃａｍ）、Ｓｔａｔ３（ｐｈｏｓｐｈｏ Ｔｙｒ７０５）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びＤＣＬＫ１（Ａｂｃａｍ）。

オルガノイド注射によって再構成された膵臓組織におけるＧＦＰ検出のために、試料を４℃において４％緩衝化ＰＦＡで一晩固定し、ＰＢＳ＋スクロース２０％に移し、ＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）に包埋した。標本を凍結切片化し（Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９５０）、室温で１０分間乾燥させた後、ＤＡＰＩ核対比染色及び画像取得を行った。

画像定量化：スフェロイドサイズの定量化のために、３つの生物学的複製物からのオルガノイド培養物を表す９つの４倍倍率視野を、各実験群を、オルガノイド領域をピクセルとして表すＩｍａｇｅＪで分析した。定量化に使用した画像は、広視野Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ－Ｔｉ顕微鏡を使用してＣｏｏｌ－ＳＮＡＰ ＥＳ^２デジタルカメラで撮影した。

ＡＤＭ定量のために、各実験群２匹のマウスに由来する膵臓全組織標本のヘマトキシリン／エオシン染色された２つの１０倍視野について、ＩｍａｇｅＪを用いて分析した。ピクセルで表されるＡＤＭ領域を、参照と考えられる対照（再チャレンジ）マウスに対して正規化した。定量化に使用した画像は、広視野Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ－Ｃｉ顕微鏡を使用してＮｉｋｏｎ ＤＳ－Ｆｉ１デジタルカメラで撮影した。

切断型カスパーゼ－３（ＣＣ３）免疫染色定量化のために、広視野Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ－Ｎｉ顕微鏡を使用してＨａｍａｍａｔｓｕ Ｃ１１４４０デジタルカメラで撮影した画像を電子的に処理して、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して自己蛍光（例えば、赤血球）を除去した。次いで、画像をＩｍａｇｅＪで分析し、面積（ピクセル）として表されるＣＣ３特異的シグナルを、ＤＡＰＩを使用して総膵臓実質に対して正規化した。３匹のマウスに由来する膵臓全組織標本の６～９つの４倍拡大視野について、各実験群を分析した。

炎症誘導性ＴＦの定量化のために、Ｍａｔｌａｂ（Ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．）を用いた自動画像セグメンテーションを行った。Ｏｔｓｕの閾値化法及びマーカー制御ウォーターシェッドアルゴリズムを使用して、各単一細胞の核領域をセグメンテーション及び特定し、各セグメンテーション領域における各マーカーの平均ピクセル強度を定量化した。ｓｏｘ９染色の場合、定量前に、ＤＢＡ染色について陽性の細胞を除外した。データ表現には、対数スケールのバイオリングラフを用いた。各実験群の３～５匹のマウスの膵臓組織の少なくとも７つの４０倍視野から平均３，８００個の核を計数し、分析に使用した。

磁気共鳴画像法：内径６ｃｍの勾配磁場コイル及び内径３５ｍｍのボリュームコイルを備えた４．７Ｔ Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃ（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ）で動物を画像化した。マルチスライスＴ２強調画像を、ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ（ＲＡＲＥ）ｓｅｑｕｅｎｃｅを２，０００／３８ｍｓのＴＲ／ＴＥ、マトリックスサイズ２５６×１９２、０．７５ｍｍのスライス厚、０．２５ｍｍのスライスギャップ、４×３ｃｍのＦＯＶ、１０１ｋＨｚの帯域幅、３ＮＥＸで使用して、冠状面及び軸方向の幾何学的形状で取得した。軸方向スキャンシーケンスをゲーティングして呼吸運動を減少させた。

（インビトロ実験）
オルガノイド培養：オルガノイド（嚢胞スフェロイド）培養を、野生型又はｉＫＲＡＳ動物の両方を使用して、いくつかの改変を加えて、以前に記載されたように（Ａｇｂｕｎａｇ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｄｅｒａｍａｕｄｔ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）行った。簡潔には、年齢が一致した対照動物及び急性膵炎から回復期間４週間の動物から膵臓を採取し、処理前に氷上で維持した。機械的に破壊したら、組織をＧ溶液（ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）、５ｍｇ／ｍｌ Ｄ－グルコース（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））で２回洗浄し、酵素消化（コラゲナーゼＩＶ（Ｇｉｂｃｏ）－ディスパーゼＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）、２ｍｇ／ｍｌ）のために３７℃において４５分間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離し、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いて３７℃で５分間さらに消化して、単一細胞懸濁液を得た。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、コラーゲンＩＶコーティングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の改変ＰＤＥＣ培地：２．５ｍＭ Ｌ－グルタミン、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＨｙＣｌｏｎｅ）、５ｍｇ／ｍｌ Ｄ－グルコース（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１．２２ｍｇ／ｍｌニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、５ｎＭ ３，３，５－トリ－ヨード－Ｌ－チロニン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５μＭヒドロコルチゾン溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｎｇ／ｍｌコレラ毒素（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５％インスリン－トランスフェリン－セレン＋（ＢＤ）、１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍｇ／ｍｌ大豆トリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２５μｇ／ｍｌのウシ下垂体抽出物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び５％Ｎｕ血清ＩＶ培養サプリメント（ＢＤ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１にプレーティングした。２日後、上清細胞画分を回収し、ＰＤＥＣ－Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）（１：１．５比）に再プレーティングした。次いで、オルガノイドを低密集度で７～１０日ごとに継代した。

ＣＤ４５＋細胞の単離、オルガノイド共培養及びＨｙｐｅｒ－ＩＬ６処理。
セルレインの最後の注射の２４時間後に膵臓を採取し、表面抗原を保存するためにトリプシン消化を行わなかったことを除いて、上記のプロトコルに従って細胞を単離した。消化後、膵臓を４５μｍナイロンメッシュで濾過して、上皮構造を他の細胞から分離した。濾過後、ＣＤ４５＋細胞画分を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍｏｕｓｅ Ｂｉｏｔｉｎ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者のプロトコルに従って用い、抗ＣＤ４５－Ｂｉｏ抗体（３０－Ｆ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して精製した。単離された細胞の純度（約９５～９８％）を、ＳＡ－ＡＰＣを使用してフローサイトメトリーによってチェックした。次いで、単離されたＣＤ４５＋細胞を改変ＰＤＥＣ培地に懸濁し、上皮オルガノイドとの共培養を設定するために使用した。手短に言えば、炎症に曝露されたことがないオルガノイド由来のｉＫＲＡＳ上皮細胞を、高密度細孔トランズウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．）のＰＤＥＣ－Ｍａｔｒｉｇｅｌにプレーティングし、次いで、改変ＰＤＥＣ培地（２ｍｌ／ウェル）に懸濁した精製ＣＤ４５＋細胞を含む６ウェルプレートに挿入した。１週間の共培養後、オルガノイドを収集し、「従来の」改変ＰＤＥＣ－Ｍａｔｒｉｇｅｌに再播種した。Ｈｙｐｅｒ－ＩＬ６実験のために、オルガノイドを２００ｎｇ／ｍｌのＨｙｐｅｒ－ＩＬ６の存在下でＰＤＥＣ－Ｍａｔｒｉｇｅｌに２４時間プレーティングした。Ｈｙｐｅｒ－ＩＬ６は、Ｄｒ．Ｓｔｅｆａｎ Ｒｏｓｅ－Ｊｏｈｎの厚意により提供された。

フローサイトメトリー及び単一細胞選別：フローサイトメトリーのために、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｓｏｕｔｈ Ｃａｍｐｕｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ又はＬＳ－Ｆｏｒｔｅｓｓａサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して試料取得を行った。ゲーティング戦略の時点でダブレット及び死細胞（ＤＡＰＩ陽性）を除外して、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ又はＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）によってデータを分析した。単離された炎症細胞の純度評価のために、抗ＣＤ４５－Ｂｉｏ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体で標識された消化膵臓を、ＥａｓｙＳｅｐ精製の前後にＳＡ－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。

細胞選別のために、上記の機械的破壊及び酵素消化の後、ＤＣＬＫ１－ＤＴＲ－ｚｓＧｒｅｅｎマウス及び野生型対照動物の膵臓から単一細胞懸濁物を得た。死細胞を除外するために１μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を添加した後、選別ゲートを設定するために野生型動物から単離した細胞を使用して、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｉｎｆｌｕｘ細胞選別機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で試料を処理した。ＤＣＬＫ１－ＤＴＲ－ｚｓＧｒｅｅｎ消化された膵臓由来の細胞のｚｓＧｒｅｅｎ陽性画分と陰性画分の両方を収集し、オルガノイド培養物を確立するために使用した。

サイトカイン検出：セルレイン処理された膵臓から単離されたＣＤ４５＋細胞によって馴化された培地を指示された時点で収集し、Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｍｕｌｔｉ－Ａｎａｌｙｔｅ ＥＬＩＳＡｒｒａｙ Ｋｉｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって分析した。製造業者のプロトコルに従って、独立したウェルから測定を複数回繰り返した。吸光度をＰＨＥＲＡＳｔａｒ ＨＴＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）によって読み取った。

血清アミラーゼ及びＬＤＨ検出：セルレインの最初の注射から２４時間後（８回の注射後）に眼窩後静脈から血液を採取し、Ｚ－Ｓｅｒｕｍ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｃｌｏｔ Ａｃｔｉｖａｔｏｒチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に収集した。室温で３０分後、試料を１０分間遠心分離して凝血塊を血清から分離し、次いで試料のアリコートをとり、－８０℃で保存した。血清中の膵アミラーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼの濃度を、それぞれＡｍｙｌａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）及びＭｏｕｓｅ ＬＤＨ／Ｌａｃｔａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、仕様に従って測定した。

免疫ブロット法：氷冷ＰＢＳで洗浄した後、収集した細胞をペレット化し、プロテイナーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液に再懸濁した。次いで、溶解物を１４，０００ｒｐｍで２０分間４℃において遠心分離して、デブリド（ｄｅｂｒｉｄｅ）を除去した。タンパク質濃度を、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して評価した。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用の５～１５％勾配のＭｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅａｎ ＴＧＸ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌにロードし、次いで、標準プロトコルに従ってＰＶＤＦ膜に転写した。膜を、表示の一次抗体と共にインキュベートし、洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体でプロービングした。タンパク質特異的シグナルを、フィルム曝露時の化学発光によって同定した。以下の抗体を使用した：Ｓｔａｔ３（ホスホＴｙｒ７０５）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｓｔａｔ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｅｇｒ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｒｕｎｘ１（Ａｂｃａｍ）、Ｅｔｓ１（Ａｂｃａｍ）、Ｓｏｘ９（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びＶｉｎｃｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。

ＣｙＴＯＦ免疫表現型検査：細胞表面マーカーに対する金属標識抗体は、ＤＶＳ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。単一細胞懸濁液を、セルレイン誘導炎症に供され、最後のセルレイン注射から２４時間後に回収された膵臓組織から上記（ＣＤ４５＋細胞単離の項）のようにして得た。細胞を低張溶解によって赤血球を枯渇させた。洗浄後、試料を遠心分離し、全ての表面抗体の混合物を含むＰＢＳ＋０．５％ＳＡ溶液に再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を１回洗浄し、生存率染色のために２５ｕＭシスプラチンと共に１分間インキュベートした。固定・透過処理工程は、固定／透過処理溶液キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて２０分間行った。洗浄後、細胞内染色の工程を、細胞をＰＢＳ＋０．５％ ＢＳＡ溶液中でＩＬ６＿１６７Ｅｒ抗体（ＦｌｕｉｄｉＧＭ）と共に１時間インキュベートすることによって行った。洗浄後、試料をＭＡＸＰＡＲ（登録商標）核酸インターカレーター－Ｉｒ（ＤＶＳ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に４℃で一晩インキュベートして核を染色し、Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒのＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｅ ＦａｃｉｌｉｔｙでＣｙＴＯＦ機器（ＤＶＳ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。データをＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）及びｖｉＳＮＥで処理した。以下のマーカーを使用して、異なる免疫集団を画定した：ＣＤ４５＿８９Ｙ、ＣＤ６８ １４５Ｎｄ、ＣＤ１１ｂ １４８Ｎｄ、Ｆ４／８０＿１７３Ｙｂ、ＣＤ４＿１１５Ｉｎ、ＣＤ８ａ＿１６８Ｅｒ、Ｂ２２０＿１７６Ｙｂ、ＮＫ１．１＿１７０Ｅｒ。

ＲＮＡ－Ｓｅｑデータ解析：全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用してＣ５７ＢＬ６ ＷＴオルガノイドから抽出し、ＲＮＡ ＮａｎｏキットをＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で使用して解析した。試料のペアエンドマルチプレックス配列決定をＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００配列決定プラットフォームで行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａパイプラインによる品質フィルタリング後、オプション「－ｒ １４８－－ｎｏ－ｍｉｘｅｄ－－ｎｏ－ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ」でＴｏｐＨａｔ（バージョン２．１．０）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１３）を使用して、７６ｂｐのペアエンドリードをｍｍ１０マウス参照ゲノム及びＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓトランスクリプトーム（ＧＲＣｍ３８）とアラインメントした。遺伝子レベルで、オプション「－－ｌａｒｇｅｓｔＯｖｅｒｌａｐ」を用いて、ＮＣＢＩ ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０で注釈されているようにすべてのエクソンにわたるリードを合計するｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔ（Ｒｓｕｂｒｅａｄ ｖｅｒｓｉｏｎ １．５．１）（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を使用して、発現カウントを推定した。コード遺伝子と長い非コード遺伝子の両方を下流分析のために保持した。

対照の２つの生物学的複製物（Ｃｔｒｌ）及び３つの処置複製物（Ｐｏｓｔ－ＣＡＥ）における正規化及び差次的発現遺伝子を、ＥｄｇｅＲ Ｒ－ｐａｃｋａｇｅ（バージョン３．２．２）（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）を用いて同定した。正規化の前に、発現が低い遺伝子（０．５ ＣＰＭ未満、百万あたりのカウント、２つのＣｔｒｌ試料又は３つのＣＡＥ後試料中）をさらなる解析から除外した。正規化係数は、Ｔｒｉｍｍｅｄ Ｍｅａｎ ｏｆ Ｍ（ＴＭＭ）法を使用してフィルタリングされたデータ行列で計算し、続いてＬｉｍｍａ線形モデリング（Ｌａｗ ｅｔ ａｌ．，２０１４）の準備としてｖｏｏｍ平均－分散変換を行った。線形モデルを各遺伝子に適合させ、経験的ベイズモデレーテッド ｔ－統計を使用して発現の差を評価した（Ｓｍｙｔｈ，２００４）。発現レベルを、ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ法（ＦＰＫＭ）を用いて算出した。以下の基準が満たされた場合、遺伝子を差次的発現（ＤＥＧ）として同定した：倍率変化（ＦＣ）のｌｏｇ２≧０．８；偽発見率（ＦＤＲ）＜０．０５；一方又は両方の条件のすべての試料においてＦＰＫＭ少なくとも１。最小ＦＰＫＭ値を０．１に設定した後、及びｌｏｇ２変換後に、ユークリッド距離計量及び完全リンケージ規則を利用したｐｈｅａｔｍａｐ Ｒパッケージ（Ｋｏｌｄｅ Ｒ：ｐｈｅａｔｍａｐ：Ｐｒｅｔｔｙ Ｈｅａｔｍａｐｓ２０１５）を使用して、ＤＥＧを階層的にクラスタリングした。

遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）については、全ての遺伝子を符号付きＰ値によってランク付けし、１０００のｇｅｎｅ ｓｅｔ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎを行って統計学的有意性を評価した。ＦＤＲ＜０．０５の遺伝子セットを有意とみなした。遺伝子セットのバックグラウンドは、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）からダウンロードしたホールマーク遺伝子シグネチャを使用して構築した。発生及びＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ依存性発がん（腫瘍進行）の上皮膵臓マウス細胞において一般に上方制御される３１０個の遺伝子を考慮して、Ｒｅｉｃｈｅｒｔら（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）から「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ／Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ」と命名された追加の遺伝子セットを得た。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）は、市販のソフトウェアを用いて行った。

ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータ解析：Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００から得られたショートリードを、Ｉｌｌｕｍｉｎａパイプラインに従って品質フィルタリングした。次いで、パラメータの「－ｖｅｒｙ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ」プリセットを用いてＢｏｗｔｉｅ２ ｖ２．２．６（５４）を使用し、リードをヒトｍｍ１０参照ゲノムにマッピングした。核ゲノムにアラインメントしなかったリード又はミトコンドリアゲノムにアラインメントしたリードを除去した。さらに、ＳＡＭｔｏｏｌｓを使用して重複リードをマークし、除去した（５５）。ピークコール対インプットゲノムＤＮＡを、「ｇｓｉｚｅ ｍｍ」、「－－ｎｏｍｏｄｅｌ」及び「－－ｓｈｉｆｔｓｉｚｅ １２５」フラグ及び引数を使用してＭＡＣＳ１．４（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）を使用して行った。一致した入力を対照として使用した。Ｐ値＞１Ｅ－１０、ＣｈＩＰ対インプットＤＮＡ及びＣｈＩＰ対ＣｈＩＰの両方のピーク、並びにマウスゲノムにおけるアーチファクトシグナルのＥＮＣＯＤＥコンソーシアム分析によってブラックリストに記載されたピークを、ｂｅｄｔｏｏｌｓを使用して除去した（Ｑｕｉｎｌａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，２０１０）。アセチル化領域をそれらのゲノム位置に基づいて分類し、それらを最も近い転写開始部位（ＴＳＳ）に割り当てるために、マウスゲノムのｍｍ１０バージョンの２０１７年９月のＲｅｆＳｅｑアノテーションを、ＨＯＭＥＲパッケージ（Ｈｅｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，２０１０）からのａｎｎｏｔａｔｅＰｅａｋｓスクリプトへの入力として与えた。各ピークを、ＴＳＳからのその距離に応じて、ＴＳＳ近位又はＴＳＳ遠位のいずれかとして分類した（それぞれ２．５ｋｂ未満又は２．５ｋｂ超）。
１．モチーフエンリッチメント解析
２．公知のＴＦ結合部位に対応する統計的に過剰提示されたモチーフを同定するために、Ｄｉａｆｅｒａ＆Ｂａｌｅｓｔｒｉｅｒｉら（Ｄｉａｆｅｒｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）に記載されているように、位置特異的重み行列（ＰＷＭ）のコレクションを得た。有意に過剰提示されたＰＷＭは、元のｚ検定の代わりにｔ検定が実施されたＰｓｃａｎの修正バージョンを使用して同定した（Ｚａｍｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。１Ｅ－５以下のＰ値を示すＰＷＭはすべて、有意に過剰提示されているとみなした。

上方制御された遺伝子のプロモーター領域で濃縮されたＰＷＭを同定するために、６００ｂｐのウィンドウ（ＴＳＳに対して－５００及び＋１００ｂｐ）を考慮し、全てのＲｅｆｓｅｑ遺伝子プロモーターを含むセットをバックグラウンドとして使用した。一組の差次的アセチル化領域について、アセチル化エンハンサーを、エンハンサー中心の周り±２５０ｂｐのウィンドウを使用して、ＦＡＮＴＯＭ５コレクション（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）におけるマウスエンハンサーのセットと比較した。

統計解析：インビトロ及びインビボデータを平均±標準偏差として示す。統計解析は、分散の評価後に両側スチューデントｔ検定を使用して計算した。生存試験のために、マウスを実験群に無作為化し、結果をログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定で解析し、カプランマイヤー生存曲線として表した。

本明細書で開示及び特許請求する方法はすべて、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本明細書に記載の方法及び該方法の工程又は一連の工程において、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく変更が適用され得ることは当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的の両方に関連するある特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤に置き換えても、同じ又は類似の結果を達成できることは明らかであろう。当業者に明らかなすべてのそのような類似の代替物及び修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であると見なされる。

［参考文献］
以下の参考文献は、本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する限りにおいて、参照することにより本明細書に具体的に組み込まれる。
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Claims (70)

1. 対象において膵炎を治療する、及び／又は膵臓がんを予防する方法であって、有効量の腺房－導管異形成（ＡＤＭ）誘導物質を前記対象に投与することを含む、方法。
2. 前記対象において膵炎を治療又は予防することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記対象において膵臓がんを予防することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記膵臓がんが、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
5. 前記膵炎が、慢性膵炎である、請求項１又は２に記載の方法。
6. 前記膵炎が、急性膵炎である、請求項１又は２に記載の方法。
7. 前記ＡＤＭ誘導物質が、エピジェネティック修飾因子である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
8. 前記エピジェネティック修飾因子が、ブロモドメイン余剰末端モチーフ（ＢＥＴ）阻害剤である、請求項７に記載の方法。
9. 前記ＢＥＴ阻害剤が、ＢＲＤ２阻害剤、ＢＲＤ３阻害剤、ＢＲＤ４阻害剤、又はＢＲＤＴ阻害剤である、請求項８に記載の方法。
10. 前記ＢＥＴ阻害剤が、ＢＲＤ４阻害剤である、請求項８に記載の方法。
11. 前記ＢＲＤ４阻害剤が、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＧＳＫ５２５７６２Ａ／Ｉ－ＢＥＴ７６２、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＡＢＢＶ－０７５、ＯＴＸ０１５／ＭＫ－８６２８、ＧＳＫ２８２０１５１／Ｉ－ＢＥＴ１５１、ＰＬＸ５１１０７、ＡＢＢＶ－７４４、又はＡＺＤ５１５３である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＡＤＭ誘導物質が、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）アゴニストである、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記ＭＡＰＫアゴニストが、ＢＲＡＦ阻害剤、ＴＧＦα又はＥＧＦである、請求項１２のいずれかに記載の方法。
14. 前記ＭＡＰＫアゴニストが、ＴＧＦα又はＥＧＦである、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. 前記ＭＡＰＫアゴニストが、ＢＲＡＦ阻害剤である、請求項１２又は１３に記載の方法。
16. 前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ）、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０、ソラフェニブ、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６）、ＡＺ６２８、ＬＧＸ８１８、又はＮＶＰ－ＢＨＧ７１２である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ＳＯＳ活性化因子及び／又はＧＥＦ阻害剤である、請求項１５又は１６に記載の方法。
18. 前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ベムラフェニブである、請求項１５又は１６に記載の方法。
19. 前記対象が、ＲＡＦ野生型であると決定される、請求項１～１８のいずれかに記載の方法。
20. 前記対象が、ＭＥＫ阻害剤を投与されていない、請求項１～１９のいずれかに記載の方法。
21. 前記ＭＥＫ阻害剤が、トラメチニブである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ＡＤＭ誘導物質を投与することにより、前記対象におけるＫＲＡＳ変異の発生を予防する、請求項１～２１のいずれかに記載の方法。
23. ＡＤＭ誘導物質を投与することにより、ＡＤＭ誘導物質を投与されていない対象と比較して、膵臓細胞における組織損傷及び／又は炎症を予防又は減少させる、請求項１～２２のいずれかに記載の方法。
24. 炎症の減少が、炎症浸潤、血清炎症性生化学マーカー、浮腫又は疼痛の減少によって測定される、請求項２３に記載の方法。
25. 組織損傷の減少が、リパーゼ、アミラーゼ、トリプシノーゲン及び／又は乳酸デヒドロゲナーゼによって測定される、請求項２３又は２４に記載の方法。
26. 前記対象が、ヒトである、請求項１～２５のいずれかに記載の方法。
27. 少なくとも第２の療法を投与することをさらに含む、請求項１～２６のいずれかに記載の方法。
28. 前記第２の療法が、抗炎症剤、免疫療法、及び／又は支持療法である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記第２の療法が、ＡＤＭ誘導物質と同時に投与される、請求項２７又は２８に記載の方法。
30. 前記第２の療法が、ＡＤＭ誘導物質と連続して投与される、請求項２７～２９のいずれかに記載の方法。
31. 前記第２の療法が、抗炎症剤である、請求項２７～３０のいずれかに記載の方法。
32. 前記抗炎症剤が、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）又はステロイドである、請求項３１に記載の方法。
33. 前記ＡＤＭ誘導物質が、経口投与、脂肪内投与、皮内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、腹腔内投与、直腸内投与、静脈内投与、リポソーム投与、局所投与、粘膜投与、非経口投与、直腸投与、皮下投与、舌下投与、バッカル投与、経皮投与、カテーテルを介して、洗浄液を介して、連続注入を介して、注入を介して、吸入を介して、注射を介して、又は局所送達を介して投与される、請求項１～３２のいずれかに記載の方法。
34. 前記ＡＤＭ誘導物質が前記対象に１回投与される、請求項１～３３のいずれかに記載の方法。
35. 前記ＡＤＭ誘導物質が前記対象に２回以上投与される、請求項１～３４のいずれかに記載の方法。
36. 対象において膵炎の治療及び／又は膵臓がんの予防に使用するための、有効量のＡＤＭ誘導物質を含む組成物。
37. 前記ＡＤＭ誘導物質がＭＡＰＫアゴニストである、請求項３６に記載の組成物。
38. 前記ＭＡＰＫアゴニストが、ＢＲＡＦ阻害剤、ＴＧＦα又はＥＧＦである、請求項３７に記載の組成物。
39. 前記ＭＡＰＫアゴニストが、ＢＲＡＦ阻害剤である、請求項３８に記載の組成物。
40. 前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ）、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０、ソラフェニブ、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６）、ＡＺ６２８、ＬＧＸ８１８、又はＮＶＰ－ＢＨＧ７１２である、請求項３９に記載の組成物。
41. 前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ベムラフェニブである、請求項３９又は４０に記載の組成物。
42. 前記ＡＤＭ誘導物質が、エピジェネティック修飾因子である、請求項３６に記載の組成物。
43. 前記エピジェネティック修飾因子が、ブロモドメイン余剰末端モチーフ（ＢＥＴ）阻害剤である、請求項４２に記載の組成物。
44. 前記ＢＥＴ阻害剤が、ＢＲＤ４阻害剤である、請求項４３に記載の組成物。
45. 前記ＢＲＤ４阻害剤が、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＧＳＫ５２５７６２Ａ／Ｉ－ＢＥＴ７６２、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＡＢＢＶ－０７５、ＯＴＸ０１５／ＭＫ－８６２８、ＧＳＫ２８２０１５１／Ｉ－ＢＥＴ１５１、ＰＬＸ５１１０７、ＡＢＢＶ－７４４、又はＡＺＤ５１５３である、請求項４４に記載の組成物。
46. 前記エピジェネティック修飾因子が、小分子、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＰＲＯＴＡＣ又はデグロンである、請求項４２に記載の方法。
47. 前記対象が、ヒトである、請求項３６～４６のいずれかに記載の組成物。
48. 前記膵炎が、慢性膵炎である、請求項３６～４７のいずれかに記載の組成物。
49. 前記膵炎が、急性膵炎である、請求項３６～４８のいずれかに記載の組成物。
50. 前記膵臓がんが、ＰＤＡＣである、請求項３６～４９のいずれかに記載の組成物。
51. 前記ＡＤＭ誘導物質が、前記対象におけるＫＲＡＳ変異、組織損傷、及び／又は炎症の発生を予防する、請求項３６～５０のいずれかに記載の組成物。
52. 少なくとも第２の療法をさらに含む、請求項３６～５１のいずれかに記載の組成物。
53. 前記第２の療法が、抗炎症剤及び／又は免疫療法である、請求項５２に記載の組成物。
54. 前記第２の療法が、抗炎症剤である、請求項５２又は５３に記載の組成物。
55. 前記抗炎症剤が、ステロイド又はＮＳＡＩＤである、請求項５４に記載の組成物。
56. 対象において膵臓の組織損傷及び／又は炎症を阻害する方法であって、有効量のＡＤＭ誘導物質を前記対象に投与することを含む、方法。
57. 前記ＡＤＭ誘導物質が、ＭＡＰＫアゴニストである、請求項５６に記載の方法。
58. 前記ＭＡＰＫアゴニストが、ＢＲＡＦ阻害剤、ＴＧＦα又はＥＧＦである、請求項５７に記載の方法。
59. 前記ＭＡＰＫアゴニストが、ＢＲＡＦ阻害剤である、請求項５８に記載の方法。
60. 前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ベムラフェニブである、請求項５９に記載の方法。
61. 前記ＡＤＭ誘導物質が、エピジェネティック修飾因子である、請求項５６～６０のいずれかに記載の方法。
62. 前記エピジェネティック修飾因子が、ブロモドメイン余剰末端モチーフ（ＢＥＴ）阻害剤である、請求項６１に記載の方法。
63. 前記ＢＥＴ阻害剤が、ＢＲＤ４阻害剤である、請求項６２に記載の方法。
64. 前記ＢＲＤ４阻害剤が、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＧＳＫ５２５７６２Ａ／Ｉ－ＢＥＴ７６２、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＡＢＢＶ－０７５、ＯＴＸ０１５／ＭＫ－８６２８、ＧＳＫ２８２０１５１／Ｉ－ＢＥＴ１５１、ＰＬＸ５１１０７、ＡＢＢＶ－７４４、又はＡＺＤ５１５３である、請求項６３に記載の方法。
65. 前記エピジェネティック修飾因子が、小分子、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＰＲＯＴＡＣ又はデグロンである、請求項６１に記載の方法。
66. 対象において膵炎を治療する方法であって、有効量のＡＤＭ誘導物質を前記対象に投与することを含み、前記ＡＤＭ誘導物質がＭＡＰＫアゴニスト又はエピジェネティック修飾因子である、方法。
67. 前記ＡＤＭ誘導物質が、ＭＡＰＫアゴニストであり、該ＭＡＰＫアゴニストが、ＢＲＡＦ阻害剤である、請求項６６に記載の方法。
68. 前記ＢＲＡＦ阻害剤がベムラフェニブである、請求項６７に記載の方法。
69. 前記ＡＤＭ誘導物質が、エピジェネティック修飾因子であり、該エピジェネティック修飾因子が、ＢＲＤ４阻害剤である、請求項６６に記載の方法。
70. 前記ＢＲＤ４阻害剤が、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＧＳＫ５２５７６２Ａ／Ｉ－ＢＥＴ７６２、ＩＮＣＢ０５４３２９、ＡＢＢＶ－０７５、ＯＴＸ０１５／ＭＫ－８６２８、ＧＳＫ２８２０１５１／Ｉ－ＢＥＴ１５１、ＰＬＸ５１１０７、ＡＢＢＶ－７４４、又はＡＺＤ５１５３である、請求項６９に記載の方法。

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