KR20230140614A - 혈관신생과 관련된 병리학적 증상을 치료하기 위한ido1-의존성 혈관화 세포를 이용한 방법 및 조성물 - Google Patents

혈관신생과 관련된 병리학적 증상을 치료하기 위한ido1-의존성 혈관화 세포를 이용한 방법 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20230140614A
KR20230140614A KR1020237022126A KR20237022126A KR20230140614A KR 20230140614 A KR20230140614 A KR 20230140614A KR 1020237022126 A KR1020237022126 A KR 1020237022126A KR 20237022126 A KR20237022126 A KR 20237022126A KR 20230140614 A KR20230140614 A KR 20230140614A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ido1
cells
vegf
inhibitor
angiogenesis
Prior art date
Application number
KR1020237022126A
Other languages
English (en)
Inventor
알렉산더 제이 멀더
아르피타 몬달
수빅 데이
사이먼 톰린슨
리사 로리 클린탑
Original Assignee
란케나우 인스티튜트 포 메디칼 리서치
듀엣 테라퓨틱스 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 란케나우 인스티튜트 포 메디칼 리서치, 듀엣 테라퓨틱스 인코퍼레이티드 filed Critical 란케나우 인스티튜트 포 메디칼 리서치
Publication of KR20230140614A publication Critical patent/KR20230140614A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/405—Indole-alkanecarboxylic acids; Derivatives thereof, e.g. tryptophan, indomethacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/247—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2845—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

대상체에서 망막병증(retinopathy)을 치료하거나 병리학적 혈관신생(neovascularization)을 저해하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 방법은 대상체의 눈에서 IDO-의존성 혈관화 세포(IDVC: IDO-dependent vascularizing cell)를 제거하거나 저해하는 단계를 포함한다. IDO1 및/또는 통합 반응 노드(integrated response node)를 저해하는 것을 포함하여 IDVC를 저해하거나 제거하는 다양한 방법이 기재되어 있다.

Description

혈관신생과 관련된 병리학적 증상을 치료하기 위한 IDO1-의존성 혈관화 세포를 이용한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2020년 12월 7일에 출원된 미국 임시 출원 제63/122,121호에 대해 우선권을 주장하며, 이의 전체 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
전자 형태로 제출된 물질의 인용에 의한 포함
2021년 12월 7일에 생성되고 크기가 4,212 바이트인 SEQLIST.txt라고 하는 텍스트 파일로서 EFS-Web를 통해 제출된 서열 목록은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
새로운 혈관 형성의 긴밀하게 조절되는 과정인 신혈관형성(angiogenesis)은 기관발생(organogenesis)에 발달적으로 필요하지만, 여성 생식 주기와 상처 치유를 제외하고는 정상적인 성인 조직에서는 드물다. 대조적으로, 병리학적 신혈관형성은 조절이상된(dysregulated) 혈관신생(neovascularization)에 의해 두드러지며, 특정한 단계(stage)를 지나 성장하기 위해 숙주로부터의 혈관 공급을 필요로 하는 종양의 발달을 포함한 여러 가지 질환에 원인이 된다(1). 종양 신혈관형성은 상처 치유의 생리학적 과정을 뒤엎는 국소 염증 환경과의 상호작용을 통해 유발된다(2). 염증성 종양 미세환경의 한 가지 분명한 특징은 집합적으로 MDSC(골수-유래 억제자 세포: myeloid-derived suppressor cell)로 지칭되는 미성숙 골수 세포(myeloid cell)의 이종성 모음(heterogeneous assortment)이 존재한다는 것이다(3). MDSC의 특징적인 면역억제 능력에 더하여, 신혈관형성을 촉진하는 능력은 현재 결정적인 특징으로 간주되며, MDSC는 종양 혈관신생의 중요한 구동인자(driver)인 것으로 여겨진다(4).
IFNγ 및 IL6은 신혈관형성을 각각 억제시키거나 촉진하는 것과 관련하여 길항적으로 기능하는 것으로 보이는 2개의 주요 염증성 사이토카인이다(5,6). 최근의 유전적 데이터는 트립토판 이화 효소 IDO1(인돌아민 2,3-디옥시게나제 1)이, 국소 IFNγ에 반응함으로써 혈관신생을 지속시키고 증가된 IL6 생성을 위한 신호전달에 의해 이의 항신혈관형성 활성을 상쇄시키는 주요 조절 노드(regulatory node)로서 관여하고 있지만, 이러한 명백한 길항적인 활성의 생물학적 파급 효과는 불분명하다(7). IDO1을 유도하는 IFNγ의 능력은 광범위하게 특징화되었으나(8), IOD1과 IL6 사이의 조절 연관성은 잘 이해되지 않았으며, IDO1이 IL6 유도에 긍정적인 또는 부정적인 영향을 미치는 것으로 밝혀진 분명하게 모순되는 이전에 공개된 발견에 의해 복잡해졌다(9-12). IDO1이 IL6 유도의 긍정적인 구동인자인 것에도 불구하고, 적어도 2개의 구별되는 신호전달 경로가 연관되었다. 일부 연구에서, IDO1에 의한 IL6의 유도는 IDO1-매개 트립토판 결실에 의한 GCN2(일반 제어 비(非)탈억제성 2: general control nonderepressible 2) 세린 키나제의 활성화 후 ISR(통합 스트레스 반응: integrated stress response) 경로를 통한 신호전달에 기인하였으며(11), 한편 다른 연구는 내인성 AHR 리간드 키누레닌(kynurenine)의 IDO1-개시 생성에 반응하여 AHR(아릴 탄화수소 수용체) 신호전달을 연관시켰다(13). 이들 간극에 대한 하나의 가능성 있는 설명은 콘텍스트(context), 즉 IDO1이 발현되는 관련 세포 유형이다. IDO1 발현은 MDSC뿐만 아니라 DC(수지상 세포), 대식세포, NK(자연 살해) 세포, 내피 세포, 중간엽 간질 세포(mesenchymal stromal cell) 및 섬유아세포를 포함한 여러 가지 면역 세포 및 비(非)면역 세포에서 보고되었다(14). 유전적 증거는 혈관신생을 촉진하기 위해 IDO1에 필요한 다운스트림 이펙터로서 IL6을 강하게 연관지었지만, 혈관신생과 관련하여 IDO1이 발현되는 세포 유형이 아직 식별되지 않았기 때문에, IDO1을 IL6에 연관짓는 데 담당하는 기저(underlying) 신호전달 경로 또한 아직 밝혀지지 않았다.
일 양태에서, 대상체에서 망막병증(retinopathy)을 치료하거나 병리학적 혈관신생을 저해하는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 대상체의 눈에서 IDO-의존성 혈관화 세포(IDVC: IDO-dependent vascularizing cell)를 제거하거나 저해하는 단계를 포함한다. IDVC는 확립 및 유지가 이러한 IDVC 내에서 IDO1의 유도를 필요로 하는 혈관신생에서 역할을 하는 것으로 기능적으로 특징지어진다. 일 구현예에서, IDVC 활성의 저해는 IDO1의 저해에 의해 달성된다. 또 다른 구현예에서, IDVC는 이러한 IDVC의 세포-표면 마커에 관한 항체 또는 항체-약물 접합체(ADC)를 사용하여 저해되거나 제거된다. 또 다른 구현예에서, IDVC는 이러한 IDVC에서 통합 스트레스 반응(ISR)을 차단하거나 저해함으로써 저해되거나 제거된다.
일 구현예에서, 방법은 (a) GCN2의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계; 및/또는 (b) ATF4의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계; 및/또는 (c) CHOP의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 방법은 통합 스트레스 반응의 신호전달 분자 다운스트림을 차단하거나 저해하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 신호전달 분자는 사이토카인이다. 또 다른 구현예에서, 사이토카인은 IL-6이다.
본원에 기재된 방법의 또 다른 구현예에서, 방법은 임의의 형태의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 인돌아민 2,3 디옥시게나제-1(IDO1)의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달의 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
투여용 키트를 포함한 치료제를 포함하는 치료용 조성물 및 다른 양태와 이점은 아래 상세한 설명에 기재되어 있다.
도 1a 내지 도 1d는 4T1 폐 전이 파생물, 혈관신생 및 IL6 상승을 제한하는 IDO1의 GCN2 표현형 손실의 손실을 보여준다. (도 1a) WT, Ido1-/- 및 Gcn2-/- 마우스에 동소(orthotopic) 4T1 유방 종양 세포 생착 후 5주째에 전이성 부담(burden)을 시각화하기 위해 인디아 잉크로 폐를 염색한다. (도 1b) 2-군 로그-순위 검정에 의해 평가된 유의성을 이용한 1x104 4T1 세포(N ≥ 7 마우스/군)의 동소 생착 후 WT, Ido1-/- 및 Gcn2-/- 마우스의 코호트에 대한 카플란-마이어 생존 곡선이다. (도 1c) WT, Ido1-/- 및 Gcn2-/- 마우스로부터 5주 내지 6주째에 4T1 폐 전이 내 면역형광 염색 혈관(항-CAV1; Cy3) 및 핵(DAPI)의 공초점 이미지이다. 축척 막대 = 100 μm. (도 1d) 동소 4T1 유방 종양 세포 생착(N = 3 마우스/군) 후 5주 내지 6주째에 WT, Ido1-/- 및 Gcn2-/- 마우스로부터의 폐 전이 내 혈관신생 밀도의 정량적 평가이다. 던넷의 다중 비교 검정(Dunnett's multiple comparisons test)을 이용한 일원 ANOVA에 의해 결정된 WT 대조군과 Ido1-/- 및 Gcn2-/- 군(직선 막대를 따라 표시됨) 사이의 유의성 및 일원 독립 스튜던트 t-검정(one-way unpaired Student's t-test)에 의해 결정된 Ido1-/- 군과 Gcn2-/- 군(괄호에 표시됨) 사이의 유의성을 이용한 평균 ± SEM으로 그래프로 표시된다.
도 2a 내지 도 2c는 AHR 신호전달이 아니라 ISR의 저해가 시험관내에서 IDO1 활성의 저해로서 IL6 발현의 유도를 유사하게 차단함을 실증한다. (도 2a) IDO1 활성에 미치는 IDO1 저해제(에파카도스타트(epacadostat); 좌측 컬럼), ISR 저해제(ISRIB; 중간 컬럼) 및 AHR 저해제(BAY-218; 우측 컬럼) 처리의 영향을 평가하기 위한 IFNγ+LPS 처리된 U937 및 HL60 세포의 상층액 내 키누레닌 수준의 분광광도-기초 결정이다. IFNγ+LPS 유도가 없는 대조군 대비 배수 유도(fold induction)는 평균 ± SEM(N = 3 시험/증상)으로서 그래프로 표시된다. (도 2b 내지 도 2c) U937 및 HL60 세포에서 비처리 베이스라인 수준을 능가하는 Il6, Atf4, Chop 및 Cyp1a1 유전자 발현 IFNγ+LPS 매개 유도(행(row)에 의해) 및 이들 유전자의 각각의 유도에 미치는 IDO1 저해제(에파카도스타트; 좌측 컬럼), ISR 저해제(ISRIB; 중간 컬럼) 및 AHR 저해제(BAY-218; 우측 컬럼) 처리의 영향의 qPCR-기초 평가이다. IFNγ+LPS 유도가 없는 대조군에 비한 배수 유도는 평균 ± SEM(N = 3 시험/증상)으로서 그래프화된다. 상이한 저해제 처리의 효과의 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-검정(two-tailed Student's t-test)에 의해 결정되었다. 저해제 처리로 인한 저해 백분율 또한 각각의 그래프의 상단에 표시되어 있다.
도 3a 내지 도 3g는 산소-유도 망막병증에서 ISR 신호전달의 차단이 혈관신생 및 IL6 유도를 제한하는 한편 IDO1은 상승된 채로 남아 있음을 실증한다. (도 3a) OIR 및 정상 산소(normoxic) 조건 후 망막 플랫마운트(retinal flatmount)에서 맥관 구조(vasculature)의 형광 현미경이다. (도 3b 내지 도 3d) P17에서 (도 3b) 총 망막 영역(N ≥ 6 눈/군)에 걸친 혈관신생 영역, (도 3c) 풀링된(pooled) 유리체액(40 눈/풀; N ≥ 2 풀(pool)/군)에 존재하는 IL6, (도 3d) 풀링된 유리체액(40 눈/풀; N ≥ 2 풀/군)에 존재하는 키누레닌에 대해 평가된 WT, Ido1-/- 및 Gcn2-/- OIR 코호트로부터의 눈이다. (도 3b 내지 도 3d) 직선형 막대: WT를 다른 군과 비교하는 던넷 검정을 이용한 ANOVA이다. (도 3e) t-검정을 이용한 총 망막 영역(N> 눈/군)에 걸친 혈관신생 영역에 대해 평가된 Gcn2, Atf4, Chop, Ahr을 표적화하는 siRNA 또는 비(非)표적화된 대조군으로 안구내 주사된 WT OIR 코호트이다. (도 3f, 도 3g) 혈관(B4-Alexa 488-이소렉틴) 및 IDO1(CY3)에 대해 염색된 (도 3b 및 도 3e로부터의) 망막 플랫마운트의 공초점 이미지이다. 축척 막대 = 50 μm.
도 4a 내지 도 4e는 4T1 전이 및 OIR에서 Gr1-양성 면역 세포 집단으로의 IDO1 발현의 국소화를 실증한다. (도 4a) WT, IDO1-/- 및 Gcn2-/-로부터의 IDO1(Cy3) 및 혈관(항-CAV1; FITC)(축척 막대 = 20 μm), (도 4b) WT 마우스로부터의 원발성 종양 및 비장과 비교하여 WT 및 IDO1-/- 마우스로부터의 IDO1(Cy3) 및 CD45(FITC)(축척 막대 = 50 μm), (도 4c) WT 및 IDO1-/- 마우스로부터의 IDO1(Cy3) 및 Cr1 또는 CD11b(Alexa 488)(축척 막대 = 50 μm)에 대해 염색된 공초점 이미지이다. (도 4d) WT OIR-유도 신생 마우스(neonate)로부터의 IDO1(Cy3) 및 CD45 또는 Gr1(FITC)에 대해 염색된 망막 플랫마운트이다(축척 막대 = 10 μm). (도 4e) t-검정을 이용한 α-Gr1 및 이소타입(isotype) 대조군 항체 주사된 WT OIR-유도 신생 마우스(N≥ 눈/군) 사이에서 총 망막 영역 비교에 걸친 혈관신생 영역이다.
도 5a 내지 도 5f는 Gr1+ CD11blo 하위집단이 IDO1의 발현을 통해 혈관신생을 촉진함을 실증한다. (도 5a) CD11blo(P3) 및 CD11bhi(P4) 세포의 분리에 대한 게이팅(전체 게이팅 식에 대해서는 도 12 참조)을 보여주는 4T1 전이 부담 폐로부터 단리된 CD45+ 자기 비드 선택된, Gr1+ 게이팅된 면역 세포의 유세포측정법 플롯이다. (도 5b) 슬라이드에 부착되고 IDO1(Cy3), CD11b(Alexa 488) 및 핵(DAPI)에 대해 염색된 단리된 CD45+ Gr1+ CD11blo 및 CD45+ Gr1+ CD11bhi 세포의 공초점 이미지이다. 축척 막대 = 50 μm. (도 5c, 도 5e) 혈관(항-CAV1; Cy3) 및 핵(DAPI)에 대해 염색된 공초점 이미지와 쌍을 이룬 마트리겔 사진이다. 마트리겔 플러그는 PBS 단독으로 혼입되거나: (도 5c) WT 또는 Ido1-/- 마우스로부터 수득되고, WT 마우스 내로 이식되거나 (도 5e) WT 마우스로부터 수득되고, WT 마우스 내로 이식되고 마지막 3일에 걸쳐 비히클 또는 50 mg/kg 에파카도스타트(epacadostat) b.i.d.를 받은 1.5x106 Gr1+ CD11blo 또는 Gr1+ CD11bhi 세포로 혼입되었다. 축척 막대 = 100 μm. (도 5d, 5f) 도 5c 및 도 5e의 이미지에 상응하는 혈관신생 밀도 정량화이다(N ≥ 5 플러그/증상). 직선형 막대: 다른 군과 비교된 PBS에 대한 던넷 검정을 이용한 ANOVA이다. 괄호: 선택된 쌍에 대한 시닥 검정(Sidak's test)을 이용한 ANOVA이다.
도 6a 내지 도 6f는 혈관신생을 촉진하기 위해 Gr1+ CD11blo 세포는 IL6과 GCN2를 둘 다 필요로 하고 IDO1을 유도함으로써 IFNγ과 반작용함을 보여준다. (도 6a, 도 6e) 혈관(항-CAV1; Cy3) 및 핵(DAPI)에 대해 염색된 공초점 이미지와 쌍을 이룬 마트리겔 플러그 사진이다. 마트리겔 플러그는 PBS 단독으로 혼입되거나: (도 6a) Il6 -/- 또는 Gcn2 -/- 마우스로부터 수득되고, WT 마우스 내로 이식되거나 (도 6e) WT 또는 Ido1 - /- 마우스로부터 수득되고, Ifng-/- 마우스 내로 이식되어 1.5x106 Gr1+ CD11blo 또는 GR1+ CD11bhi 세포로 혼입되었다. 축척 = 100 μm. (도 6b, 도 6f) 도 6a 및 도 6e의 이미지에 상응하는 혈관신생 밀도의 정량적 평가이다(N≥ 3 플러그/증상). 직선형 막대: 다른 군과 비교된 PBS에 대한 던넷 검정을 이용한 ANOVA이다. 괄호: 선택된 쌍에 대한 시닥 검정을 이용한 ANOVA이다. (도 6c, 도 6d) 혈관(B4-Alexa 488-이소렉틴) 및 IDO1(Cy3)에 대해 염색된 망막 OIR 플랫마운트의 WT 및 Ifng -/- 마우스로부터 수득된 공초점 이미지, 또는 (도 6d) 혈관(항-CAV1: FITC) 및 IDO1(Cy3)에 대한 4T1 폐 전이이다. 축척 = (도 6c) 50 μm 또는 (도 6d) 10 μm.
도 7a 내지 도 7f는 혈관신생을 촉진하는 Gr1+ CD11blo 세포의 자가형광 하위집단이 높은 CD11c 및 아시알로-GM1로 표시된 IDO1-의존성 하위세트를 포함함을 보여준다. (도 7a) IDO1(Cy3) 및 핵(DAPI)에 대해 염색된 4T1 폐 전이로부터의 Gr1+ CD11blo 세포의 자가형광 높은(AFhi) 및 낮은(AFlo) 하위세트의 공초점 이미지이다. 축척 = 100 μm. (도 7b) 혈관(항-CAV1; Cy3) 및 DAPI에 대해 염색된 공초점 이미지(축척 = 100 μm)와 쌍을 이룬 마트리겔 플러그 사진이다. 마트리겔 플러그는 WT 마우스로부터 단리되고 이 마우스 내로 이식된 1.5x106 AFhi 또는 AFlo 세포로 혼입되었다. (도 7c) Gr1+ CD11blo 게이팅 후의 플롯이다: (좌측) 488/530 강도 상에서의 게이팅, 및 (우측) CD11c-PE(Y-축) 및 아시알로-GM1-APC 강도(x-축) 강도 상의 후속 게이팅이다. (도 7d) 도 7c에서 도시된 바와 같이 단리되고 염색된 CD1chi 아시알로-GM1hi 및 CD11clo 아시알로-GM1lo 세포이다: (좌측 패널) 공초점 이미지화를 위해 IDO1(Cy3) 및 DAPI(축척 = 50 μm), 또는 (우측 패널) 광학 현미경에 대해 김사(Giemsa)(축척 = 20 μm). (도 7e) PBS 단독으로 혼입되거나, (좌측) WT 또는 IDO1-/- 마우스로부터 수득되고, WT 마우스 내로 이식되거나 (우측) WT, IDO1-/-, Il61-/- 또는 Gcn2-/- 마우스로부터 수득되고, WT 또는 Ifng-/- 마우스(N ≥ 플러그/증상) 내로 이식되어 5x104 CD11chi 아시알로-GM1hi(hi/hi) 또는 CD11clo 아시알로-GM1lo(lo/lo) 세포로 혼입된 마트리겔 플러그에서의 혈관신생 밀도의 정량적 평가이다. WT 및 IDO1-/- 내지 WT 군은 비교 목적을 위해 두 패널 모두에 포함된다. 직선형 막대: (좌측) PBS 또는 (우측) WT와 다른 군과의 비교를 위한 던넷 검정을 이용한 ANOVA이다. 괄호: 선택된 쌍에 대한 시닥 검정을 이용한 ANOVA이다.
도 8a 내지 도 8b는 유전자이식 마우스 계통의 확증을 보여준다. (도 8a) 유전자형 분석이다. 이 연구에 이용된 4개의 유전자이식 마우스 계통 각각 및 야생형 대조군으로부터 수득된 정제된 게놈 DNA는 표적 유전자의 기능적 붕해(functional disruption)를 초래하는 각각의 유전적 변경을 검출하도록 설계된 프라이머 쌍을 이용한 PCR에 의해 검정되었다(표 1 내지 표 3 참조). 각각의 세트의 분석에 사용되는 프라이머는 각각의 겔 이미지의 상단에 표시되고, PCR 생성물이 로딩된 순서는 측면에 나열되어 있다. 각각의 유전자이식 염색에 대한 밴딩 패턴의 변화는 각각의 프라이머 세트에 대한 예상과 일치한다. (도 8b) 사이토카인 분석이다. (좌측) Il6-/- 및 (우측) Ifng-/- 계통 마우스, 및 상응하는 WT 대조군으로부터의 폐 균질물(homogenate)은 25 μg LPS의 비강내 점적(intranasal instillation) 후 24시간째에 이전에 기재된 바와 같이(Smith, 2012, ref.9) 사이토카인 비드 어레이 면역검정-기초 분석(BD Biosciences)에 의해 IL6 및 IFNγ 수준에 대해 각각 평가되었다. 평균 ± SEM(N= 4 마우스)은 각각의 쌍형성(pairing)에서 WT 및 넉아웃 동물로부터 수득된 값 사이의 큰 차이로 인해 로그 축척 상에 플롯화된다.
도 9. 원발성 4T1 종양은 WT, Ido1-/- 및 Gcn2-/- 마우스에서 유사한 성장률을 나타낸다. 암컷 WT, Ido1-/- 및 Gcn2-/- 마우스는 각각 1x104 4T1 세포(N = 5 종양)의 동소 이식물을 받았다. 생착후 11일째에 시작하여, 만져지는 종양 덩어리가 분명해졌을 때, 캘리퍼(caliper) 측정을 격주 기준으로 수행하여 원발성 종양 부피를 계산하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 플롯화된다.
도 10. 다양한 저해제 처리에 반응한 세포 생존력의 평가이다. IFNγ+LPS로 유도되고 IDO1 저해제 에파카도스타트, ISR 저해제 ISRIB 또는 AHR 저해제 BAY-218(상단부터 하단까지)로 처리된 U937 및 HL60 세포의 생존력은 LDI Cell CountEZ TPS 검정 키트를 사용하여 평가되었다. 다양한 처리군에 대한 세포 생존율 백분율은 비처리 대조군 세포의 상응하는 세트로 정규화함으로써 결정되고, 평균 ± SEM(N = 3 웰/증상)으로서 그래프로 표시되었다. 각각의 군에서 부가적인 세포 세트는 약물학적으로 유도된 세포 사멸에 대한 양성 대조군으로서 프로테아솜 저해제 보르테조밉(bortezomib)(BTZ, 20 nM)으로 처리되었다.
도 11. 산소-유도 망막병증의 마우스 모델에서 Ido1 손실에 비한 Gcn2 손실의 혈관신생에 미치는 영향을 시각화하기 위한 망막 플랫마운트 이미지의 비교이다. P17에서: (상단 행) OIR을 유도하기 위해 P7 내지 P12로부터 고산소혈증(hyperoxia)에 노출되거나 정상적인 망막 혈관화의 일례로서 일정한 정상 산소 조건 하에 유지된 WT 신생 마우스, (하단 행) OIR을 유도하기 위해 P7 내지 P12로부터 고산소혈증에 노출된 Ido1-/- 및 Gcn2-/- 신생 마우스로부터 수득된 망막 플랫마운트에서 혈관의 B4-Alexa488-이소렉틴 염색의 대표적인 이미지이다.
도 12. 표면 마커 Gr-1 및 CD11b를 사용한 혈관 촉진의 평가를 위한 유세포측정법에 의한 세포의 단리이다. 형광-활성화된 세포 분류는 마트리겔 플러그 내로의 혼입을 위해 4T1 폐 전이로부터 IDO1+로서 식별된 세포 집단에 대해 농화시키기 위해 이용되었다. 이용된 순차적 게이팅의 플롯은 좌측부터 우측까지 제시되어 있다: (P1) 포워드 스캐터(X 축) 및 사이드 스캐터(Y 축) 상에서의 게이팅, (P2) Gr-1+ 세포를 선택하기 위한 PerCP-Cy5 강도 상에서의 게이팅, (P3 및 P4) CD11blo 및 CD11bhi 세포를 각각 선택하기 위한 FITC 강도 상에서의 게이팅이다. P3 게이트와 P4 게이트 사이의 갭은 2개의 분류된 집단 사이에서의 교차 오염 가능성을 감소시키기 위해 포함되었다.
도 13a 내지 도 13b. Gr1+ CD11blo 세포의 고도 자가형광 하위집단의 FACS-기초 식별 및 단리이다. (도 13a) 자가형광 양성 세포를 단리하기 위해 이용된 순차적 게이팅의 플롯은 좌측부터 우측까지 제시되어 있다: (P1) 포워드 스캐터(X 축) 및 사이드 스캐터(Y 축) 상에서의 게이팅, (P2) Gr1+ 세포를 선택하기 위한 PerCP-Cy5 강도 상에서의 게이팅, (P3) CD11blo 세포를 선택하기 위한 PE-Cy7 강도 상에서의 게이팅, 및 (P4,5) AFhi(자가형광 높음, P4) 및 AFlo(자가형광 낮음, P5) 세포 집단을 선택하기 위한 488/530 nM 여기/방출 채널 상에서의 게이팅이다. (도 13b) 상이한 채널 상에서의 자가형광의 검출이다. Gr1+ CD11blo 세포의 순차적 게이팅 후(플롯 1 내지 3 좌측부터 우측까지), 5개의 상이한 여기/방출 파장에서의 자가형광 프로파일은 플롯 4 내지 8에 제시되어 있다.
도 14a 내지 도 14b. Ido1-발현 세포 집단의 마커로서의 CD11c 및 아시알로-GM1의 식별이다. (도 14a) 유세포측정법에 의한 Gr1+ CD11blo AFhi 집단 상에서의 세포 표면 마커의 패널의 평가이다. F480, B220, CD3ε, CD11c, 아시알로-GM1, Siglec-F, CD31, IFNGR1(CD119), MHC-II 및 PDL1(CD274)에 대한 항체는 633/660(Alexa647) 또는 633/780(APC-Cy7) 채널 상에서의 검출에 사용되었다. 각각의 그래프 상의 청색 라인은 적색 라인으로 표시된 베이스라인에 비해 각각의 항체-관련 신호를 나타내는 히스토그램을 보여준다. (도 14b) Gr1+ CD11blo AFhi 집단 상에서의 CD11c 및 아시알로-GM1 표면 마커의 병행 평가이다. 이용된 순차적 게이팅의 플롯은 좌측부터 우측까지 제시되어 있다: (P1) 포워드 스캐터(X 축) 및 사이드 스캐터(Y 축) 상에서의 게이팅, (P2) Gr1+ 세포를 선택하기 위한 PerCP-Cy5 강도 상에서의 게이팅, (P3) CD11blo 세포를 선택하기 위한 PE-Cy7 강도 상에서의 게이팅, (P4) AFhi 세포를 선택하기 위한 488/530 강도 상에서의 게이팅, (P5,6) CD11chi 아시알로-GM1hi(상부 우측) 및 CD11clo 아시알로-GM1lo(하부 좌측) 세포를 선택하기 위한 CD11c-PE 강도(X-축) 및 아시알로-GM1-APC 강도(Y-축) 상에서의 게이팅이다.
도 15a 내지 도 15d. AFhi 집단 내에서 CD11chi 아시알로-GM1hi 및 CD11clo 아시알로-GM1lo 세포의 혈관신생 용량(capacity)의 비교이다. (도 15a, 도 15c) 혈관(항-CAV1; Cy3) 및 핵(DAPI)에 대해 염색된 공초점 이미지와 쌍을 이룬 마트리겔 플러그 사진이다. 마트리겔 플러그는 PBS 단독으로 혼입되거나, (도 15a) WT 또는 Ido1-/- 마우스로부터 수득되고, WT 마우스 내로 이식되거나 (도 15c) Il6-/- 또는 Gcn2-/- 마우스로부터 수득되고, WT 마우스 내로 이식된 5x104 CD11chi 아시알로-GM1hi 또는 CD11clo 아시알로-GM1lo 세포로 혼입되었다. 축척 = 100 μm. (도 15b) 마우스 내로의 피하 이식 후 9일째에 절제된 마트리겔 플러그의 사진 이미지이다. 플러그는 WT 마우스로부터 단리되고 WT 마우스 내로 이식된 CD11chi 아시알로-GM1hi 및 CD11clo 아시알로-GM1lo 세포의 3배 일련의 희석물(좌측에 표시됨)로 혼입되었다. (도 15d) 도 15c(N ≥ 2 플러그/증상)의 이미지에 상응하는 혈관신생 밀도의 정량적 평가이다. 직선형 막대: 다른 군과 비교된 PBS에 대한 던넷 검정을 이용한 ANOVA이다. 괄호: 선택된 쌍에 대한 시닥 검정을 이용한 ANOVA이다.
도 16a 내지 도 16b. Ido1-/-, Il6-/- 및 Gcn2-/- 마우스로부터의 CD11chi 아시알로-GM1hi IDVC는 숙주 IFNγ에 의존적인 혈관신생을 지지하는 손상된 용량을 나타낸다. (도 16a) (우측) 각각의 마트리겔 플러그로부터 절단되고 혈관(항-CAV1; Cy3) 및 핵(DAPI)에 대해 염색된 절편(section)의 공초점 이미지와 함께 쌍형성된 (좌측) 마우스 내로의 피하 이식 후 9일째에 절제된 CD11chi 아시알로-GM1hi 세포로 혼입된 마트리겔 플러그의 사진 이미지이다. 상단부터 하단까지, 행은 WT 및 Ifng-/- 마우스 내로 도입된 마트리겔 플러그를 보여준다. 좌측부터 우측까지, 열은 WT, Ido1-/-, Il6-/- 및 Gcn2-/- 마우스로부터 수득된 세포로 혼입된 마트리겔 플러그를 보여준다. 축척 막대 = 100 μm. 이들 이미지는 도 7e에 제시된 혈관신생 밀도의 정량적 평가와 관련이 있다. (도 16b) 상이한 유전자이식 마우스 계통으로부터 단리된 CD11chi 아시알로-GM1hi 세포에서의 IDO1의 검출이다. 슬라이드에 부착되고 2차 Cy3-접합 항체(제1 슬라이드) 또는 항-IDO1(Cy3) 및 핵(DAPI)으로 염색된 단리된 CD11chi 아시알로-GM1hi 세포의 공초점 이미지이다. 축척 막대 = 50 μm. 세포가 단리된 유전자이식 마우스 계통(WT, Ido1-/-, Gcn2-/-, Il6-/-, Ifng-/-)은 각각의 이미지의 상단에 나열되어 있다.
도 17a 내지 도 17b. IDVC를 식별하고 단리하는 데 사용된 항체로 수득된 형광 신호의 유세포측정법-기초 확증이다. (도 17a) 4T1 폐 전이로부터의 IDVC 상에서 CD11c 및 아시알로-GM1 검출의 형광 마이너스 원 검증(fluorescence minus one verification)이다. CD11chi 아시알로-GM1hi IDVC를 식별하고 단리하는 데 이용된 순차적 게이팅 전략으로부터의 플롯은 좌측부터 우측까지 제시되어 있다: (P1) 포워드 스캐터(X 축) 및 사이드 스캐터(Y 축) 상에서의 게이팅, (P2) Gr1+ 집단을 선택하기 위한 PerCP-Cy5 강도(X 축) 상에서의 게이팅, (P3) CD11blo 집단을 선택하기 위한 PE-Cy7 강도(X 축) 상에서의 게이팅, (P4) AFhi 집단을 선택하기 위한 488/530 nm 여기/방출 채널 상에서의 게이팅, 및 (P5,6) CD11chi 아시알로-GM1hi 및 CD11clo 아시알로-GM1lo 집단을 분리하기 위한 PE 강도(Y 축) 및 Alexa647 강도(X 축) 상에서의 게이팅이다. (상단 행) 존재하는 모든 항체, (중간 행) 어떠한 항-CD11c 항체도 포함되지 않음, (하단 행) 어떠한 항-아시알로-GM1 항체도 포함되지 않음. (도 17b) 4T1 폐 전이로부터 IDVC 상에서 CD45 검출의 형광 마이너스 원 검증이다. 하기와 같이 변형된 CD11chi 아시알로GM1hi IDVC를 식별하고 단리하는 데 이용된 순차적 게이팅 전략으로부터의 플롯이다: (P1) 포워드 스캐터(X 축) 및 사이드 스캐터(Y 축) 상에서의 게이팅, (P2) CD45+ 집단을 선택하기 위한 APC-Cy7 강도(X 축) 상에서의 게이팅, (P3) Gr-1+ 집단을 선택하기 위한 Pacific Blue 강도(X 축) 상에서의 게이팅, (P4) CD11blo 집단을 선택하기 위한 PE-Cy7 강도(X 축) 상에서의 게이팅, (P5) AFhi 집단을 선택하기 위한 488/530 nm 여기/방출 채널 상에서의 게이팅, 및 (P6,7) CD11chi 아시알로-GM1hi 및 CD11clo 아시알로-GM1lo 집단을 분리하기 위한 PE 강도(Y 축) 및 Alexa647 강도(X 축) 상에서의 게이팅이다. (상단 행) 존재하는 모든 항체, (하단 행) 어떠한 항-CD45 항체도 포함되지 않음.
도 18a 내지 도 18c. IDVC의 CD11blo 상태의 검증이다. (도 18a) 4T1 폐 전이로부터의 CD11chi 아시알로-GM1hi AFhi IDVC의 CD11b 염색의 형광 마이너스 원 평가이다. CD11chi 아시알로-GM1hi AFhi CD11blo IDVC를 식별하는 데 이용된 변형된 순차적 게이팅 전략의 플롯은 좌측부터 우측까지 제시되어 있다: (P1) 포워드 스캐터(X 축) 및 사이드 스캐터(Y 축) 상에서의 게이팅, (P2) CD11chi 아시알로-GM1hi 세포를 선택하기 위한 PE 강도(Y 축) 및 Alexa647 강도(X 축) 상에서의 게이팅, (P3,4) AFhi CD11chi 및 AFhi CD11blo 세포를 분리하기 위한 488/530 nm 여기/방출 채널(X 축) 및 PE-Cy7 강도(Y 축) 상에서의 게이팅이다. (상단 행) 존재하는 모든 항체, (하단 행) 어떠한 항-CD11b 항체도 포함되지 않음. 먼 우측 열은 (상단) CD11b 비(非)염색 집단에 비해 P3 게이팅 집단과 P4 게이팅 집단 둘 다의 PE-Cy7 강도의 천이(shift) 및 (하단) P3 게이팅 집단 및 P4 게이팅 집단과 CD11b 비염색 집단 사이의 488/530 자가형광의 중첩(overlap)을 실증하는 이전의 열로부터의 오버레이(overlay)를 보여준다. (도 18b) 도 18a에 제시된 바와 같이 단리되고, 슬라이드에 부착되고, 공초점 이미지화를 위해 IDO1(Cy3) 및 DAPI에 대해 염색된 FACS 분류된 AFhi CD11chi 및 AFhi CD11blo 세포이다(축척 막대 = 50 μm). (도 18c) (우측) 각각의 마트리겔 플러그로부터 절단되고 혈관(항-CAV1; Cy3) 및 핵(DAPI)에 대해 염색된 냉동된 절편의 공초점 이미지와 함께 쌍형성된 (좌측) WT 마우스 내로의 피하 이식 후 9일째에 절제된 마트리겔 플러그의 사진 이미지이다. 상단부터 하단까지의 행은 AFhi CD11chi 또는 AFhi CD11blo 세포로 혼입된 마트리겔 플러그의 예를 보여준다.
도 19a 내지 도 19c. MDSC와 비교된 IDVC의 Gr-1, Ly6C 및 Ly6G 상태의 유세포측정법-기초 평가이다. 도 19a는 하기와 같이 4T1 폐 전이로부터 종래의 MDSC와 IDVC를 둘 다 식별하는 데 사용된 분기화된(bifurcated) 게이팅 전략의 대표적인 예이다: (P1 상단) 포워드 스캐터(X 축) 및 사이드 스캐터(Y 축) 상에서의 초기 게이팅, 뒤이어 (P2 좌측) CD45hi CD11bhi 집단(MDSC)을 선택하기 위한 Pacific Blue 강도(X 축) 및 PE-Cy7 강도(Y 축) 상에서의 게이팅 또는 (P2 우측) CD45+ 집단을 선택하기 위한 Pacific Blue 강도(X 축) 상에서의 게이팅, (P3) CD11chi 아시알로-GM1hi 집단을 선택하기 위한 PE 강도(X 축) 및 Alexa647 강도(Y 축) 상에서의 게이팅, 및 (P4) AFhi CD11blo 집단(IDVC)을 선택하기 위한 488/530 nm 여기/방출 채널(X 축) 및 PE-Cy7 강도(Y 축) 상에서의 게이팅이다. 하단의 3개 행은 스트렙타비딘-APC-Cy7 단독(적색 히스토그램)과 비교하여 비오틴-접합 항-Gr-1, 항-Ly6C 또는 항-Ly6G 항체(청색 히스토그램)로 표지된 3개의 독립적 시료로부터의 MDSC(도 19b) 및 IDVC(도 19c) 집단 상에서의 스트렙타비딘-APC-Cy7 형광 염색 강도이다.
도 20a 내지 도 20f. IDO1은 Nos2의 유도를 억제시킴으로써 IFNg-매개 혈관신생 퇴행(regression)으로부터 보호한다. (도 20a) IDO1의 손실로부터 비롯되는 폐 전이 생존율 유익성은 IFNγ의 수반되는 손실에 의해 무효화된다. 2-군 로그-순위 검정에 의해 평가된 유의성을 이용한 1 x 104 4T1 세포(N ≥ 17 마우스)의 동소 생착 후 WT, Ido1-/-, Ifng-/- 및 Ifng-/- Ido1-/- 마우스의 코호트에 대한 카플란-마이어 생존율 곡선이다. (도 20b) IDO1의 손실로부터 비롯되는 폐 전이 생존율 유익성은 NOS2의 수반되는 손실에 의해 유사하게 무효화된다. 2-군 로그-순위 검정에 의해 평가된 유의성을 이용한 1 x 104 4T1 세포(N ≥ 9 마우스)의 동소 생착 후 WT, Ido1-/-, Nos2-/- 및 Nos2-/- Ido1-/- 마우스의 코호트에 대한 카플란-마이어 생존율 곡선이다. (도 20c) IDO1 결여 IDVC는 Nos2-/- 마우스에서 혈관신생을 유도하기 위한 용량을 재획득한다. (우측) 각각의 마트리겔 플러그로부터 절단되고 혈관(항-CAV1; Cy3)에 대해 염색된 절편의 공초점 이미지와 쌍형성된 (좌측) WT 또는 Ido1-/- 마우스로부터 수득된 CD11chi아시알로-GM1hi 세포로 혼입되고 WT 또는 Nos2-/- 마우스 내로 피하 이식 후 9일째에 절제된 마트리겔 플러그의 사진 이미지이다. 축척 막대 = 100 μM. (도 20d) (좌측) 평균 ± SEM으로서 플롯화되고 스튜던트 t-검정에 의해 통계적 유의성에 대해 평가된 C(N ≥ 2 플러그/증상)의 Nos2-/- 마우스로부터의 이미지에 상응하는 혈관신생 밀도의 정량적 평가이다. (우측) 비교를 위해 포함된 도 7의 WT 및 Ifng-/- 마우스로부터의 마트리겔 플러그에서의 혈관신생 밀도의 정량적 평가이다. ****, P < 0.0001; ns, 유의하지 않음. (도 20e) IDO1의 손실은 폐 전이 내에서 상승된 NOS2 발현을 초래한다. WT, Ido1-/-, Nos2-/- 및 Ifng-/- 마우스로부터 NOS2(FITC, 녹색)에 대해 염색된 4T1 폐 전이로부터의 공초점 이미지이다. (도 20f) IDO1 저해는 폐 전이 내에서 NOS2 상승을 유사하게 유도한다. 3일에 걸쳐 비히클 또는 50 mg/kg 에파카도스타트 b.i.d.로 p.o. 투여된 WT 마우스로부터의 NOS2(FITC, 녹색) 및 핵(DAPI, 청색)에 대해 염색된 4T1 폐 전이로부터의 공초점 이미지이다. 상단 패널의 파선형 백색 라인은 상응하는 하단 패널에 제시된 확대된 영역을 나타낸다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 망막에서 IDVC의 본 발명자들의 식별에 관한 것이다. IDVC에서 IDO1의 유도는, 혈관신생의 확립 및 유지를 지지하는 IDVC의 능력의 핵심인 통합 스트레스 반응(ISR) 활성화를 초래한다.
면역억제에 더하여, MDSC(골수-유래 억제자 세포) 또한 종양 신혈관형성을 지원하는 것으로 일반적으로 받아들여지고 있다. 최근, 트립토판 이화 효소 IDO1(인돌아민 2,3-디옥시게나제)은 염증성 사이토카인 IFNγ(인터페론-γ)와 IL6(인터류킨 6) 사이의 핵심 조절 노드로서 위치함으로써 혈관신생을 촉진하는 데 관여해 왔다. 그러나, IDO1이 발현되는 세포 유형은 이전에 보고된 적이 없다. Gr-1+ MDSC의 이종성 확장(heterogeneous expanse) 내에서 혈관신생을 생체내에서 유도하는 능력은 고도 자가형광 CD11blo 세포의 부(minor) 하위세트와 주로 관련이 있는 것으로 본원에서 보고된다. IDO1 발현은 이들 세포에서의 IDO1 활성이 혈관신생을 촉진하는 주된 역할로 인해 본원에서 IDVC(IDO1-의존성 혈관화 세포)라고 하는 이들 세포의 아시알로-GM1 이중 양성 하위집단인 별개의(discrete) CD11c로 추가로 제한된다. 기계적으로, IDVC에서 IDO1의 유도는 이들 세포 내에서 통합 스트레스 반응의 GCN2-매개 활성화를 통한 IL6의 생성을 위한 신호전달에 의해 숙주 IFNγ의 항신혈관형성 효과에 부정적인 피드백 제약을 제공한다. 이들 발견은 IDO1이 염증성 환경과 상호작용하여 혈관신생을 촉진하는 방법에 대한 근본적인 분자적 및 세포적 이해를 보여준다.
I. 조성물 및 방법의 구성요소
본원에서 논의된 조성물 및 방법의 설명에서, 다양한 구성요소는 본 발명이 속한 당업계의 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 기술적 및 과학적 용어의 사용에 의해 정의되고 공개된 교재를 참조할 수 있다. 이러한 교재는 당업자에게 본 출원에 사용된 많은 용어에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 본 명세서에 포함된 정의는 본원의 구성요소 및 조성물을 설명하는 데 있어서 명료성을 제공하고, 청구된 발명을 제한하려는 것이 아니다.
A. 대상체
본원에서 "환자" 또는 "대상체" 또는 "개체"는 인간, 수의학 또는 농장 동물, 가축 또는 애완 동물, 및 임상 연구에 통상적으로 사용되는 동물을 포함한 포유류 동물을 의미한다. 일 구현예에서, 이들 방법 및 조성물의 대상체는 인간이다. 일 구현예에서, 대상체는 안질환을 갖고 있다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 안질환을 갖고 있고 아직까지는 임의의 치료법으로 치료된 적이 없다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 안질환을 갖고 있고 종래의 방법, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 저해제의 안구내 투여로 치료되지만, 최적으로 또는 충분한 치료 유익성을 달성하기에 충분한 방식으로 치료에 반응하고 있지 않다. 또 다른 구현예에서, 상기 안질환을 갖는 대상체는 VEGF 저해제 또는 차단제의 투여를 받고 있지만, VEGF 차단제 또는 저해제 단독치료법의 투여 시 다른 환자에서 관찰된 원하는 치료적 최대 반응을 달성하고 있지 않다.
B. 안질환
용어 "안질환"이란, 눈의 장애 또는 질환을 의미한다. 일 구현예에서, 안질환은 혈관신생, 즉, 눈의 조직 또는 부분에서의 새로운 또는 비정상적인 혈관 형성을 특징으로 하거나, 과도한 혈관 형성이 눈의 조직 또는 부분이다. 일 구현예에서, 안구 장애(ocular disorder)는 망막병증이다. 특정 구현예에서, 안질환은 비정상적인/일탈적인 혈관화를 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 안질환은 안구내 혈관신생을 특징으로 한다. 안구내 혈관신생은 비제한적으로 시신경 유두(optic disc), 홍채(iris), 망막, 맥락막, 각막, 및/또는 유리체액(vitreous humour)의 혈관신생일 수 있다. 안질환의 예는 비제한적으로, 녹내장(glaucoma), 파누스(pannus), 익상편(pterygium), 황반 부종(macular edema), 황반 변성(macular degeneration)(예를 들어 나이-관련 황반 변성(age-related macular degeneration)), 망막병증(예를 들어 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 혈관 망막병증(vascular retinopathy), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity)), 당뇨병성 망막 허혈증(diabetic retinal ischemia), 당뇨병성 황반 부종, 망막 변성(retinal degeneration), 수정체후부 섬유증식증(retrolental fibroplasia), 각막 이식 혈관신생, 망막 중심 정맥 폐쇄(central retinal vein occlusion), 병리학적 근시, 포도막염(uveitis), 눈의 염증성 질환, 및 증식성 유리체망막병증(proliferative vitreoretinopathy)을 포함한다. 특정 구현예에서, 안질환은 망막병증(예를 들어 미숙아 망막병증, 당뇨병성 망막병증(예를 들어 증식성 당뇨병성 망막병증) 및 황반 변성(예를 들어 건식 또는 습식 황반 변성)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 또 다른 구현예에서, 안질환 또는 안구 장애는 황반 이영양증(macular dystrophy)(예를 들어 스타가르트(Stargardt's), 난황형 황반 이영양증(VTM: vitelliform macular dystrophy), 노스 캐롤라이나 황반 이영양증(North Carolina macular dystrophy) 또는 베스트 질환(Best disease))이다.
나이-관련 황반 변성(AMD)은 황반의 퇴행성 질환으로서, 종종 점진적인 시력 상실을 유발한다. 이는 건식(비(非)혈관신생) 또는 습식(혈관신생)으로 진단된다. 질환 진행 속도는 개체마다 다양할 수 있고, 다수의 위험 인자와 관련이 있어 왔다. 초기 AMD는 드루젠(drusen) 및 망막 색소 상피의 비정상과 같은 임상 징후를 포함한다. 말기 AMD는 혈관신생(습식 또는 삼출성(exudative)으로도 알려져 있음) 또는 비혈관신생(위축성(atrophic), 건식 또는 비삼출성으로 알려져 있음)일 수 있다. 말기 비혈관신생 AMD는 황반의 지도모양 위축(GA: geographic atrophy)의 발증 및 중심 시력(central visual acuity)의 손실과 이로 인한 중증 및 영구 시각 장애(visual impairment) 및 법적 시각 상실(legal blindness)을 특징으로 한다(예를 들어 인용되어 본원에 포함된 문헌[Mitchell, P. et al. (2018). Age-related macular degeneration. The Lancet, 392(10153), 1147-1159] 참조). 말기 혈관신생 AMD는 중심 시력의 손실과 함께 망막 박리 및 부종의 발증과 이로 인한 중증 및 영구 시각 장애 및 법적 시각 상실을 특징으로 한다.
C. IDO-의존성 혈관화 세포(IDVC)
IDO1-의존성 혈관화 세포(IDVC)라고 하는 새로 단리된 세포 유형이 본원에 기재된다. 이러한 신규 면역 세포 하위유형은 이종성 Gr-1+ MDSC 집단 내의 마우스에서 단리되었고, IDO1에 의해 활성화된 IL6의 ISR-구동 생성을 통한 IFNγ의 존재 하에 혈관신생을 유도하고 이들 새로운 혈관을 지속시키는 능력에 의해 MDSC의 벌크(bulk)와 기능적으로 구분 가능하다.
면역억제에 더하여, 일반적으로 MDSC(골수-유래 억제자 세포) 또한 종양 신혈관형성을 지원하는 것으로 받아들여지고 있다. 최근, 트립토판 이화 효소 IDO1(인돌아민 2,3-디옥시게나제)은 염증성 사이토카인 IFNγ(인터페론-γ)와 IL6(인터류킨 6) 사이의 핵심 조절 노드로서 위치함으로써 혈관신생을 촉진하는 데 관여해 왔다. 본원에 기재된 바와 같이, Gr-1+ MDSC의 이종성 확장 내에서, 혈관신생을 생체내에서 유도하는 능력은 고도 자가형광 CD11blo 세포의 부 하위세트와 주로 관련이 있다. IDO1 발현은 이들 세포에서의 IDO1 활성이 혈관신생을 촉진하는 주된 역할로 인해 본원에서 IDVC라고 하는 이들 세포의 아시알로-GM1 이중 양성 하위집단인 별개의 CD11c로 추가로 제한된다. 기계적으로, IDVC에서 IDO1의 유도는 이들 세포 내에서 통합 스트레스 반응의 GCN2-매개 활성화를 통한 IL6의 생성을 위한 신호전달에 의해 숙주 IFNγ의 항신혈관형성 효과에 부정적인 피드백 제약을 제공한다. 일 구현예에서, IDVC는 눈의 망막에 위치한다. 또 다른 구현예에서, IDVC는 눈의 맥락막에 위치한다. 또 다른 구현예에서, IDVC는 눈의 망막 및 맥락막에 위치한다.
IDVC 세포에서 IDO1의 유도는, 혈관신생의 확립 및 유지를 지원하는 IDVC의 능력의 핵심인 ISR(통합 스트레스 반응(ISR)) 활성화를 초래한다. IDVC는 상대적으로 높은 수준의 내인성 자가형광과 결합된 세포 표면 상의 높은 수준의 CD45, CD11c, 아시알로-GM1 및 Gr-1 및 낮은 수준의 CD11b를 검출하기 위해 항체를 사용한 유세포측정법에 의해 마우스로부터 거의 균질하게 단리될 수 있다.
IDVC는 IDO1을 유도함으로써 사이토카인 IFNγ(인터페론-감마)를 포함한 사이토카인에 반응하고 기능적으로 혈관신생에서 역할을 하는 것을 특징으로 하는 백혈구 또는 또 다른 세포 유형이며, 이의 확립 및 유지는 IDVC 내에서 IDO1의 유도를 필요로 한다. IDVC로서의 세포의 특징화는 세포를 단리하고 이를 마우스의 피부 아래에 이식되는 마트리겔 플러그 내로 혼입하는 것을 포함할 수 있다. 며칠 후, 이식 부위는 혈관의 존재에 대해 평가된다.
일 구현예에서, IDVC는 하기 표현형을 특징으로 한다: CD11b+CD14-CD15+ 또는 CD11b+CD14-CD66b+. 대안적으로, CD33 골수성 마커는 CD11b 대신에 사용될 수 있는데, 매우 소수의 CD15+ 세포가 CD11b-이기 때문이다. 또 다른 구현예에서, IDVC는 하기 표현형을 특징으로 한다: Lin-HLA-DR-/loCD33+ 또는 Lin-HLA-DR-/loCD11b+CD14-CD15+CD33+. 일 구현예에서, 하기 세포 표면 마커 중 하나 이상은 IDVC 상에 위치한다: CD11c, CD274(PDL1), MHC 부류 II, CD4, CD31(PECAM-1), CD202B(TIE2), CD205(DEC-205), Siglec 8 또는 EMR1.
D. 통합 스트레스 반응(ISR) 경로 노드
통합 스트레스 반응(ISR)은 진핵 세포에서 유도 가능한 어디에나 있는(ubiquitous) 신호전달 경로이며, 이는 광범위한 생리학적 자극 및 병리학적 조건에 반응하여 활성화된다. 이러한 자극은 보편적으로 세포 외인성 인자 및 스트레스 인자(stressor), 예컨대 저산소증, 아미노산 결핍(deprivation), 포도당 결핍, 및 바이러스 감염을 포함한다. 이에 더하여, 세포 내인성 스트레스, 예컨대 ER에서 접히지 않은 단백질의 축적에 의해 야기되는 소포체(ER) 스트레스 또한 ISR을 활성화시킬 수 있다. 더욱이, 암 생물학과 관련하여, ISR은 발암유전자 활성화에 의해 촉발될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, ISR은, IDO1이 망막병증에서 병리학적 혈관신생을 촉진하는 작용을 하는 생물학적으로 관련된 신호전달 경로인 것으로 제시된다. 핵심 ISR 노드, 예컨대 GCN2, CHOP 및 ATF4의 저해는 망막병증의 동물 모델, 즉, 산소 유도 망막병증(OIR) 마우스 모델에서 혈관신생을 감소시키는 것으로 제시되었다. 본원에 사용된 용어 "ISR 노드"는 스트레스-활성화된 eIF2α 키나제에 의해 개시되는 신호전달 경로를 따른 임의의 구성요소를 지칭한다. 특정 구현예에서, ISR 노드는 GCN2, CHOP 및/또는 ATF4를 지칭한다.
일반 제어 비탈억제성 2(GCN2)는 아미노산 항상성의 마스터 조절인자 키나제이고, 아미노산 결실 하에 종양 미세환경에서 암 생존에 중요하다. GCN2는 또한 인간에서 진핵 생물 번역 개시 인자 2-알파 키나제 4(EIF2AK4), eIF-2-알파 키나제 GCN2, 및 GCN2-유사 단백질로 명명되고, EIF2AK4 유전자에 의해 인코딩된다. GCN2는 낮은 아미노산 이용률에 반응하여 진핵 생물 번역 개시 인자 2(EIF2S1/eIF-2-알파)의 알파 하위단위를 인산화시키는 대사-스트레스 감지 단백질 키나제이다. hGCN2의 서열은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 UniProtKB - Q9P2K8에서 찾을 수 있다.
성장 억제 및 DNA 손상-유도성 단백질 153(GADD153)으로도 알려져 있는 C/EBP 상동성 단백질(CHOP)은 CCAAT/인핸서-결합 단백질(C/EBP) 계열(family)에 속한다. CHOP는 다른 C/EBP 구성원과 이량체화하고, 이의 DNA-결합 및 트랜스활성화 특성을 변화시킨다. 이는 소포체 스트레스 또는 DNA 손상 후 성장 억제 및 세포자멸사를 유도한다. hCHOP의 서열은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 UniProtKB - P35638에서 찾을 수 있다.
활성화 전사 인자 4(ATF4)는, cAMP 반응 요소(CRE)(컨센서스(consensus): 5'-GTGACGT[AC][AG]-3')에 결합하고 정상적인 대사 및 산화환원 과정의 조절인자로서 그리고 통합 스트레스 반응(ISR) 동안 마스터 전사 인자로서 작용하는 전사 인자이다(PubMed:1847461, PubMed:16682973, PubMed:31444471, PubMed:32132707). ATF4는 다양한 스트레스, 예컨대 소포체(ER) 스트레스, 아미노산 고갈, 미토콘드리아 스트레스 또는 산화 스트레스에 대한 적응에 필요한 ISR의 코어 이펙터이다. hATF4의 서열은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 UniProtKB - P18848에서 찾을 수 있다.
E. IDO1
인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO1)는 트립토판을 키누레닌으로 전환시키는 제1 단계를 촉매화하는 트립토판 이화 효소이다. IDO1은 간에서 트립토판의 대사 가공과 독립적으로 필수적인 아미노산 트립토판을 이화시키는 간외(extrahepatic) 효소이다. 안구 장애의 치료를 위한 IDO1 단독치료법은 공보 제WO2016/100851호에 기재되어 있으며; 또한 인용되어 본원에 포함된 미국 특허 제10,535,035호를 참조한다. IDO1은 이따금 본원에서 IDO로 지칭된다.
F. VEGF 및 VEGFR
"VEGF"는 신혈관형성 또는 신혈관형성 과정을 유도하는 혈관 내피 성장 인자를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "VEGF"는 예를 들어 VEGF121, VEGF165 및 VEGF189를 포함한 VEGF-A/VPF 유전자의 대체 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 발생하는 VEGF의 다양한 하위유형 또는 이소형(isoform)(혈관 침투성 인자(VPF) 및 VEGF-A로도 알려져 있음)을 포함한다. 추가로, 본원에 사용된 용어 "VEGF"는 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 VEGF-E를 포함하며, 이는 동족(cognate) VEFG 수용체(즉, VEGFR)를 통해 작용하여 신혈관형성 또는 신혈관형성 과정을 유도한다. 용어 "VEGF"는 VEGFR-1(Flt-1), VEGFR-2(KDR/Flk-1) 또는 VEGFR-3(FLT-4)과 같은 VEGF 수용체에 결합하는 성장 인자 부류의 임의의 구성원을 포함한다. 용어 "VEGF"는 "VEGF" 폴리펩타이드 또는 "VEGF" 인코딩 유전자 또는 핵산을 지칭하는 데 사용될 수 있다. 인용되어 본원에 포함된 미국 특허 공보 제2019/0380187호를 참조한다.
G. 저해제, 차단제, 길항제
일반적인 용어 "차단제", "저해제" 또는 "길항제"란, 표적 분자 또는 표적 세포, 예를 들어 본원에 사용된 바와 같은 IDVC, ISR 노드, IDO1 또는 VEGF의 활성 또는 생성을 부분적으로 또는 전체적으로 저해하는 제제를 의미한다. 특정 구현예에서, 이들 용어는 표적 분자의 유전자 발현 수준, mRNA 수준, 단백질 수준 또는 단백질 활성을 저하시킬 수 있는 조성물, 화합물 또는 제제를 지칭한다. 길항제의 예시적인 형태는 예를 들어, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드(예컨대 환식 펩타이드), 항체 또는 항체 단편, 펩타이드 모방체(mimetic), 핵산 분자, 안티센스 분자, 리보자임, 앱타머, RNAi 분자, 및 유기 저분자를 포함한다. 길항제 저해의 예시적인 비제한적 기전은 (예를 들어 리간드 유전자/핵산을 표적화하는 안티센스, 리보자임 또는 RNAi 조성물을 사용한) 리간드 합성 및/또는 안정성의 억제, (예를 들어 항-리간드 앱타머, 항체 또는 가용성 유인(decoy) 동족 수용체를 사용한) 리간드가 이의 동족 수용체에 결합하는 것의 차단, (예를 들어 리간드 수용체 유전자/핵산을 표적화하는 안티센스, 리보자임 또는 RNAi 조성물을 사용한) 수용체 합성 및/또는 안정성의 억제, (예를 들어 수용체 항체를 사용한) 수용체가 이의 동족 수용체에 결합하는 것의 차단, (예를 들어 수용체 티로신 키나제 저해제를 사용한) 수용체의 동족 리간드에 의한 수용체의 활성화의 차단, 단백질의 생물학적 활성을 조절하기 위해 천연 기질의 결합을 방지하는, 즉, 저해하는 분자와 효소의 결합 또는 단백질의 활성 또는 결합 부위에 결합하는 저해제 분자의 상호작용의 결과로서 또는 단백질 상에서의 알로스테릭 부위를 통한 효소의 활성 부위의 차단을 포함한다. 이에 더하여, 차단제 또는 저해제는 표적 분자를 직접적으로 또는 간접적으로 저해할 수 있다.
i. 염
본원에 기재된 조성물은 또한 본원에 기재된 특정 IDVC, ISR 노드, IDO, 또는 VEGF 저해제 화합물의 모든 염을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "염"은 개시된 화합물의 유도체를 지칭하며, 여기서 모(parent) 화합물은 기존의 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환시킴으로써 변형된다. 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기산(예컨대 HCl, HBr, H2SO4) 또는 유기산(예컨대 아세트산, 벤조산, 트리플루오로아세트산) 염; 카르복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리(예컨대 Li, Na, K, Mg, Ca) 또는 유기(예컨대 트리알킬 암모늄) 염 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 본원에 기재되거나 지칭된 화합물의 염은 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 종래의 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 물에서 또는 유기 용매에서 또는 이들 둘의 혼합물에서 이들 화합물의 유리(free) 산 또는 염기 형태를 화학양론 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있으며; 일반적으로, 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴(ACN)과 같은 비수성 매질이 바람직하다.
본원에 기재되거나 인용되어 포함된 화합물의 "약학적으로 허용 가능한 염"은 상기 기재된 "염"의 하위세트를 포함하며, 이는 예를 들어 무독성 무기산 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 종래의 무독성 염이다. 적합한 염의 목록은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418] 및 문헌[Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977)]에서 찾을 수 있으며, 이는 그 전체 내용이 인용되어 본원에 포함된다.
어구 "약학적으로 허용 가능한"은 합리적인 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제나 합병증 없이 합리적인 유익성/위험성 비(benefit/risk ratio)에 비례하여 인간 및 동물의 조직과 접촉되어 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 본원에 이용된다.
ii. 전구약물
용어 "전구약물"이란, 투여 후 모 약물학적 활성 분자 또는 화합물, 예를 들어 활성 IDO 저해제(예를 들어 국제 공보 제WO2019/051198호), VEGF 또는 VEGFR 저해제 또는 길항제, ISR 노드 길항제 또는 저해제로 대사되는(즉, 체내에서 전환되는) 화합물, 분자 또는 제제를 의미한다. 전구약물은 전형적으로 예를 들어 내인성 효소 또는 다른 화학물질 및/또는 조건의 작용에 의해 예컨대 신체 또는 세포 내에서 활성 형태(즉, 약물)로 전환되거나 대사되는, 완전히는 아니라도 실질적으로 약물학적 비활성 형태이다. 활성 분자를 직접적으로 투여하는 대신, 상응하는 전구약물은 조성물/활성 분자가 흡수되고/되거나, 분포되고/되거나, 대사되고/되거나 배출되는 방법을 향상시키기 위해 사용된다. 전구약물은 종종 생체이용률 또는 약물이 이의 의도된 표적이 아닌 세포 또는 과정과 선택적으로 상호작용하는 방법을 향상시키기 위해 설계된다. 이는 활성 분자 또는 약물의 유해 또는 의도치 않은 바람직하지 못한 또는 중증 부작용을 감소시킨다.
iii. 바이오시밀러
"바이오시밀러"는 살아 있는 유기체로부터 생성되고, 참조 제품, 예를 들어 이미 FDA-승인된 생물학적 약물과 고도로 유사한 일관된 품질을 보장하기 위해 모니터링될 수 있는 생물학적 제품, 일반적으로 크고 복잡한 분자이다. FDA 승인을 받는 바이오시밀러는 순도, 안전성, 분자 구조 및 생물활성, 또는 약효에서 참조 약물과 어떠한 임상적으로 유의한 차이도 갖지 않아야 한다.
iv. 항체 및 단편
용어 "항체" 또는 "항체 분자"란, 특정 항원에 결합하는 항체 및 이의 단편을 포함한 임의의 펩타이드 또는 단백질이다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체 또는 항체 분자는 무손상(intact) 면역글로불린 분자, 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분의 융합을 고려한다.
항체는 천연 발생 항체일 수 있거나 합성 또는 변형된 항체(예를 들어 재조합적으로 발생된 항체; 키메라 항체; 이중특이적 항체; 인간화(humanized) 항체; 카멜리드(camelid) 항체 등)일 수 있다. 항체는 적어도 하나의 정제 태그를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 프레임워크 항체는 항체 단편이다. 용어 "항체 단편"은 항원 결합 단편 또는 이의 단일 사슬인 항체 부분을 포함한다. 항체 단편은 합성적으로 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드일 수 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포괄된 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편; 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 2개 도메인인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들은 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 형성하여 1가 분자(단일 사슬 Fv(scFv)로 알려져 있음)를 형성하는 단일 단백질 사슬로서 만들어지게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 알려진 종래의 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 전체 항체로서의 이용성에 대해 동일한 방식으로 스크리닝될 수 있다. 항체 단편은 비제한적으로: 단일 도메인(Dab; 예를 들어 단일 가변 경쇄 또는 중쇄 도메인), Fab, Fab', F(ab')2 및 F(v)를 포함한 면역글로불린 단편; 및 비제한적으로: (예를 들어 링커를 통한) scFv, scFv2, scFv-Fc, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody)를 포함한 이들 면역글로불린 단편의 융합을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 항체는 또한 적어도 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 단백질(예를 들어 융합 단백질)일 수 있다.
방법에 유용한 항체는 바람직하게는 "면역학적으로 특이적"이며, 이는 관심 단백질 또는 화합물의 하나 이상의 에피토프에 결합하지만 항원성 생물학적 분자의 혼합된 집단을 함유하는 시료 내 다른 분자를 실질적으로 인식하고 결합하지 않는 단백질/폴리펩타이드, 특히 항체를 지칭한다.
본 발명의 항체는 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 항체는 인간화될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체(또는 이의 부분)는 항체 또는 항체 단편 작제물의 백본 내로 삽입된다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 가변 경쇄 도메인 및/또는 가변 중쇄 도메인은 또 다른 항체 작제물 내로 삽입될 수 있다. 항체를 재조합적으로 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 실제로, 특정한 항체 및 항체 단편 작제물에 대한 상업적인 벡터가 입수 가능하다.
본 발명의 항체는 또한 다른 구성요소에 접합/연결될 수 있다. 예를 들어, 항체는 적어도 하나의 침투성 펩타이드, 검출 가능한 제제, 이미징제(imaging agent) 또는 조영제에 작동 가능하게 연결(예를 들어 선택적으로 링커를 통해 공유 연결)될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 적어도 하나의 정제 태그(예를 들어 His-태그)를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 세포 침투성 펩타이드에 접합된다.
v. 앱타머
용어 "앱타머"는 표적 상에 저해 효과를 갖는 펩타이드 또는 핵산을 지칭한다. 앱타머에 의한 표적의 저해는 표적의 결합에 의해, 표적을 촉매적으로 변경시킴으로써, 표적 또는 표적의 기능적 활성을 변형시키는 방식으로 표적과 반응함으로써, 자살(suicide) 저해제에서와 같이 표적에 이온적으로 또는 공유 부착함으로써 또는 표적과 또 다른 분자 사이의 반응을 용이하게 함으로써 발생할 수 있다. 앱타머는 펩타이드, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 다른 핵산 또는 상이한 유형의 핵산의 혼합물일 수 있다. 앱타머는 본원에서 추가로 상세히 기재된 바와 같이 하나 이상의 변형된 아미노산, 염기, 당(sugar), 폴리에틸렌 글리콜 스페이서 또는 포스페이트 백본 단위를 포함할 수 있다.
vi. RNA 및 DNA
용어 "RNA 간섭," "RNAi," "miRNA," "shRNA" 및 "siRNA"는 표적 세포 내로 하나 이상의 이중-가닥 RNA를 도입함으로써 유전자 또는 유전자 생성물의 발현이 저하되는 임의의 방법을 지칭하며, 이는 관심 유전자(특히 관심 유전자의 메신저 RNA)와 상동성이다. 유전자 치료법, 즉, 재조합 기술을 사용하고/하거나 변형된 RNA 또는 변형된 DNA를 수많은 광범위하게 알려진 실험 벡터, 재조합 바이러스 및 CRISPR 기술을 통해 세포 내로 도입함으로써 질환을 치료하는 RNA 또는 DNA의 조작은 또한 변형된 RNA 또는 변형된 DNA를 통해 IDO/TDO 경로와 유전자 생성물 및 VEGF 경로와 유전자 생성물의 효과적인 저해를 전달하여 기재된 병용 치료법과 함께 본원에 기재된 성과를 달성하는 데 이용될 수 있다. 이러한 유전적 조작은 또한 무엇보다도 CRISPR(규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) 및 TALEN(전사 활성인자-유사 이펙터 게놈 변형)과 같은 유전자 편집 기술을 이용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법의 세부사항에 대해서는 인용되어 본원에 포함된 교재[National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. Human Genome Editing: Science, Ethics, and Governance. Washington, DC: The National Academies Press. https://doi.org/10.17226/24623]을 참조한다.
vii. 저분자
용어 "저분자"는 약학에 적용될 때 대략 900 달톤 미만의 상대적으로 낮은 분자량을 갖는, 생물학적 과정에 영향을 미치는 일반적으로 비(非)생물학적 유기 화합물을 지칭한다. 저분자 약물은 높은 신뢰도로 합성적으로 복제될 수 있는 쉽게 식별 가능한 구조를 갖는다. 일 구현예에서, 저분자는 분자가 인간 소화계의 세포내 흡수 능력과 상용적인(compatible) 가능성을 증가시키기 위해 550 달톤 미만의 분자량을 갖는다. 저분자 약물은 종종 정제로서 경구 투여된다. 용어 저분자 약물은 종종 상대적으로 큰 분자, 예컨대 펩타이드, 단백질 및 재조합 단백질 융합이고 살아 있는 유기체를 사용하여 빈번하게 생성되는 생물학적 약물과 이를 대조시키기 위해 사용된다.
viii. IDO1의 특이적 저해제
어구 "IDO1의 발현, 유도, 활성 및/또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 조성물"은 비제한적으로, IDO1를 직접적으로 표적화하는 저분자 효소 저해제 또는 이의 염, 거울상이성질체 또는 전구약물을 포함한다. 이러한 조성물의 또 다른 구현예는 IDO1의 하나 이상의 표적 업스트림 또는 다운스트림(GCN2, CHOP10, 및/또는 ATF4와 같은 ISR 노드 포함)을 이의 각각의 경로에서 차단하거나 저해하여 IDO1 및 다른 트립토판 이화 효소 또는 이의 염, 거울상이성질체 또는 전구약물의 작용을 저해하는 저분자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, IDO1 저해제 조성물은 트립토판의 존재를 모방하는 분자를 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, IDO 저해제를 함유하는 조성물은 IDO1의 번역 또는 전사를 저해하는 핵산 분자, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA를 포함한다. 또 다른 구현예에서, IDO1 저해제 조성물은 IDO1에 결합하고 이의 활성을 저해하는 단백질 치료제를 포함한다. 이러한 단백질 치료제는 항-IDO1 항체 또는 이의 결합 단편을 포함할 수 있다.
더 구체적으로, IDO1의 발현, 유도, 활성 및/또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 조성물은 비제한적으로, 하기 화합물 또는 이의 전구약물, 염 및/또는 임의의 치료적 유효 제형 중 적어도 하나를 포함한다:
인독시모드(indoximod)(1-메틸-D-트립토판, 1MT, NLG-8189)
1-메틸-L-트립토판
1-메틸-D-트립토판과 1-메틸-L-트립토판의 라세미 혼합물
에파카도스타트(INCB024360; Incyte; 미국 델라웨어주 윌밍턴 소재; 문헌[Liu et al. (2010) Blood 115(17):3520-3530]; 문헌[Koblish et al. (2010) Mol. Cancer Ther., 9(2):489-498)]에 기재됨)
나복시모드(navoximod)(NLG-919, GDC-0919, RG6078; Lumos Pharma/NewLink Genetics/Genentech),
인독시모드 전구약물 NLG802
BMS-986205/ONO-7701(F001287, 문헌[Hunt et al., AACR 2017, Abstract 4964]),
PF-06840003/EOS200271(EOS, 문헌[Wythes et al, SITC 2016, Abstract 253]),
화학식 1-R-D-트립토판 또는 1-R-L-트립토판의 화합물, 여기서 R은 C1-C12 알킬임;
MK-7162/IOM2983(Merck and Co.)
LY3381916(Lilly)
KHK2455(Kyowa Hakko Kirin)
HTI-1090/SHR9146(Hengrui Therapeutics, Inc)
DN1406131(De Novo Pharmatech)
RG70099(Roche/CuraDev)
Roxyl-WL(문헌[Xu et al. J Enzyme Inhib Med Chem. 2018; 33(1): 1089-94])
TPST-8844(Tempest Therapeutics)
에틸 피루베이트
AMG-1(Amgen), 인용되어 본원에 포함된 문헌[Smith JR et al, Novel indoleamine 2,3-dioxygenase-1 inhibitors from a multistep in silico screen, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 20(3): 1354-1363 1 February 2012]에 기재된 바와 같음;
메틸티오히단토인-DL-트립토판(MTH-Trp),
β-(3-β)-DL-알라닌,
β-(3-벤조(b)티에닐)-DL-알라닌,
6-니트로-L-트립토판,
인돌 3-카르비놀,
3,3'-디인돌릴메탄,
에피갈로카테킨 갈레이트,
5-Br-4-Cl-인독실 1,3-디아세테이트,
9-비닐카르바졸, 아세메타신(acemetacin),
5-브로모-DL-트립토판,
5-브로모인독실 디아세테이트,
나프토퀴논-기초,
S-알릴-브라씨닌,
S-벤질-브라씨닌,
5-브로모-브라씨닌,
페닐이미다졸-기초,
4-페닐이미다졸,
엑시구아민 A(Exiguamine A)
NSC401366
베타-라파콘(beta-lapachone)(3,4-디하이드로-2,2-디메틸-2H-나프톨[1,2-b]피란-5,6-디온, 문헌[Flick et al. (2013) Int. J. Tryp. Res. 6:35-45])(ARQ 761; ArQule, 현재 Merck 소유);
DX-03-12 및 인용되어 본원에 포함된 문헌[Wen, H. et al, Design and Synthesis of Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1 Inhibitors and Evaluation of Their Use as Anti-Tumor Agents, Molecules 2019, 24, 2124; doi:10.3390/molecules -24112124]에 기재된 다른 화합물;
특허 제WO2014/186035호 및 미국 특허 공보 제US 2018/030026호(Curadev)에 기재된 화합물; 및/또는
제WO2014/081689호 및 미국 특허 제9,499,497호(Vertex Pharmaceuticals)에 기재된 화합물.
더욱 다른 적합한 저해제는 문헌[Wang, X-X et al, Recent advances in the discovery of indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) inhibitors, MedChemComm]에서 식별되고, 트립토판 유도체, 이미다졸, 1,2,3-트리아졸 또는 테트라졸 스캐폴드를 갖는 저해제, 퀴논 또는 이미노퀴논을 갖는 저해제, N-하이드록시아미딘으로서 분류된다.
저분자 IDO1 저해제의 더욱 다른 예는 비제한적으로, 국제출원 PCT/US2014/022680호(예를 들어 이미다조이소인돌과 관련된 삼환식 화합물; 화학식 I 내지 V의 화합물), 국제출원 PCT/US2012/033245호(예를 들어 융합된 이미다졸 유도체; 화학식 I 또는 II의 화합물), 국제출원 PCT/US2010/054289호(예를 들어 이미다졸 유도체; 화학식 I 내지 VIII의 화합물), 국제출원 PCT/US2009/041609호(예를 들어 화학식 I 내지 VIII의 화합물), 국제출원 PCT/US2008/57032호(예를 들어 나프토퀴논 유도체; 화학식 I, II 또는 III의 화합물), 국제출원 PCT/US2008/085167호(예를 들어 화학식 I 내지 XLIV의 화합물), 국제출원 PCT/US2006/42137호(예를 들어 화학식 I의 화합물), 국제출원 PCT/US2006/017983호(예를 들어 화학식 I의 화합물), 국제출원 PCT/US2004/005155호(예를 들어 페닐-TH-DL-trp(3-(N-페닐-티오히단토인)-인돌), 프로페닐-TH-DL-trp(3-(N-알릴-티오히단토인)-인돌) 및 메틸-TH-DL-trp(3-(N-메틸-티오히단토인)-인돌)), 국제출원 PCT/US2004/005154호(예를 들어 화학식 I 또는 II의 화합물), 미국 특허 제7,705,022호(예를 들어 화학식 I의 화합물), 미국 특허 제8,008,281호(예를 들어 페닐-TH-DL-trp(3-(N-페닐-티오히단토인)-인돌), 프로페닐-TH-DL-trp(3-(N-알릴-티오히단토인)-인돌) 및 메틸-TH-DL-trp(3-(N-메틸-티오히단토인)-인돌)), 미국 특허 제7,714,139호(예를 들어 화학식 I 또는 II의 화합물), 미국 특허 출원 공보 제20140066625호(예를 들어 융합된 이미다졸 유도체; 화학식 I 또는 II의 화합물), 미국 특허 출원 공보 제20130177590호(예를 들어 N-하이드록시아미디노헤테로사이클; 화학식 I 내지 III의 화합물), 미국 특허 출원 공보 제20140023663호(예를 들어 1,2,5-옥사디아졸; 화학식 I의 화합물), 미국 특허 출원 공보 제20080146624호(예를 들어 아미딘; 화학식 I 또는 II의 화합물), 미국 특허 출원 공보 제20080119491호(예를 들어 아미디노헤테로사이클; 화학식 I 내지 IV의 화합물), 미국 특허 출원 공보 제20080182882호(예를 들어 N-하이드록시아미디노헤테로사이클; 화학식 I의 화합물), 미국 특허 출원 공보 제20080214546호(예를 들어 N-하이드록시아미디노헤테로사이클; 화학식 I의 화합물), 미국 특허 출원 공보 제20060258719호(화학식 I의 화합물), 문헌[Banerjee et al. (2008) Oncogene 27:2851-2857](예를 들어 브라씨닌 유도체) 및 문헌[Kumar et al. (2008) J. Med. Chem., 51:1706-1718](예를 들어 페닐-이미다졸-유도체)에 제공된다. 특정 구현예에서, IDO1 저해제는 전구약물이다(예를 들어 미국 특허 출원 공보 제20170022157호 및 미국 임시 출원 제62/555,726호 참조). 특히 본원에 제공된 IDO1 저해제에 대해 모든 참조문헌은 인용되어 본원에 포함된다.
특정 구현예에서, IDO1 유도 저해제는 에틸 피루베이트(문헌[Muller, et al. (2010) Cancer Res. 70:1845-1853]) 또는 글리벡(gleevec)(이마티닙(imatinib), 문헌[Balachandran et al. (2011) Nat. Med. 17:1094-1100])이다. 특정 구현예에서, IDO1 경로 저해제(예를 들어 다운스트림 신호전달 경로의 저해제)는 1-메틸-트립토판, 특히 1-메틸-D-트립토판(인독시모드, NLG-8189; 1-메틸-D-트립토판; NewLink Genetics)이며 이의 염 및 전구약물(미국 특허 출원 공보 제20170022157호) 또는 이들을 포함하는 라세미 혼합물을 포함한다.
IDO1 발현의 추가의 저해제는 비제한적으로, JAK/STAT(예를 들어 JAK, STAT3, STAT1)(문헌[Du et al. (2000) J. Interferon Cytokine Res., 20:133-142], 문헌[Muller et al. (2005) Nature Med., 11:312-319]; 문헌[Yu et al. (2014) J. Immunol., 193:2574-2586]), NFκB(문헌[Muller et al. (2005) Nature Med., 11:312-319]; 문헌[Muller et al. (2010) Cancer Res., 70:1845-1853]), KIT(문헌[Balachandran et al. (2011) Nature Med., 17:1094-1100]), MET(문헌[Rutella et al. (2006) Blood 108:218-227]; 문헌[Giannoni et al. (2014) Haematologica 99:1078-1087]), RAS/RAF/MEK(문헌[Liu (2010) Blood 115:3520-3530]), 아릴 탄화수소 수용체(AHR)(문헌[Bessede et al. (2014) Nature 511:184-190]; 문헌[Litzenburger et al. (2014) Oncotarget 5:1038-1051]) 또는 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR)(문헌[Marti et al. (2014) Mem Inst Oswaldo Cruz 109:70-79])의 저해제를 포함한다. 특정 구현예에서, 저해제는 VEGFR의 저해제가 아니다.
더욱 다른 IDO 저해제, 이의 염 또는 전구약물은 인용되어 본원에 포함된 하기 미국 특허에 기재되어 있다:
미국 특허 제10,501,458호 인돌아민-2,3-디옥시게나제 저해제로서의 치환된 이환식 융합된 고리 화합물;
미국 특허 제10,494,360호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 저해제;
미국 특허 제10,472,336호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 조절제;
미국 특허 제10,436,785호 항-인돌아민 2,3-디옥시게나제 1 항체 및 이의 진단적 용도;
미국 특허 제10,399,933호 암의 치료를 위한 인돌아민-2,3-디옥시게나제의 저해제;
미국 특허 제10,399,932호 암의 치료를 위한 인돌아민-2,3-디옥시게나제의 저해제
미국 특허 제10,369,137호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 저해제로서의 1,2,5-옥사디아졸
미국 특허 제10,358,427호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 조절제
미국 특허 제10,336,731호 인돌아민-2,3-디옥시게나제 저해제로서의 치환된 1H-인돌-2-카르복사미드 화합물
미국 특허 제10,329,297호 인돌아민-2,3-디옥시게나제의 저해를 위한 화합물
미국 특허 제10,323,004호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 저해제 및 이의 사용 방법
미국 특허 제10,287,252호 트립토판-2,3-디옥시게나제 또는 인돌아민-2,3-디옥시게나제의 저해제
미국 특허 제10,280,163호 인돌아민 및/또는 트립토판 2, 3-디옥시게나제로서의 5 또는 8-치환된 이미다조[1, 5-a] 피리딘
미국 특허 제10,280,157호 인돌아민 2,3-디옥시게나제 저해제의 합성 방법
미국 특허 제10,239,894호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 저해제
미국 특허 제10,208,002호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 조절제 및 이의 사용 방법
미국 특허 제10,034,864호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 저해제로서의 1,2,5-옥사디아졸
미국 특허 제9,873,688호 인돌아민 2,3-디옥시게나제 저해제의 합성 방법
미국 특허 제9,789,094호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 저해제로서의 1,2,5-옥사디아졸
미국 특허 제9,771,370호 인돌아민-2,3-디옥시게나제의 저해를 위한 화합물
미국 특허 제9,675,571호 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO)의 저해제
미국 특허 제9,499,497호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 저해제로서 유용한 화합물
미국 특허 제9,463,239호 다른 치료 양식과 병용된 인돌아민-2,3-디옥시게나제의 저해제의 용도
미국 특허 제9,433,666호 인돌아민 2,3-디옥시게나제-기반 면역치료법
미국 특허 제9,321,755호 인돌아민 2,3-디옥시게나제 저해제의 합성 방법
미국 특허 제9,320,732호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 저해제로서의 1,2,5-옥사디아졸
미국 특허 제9,073,875호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 저해제로서 유용한 화합물
미국 특허 제8,993,605호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 저해제로서의 1,2,5-옥사디아졸
미국 특허 제8,951,536호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 조절제로서의 N-하이드록시아미디노헤테로사이클
미국 특허 제8,846,726호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 조절제 및 이의 사용 방법
미국 특허 제8,822,511호 및 제8,796,319호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 저해제로서의 1,2,5-옥사디아졸
미국 특허 제8,580,844호 다른 치료 양식과 병용된 인돌아민-2,3-디옥시게나제의 저해제의 용도
미국 특허 제8,507,541호; 제8,450,351호 및 제8,377,976호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 조절제로서의 N-하이드록시아미디노헤테로사이클
미국 특허 제8,436,151호 인돌아민 2,3-디옥시게나제-2 항체
미국 특허 제8,372,870호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 조절제 및 암을 치료하기 위한 이의 사용 방법
미국 특허 제8,088,803호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 저해제로서의 1,2,5-옥사디아졸
미국 특허 제8,058,416호 인돌아민 2,3-디옥시게나제-2를 인코딩하는 핵산 분자
미국 특허 제8,034,953호 인돌아민 2,3-디옥시게나제의 조절제 및 이의 사용 방법
미국 특허 제7,799,776호 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO) 저해제
미국 특허 제7,598,287호 다른 치료 양식과 병용된 인돌아민-2,3-디옥시게나제의 저해제의 용도.
더욱 또 다른 구현예에서, IDO 저해제는 IDO-표적화, 펩타이드-기초 백신이다(예컨대 문헌[Iversen et al. (2014) Clin. Cancer Res., 20:221-32]에 기재됨).
ix. ISR 노드의 특이적 저해제
GCN2 저해제는 비제한적으로, GCN2-IN-1(A-92)(Medchemexpress), GCN2iA(문헌[Nakamura et al, Inhibition of GCN2 sensitizes ASNS-low cancer cells to asparaginase by disrupting the amino acid response, PNAS, epub July 30, 2018 115 (33) E7776-E7785]), Fujimoto 등에 의해 기재된 것(문헌[Identification of Novel, Potent, and Orally Available GCN2 Inhibitors with Type I Half Binding Mode, ACS Med Chem Lett. 2019 Oct 10; 10(10): 1498-1503, epub Sept 2019]), GZD824(문헌[Kato et al, GZD824 inhibits GCN2 and sensitizes cancer cells to amino acid starvation stress, Molecular Pharmacology, 98(6) (October 8, 2020)]), 트리아졸로[4,5-d]피리미딘 스캐폴드에 기초한 저해제, 예컨대 Lough 등에 의해 기재된 것(문헌[Triazolo[4,5-d]pyrimidines as Validated General Control Nonderepressible 2 (GCN2) Protein Kinase Inhibitors Reduce Growth of Leukemia Cells, Volume 16, September 2018, Pages 350-360]), RAPT 치료제(예를 들어 GCN2i-282, GCN2i-490, FLX-GCN2i-A, FLX-GCN2i-B)에 의해 시험되는 GCN2 저해제(문헌[Marshall et al, Targeting the Stress Response Kinase GCN2 to Restore Immunity And Decrease Tumor Cell Survival SITC 2019])를 포함한다. 다른 GCN2 저해제는 일반 화학식(Rapt Therapeutics)을 갖는 것을 포함하여 미국 특허 공보 제20190375753호에 개시된 것을 포함한다:
또는
또는
또는
또는
.
이들 문헌은 각각 인용되어 본원에 포함된다.
CHOP 저해제는 비제한적으로, 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 Klar 등에 의해 기재된 것(문헌[Abstract 3275: Inhibition of ER-stress factor C/EBP homologous protein (Chop) with LNAplus™ antisense-oligonucleotides to improve immunotherapy of cancer, DOI: 10.1158/1538-7445.AM2019-3275 Published July 2019]), 및 ISRIB를 포함한다.
ATF4 저해제는 비제한적으로, 우르솔릭산(ursolic acid), 토마티딘(tomatidine) 및 이의 유도체, Ebert 등(문헌[Identification and Small Molecule Inhibition of an Activating Transcription Factor 4 (ATF4)-dependent Pathway to Age-related Skeletal Muscle Weakness and Atrophy, J Biol Chem. 2015 Oct 16; 290(42): 25497-25511]), GSK2606414 및 TRIB3을 포함한다. 다른 ATF4 저해제는 Ratan에 의한 발명의 명칭이 "ATF4 inhibitors and their use for neural protection, repair, regeneration, and plasticity"인 미국 특허 제9,034,299호; Ratan 및 Karuppagounder에 의한 발명의 명칭이 "Prolylhydroxylase/atf4 inhibitors and methods of use for treating neural cell injury or death and conditions resulting therefrom"에 의한 미국 특허 출원 공보 제20160317526호; 및 Axten 등에 의한 발명의 명칭이 "Chemical Compounds"인 PCT 국제 특허 출원 제WO2017212423호에 개시된 화합물을 포함한다. 이들 문헌은 각각 인용되어 본원에 포함된다.
ISR 노드 저해제는 ISR 노드의 유전자, 유전자 생성물, 또는 전사체에 결합하고 이의 활성, 발현 또는 번역을 차단하거나 감소시키는 핵산 분자를 추가로 포함한다. ISR 노드 저해제의 예는 siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)를 포함한다.
x. VEGF 및 VEGFR의 특이적 저해제
어구 "VEGF의 하위유형 또는 이소형 또는 VEGF 수용체의 하위형태 중 하나 이상의 발현, 유도, 활성 및/또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 조성물"은 비제한적으로 VEGF가 하나 이상의 VEGFR에 결합하는 것을 포함한 VEGF 활성을 중화시키거나, 차단하거나, 저해하거나, 제거하거나, 감소시키거나 간섭할 수 있는 임의의 VEGF 길항제를 포함하는 조성물을 지칭한다. 이러한 저해제 또는 길항제 중에는 VEGF 이소타입 A 내지 F의 에피토프에 대한 항-VEGF 항체나 항체 단편 또는 이의 VEGF-결합 단편, 인공 단일 사슬 항체 단편, 또는 VEGF 수용체를 모방하여 VEGF 이소타입에 결합하는 분자, 또는 수용체 신호전달을 간섭하는 약물이 있다. 예를 들어, VEGF 길항제는 비제한적으로, 항-VEGF 항체, VEGF-트랩, 항-VEGFR 항체, VEGFR 저해제, 탈리도마이드(thalidomide), DI 14-Notch 저해제, 항튜불린 혈관 붕해제(VDA: vascular disrupting agent), 안지오포이에틴-Tie2 저해제, 산화질소 신타제(NOS: nitric oxide synthase) 저해제, 또는 양이온성 폴리 아미노산 덴드리머일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "VEGF 트랩"은 VEGF에 우선적으로 결합하여 이로써 VEGF가 이의 동족 수용체에 결합하는 것을 저해함으로써 VEGF 신호전달 경로를 차단하는 유인 VEGF 수용체를 지칭한다. 일 구현예에서, VEGF 트랩은 제2 단백질에 융합된, VEGF 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인 또는 이러한 세포외 도메인의 부분을 포함하는 재조합 융합 단백질이다. 예를 들어, VEGF 수용체 세포외 도메인은 Fc 이소형, 예컨대 면역글로불린의 Fc 단편에 융합될 수 있다. 일 구현예에서, VEGF 트랩은 상표명 EYLEA® 약물(Regeneron)이며, 이는 인간 IgG1의 Fc 부분에 융합되고 유리체내 투여를 위한 등삼투성(iso-osmotic) 용액으로서 제형화되는 인간 VEGF 수용체 1 및 2 세포외 도메인의 부분으로 구성된 재조합 융합 단백질이다. 또 다른 구현예에서, VEGF 트랩은 OPT-302(Opthea; 문헌[Dugel, Pravin U. et al., Phase 1 Study of OPT-302 Inhibition of Vascular Endothelial Growth Factors C and D for Neovascular Age-Related Macular Degeneration Ophthalmology Retina, DOI:　https://doi.org/10.1016/j.oret.2019.10.008]), 즉, 인간 면역글로불린 G1(IgG1)의 Fc 단편에 융합된 VEGFR-3의 세포외 도메인의 면역글로불린-유사 도메인 1 내지 3을 포함하는 융합 단백질이다. 더욱 다른 트랩은 다른 수용체 도메인 및 다른 Fc 이소형을 포함한다.
특정한 구현예에서, VEGF 저해제의 구체적인 예는 비제한적으로, 라파마이신(rapamycin), 에베롤리무스(everolimus), 템세롤리무스(temserolimus), 저분자량 헤파린, SPARC(오스테오넥틴(osteonectin)) 펩타이드, 베바시주맙(bevacizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 라무시루맙(ramucirumab), 아플리베르셉트(aflibercept), 인터류킨 17(IL-17), DC101, 수니티닙(sunitinib), 소라페닙(sorafenib), 파조파닙(pazopanib), AMG706, 세디라닙(cediranib), 반데타닙(vandetanib), 바르가테프(vargatef), 브리바닙(brivanib), XL-184, 악시티닙(axitinib), 티보자닙(tivozanib), 탈리도마이드, 라날리도마이드(lanalidomide), DMXAA, 나드로파린(nadroparin), 2,5-디메틸-셀레콕시브, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), HBC 및 타스퀴니모드(tasquinimod)를 포함한다.
특정한 구현예에서, VEGF 저해제 또는 길항제는 라니비주맙(Lucentis®), 베바시주맙(Avastin®), 아플리베르셉트(Eylea®), 브롤루시주맙(brolucizumab)(Boevu®), 페갑타닙(pegaptanib)(Macugen®), 아비시파르 페골(Abicipar pegol)(예를 들어 문헌[Moisseiev, E., Loewenstein, A. Abicipar pegol-a novel anti-VEGF therapy with a long duration of action. Eye (2019). https://doi.org/10.1038/s41433-019-0584-y] 참조), 라니비주맙 바이오시밀러 FYB201(Bioeq GMBH, 독일 뮌헨 소재), PF582(Pfenex Inc.), SB11(Samsung Bioepis Co. Ltd) 및 엑스루칸(Xlucane)(Xbrane Biopharma), 아플리베르셉트 바이오시밀러 MYL-1701P/M-710(Momenta Pharmaceuticals,　Inc.) 또는 콘베르셉트(conbercept)(문헌[Liu K, et al; PHOENIX study group. Conbercept for treatment of neovascular age-related macular degeneration: Results of the Randomized phase 3 PHOENIX study. Am J Ophthalmol. 2019;197:156-167]); 파리시맙(faricimab)/RG7716(문헌[Mojunder, MI et al, The Mechanism of the Bispecific Antibody Faricimab Retinal Physician, Volume: 16, March 2019, 32-35]), OPT-302(상기 인용된 Dugel 참조), KS-301(Kodiak Sciences; 문헌[Wykoff CC. Extended durability in exudative retinal diseases using the novel intravitreal anti-VEGF antibody biopolymer conjugate KSI-301: Results from the Phase 1b study in patients with AMD, DME and RVO. Presented at American Academy of Ophthalmology Subspecialty Day Retina 2019; October 11, 2019]; 미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재), KS-501(Kodiak Sciences; 예를 들어 https://www.prnewswire.com/news-releases/kodiak-sciences-announces-emerging-durability-data-from-ongoing-phase-1b-study-of-ksi-301-in-wet-amd-patients-at-the-retina-society-annual-meeting-300918262 참조)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 병용에 유용한 VEGF 길항제는 라니비주맙(상표명 Lucentis®(Genentech, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재) 하에 상업적으로 입수 가능함; 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열에 대해 미국 특허 제7,060,269호의 도 1 참조), 베바시주맙(상표명 Avastin®(Genentech, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재) 하에 상업적으로 입수 가능함; 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열에 대해 미국 특허 제6,054,297호의 도 1 참조), 아플리베르셉트(상표명 Eylea®(Regeneron, 미국 뉴욕주 태리타운 소재) 하에 상업적으로 입수 가능함), KH902 VEGF 수용체-Fc 융합 단백질(문헌[Zhang et al. (2008) Mol Vis. 14:37-49] 참조), 2C3 항체(미국 특허 제6,342,221호, 컬럼 8, 라인 48-67, 컬럼 9, 라인 1-21 참조), ORA102(Ora Bio, Ltd.로부터 입수 가능함), 페갑타닙(예를 들어 페갑타닙 소듐; 상표명 Macugen®(Valeant Pharmaceuticals, 미국 뉴욕주 브릿지워터 소재; 미국 특허 제6,051,698호의 도 1 참조) 하에 상업적으로 입수 가능함), 베바시라닙(bevasiranib)(문헌[Dejneka et al. (2008) Mol Vis. 14:997-1005] 참조), SIRNA-027(문헌[Shen et al. (2006) Gene Ther. 13:225-34] 참조), 데커신(decursin)(미국 특허 제6,525,089호(컬럼 3, 라인 5-16) 참조), 데커시놀(decursinol)(문헌[Ahn et al. (1997) Planta Med. 63:360-1] 참조), 피크로포도필린(picropodophyllin)(문헌[Economou (2008) Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49:2620-6] 참조), 구굴스테론(guggulsterone)(문헌[Kim et al. (2008) Oncol. Rep. 20:1321-7] 참조), PLG101(문헌[Ahmadi and Lim (2008) Expert Opin Pharmacother. 9:3045-52] 참조), PLG201(Ahmadi and Lim (2008) 참조), 에이코사노이드 LXA4(eicosanoid LXA4)(문헌[Baker et al (2009) J Immun. 182:3819-26] 참조), PTK787(상표명 Vitalanib™ 하에 상업적으로 입수 가능함; 문헌[Barakat and Kaiser (2009) Expert Opin Investig Drugs 18:637-46] 참조), 파조파닙(pazopanib)(문헌[Takahashi et al. (2009) Arch Ophthalmol. 127:494-9] 참조), 악시티닙(axitinib)(문헌[Hu-Lowe et al. (2008) Clin Cancer Res. 14:7272-83] 참조), CDDO-Me(문헌[Sogno et al. (2009) Recent Results Cancer Res. 181:209-12] 참조), CDDO-Imm(Sogno et al. (2009) 참조), 쉬코닌(shikonin)(문헌[Hisa et al. (1998) Anticancer Res. 18:783-90] 참조), 베타-하이드록시이소발레릴쉬코닌(Hisa et al. (1998) 참조), 강글리오사이드 GM3(문헌[Chung et al. (2009) Glycobio. 19:229-39] 참조), DC101 항체(미국 특허 제6,448,077호, 컬럼 2, 라인 61-65 참조), Mab25 항체(미국 특허 제6,448,077호, 컬럼 2, 라인 61-65 참조), Mab73 항체(미국 특허 제6,448,077호, 컬럼 2, 라인 61-65 참조), 4A5 항체(미국 특허 제6,383,484호, 컬럼 12, 라인 50-54 참조), 4E10 항체(미국 특허 제6,383,484호, 컬럼 10, 라인 66-67, 컬럼 11, 라인 1-2 참조), 5F12 항체(미국 특허 제6,383,484호, 컬럼 10, 라인 62-65 참조), VA01 항체(미국 특허 제5,730,977호, 컬럼 6, 라인 26-30 참조), BL2 항체(미국 특허 제5,730,977호, 컬럼 6, 라인 30-32 참조), VEGF-관련 단백질(미국 특허 제6,451,764호, 도 1 참조), sFLT01(문헌[Pechan et al. (2009) Gene Ther. 16:10-6] 참조), sFLT02(Pechan et al. (2009) 참조), 펩타이드 B3(문헌[Lacal et al. (2008) Eur J Cancer 44:1914-21] 참조), TG100801(문헌[Palanki et al. (2008) J Med Chem. 51:1546-59] 참조), 소라페닙(sorafenib)(상표명 Nexavar.TM. 하에 상업적으로 입수 가능함; 문헌[Kernt et al. (2008) Acta Ophthalmol. 86:456-8] 참조), G6-31 항체(문헌[Crawford et al. (2009) Cancer Cell 15:21-34] 참조), ESBA1008(미국 특허 제8,349,322호 참조), 티보자닙(tivozanib)(그 전체 내용이 인용되어 본원에 포함된 미국 특허 제6,821,987호; 문헌[Campas et al. (2009) Drugs Fut 2009, 34(10): 793] 참조), 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 전구약물을 포함하여 미국 특허 공보 제US20190381087호에 기재된 것으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, VEGF 길항제는 상기 인용되고 모두 인용되어 포함된 참조문헌에 기재된 바와 같이 에피토프 VEGF-A 또는 VEGF-B 또는 이러한 에피토프의 임의의 부분에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 일 구현예에서, VEGF 길항제는 VEGF의 에피토프 중 하나 이상에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 또 다른 구현예에서, VEGF 길항제는 VEGF의 에피토프, 예컨대 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 또는 VEGF-E의 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, VEGF 길항제는 VEGF와 VEGFR의 결합이 저해되도록 VEGF의 에피토프에 결합한다. 일 구현예에서, 에피토프는 표시되는 VEGF의 3차원 구조의 구성요소를 포괄하며, 따라서 에피토프는 접혀진 VEGF 분자의 표면 상에 노출된다. 일 구현예에서, 에피토프는 VEGF로부터의 선형 아미노산 서열이다.
일부 구현예에서, VEGF에 대한 저해성 항체는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 제6,524,583호, 제6,451,764호(VRP 항체), 미국 특허 제6,448,077호, 제6,416,758호, 제6,403,088호(VEGF-C까지), 미국 특허 제6,383,484호(VEGF-D까지), 미국 특허 제6,342,221호(항-VEGF 항체), 미국 특허 제6,342,219호, 제6,331,301호(VEGF-B 항체) 및 미국 특허 제5,730,977호 및 PCT 공보 제WO96/30046호, 제WO 97/44453호 및 제WO 98/45331호에 기재된 것을 포함하며, 이의 내용은 그 전체 내용이 인용되어 본원에 포함된다.
다른 비(非)항체 VEGF 길항제는 VEGF 길항제 활성을 갖는 항체 모방체(mimetic)(예를 들어 Affibody® 분자, 아필린(affilin), 아피틴(affitin), 안티칼린(anticalin), 아비머(avimer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩타이드, 및 모노바디(monobody))를 포함한다. 이는 VEGF-A에 결합하고 VEGFR-2에의 VEGF-A의 결합을 방지하는 안키린(ankyrin) 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 포함한다. 일례는 AGN 150998(DARPin®)로도 알려진 MP0112이다. 더욱 다른 구현예에서, VEGF-A에 결합하고 VEGFR-2에의 VEGF-A의 결합을 방지하는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질은 제WO2010/060748호 및 제WO2011/135067호에 더 상세히 기재된 바와 같이 유용하다. 더욱 또 다른 구현예에서, VEGF 길항제 활성을 갖는 특이적인 항체 모방체는 40 kD 페길화된(pegylated) 안티칼린(anticalin) PRS-050 및 모노바디 안지오셉트(angiocept)(CT-322)이다.
전술한 비항체 VEGF 길항제는 이의 약물동력학적 특성 또는 생체이용률을 추가로 향상시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 비항체 VEGF 길항제는 이의 생체내 반감기를 연장시키도록 화학적으로 변형(예를 들어 페길화)될 수 있다. 대안적으로 또는 이에 더하여, 이는 VEGF 길항제가 유래된 천연 단백질의 단백질 서열에 천연적으로 존재하지 않는 추가의 글리코실화 부위의 첨가 또는 글리코실화에 의해 변형될 수 있다. 현재 전임상 발달에서의 또 다른 비항체 VEGF 길항제 면역어드헤신(immunoadhesin)은 VEGFR2/KDR로부터의 세포외 리간드-결합 도메인 3 및 4, 및 VEGFR1/Flt-1로부터의 도메인 2를 함유하는 VEGF-트랩과 유사한 재조합 인간 가용성 VEGF 수용체 융합 단백질이며; 이들 도메인은 인간 IgG Fc 단백질 단편에 융합된다(문헌[Li et al., 2011 Molecular Vision 17:797-803]). 이러한 길항제는 이소형 VEGF-A, VEGF-B 및 VEGF-C에 결합한다. 분자는 2개의 상이한 생성 과정을 사용하여 제조되어, 최종 단백질 상에 상이한 글리코실화 패턴을 초래한다. 2개의 글리코폼(glycoform)은 KH902(콘베르셉트) 및 KH906으로 지칭된다. 융합 단백질은 이량체로서 존재할 수 있다. 이러한 융합 단백질 및 관련 분자는 미국 특허 공보 제US2010/0215655호에서 추가로 특징화된다. 적합한 VEGF 또는 VEGFr 저해제 또는 길항제의 개시내용에 대한 상기 모든 참조문헌은 인용되어 본원에 포함된다.
xi. IL-6의 특이적 저해제
인터류킨 6(IL-6)은 B 세포 자극 인자 2(BSF2) 또는 인터페론 β2라고도 하는 사이토카인이다. IL-6은 B 림프구 시리즈의 세포의 활성화에 관여하는 분화 인자 및 다양한 세포의 기능에 영향을 미치는 다작용성 사이토카인이다. 다양한 IL-6 저해제는 당업계에 알려져 있고, 비제한적으로 MH166, SK2, MR16-1, PM-1 항체, AUK12-20 항체, AUK64-7 항체, AUK146-15 항체 및 토실리주맙(tocilizumab)을 포함한 IL6 수용체 항체를 포함한다. 항-IL-6 항체, 항-IL-6 수용체 항체, 항-gp130 항체, IL-6 변이체, 가용성 IL-6 수용체 변이체, 및 IL-6 또는 IL-6 수용체의 부분 펩타이드 및 유사한 활성을 보여주는 저분자량 화합물을 포함한 IL-6 저해제의 투여에 의해 맥락막 혈관신생을 치료하는 방법은 제US8771686B2호에 기재되어 있으며, 이는 인용되어 본원에 포함된다.
H. 유효량, 경로 및 관련 정의
화합물 또는 약학적 조성물의 "치료적 유효량"은 특정 장애 또는 질환의 증상을 예방하거나, 저해하거나, 치료하거나 약화시키기에 효과적인 양을 지칭한다. 예를 들어, "치료적 유효량"은 안구 장애를 갖는 치료받는 대상체의 눈에서 비정상적인 혈관화 또는 부종을 감소시키기에 충분한 양을 지칭할 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체"는 비제한적으로, 본 발명의 활성제와 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트, 부형제, 보조제 또는 비히클을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 동물, 더욱 특히 인간에 사용하기 위한 약전에 나열된 것이고, 물 및 땅콩 기름, 대두유, 광유, 참기름 등과 같은 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것을 포함하는 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물 또는 수성 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 바람직하게는 특히 주사 가능한 용액을 위한 담체로서 이용된다. 적합한 약학적 담체는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, PA)]; 문헌[Gennaro, A. R., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Lippincott, Williams and Wilkins)]; 문헌[Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y.]; 및 문헌[Kibbe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association, Washington]에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 대상체에게 유익성을 부여하는 데 사용되는, 즉, 안구 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 양태를 완화시키거나, 개시를 지연시키거나, 중증도 또는 발생률을 감소시키거나, 예방을 산출할 수 있는 데 사용되는 임의의 방법을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 치료는 증상의 개시 전, 동안 및/또는 후에 투여될 수 있다. 특정한 구현예에서, 치료는 대상체가 종래의 치료법을 받은 후에 일어난다. 일부 구현예에서, 용어 "치료하는"은 병태의 진행을 제거하거나, 실질적으로 저해하거나, 느리게 하거나 역전시키는 것, 병태의 임상적 또는 미적 증상을 실질적으로 개선하는 것, 또는 병태의 임상적 또는 미적 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것, 또는 질환으로 인한 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 빈도를 저하시키는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "예방하다"는, 대상체가 병태를 발증시킬 가능성의 저하를 초래하는, 병태를 발증시킬 위험에 있는 대상체의 예방적 치료를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료 요법"은 하나 이상의 치료제의 투여의 특정 순서, 시기, 연속기간, 경로 및 투여 사이의 간격을 지칭한다. 일 구현예에서, 치료 요법은 대상체-특이적이다. 또 다른 구현예에서, 치료 요법은 질환 특이적이다. 또 다른 구현예에서, 치료 요법은 대상체가 치료법에 반응함에 따라 변한다. 또 다른 구현예에서, 치료 요법은 특정한 치료 이정표(therapeutic milestone)가 충족될 때까지 고정된다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에서 병리학적 혈관신생을 저해하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 대상체의 망막에서 IDVC를 제거하거나 저해하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 ISR 노드의 발현, 유도, 활성 및/또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 조성물의 투여를 포함한다. 일 구현예에서, ISR 노드는 GCN2, CHOP 및 ATF4로부터 선택된다.
더욱 다른 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 ISR 노드의 발현, 유도, 활성 및/또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 조성물; 및 VEGF의 하위유형 또는 이소형 또는 VEGFR의 하위유형 또는 이소형 중 하나 이상의 발현, 유도, 활성 및/또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 조성물의 조합을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 치료 요법은 투여되는 조성물의 하나 이상의 용량을 포함한다.
본원에 사용된 "치료 효과" 또는 "치료 유익성"이란, 질환 시스템의 중증도의 향상 또는 축소(diminution)를 의미한다. "유효량"이란, 투여의 적합한 경과 후 치료 유익성 또는 치료 효과를 제공하기에 충분한 조성물의 양을 의미한다.
적어도 하나의 IDO 저해제, VEGF 또는 VEGFR 저해제, 또는 ISR 노드 저해제(예를 들어 GCN2, CHOP 또는 ATF4)를 포함하는 조성물에 대한 "유효량"은 방법에 사용하기 위해 선택되는 저해제/길항제에 따라 다양할 것임을 이해해야 한다. 용량에 관하여, "저분자" 약물은 전형적으로 mg/kg 기준보다는 고정된 투여량으로 투여됨을 이해해야 한다. 주사용으로 의사 또는 간호사가 바이알에서 주사기에 이 양을 채워서 계산된 양을 주사할 수 있다. 대조적으로, 정제 및 일부 생물제제는 고정 투여 형태로 제공된다. 저분자를 이용한 일부 용량 범위 연구는 mg/kg을 사용하지만, 본 명세서의 교시에 기초하여 당업자에 의해 다른 용량이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물의 저해제에 대한 유효량은 비제한적으로 약 0.001 내지 약 25 mg/kg 대상체 체중을 포함한다. 일 구현예에서, 유효량의 범위는 0.001 내지 0.01 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 0.001 내지 0.1 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 0.001 내지 1 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 0.001 내지 10 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 0.001 내지 20 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 0.01 내지 25 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 0.01 내지 0.1 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 0.01 내지 1 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 0.01 내지 10 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 0.01 내지 20 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 0.1 내지 25 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 0.1 내지 1 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 0.1 내지 10 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 0.1 내지 20 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 1 내지 25 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 1 내지 5 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 1 내지 10 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 10 내지 20 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 20 내지 30 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 30 내지 40 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 40 내지 50 mg/kg 체중이다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 범위는 1 내지 50 mg/kg 체중이다. 이들 범위 내에 속하는 더욱 다른 용량이 유용한 것으로 예상된다.
VEGF의 하위유형 또는 이소형 또는 VEGFR의 하위유형 또는 이소형 중 하나 이상의 발현, 유도, 활성 및/또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 조성물에 대한 "유효량"은 조성물이 VEGF 또는 VEGFR 저해제 중 적어도 하나를 포함하고 치료 효과를 달성하기에 적합한 양으로 대상체에게 투여될 때 달성된다. 이들 양은 선택된 특이적 저해제 및 투여 경로에 기초하여 상이할 수 있다. 적어도 하나의 VEGF 또는 VEGFR 길항제 또는 차단제를 포함하는 조성물에 대한 "유효량"은 방법에 사용하기 위해 선택된 저해제/길항제에 따라 다양할 수 있다. VEGF 저해제가 저분자인 경우, 이는 상기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 ISR 노드 저해제(예를 들어 GCN2, CHOP 또는 ATF4) 저해제를 포함하는 조성물에 대해 상기 기재된 바와 동일한 용량으로 전달될 수 있다. VEGF 길항제가 단백질, 예를 들어 항체, 항체 단편 또는 재조합 단백질 또는 펩타이드인 경우, 유효량은 VEGF 단독치료법에 대해 승인된 것과 유사할 수 있으며, 즉, 0.01 내지 25 mg 항체/주사일 수 있다. 일 구현예에서, 유효량은 0.01 내지 10 mg 항체/주사이다. 또 다른 구현예에서, 유효량은 0.01 내지 1 mg 항체/주사일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 유효량은 0.01 내지 0.10 mg 항체/주사이다. 또 다른 구현예에서, 유효량은 0.2, 0.5, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3.0 mg 항체/주사 이상까지이다. 이들 범위 내에 속하는 더욱 다른 용량이 유용한 것으로 예상된다.
일 구현예에서, 특정 환자에게 투여하기에 적합한 조성물의 용량 및 투여 요법은 환자의 연령, 성별, 체중, 일반적인 의학적 조건, 및 조성물이 함께 투여되기 위한 특정 병태 및 이의 중증도를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 의사는 또한 제제의 투여 경로, 제제(들)가 조합될 수 있는 약학적 담체, 및 제제의 생물학적 활성을 고려할 수 있다.
"투여" 또는 "투여 경로"는 선택된 저해제 또는 조성물에 적합하고 유효량을 대상체에게 전달할 수 있는 임의의 알려진 투여 경로를 포함한다. 본원에 기재된 방법의 일 구현예에서, 조성물의 투여 경로는 동일하다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 서로 상이한 경로에 의해 투여된다. 본 발명의 방법에 유용한 투여 경로는 데폿 제형 또는 장치를 통한, 점안액을 통한, 흡입에 의한 경구, 비경구, 정맥내, 비강내, 설하, 안구내 주사, 유리체내 주사 중 하나 이상을 포함한다. 일 구현예에서, 저해제는 경구 투여되거나, 잠재적으로는 또 다른 저해제와 동시에 유리체내 투여되거나, 잠재적으로는 동일한 장치(주사기 또는 데폿 장치)에서 또 다른 저해제 치료제와 조합되어 투여되거나, 점안액을 통해, 비강내 또는 설하로 투여될 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다", "포함한다" 및 "포함하는"은 배타적이 아니라 포괄적으로 해석되어야 한다. 단어 "구성되다", "구성되는" 및 이의 변화형은 포괄적이 아니라 배타적으로 해석되어야 한다. 명세서의 다양한 구현예는 "포함하는" 언어를 사용하여 제시되지만, 다양한 상황에서 관련 구현예는 또한 "구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는" 언어를 사용하여 설명됨을 이해해야 한다.
용어 단수형("a" 또는 "an")은 하나 이상을 지칭하며, 예를 들어 "바이오마커"는 하나 이상의 바이오마커를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 단수형("a"(또는 "an")), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "약"은 달리 명시되지 않는 한 주어진 참조로부터의 10%의 가변성을 의미한다.
II. 약학적 조제물
본원에 기재된 조성물은 적어도 하나의 담체(예를 들어 약학적으로 허용 가능한 담체)를 포함하는 단일 조성물에 함유될 수 있다. 대안적으로, 제제는 적어도 하나의 담체를 포함하는 별도로 투여(예를 들어 별도의 조성물로 투여)될 수 있다. 조성물을 포함하는 약학적 조제물은 편리하게는 물, 완충 식염수, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 디메틸 설폭사이드(DMSO), 오일, 세제, 현탁제 또는 이의 적합한 혼합물과 같은 허용 가능한 매질과 함께 투여용으로 제형화될 수 있다. 선택된 매질 내 제제의 농도는 다양해질 수 있고, 매질은 약학적 조제물의 원하는 투여 경로에 기초하여 선택될 수 있다. 임의의 종래의 매질 또는 제제가, 투여될 저해제 또는 조성물과 상용 불가능하지 않는 한, 약학적 조제물에서의 이의 용도가 고려된다.
특정 구현예에서, 하나 초과의 조성물이 투여되는 경우, 조성물은 순차적으로 그리고/또는 병행하여 투여될 수 있다. 예를 들어, ISR 노드 저해제를 함유하는 조성물은 항-VEGF 저해제 또는 길항제를 함유하는 조성물 전에, 후에 및/또는 동시에 투여될 수 있다. 조성물이 동시에 투여되지 않는 경우, 조성물은 2개 이상의 조성물이 상승적으로, 부가적으로 또는 대상체에서 치료 유익성을 달성하는 방식으로 작용할 수 있도록 충분히 가까운 시간에 투여되어야 한다.
적합한 약학적 조제물의 선택은 선택된 투여 방법에 의존한다. 예를 들어, 조성물(들)은 눈 또는 눈의 특정 조직으로의 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. 이러한 경우, 약학적 조제물은 안구 전달과 상용적인 매질에 분산된 제제(들)를 포함한다. 제제는 또한 혈류 내로의 정맥내 주사에 의해 또는 피하, 근육내 또는 복강내 주사에 의해 비경구 투여될 수 있다. 비경구 주사를 위한 약학적 조제물은 당업계에 알려져 있다. 항체를 투여하는 방법으로서 비경구 주사가 선택된다면, 생물학적 효과를 발휘하기 위해 충분한 양의 분자가 이의 표적 세포에 도달하는 것을 보장하기 위한 단계가 취해져야 한다. 제제, 또는 제제가 전달되는 약학적 조제물의 친유성은 분자가 이의 표적 위치에 더 잘 도달할 수 있도록 증가될 수 있다.
약학적 담체와 밀접하게 혼합된 활성 성분으로서 본원에 기재된 저해제/길항제를 함유하는 약학적 조성물은 종래의 약학적 화합 기술에 따라 제조될 수 있다. 담체는 투여하고자 하는 조제물의 형태에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 제제를 경구 투여 형태로 제조할 때, 예를 들어 경구 액체 조제물(예를 들어 현탁액, 엘릭서 및 용액)의 경우 물, 글리콜, 오일, 알코올, 풍미제, 보존제, 착색제 등; 또는 경구 고체 조제물(예를 들어 분말, 캡슐 및 정제)의 경우 전분, 당, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등과 같은 담체와 같은 임의의 통상의 약학적 매질이 이용될 수 있다. 투여가 용이하기 때문에, 정제 및 캡슐은 고체 약학적 담체가 분명히 이용되는 경우 가장 유리한 경구 투여 단위 형태를 나타낸다. 원한다면, 정제는 표준 기술에 의해 당-코팅되거나 장용-코팅될 수 있다. 비경구 조성물의 경우, 담체는 통상 멸균수를 포함할 것이지만, 예를 들어 용해도를 돕기 위해 또는 보존 목적을 위해 다른 성분이 포함될 수 있다. 주사 가능한 현탁액이 또한 제조될 수 있으며, 이 경우 적절한 액체 담체, 현탁제 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조제물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제형화될 수 있다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 치료를 받는 환자에게 적절한 약학적 조제물의 물리적으로 별개의 단위를 지칭한다. 각각의 투여량은 선택된 약학적 담체와 관련하여 원하는 효과를 발휘하도록 계산된 활성 성분의 양을 포함해야 한다. 적절한 투여 단위를 결정하기 위한 절차는 당업자에게 잘 알려져 있다. 투여 단위는 환자의 체중에 기초하여 비례적으로 증가되거나 저하될 수 있다. 특정 병리학적 증상의 완화를 위한 적절한 농도는 당업계에 알려진 바와 같이 투여량 농도 곡선 계산에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물의 투여에 적절한 투여 단위는 동물 모델에서 활성 치료 저해제의 독성을 평가함으로써 결정될 수 있다. 조합된 것을 포함하여 전술한 다양한 농도의 저해제가 안질환(예컨대 산소-유도 망막병증(OIR))의 마우스 모델에 투여될 수 있으며, 최소 및 최대 투여량은 치료 결과로서 혈관화 또는 부종의 유의한 감소 및 부작용의 결과에 기초하여 결정될 수 있다. 적절한 투여 단위는 또한 안구 장애의 치료를 위한 다른 표준 약물과 병용된 저해제 조성물의 효능을 평가함으로써 결정될 수 있다. 저해제의 투여 단위는 개별적으로 또는 선택된 증상에 대한 각각의 안구 치료와 병용되어 결정될 수 있다.
본 발명의 조합된 저해제를 포함하는 조성물은 적절한 간격으로, 예를 들어 병리학적 증상이 감소되거나 완화될 때까지 하루에 적어도 2회 이상 투여될 수 있으며, 그 후에 투여량은 유지 수준으로 감소될 수 있다. 특정한 경우 적절한 간격은 일반적으로 환자의 병태에 따라 다를 것이다.
III. 특정 방법 및 조성물
본원에 제공된 방법은 안질환과 관련된 병리학적 혈관신생에 있어서 본 발명자들의 IDVC의 식별 및 이의 역할에 관한 것이다. 일 구현예에서, 대상체에서 망막병증을 치료하거나 병리학적 혈관신생을 저해하는 방법이 본원에 제공되며, 대상체의 눈에서 IDO-의존성 혈관화 세포(IDVC)의 활성을 제거하거나 저해하는 단계를 포함한다. IDVC는 혈관신생에서 역할을 하는 것으로 기능적으로 특징지어지며, 이의 확립 및 유지는 IDVC 내에서 IDO1의 유도를 필요로 한다.
일 구현예에서, IDVC는 IDO1의 활성을 저해함으로써 저해된다. IDO1 저해제는 본원에 기재된다.
또 다른 구현예에서, IDVC는 이러한 IDVC의 세포-표면 마커에 관한 항체를 통해 저해된다. 일 구현예에서, 항체는 ADC 또는 항체-약물 접합체이다. 세포 표면 마커는 IDVC를 또 다른 비표적화된 세포 집단으로부터 구별하는 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 일 구현예에서, 세포 표면 마커는 CD33, CD11b, CD15 및 CD66으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 방법은 눈의 조직(예를 들어 망막 또는 맥락막) 내 IDVC 세포에서 통합 스트레스 반응(ISR)을 차단하거나 저해하는 단계를 포함한다. 발명자들은 OIR 마우스 모델에서 GCN2, CHOP 및 ATF4와 같은 핵심 ISR 노드의 저해가 혈관신생을 감소시켰음을 보여주었다. 그러므로, 일 구현예에서, 방법은 ISR 경로 노드의 발현, 유도, 활성 및/또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계를 포함한다. ISR 경로 노드의 저해제는 상기 ISR 경로 노드의 번역 또는 전사를 저해하는 저분자, 생물학적 분자 및 핵산 분자를 포함한다. 이들 분자는 당업계에 알려진 것, 또는 발견될 것일 수 있다. 비제한적인 예는 본원에 기재되어 있다.
일 구현예에서, 방법은 GCN2의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 ATF4의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 CHOP의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 방법은 IL-6을 차단하거나 저해하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 유효량의 GCN2-IN-1(A-92)을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 유효량의 GCN2iA를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 유효량의 GZD824를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 유효량의 트리아졸로[4,5-d]피리미딘 스캐폴드에 기초한 저해제, 예컨대 Lough 등(문헌[Triazolo[4,5-d]pyrimidines as Validated General Control Nonderepressible 2 (GCN2) Protein Kinase Inhibitors Reduce Growth of Leukemia Cells, Volume 16, September 2018, Pages 350-360])에 의해 기재된 것을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 방법은 유효량의 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 Klar 등에 의해 기재된 것을 투여하는 단계를 포함한다(문헌[Abstract 3275: Inhibition of ER-stress factor C/EBP homologous protein (Chop) with LNAplus™ antisense-oligonucleotides to improve immunotherapy of cancer, DOI: 10.1158/1538-7445.AM2019-3275 Published July 2019]). 또 다른 구현예에서, 방법은 유효량의 ISRIB를 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 방법은 유효량의 우르솔릭산을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 유효량의 토마티딘을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 유효량의 GSK2606414를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 유효량의 TRIB3을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 망막병증을 치료하거나 병리학적 혈관신생을 저해하는 방법이 제공된다. 방법은 통합 스트레스 반응의 신호전달 분자 다운스트림을 차단하거나 저해하는 단계를 포함한다. ISR의 특정한 신호전달 분자 다운스트림은 알려져 있고, 사이토카인 IL-6을 포함한다.
언급된 방법의 또 다른 구현예는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 임의의 형태의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, VEGF 저해제는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 라니비주맙(Lucentis®), 베바시주맙(Avastin®), 아플리베르셉트(Eylea®), 브롤루시주맙(Boevu®), 페갑타닙(Macugen®), 아비시파르 페골, 라니비주맙 바이오시밀러 FYB201, PF582, SB11 및 엑스루칸, 아플리베르셉트 바이오시밀러 MYL-1701P/M-710, 또는 콘베르셉트, 파리시맙/RG7716(이중특이적 항체 VEGF-A + Ang-2), OPT-302(VEGF-C/D '트랩'), KS301(Kodiak Sciences - 항-VEGF 중합체 접합 생물제제), KS501(Kodiak Sciences - 항-VEGF 트랩 플러스 항-IL6 항체 융합).
언급된 방법의 또 다른 구현예는 인돌아민 2,3 디옥시게나제-1(IDO1)의 임의의 형태의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, IDO-1의 차단제 또는 저해제는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 1-메틸-D-트립토판(인독시모드), 1-메틸-L-트립토판, 1-메틸-D-트립토판과 1-메틸-L-트립토판의 라세미 혼합물, 에파카도스타트, 나복시모드(GDC-0919), 및 NLG802, 또는 이의 염, 거울상이성질체 또는 전구약물; 1-R-D-트립토판 또는 1-R-L-트립토판, 여기서 R은 C1-C12 알킬임; 메틸티오히단토인-DL-트립토판(MTH-Trp), β-(3-β)-DL-알라닌, β-(3-벤조(b)티에닐)-DL-알라닌, 6-니트로-L-트립토판, 인돌 3-카르비놀, 3,3'-디인돌릴메탄, 에피갈로카테킨 갈레이트, 5-Br-4-Cl-인독실 1,3-디아세테이트, 9-비닐카르바졸, 아세메타신, 5-브로모-DL-트립토판, 5-브로모인독실 디아세테이트, 나프토퀴논-기초, S-알릴-브라씨닌, S-벤질-브라씨닌, 5-브로모-브라씨닌, 페닐이미다졸-기초, 4-페닐이미다졸, 엑시구아민 A 및 NSC401366; 또는 BMS-986205/ONO-7701, PF-06840003/ EOS200271, MK-7162/IOM2983, LY3381916, KHK2455, HTI-1090/SHR9146, DN1406131, RG70099, Roxyl-WL, TPST-8844, 에틸 피루베이트, Amg-1 또는 DX-03-12, 또는 이의 염, 거울상이성질체 또는 전구약물 또는 임의의 치료적 유효 제형.
또 다른 구현예에서, ISR 경로-차단 약물은 GSK-2606414, RPT-GCN2i, AMG-PERK44 및 trans-ISRIB로부터 선택된다.
특정한 병용 치료법이 본원에 제공된다. 예를 들어 일 구현예에서, ISR 노드 저해제는 IL-6 저해제와 함께 투여된다. 또 다른 구현예에서, ISR 노드 저해제는 VEGF 저해제와 함께 투여된다. 이러한 병용 치료법 치료 방법에 따르면, 대상체는 하나 이상의 유리한 치료제 또는 치료 유익성을 받는다. 이들 중에는 단일 제제의 투여에 비해 증진되는 치료 효과 또는 치료 유익성이 있다. 또 다른 이점은 상승적인 치료 효과 또는 치료 유익성의 생성이다. 병용 치료법의 더욱 또 다른 유익성은 투여되는 조성물 중 하나 이상의 향상된 내약성(tolerability)이다.
특정한 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 조화(coordinated) 치료 요법으로 투여된다. 조성물에 포함되는 화합물(즉, 본원에 식별된 ISR 노드, IL-6, IDO, VEGF/VEGFR 등의 저해제)의 선택에 기초하여, 투여 경로는 동일할 수 있고/있거나 2개의 조성물은 단일 제형으로 투여될 수 있다. 특정한 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 순차적으로 투여된다. 특정한 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 동시에 투여된다. 특정한 구현예에서, 조성물의 투여 경로는 동일하다. 특정한 구현예에서, 조성물의 투여 경로는 상이하다. 특정한 구현예에서, 투여 경로는 경구 투여, 정맥내 주사, 비강내 투여, 설하 투여, 유리체내 주사, 안구내 주사, 데폿 제형 또는 장치를 통한 투여 또는 점안액을 통한 투여인 적어도 하나의 경로를 포함한다.
병용 요법의 또 다른 유익성은 저해제의 병용 투여가 단일 제제 사용에 대해 승인된 용량보다 낮은 투여량의 임의의 하나의 투여되는 저해제의 사용을 가능하게 한다는 것이다. 대안적으로, 저해제의 병용 투여는 단일 제제 사용에 대해 승인된 용량보다 낮은 2개 이상의 투여되는 저해제에 대한 투여량을 사용한다. 더욱 또 다른 유익성은 본원에 기재된 화합물의 공동투여가 단독으로 투여되는 임의의 하나의 조성물로 달성된 치료 효과 또는 치료 유익성의 연속시간을 증진시킨다는 것이다. 예를 들어 일 구현예에서, 병용 치료법은 VEGF 저해제 또는 길항제가 유일한 치료제로서 투여되는 것보다 적어도 5% 내지 적어도 20% 적은 빈도를 수반하는 치료 요법에서 VEGF 저해제 또는 길항제가 안구내 주사에 의해 투여되도록 한다. 또 다른 구현예에서, 병용 치료법은 VEGF 저해제 또는 길항제가 유일한 치료제로서 투여되는 것보다 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 최대 20% 이상 덜 빈번한 치료 요법에서 VEGF 저해제 또는 길항제가 안구내 주사에 의해 투여되도록 한다.
일 구현예에서, IDVC는 눈의 망막에 위치한다. 또 다른 구현예에서, IDVC는 눈의 맥락막에 위치한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 활성 치료용 저해제 또는 길항제가 망막에 침투하여 눈의 조직으로 분배되고 상기 대상체의 혈청 내 농도보다 큰 안구 농도를 달성하는 조성물의 사용을 제공한다.
상기 임의의 방법에서, 하나 이상의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 추가로 포함한다. 임의의 조성물에 대한 제형은 활성 저해제 또는 제제 및 투여 경로와 투여량의 선택에 따라 설계될 수 있다.
IV. 키트
본 발명은 또한 예를 들어, 원하는 치료 요법에 따른 투여를 위해 또는 치료적 유효량의 ISR 노드 저해제를 포함하는 약학적 조성물을 함유하는 하나 이상의 용기를 포함하는, 본원에 지칭된 안질환 또는 안구 장애의 치료 또는 예방에 유용한 약학적 키트를 포함한다. 이러한 키트는 원한다면, 예를 들어 당업자가 쉽게 알 만한 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부가적인 용기 등과 같은 하나 이상의 다양한 종래의 약학적 키트 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 투여될 구성요소의 양, 투여에 대한 지침, 및/또는 구성요소의 혼합에 대한 지침을 나타내는 삽입물 또는 라벨로서의 설명서가 또한 키트에 포함될 수 있다.
이들 방법의 사용으로 인한 향상의 측정치는 시력의 평가, 망막액 및/또는 혈관 누수액(leakage)의 측정, 및 치료법의 투여로 인한 부작용의 감소에 의해 결정될 수 있다. 이들 효능 연구를 허용하는 구성요소가 또한 키트에 포함될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 다양한 구현예를 예시하기 위해 제공된다. 실시예는 본 발명을 어떠한 방식으로도 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1 - 재료 및 방법
유전자이식 마우스 계통. BALB/c 계통 배경의 유사유전자형(congenic) Ido1 무효접합형(nullizygous)(Ido1-/-) 마우스를 A. Mellor에 의해 제공받았다. BALB/c 계통 배경의 유사유전자형 Ifng 및 Il6 무효접합형 마우스 및 WT BALB/c 마우스를 Jackson Laboratory로부터 입수하였다. D. Ron(15)에 의해 129svev (Taconic) 계통 배경에서 확립된 Gcn2 무효접합형 마우스를 A. Mellor로부터 수득하였고, 인 하우스에서 10세대 동안 역교배하여 유사유전자형 BALB/c 계통을 수득하였다. 유전자이식 대립유전자와 야생형 대립유전자 사이를 구별하도록 설계된 특정 프라이머 세트를 사용하여 유전자형 분석을 수행하였으며(표 1 내지 3), 이들은 모두 예측된 밴딩 패턴을 산출하였다(도 8a).
[표 1]
[표 2]
[표 3]
Ido1-/- 계통 마우스에서 IDO1 단백질 발현의 결여는 이전에 확증되었다(9,16). 25 μg LPS의 비강 점적 후 24시간째에 폐 생검을 검정함으로써 Il6-/- 계통에서의 IL6 유도 및 Ifng-/- 계통에서의 IFN-γ 유도의 결여를 확인하였다(도 8b). 마우스를 수반하는 모든 연구는 랑케뉴 의료 연구소 IACUC(Lankenau Institute for Medical Research IACUC)에 의해 승인을 받았고, AAALAC 지침을 따른다.
4T1 종양 세포 전이. 약 8주령의 암컷 BALB/c 마우스의 유방 지방패드 내로 50 μl 무혈청 배지 중 1x104 세포를 주사함으로써 원발성 동소 4T1 마우스 암종 종양을 확립하였고, 이는 후속적으로 폐로 전이되었다. 폐를 15% 인디아 잉크 염료(1x PBS 및 1 방울의 암모늄 하이드록사이드로 재구성됨)로 팽창시킴으로써 폐 전이 부담을 시각화하고, 세척하고, Fekete 용액(40 ml의 빙초산, 32 ml의 (37%) 포르말린, 1 리터를 만들기 위해 ddH2O로 재구성되는 700 ml의 (100%) 에탄올 스톡)으로 표백시켰다. 면역조직화학 분석을 위해, 4T1 전이가 있는 폐를 50% OCT로 팽창시키고, OCT 블록에서 동결시키고, 뒤이어 CryoJane 테이프 전달 시스템을 사용하여 4 μm 절편을 만들었다. 항체 및 염색 시약은 표 4에 나열되어 있다.
[표 4]
토끼 항-Caveolin1 다중클론 항체를 이용한 면역형광 염색에 의해 폐 전이성 병변의 맥관구조 분석을 수행하였다. 40X 대물렌즈 및 1.0 옵토바(optovar)가 있는 Zeiss 도립 현미경에서 마우스 폐당 다수의 필드를 획득함으로써 전이성 결절 내의 혈관 밀도를 정량화하였다. 필드당 양성 CAV1 신호에 상응하는 픽셀 밀도를 Adobe Photoshop에서 결정한 다음, 이들 값을 평균하여 마우스당 전체 평균값을 결정하였다. 4T1 폐 전이 결절에서 단백질 발현을 조사하기 위해, 슬라이드를 40 μg/mL 염소 항-마우스 IgG-Fab(H+L)(Jackson ImmunoResearch), 뒤이어 10% 정상 염소 혈청(Jackson ImmunoResearch)에서 차단하고, α-IDO1(클론 4B7), α-CAV1, α-CD45(FITC 접합), α-Gr-1 또는 α-CD11b(비오티닐화) 항체로 면역염색하였다. 슬라이드를 세척하고, IDO1을 검출하기 위한 염소 항-마우스 2차 항체(Cy3 접합), CAV1을 검출하기 위한 염소 항-토끼 2차 항체(FITC 또는 Cy3 접합), Gr-1을 검출하기 위한 염소 항-래트(FITC 접합) 및 CD11b를 검출하기 위한 스트렙타비딘(Alexa 488 접합)과 함께 인큐베이션하였다. 후속적으로, DAPI(Life Technologies; Cat#P36935)을 이용한 Prolong Gold를 사용하여 슬라이드를 봉입(mount)하고, NIS 요소 AR 소프트웨어를 사용하는 60X 대물렌즈가 있는 공초점 현미경(Nikon Eclipse Ti) 하에 이미지로 만들었다.
산소-유도 망막병증. 혈관신생의 OIR 모델을 기재된 바와 같이 수행하였다(17). 신생 마우스를 산후 7일부터 12일까지(P7-P12) 75% 산소(OxyCycler)가 있는 챔버에 수용하였다. 신생 마우스를 P12에서 챔버로부터 꺼내어, 후속적으로 신생 마우스의 혈관신생이 최고 수준에 도달하는 시점인 5일(P17) 동안 정상 산소 조건 하에 유지시켰다. 망막 혈관신생의 정량화를 표 4에 나열된 항체 및 시약을 사용하여 이전에 보고된 바와 동일한 공초점 현미경 분석 방법(7)에 의해 수행하였다. 눈을 고정(4% 파라포름알데하이드 및 메탄올)시키고, 단리된 망막을 이소렉틴 B4-Alexa488로 염색하고, 평면 봉입하였다. 표시된 경우, 이소렉틴 B4-Alexa488 염색 후 망막에서 부가적인 IDO1 염색을 수행하였다. 망막을 40 μg/mL 염소 항-마우스 IgG-Fab(H+L)(Jackson ImmunoResearch), 뒤이어 10% 정상 염소 혈청(Jackson ImmunoResearch)에서 차단하였다. 항-마우스 IDO1, α-CD45α(FITC 접합) 및 α-Gr-1(FITC 접합)을 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 망막을 세척하고, 염소 항-마우스 2차 항체(Cy3 접합)와 함께 인큐베이션하여 IDO1을 검출한 다음, 평면 봉입하였다. NIS 요소 AR 소프트웨어를 사용하여 20x 대물렌즈에서 공초점 현미경(Nikon Eclipse Ti) 이미지를 만들었다.
유리체내 주사. OIR 연구에서 siRNA 및 항체 치료의 국소 전달을 유리체강내 주사에 의해 수행하였다. 주사하기 전에, 국소 마취제인 알카인(0.5% 프로파라카인 하이드로클로라이드 점안액)을 눈꺼풀에 도포하였다. 2.5 μl 유리 주사기에 부착된 33-게이지 바늘을 사용하여 PBS 중 1 μl siRNA 또는 항체와 함께 해부 현미경 하에 각막을 통해 유리체액 내로 눈에 주사하였다. siRNA(siGcn2, siAtf4, siChop 및 siAhr; 표 1 내지 3)의 경우, 표적 siRNA를 한쪽 눈에 주사하고 비표적 대조군 siRNA를 반대쪽 눈에 주사하여 P14에 단일 주사를 투여하였다. 항-Gr-1 항체(BioXCell)의 경우, 실험 항체를 한쪽 눈에 주사하고 이소타입 대조군 항체를 반대쪽 눈에 주사하여 P14에 단일 주사를 투여하였다. 모든 연구를 망막 혈관신생에 미치는 영향을 평가하기 위해 P17에서 종결하였고, 상기 기재된 바와 같이 공초점 현미경 분석에 의해 정량화하였다.
세포 배양. 4T1(마우스 유방 암종; ATCC Cat# CRL-2539) 및 U937(인간 조직구성 림프종; ATCC Cat# CRL-1593.2) 세포주를 페니실린, 스트렙토마이신, 10% FBS 및 55 μM β-머캅타에탄올이 보충된 DMEM에서 배양하였다. HL60(인간 전골수성 백혈병; ATCC Cat# CCL-240) 세포주를 10% FCS + 55 μM β-머캅타에탄올, 2 mM 글루타맥스(Life Technologies) 및 50 μg/ml 겐타마이신이 보충된 IMDM 배지에서 유지시켰다. 음성 IMPACT I 병원체 시험 결과(RADIL)를 마우스에서 사용하기 전에 4T1 세포주에 대해 수득하였다. U937 또는 HL60 세포주에 대해서는 어떠한 마이코플라스마 시험도 수행하지 않았다. 4T1 종양 생착 연구를 위해, 원래 스톡 바이알로부터의 세포를 확장하고, 즉시 동결시켰고, 각각의 실험을 동결에서 바로 꺼낸 세포로 수행하였다. 계대배양 6 이하 동안 유지된 U937 및 HL60 세포를 이용하여 시험관내 실험을 수행하였다. U937 및 HL60 세포(2x106)를 IDO1 저해제 에파카도스타트(1 μM + 0.01% DMSO; Chemietek Cat# CT-EPAC), 통합 스트레스 반응 저해제 ISRIB(1 μM + 0.01% DMSO; Sigma-Aldrich Cat# SML0843), AHR 저해제 BAY-218(1 μM + 0.01% DMSO; Selleckchem Cat# 2162982) 또는 0.01% DMSO 비히클 단독과 함께 IFNγ(100 ng/mL; ThermoFisher Scientific, Cat# PHC4031) 및 LPS(100 ng/mL; 이. 콜라이(E. coli) K-235; Cat# L2018)로 자극시켰다. 24시간째에 유전자 발현의 qPCR-기초 분석을 위해 처리된 세포로부터 mRNA를 준비하고, IDO1 효소 활성을 평가하기 위해 키누레닌 수준에 대해 세포 배양 배지를 분석하였다.
생존력 검정. U937 및 HL60 세포의 세포 생존력을 제조업체의 프로토콜에 따라 LDI Cell CountEZ TM 독성, 증식 및 생존(TPS) 분석 키트(LDI1201™)에 의해 측정하였다. 세포주를 둘 다 10% FBS가 포함된 100 μl DMEM 배지에서 96웰 플레이트의 10,000개 세포/웰의 밀도로 평판배양하였다. 검정군은 유전자 발현 분석에 따라 에파카도스타트, ISRIB 및 BAY-218을 포함하거나 포함하지 않는 비처리 세포 및 IFNγ+LPS 자극을 포함하였다. 보르테조밉(20 nM; LC Laboratories, Cat# B-1408)을 세포의 세포자멸사를 유도하기 위한 양성 대조군으로서 사용하였다. 처리된 세포를 가습된 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후에, TPS 검정을 마이크로타이터 플레이트 판독기에서 412 nm에서 흡광도를 판독함으로써 평가된 세포 생존력으로 수행하였다.
키누레닌 검정. 에를리흐(Ehrlich) 시약(p-디메틸아미노-벤즈알데하이드)을 사용하여 U937 및 HL60 세포 상층액의 키누레닌 수준을 측정하였다. 처리 후, 상층액을 수집하고, V-바닥 96-웰 플레이트로 옮기고, 40 μL 50%(w/v) 트리클로로아세트산(TCA; LabChem)과 혼합하여 임의의 단백질을 침전시켰다. 그 후에, 플레이트를 65℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 뒤이어 1250 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 100 μL의 정화된 상층액을 새로운 편평-바닥 96-웰 플레이트로 옮기고, 아세트산 중 2%(w/v) 에를리흐 시약과 동일한 부피로 혼합하였다. 생성된 반응을 Synergy HT 마이크로타이터 플레이트 판독기(Bio-Tek)를 사용하여 490 nm에서 측정하였다. OIR 과정을 거친 마우스의 눈으로부터 유리체액을 수집하였다. 키누레닌의 수준을 IDK®Kynurenin ELISA 키트(Immundiagnostik AG, 독일 벤스하임 소재)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 측정하였다. 부가적으로, 키누레닌 수준을 기재된 바와 같이 전자분무 이온화 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분광법(LC/MS-MS)과 결합된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 확인하였다(18).
IL6 측정. OIR 모델로부터 IL6 수준을 측정하기 위해, 눈 채취 직후 신생 마우스의 망막으로부터 유리체액을 수집하였다. 희석제 시료를 검정하기 위해 1:4 희석 인자의 유리체액을 BD Biosciences 마우스 사이토카인 비드 어레이 IL6 키트를 사용하여 사이토카인 수준에 대해 분석하였다. 제조업체의 지침에 따라 시료를 준비하였다. FACS Canto II 유세포 측정기(BD Biosciences) 및 FACSDIVA 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 시료를 판독하고, FCAP 어레이 소프트웨어를 사용하여 농도를 수득하였다. 사이토카인 비드 어레이 키트에서 제조업체(BD Biosciences)에 의해 제공된 표준 곡선과 비교함으로써 사이토카인 농도를 계산하였다.
정량적 실시간 PCR 분석. Trizol(Life Technologies) 시약을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 조직 배양 세포로부터 총 세포 RNA를 준비하였다. Transcription First Strand cDNA 합성 키트(Applied biosystems; Cat#4368814)를 사용하여 cDNA를 준비하였다. Eppendorf Realplex 4 Mastercycler QPCR 기계와 함께 Fast Start Universal SYBR Green Mix(Roche Applied Science)를 사용하여 정량적 PCR(QPCR) 반응을 실행하였다. Atf4, Chop Il6 및 Cyp1a1에 특이적인 프라이머로 검출된 mRNA 발현 수준(표 1 내지 3)을 18S mRNA 수준으로 정규화하고, δ-δ 주기 역치 방법을 사용하여 치료군들 사이의 차이를 분석하였다.
세포 분류. 표 4에 나열된 항체 및 염색 시약과 함께 유세포 세포 분류기(BD FACSAria III)를 사용하여 Gr-1+CD11blo 및 Gr-1+CD11bhi 세포를 분석하고 분류하였다. 4T1 주사 후 4.5주(WT, Ifng-/-) 내지 5.5주(Ido1-/-, Il6-/-, Gcn2-/-)째에, 종양이 있는 폐를 채취하고, 후속적으로 제조업체의 지침에 따라 gentleMACS Tissue Dissociator(Miltenyi Biotec), 뒤이어 RBC 용해를 사용하여 해리시키고, Trustain FcxTM(항-마우스 CD16/32)(Biolegend; Cat#101320)으로 차단시켰다. 해리된 폐로부터, 세포를 항-CD45, 항-CD11b 및 항-Gr-1 항체에 대해 염색한 다음, FACS Aria III 유세포 측정기(BD Biosciences)를 사용하여 Gr-1+ CD11blo 및 Gr-1+CD11bhi 집단에 대해 추가로 분류하였다. Gr-1+ CD11blo 게이팅된 집단으로부터의 자가형광 높은(AFhi) 및 낮은(AFlo) 세포의 집단을 분류하고, 495/519 nm 여기 및 방출 채널을 사용하는 공초점 현미경에 의해 자가형광의 수준을 확인하였다. 추가의 분류를 또한 수행하여 Gr-1+ CD11blo AFhi 게이팅된 집단으로부터의 세포를 높은 또는 낮은 조합된 Cd11c 및 아시알로-GM1 발현(CD11chi 아시알로-GM1hi 및 CD11clo 아시알로-GM1lo)으로 분석하였다. 상이한 분류된 세포 집단에서 IDO1 발현 수준을 평가하기 위해, Shandon Cytospin 3를 사용하여 800 rpm에서 50,000개의 세포를 슬라이드 상으로 원심분리하였다. 슬라이드를 밤새 건조하고, -20℃에서 아세톤으로 고정시키고, IDO1(클론 4B7)에 대해 면역염색하고, 후속적으로 공초점 현미경(Nikon Eclipse Ti)에 의해 이미지로 만들었다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Differential Quick Staining 키트(Modified Giemsa, Electron Microscopy Sciences Cat# 26096-25)에 의해 염색함으로써 CD11chi 아시알로-GM1hi 및 CD11clo 아시알로-GM1lo 세포의 세포 형태를 결정하였다.
마트리겔 플러그 검정. 4T1 폐 전이로부터 단리된 선택된 면역 세포 집단의 생체내 혈관신생 능력을 평가하기 위해, 5x104 내지 2x106개의 분류된 세포를 형광 활성 세포 분류(BD FACSAria III)에 의해 RPMI +10%로 단리하고(상응하는 도면 범례에 표시된 바와 같음), 얼음 상에 놓았다. 분류 직후, 단리된 면역 세포 집단을 250 μl PBS에 현탁시키고, 생체내 주사를 위해 얼음 위에 플러그당 250 μl 마트리겔(Corning® Cat# 356237)과 조합하였다. 21 게이지 바늘이 달린 얼음처럼 차가운 주사기를 사용하여 수용자(recipient) 마우스의 등 영역에 피하 주사함으로써 플러그를 확립하였다. IDO1 저해를 수반하는 연구를 위해, 마트리겔 플러그 주사 후 6일째에 시작하여 72시간 동안 마우스에게 경구 위관영양 b.i.d.에 의해 100 μl의 비히클(3% N,N-디메틸아세타미드, 10% 1-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린) 중 50 mg/kg 에파카도스타트를 투여하였다. 주사 후 9일 후에, 마트리겔 플러그를 채취하고, 부가적인 10x 마크로 렌즈 부착물(Moment)이 있는 2x 렌즈를 사용하여 Samsung Galaxy S6 또는 iPhone X로 이미지를 기록하였다. 혈관 정량화를 위해, 마트리겔 플러그를 OCT에서 차단하고, 테이프 전달 방법(플러그당 4 ≥ 절편)을 사용하여 동결하여 절편을 만들었다. 절편을 만든 후, 카베올린 1에 대한 토끼 항-마우스를 이용한 형광 염색에 의해 공초점 현미경 하에 혈관신생을 시각화하고, 상기 기재된 바와 같이 Adobe Photoshop을 사용하여 정량적으로 분석하였다.
통계적 분석. Prism 7(GraphPad Software Inc.)을 사용하여 통계적 분석 및 그래프 작성을 수행하였다. 산점도를 평균 ± SEM으로 제시하고, 통계적 유의성을 던넷 또는 시닥 다중 비교 검정과 함께 일원 ANOVA에 의해 또는 독립, 이원 스튜던트 t-검정에 의해 결정하였다(각각의 도면 범례에 표시된 바와 같음). 카플란-마이어 생존 곡선의 유의성을 2-군 로그-순위 검정에 의해 결정하였다. P 값의 범위를 하기와 같이 제시한다: ****, P<0.0001; ***, P<0.01; **, P<0.01; *, P<0.05: ns, 유의하지 않음.
실시예 2: 결과
GCN2의 유전적 손실은 IDO1 손실과 IL6 손실 둘 다의 항혈관신생 효과를 표현형개체화한다(phenocopy)
IDO1에 의한 트립토판의 이화작용을 포함하여 아미노산 결핍에 반응하여 활성화되는 세린 키나제인 GCN2는 ISR에 공급되는 4개의 포유류 키나제 중 하나이며, ISR은 IL6 발현의 조절과 관련이 있었지만, 규제 효과가 긍정적인지 부정적인지의 여부에 대한 상충되는 보고서가 존재한다(11,12,19). IDO1과 IL6 둘 다에 의해 공통적으로 공유되는 혈관신생에 미치는 IFNγ-의존적 효과를 연결하는 가능한 기계적 연결로서 이러한 신호전달 경로의 생물학적 관련성을 조사하기 위해(7), 본 발명자들은 Gcn2 대립유전자 둘 다의 표적화된 붕해를 갖는 Gcn2-/- 마우스에서 본 발명자들의 연구를 실시하였다. 표현형적으로 전이성 4T1 종양으로 시험된 Gcn2-/- 마우스는 Ido1-/- 마우스와 닮아서, WT 마우스와 유사한 원발성 종양 성장률을 나타내지만(도 9), 폐에서 전이 부담을 현저하게 감소시켰다(도 1a). 이러한 전이성 차등은 Ido1-/- 마우스와 유사한 Gcn2-/- 마우스가 WT 마우스에 비해 나타낸 유의한 생존 이점과 관련이 있었다(도 1b). Gcn2-/- 마우스로부터의 4T1 폐 전이의 면역형광 염색은 Ido1-/- 마우스에서 관찰된 것에 필적하는 유의하게 감소된 혈관 밀도의 증거를 보여주었다(도 1c 및 도 1d). 이들 데이터는 이러한 전이성 설정에서 종양 성장, 혈관신생 및 IL6 유도를 촉진하기 위해 IDO1에 GCN2가 필요하다는 가설과 일치한다.
통합 스트레스 반응 경로를 통한 IDO1 신호에 의한 IL6 유도
IDO1-매개 트립토판 이화작용은 내인성 리간드 키누레닌의 생성을 통한 트립토판 결핍 및 AHR 신호전달에 반응하여 ISR 신호전달의 활성화를 유도할 수 있다. IDO1 활성과 IL6 유도 사이에 관찰된 연관성이 이들 2개의 다운스트림 신호전달 경로 중 하나를 통해 연결되는지를 직접 조사하기 위해, 본 발명자들은 단리된 세포 배양물에서 두 경로를 모두 저해하는 영향을 조사하였다. 본 발명자들은 이전에 U937 세포와 HL60 세포 둘 다에서 IFNγ+LPS-매개 IDO1 활성 유도가 IL6의 상응하는 증가를 동반하였고, 둘 다 IDO1 효소 저해제 MTH-Trp로 차단될 수 있었음을 보여주었다(9). 이 연구에서, 본 발명자들은 세포에 의해 생성된 키누레닌의 80% 내지 90%를 차단하고(도 2a), IL6 유전자 발현을 99% 이상 감소시키는(도 2b 내지 도 2c) 상이한 IDO1 저해제인 에파카도스타트를 사용하였고, 이는 IDO1 활성과 IL6 유도 사이의 연관성을 추가로 확증하였다. IDO1의 신호전달 경로 다운스트림의 활성화 상태를 평가하기 위해, 본 발명자들은 마찬가지로 ISR 및 AHR 활성화 시 유도되는 유전자를 평가하였다. CHP(C/EBP 상동성 단백질/Ddit3 DNA-손상 유도성 전사물 3) 및 ATF4(활성화 전사 인자 4)는 ISR 활성화 시 유도되는 2개의 다운스트림 신호전달 요소이며(20), 한편 CYP1A1(시토크롬 P450, 계열 1, 하위계열 a, 폴리펩티이드 1)은 AHR에 대한 다운스트림 표적 유전자이다(21). qPCR 분석은 IDO1 유도 후 CHOP, ATF4 및 CYP1A1 메시지의 상승된 수준을 보여주었고, 이들 3개는 모두 에파카도스타트 처리에 의해 효과적으로 차단되었다(도 2b 내지 도 2c). 어떤 IDO1 신호전달 경로가 IL6 발현을 제어하는 데 담당하는지 조사하기 위해, ISR 신호전달을 차단하는 저해제 ISRIB(22) 및 AHR 신호전달을 차단하는 BAY-218(23)을 사용하였다. 예상된 바와 같이, ISRIB는 CHOP와 ATF4 둘 다의 유도를 차단하였으나 CYP1A1을 차단하지 않았고, 한편 BAY-218은 CYP1A1의 유도를 차단하였으나 CHOP나 ATF4의 유도를 차단하지 않았고(도 2b 내지 도 2c), 어느 것도 생성되는 키누레닌의 수준에 유의한 효과를 미치지 않았다(도 2a). IL6 유전자 발현은 ISRIB에 의해 효과적으로 차단되었으며, 한편 BAY-218은 어떠한 유의한 효과도 갖지 않았으며(도 2b 내지 도 2c), 이는 IL6 유도가 AHR을 통해서가 아니라 ISR을 통한 신호전달에 의해 제어됨을 나타낸다. ISRIB, 에파카도스타트 또는 BAY-218 중 어느 것도 관찰된 효과를 설명하는 데 사용된 농도에서 세포 생존력에 충분한 영향을 미치지 않았다(도 10). 전체적으로, 이들 데이터는 IDO1 활성을 IL6 유도에 연관짓는 다운스트림 조절 연결인 ISR 신호전달을 선호한다.
ISR 신호전달은 산소-유도 망막병증의 마우스 모델에서 혈관신생을 촉진하기 위해 IDO1의 다운스트림에서 작용한다.
종양 발생 및 면역 탈출에 미치는 다른 효과와는 별도로 혈관신생에 미치는 IDO1의 영향을 연구하기 위해, 본 발명자들은 이전에 마우스 OIR(산소-유도 망막병증) 모델(7)을 이용하였으며, 이는 종양에서 발견되는 것과 유사하게(17) 비정상적인 혈관을 재현 가능하게 그리고 정량적으로 형성한다(도 3a 및 도 11). OIR 모델에서, IDO1은 IFNγ에 대응하고 IL6을 표현형개체화하는 방식으로 혈관신생을 촉진하는 데 중요하다(7). 이러한 생물학적 맥락에서 ISR 신호전달의 관련성을 평가하기 위해, Gcn2-/- 마우스에서 OIR 관련 혈관신생을 평가하였다. Ido1-/- 마우스에서의 본 발명자들의 관찰과 유사하게, 혈관신생은 GCN2가 결여된 마우스에서 유의하게 감소된 것으로 밝혀졌다(도 3b). 이러한 효과는 Gcn2-/- 및 Ido1-/- 마우스의 유리체액 내 IL6의 감소된 수준에 상응하였다(도 3c). 그러나, Ido1-/- 마우스와 달리, Gcn2-/- 마우스는 유리체액 내 키누레닌의 유의하게 감소된 수준을 나타내지 않았으며, 이는 IDO1 활성이 이들 동물에서 영향을 받지 않음을 나타낸다(도 3d).
OIR-관련 혈관신생을 촉진하는 데 있어서 ISR 신호전달의 역할에 대한 부가적인 증거는, 본 발명자들이 이전에 Ido1 및 Vegfa를 성공적으로 표적화하는 데 사용한 접근 방식인 이 경로의 중요한 신호전달 구성요소를 표적화하기 위해 눈에 주사된 특별히 지시된 siRNA를 이용한 연구에서 나왔다(7). 생식계열 넉아웃 데이터와 일치하게, Gcn2의 siRNA 매개 표적화는 OIR-관련 혈관신생을 유의하게 감소시켰다(도 3e). 마찬가지로, 이러한 방식으로 ISR 신호전달 구성요소 Atf4 또는 Chop를 표적화하는 것은 반대쪽 눈에 주사된 비표적 대조군 siRNA에 비해 OIR-관련 혈관신생에서 유사한 감소를 초래하였다. 대조적으로, 이러한 대안적인 IDO1 신호전달 경로를 간섭하기 위해 Ahr에 대해 지시된 siRNA를 사용하여 OIR-관련 혈관신생의 어떠한 감소도 관찰되지 않았다. 대신, Ahr 표적화는 혈관신생에 있어서 상대적으로 작지만 유의한 증가와 관련이 있었으며(도 3e), 이는 AHR 신호전달이 이러한 맥락에서 U937 및 HL60 세포-기초 검정에서 AHR 저해와 함께 증가된 Il6 발현을 향한 경향과 일치하는 부(minor) 역조절 효과를 발휘할 수 있다.
혈관의 면역형광 염색과 함께, 망막 전체 봉입물을 또한 IDO1에 대해 염색하였다. IDO1 발현은 혈관신생 다발(tuft)과 밀접하게 관련된 세포에서만 독점적으로 검출되었다(도 3f). 어떠한 IDO1 염색도 OIR 마우스 망막의 혈관신생 영역 외부에서 관찰되지 않았으며 일정한 정상 산소 조건 하에 유지된 마우스의 망막 전반에 걸쳐 어디에서도 관찰되지 않았다(데이터는 표시되지 않음). Ido1-/- OIR 마우스 망막의 혈관신생 다발에서 IDO1에 대한 어떠한 양성 염색도 검출되지 않았으며, 이는 항-IDO1 항체 염색의 특이성을 확인시켜 주었다(도 3f). 대조적으로, IDO1 양성 염색 세포는 Ido1-/- 마우스에서 관찰된 것과 필적하는 감소된 수준의 혈관신생을 나타냄에도 불구하고 Gcn2-/- 마우스의 OIR 망막에서 검출 가능하였다(도 3f). 이러한 관찰은 GCN2가 IDO1의 ISR 신호전달 경로 다운스트림의 중요한 신호전달 구성요소로서 작용하는 것과 일치하며, Ido1-/- 마우스 망막에서 관찰되는 IDO1 양성 염색의 결여가 감소된 혈관신생의 가짜 결과일 수 있다는 우려에 반대한다. 마찬가지로, IDO1 발현은 Ahr뿐만 아니라 Gcn2, Chop 및 Atf4에 대한 siRNA로 처리된 마우스의 OIR 망막에서 검출되었다(도 3g). 종합하자면, 이들 데이터는, IDO1이 OIR에서 병리학적 혈관신생을 촉진하는 작용을 하는 생물학적 관련 신호전달 경로인 ISR과 일치한다.
Gr-1+ CD11blo 면역 세포 집단에서의 IDO1의 발현
IDO1에 대한 4T1 폐 전이의 염색은 OIR 망막과 유사하게 IDO1+ 세포가 WT 숙주에서 확립된 4T1 전이에서 혈관과 연관되어 있음을 보여주었다(도 4a). 중요하게는, Ido1-/- 숙주에서 확립된 4T1 전이에서 IDO1 염색의 어떠한 증거도 관찰되지 않았으며(도 4a), 이는 WT Ido1 대립유전자의 보유에도 불구하고 IDO1에 대한 항체의 특이성과 이 설정에서 생착된 4T1 종양 세포에 의한 IDO1 발현의 결여를 둘 다 확인시켜 주었다. 한편, IDO1+ 세포는 이들 종양에서 관찰된 혈관신생의 유의한 감소에도 불구하고 Gcn2-/- 숙주에서 확립된 4T1 전이에서 관찰되었으며(도 4a), 다시 IDO1의 다운스트림에서 작용하는 GCN2와 일치한다.
IDO1 양성 세포가 OIR 및 4T1 폐 전이 모델 둘 다에서 혈관신생 영역과 밀접하게 연관되어 있지만, IDO1에 대한 염색은 혈관을 식별하는 데 사용되는 내피 세포 마커에 대한 염색과 직접적으로 중첩되는 것으로 보이지 않았다. 대신, Ido1-/- 숙주가 아니라 WT로부터 수득된 4T1 전이성 병변에서 검출된 IDO1 염색은 공통(common) 백혈구 마커 CD45를 발현하는 세포의 하위세트와 중첩되었다(도 4b). 대조적으로, IDO1 발현은 원발성 4T1 종양 또는 WT 마우스로부터의 상응하는 비장에 존재하는 CD45+ 세포에서는 검출되지 않았다(도 4b). 4T1 종양은 주로 G- 또는 PMN-MDSC로 지칭되는 과립구성 다형핵 하위세트로 이루어진 MDSC(24)의 대규모 확장을 유도하고(25), 4T1 전이에서 IDO1-발현 면역 세포 집단의 추가 분석은 IDO1이 다른 보편적으로 사용되는 MDSC 마커인 CD11b가 아니라 MDSC를 식별하는 데 보편적으로 사용되는 분화 마커인 Gr-1을 발현하는 세포의 하위세트와 함께 양성적으로 공동위치하였음을 보여주었다(도 4c). 4T1 전이와 마찬가지로, OIR 마우스의 망막에서 IDO1-발현 세포는 CD45+ 및 Gr-1+ 둘 다인 것으로 식별되었다(도 4d). 이들 염색 데이터와 일치하게, Gr-1+ 세포의 항체-매개 결핍은 이소타입 항체-처리 대조군에 비해 OIR-관련 혈관신생의 유의한 감소를 초래하였으며(도 4e), 이는 이들을 IDO1이 혈관신생을 촉진하는 생물학적 관련 세포로서 연관시킨다.
Gr-1+ CD11blo 세포의 IDO1-발현 하위집단은 혈관신생을 촉진하는 능력에서 종래의 MDSC와 기능적으로 구별된다.
유세포 측정법에 의해 분석되었을 때, 4T1-전이 보유 폐로부터 단리된 대부분의 CD45+ 세포는 Gr-1과 CD11b 둘 다에 대해 양성이었다. 이들 연구에 사용된 항-IDO1 항체가 IDO1-발현 세포와 비발현 세포 사이를 유세포 측정으로 직접 적절하게 구별할 수 없기 때문에, 해리된 4T1 폐 전이의 Gr-1+ 세포를 현미경 분석을 위해 이의 CD11b 발현 수준(도 5a 및 도 12)에 기초하여 분리하였다. 면역형광 염색은 전체 CD45+ Gr-1+ 집단의 5% 미만을 포함하는 CD11blo 세포 분획 내에서 IDO1+ 세포가 고도로 농화되었으며, 한편 대부분의 CD45+ Gr-1+ CD11bhi 집단에서 IDO1 발현의 어떠한 증거도 검출되지 않았음을 실증하였다(도 5b).
IDO1-발현 하위집단이 기능적으로 혈관신생을 촉진할 수 있는지의 여부를 평가하기 위해, WT 숙주에서 확립된 4T1 폐 전이로부터 단리된 분류된 Gr-1+ CD11blo 세포를 마트리겔과 혼합하고, 미접촉(naive) WT 마우스에 피하 이식하였다. 비교를 위해, 종래의 MDSC를 나타내는 Gr-1+ CD11bhi 세포 또한 마트리겔 이식을 위해 단리하였다. 마트리겔 플러그가 9일 후 절제되었을 때, IDO1-발현 CD11blo 세포를 혼입하는 플러그가 내부적으로 고도로 혈관화되었으며, 한편 IDO1-비발현, CD11bhi 세포가 있는 플러그는 그렇지 않았음이 시각적으로 분명하였다(도 5c).
염색된 절편의 면역형광 분석은 CD11blo 플러그와 CD11bhi 플러그 사이의 평균 혈관 밀도에서 10배 초과의 차이를 확인시켜 주었다(도 5c, 도 5d). 이 결과는 CD11blo 집단이 독립적으로 혈관신생을 촉진할 수 있음을 나타내며, 이들 세포를 종래의 CD11bhi MDSC와 기능적으로 구별한다. 대조적으로, Ido1-/- CD11blo 세포로 혼입된 마트리겔 플러그(Ido1-/- 마우스에서 확립된 4T1 전이로부터 단리됨)는 혈관 침윤의 최소한의 증거를 보여주었으며(도 5c), 이는 면역형광에 의해 상응하는 CD11bhi 세포로 혼입된 플러그로부터 정량적으로 구별 불가능하고, 임의의 세포도 혼입되지 않은 마트리겔 플러그 위로 약간만 상승하였다(도 5c, 도 5d). 이들 결과는 IDO1 발현이 Gr-1+ CD11blo 세포가 혈관신생을 촉진하는 능력과 연관될 뿐만 아니라 중요하다는 것을 나타낸다.
IDO1의 저해는 단리된 Gr-1+ CD11blo 세포에 의해 유도되는 혈관신생을 감소시킨다
CD45+ Gr-1+ CD11blo 세포가 혈관신생을 촉진할 수 있게 하는 데 있어서 IDO1 효소 활성의 역할을 직접적으로 시험하기 위해, WT Gr-1+ CD11blo 세포 또는 Gr-1+ CD11bhi 세포로 혼입된 마트리겔 플러그를 WT 마우스에서 6일 동안 확립하였고, 이후에 마우스를 3일 동안 IDO1 저해제 에파카도스타트로 치료하였다. 면역형광 염색에 의한 절제된 마트리겔 플러그의 평가는 에파카도스타트 치료가 CD11blo 세포에 의해 촉진된 혈관신생의 정도를 CD11bhi 세포와 정량적으로 구별할 수 없는 수준으로 저하시켰음을 보여주었다(도 5e, 도 5f). 에파카도스타트 치료가 확립된 4T1 전이 내에서 혈관 형성을 역전시킨다는 본 발명자들의 이전의 발견과 일치하여(7), 이들 결과는 Gr-1+ CD11lo 세포 구동 혈관신생을 개시하는 것뿐만 아니라 유지하기 위해 지속적인 IDO1 활성이 필요함을 보여준다.
단리된 Gr-1+ CD11blo 세포에 의한 혈관신생은 IL6 및 GCN2를 필요로 한다
4T1 폐 전이와 OIR 모델 둘 다로부터의 결과는 혈관신생을 촉진하는 IDO1의 능력이 ISR의 활성화를 통해 강화된 IL6의 다운스트림 유도에 의존함을 나타낸다. 이러한 연관성이 단리된 Gr-1+ CD11blo 세포에도 적용되는지의 여부를 평가하기 위해, IL6 및 GCN2 손실을 유전적으로 평가하였다. Il6-/- 또는 Gcn2-/- 마우스로부터 단리된 Gr-1+ CD11blo 세포로 혼입된 마트리겔 플러그는 혈관 침윤의 최소한의 증거를 보여주었다(도 6a, 도 6b). 이들 결과는 IDO1-발현, Gr-1+ CD11blo 세포가 세포 수준에서 이러한 IDO1-구동 신호전달 경로의 생체내 내인성 관련성과 일치하는 혈관신생을 촉진하기 위해 IL6과 GCN2가 둘 다 필요함을 확인시켜 준다.
숙주 IFNγ의 제거는 IDO1-결핍 Gr-1+ CD11blo 세포의 혈관신생 촉진 능력을 회복시킨다
IFNγ는 IDO1 발현의 일차 유도인자일 뿐만 아니라 항혈관신생 활성도 발휘한다. 마우스에서 IFNγ 발현의 제거가 혈관신생의 결정인자로서 IDO1을 중요하지 않게 만든다는 본 발명자들의 이전의 발견은, IDO1의 유도가 IFNγ의 항혈관신생 효과를 제어하는 역조절 피드백 기전으로서 작용할 수 있다는 가설을 세웠다. 이 가설을 명시적으로 시험하기 위해, 본 발명자들은 유전적으로 IFNγ가 결여된 마우스를 이용한 연구를 수행하였다. OIR 망막 및 4T1 전이에서의 혈관신생 영역의 평가는 Ifng-/- 마우스의 표본에서 IDO1-양성 염색의 결여를 보여주었으며(도 6c, 도 6d), 이는 IFNγ가 이들 설정에서 IDO1 발현 유도에 필요하며 이는 IDO1이 다운스트림 역조절 요소로서 기능한다는 가설과 일치함을 실증한다.
혈관신생에서 IDO1의 역할이 외인성 IFNγ의 존재 여부에 달려 있는지의 여부를 직접적으로 평가하기 위해, WT 마우스에 도입되었을 때 혈관신생을 효과적으로 유도할 수 없었던 Ido1-/- 마우스로부터의 단리된 Gr-1+ CD11blo 세포를 Ifng-/- 마우스 내로 도입하였다. 이와 관련하여, Ido1-/- 세포의 도입은 WT 마우스의 CD11blo 세포로 혼입된 플러그에 필적하는 혈관 밀도를 갖는 고도로 혈관화된 마트리겔 플러그를 초래하였다(도 6e, 도 6f). 한편, Gr-1+ CD11bhi 세포는 WT 또는 Ido1-/- 마우스에서 이들이 유래되었는지의 여부에 관계없이 Ifng-/- 마우스에서 혈관신생을 효과적으로 촉진할 수 없었다(도 6e, 도 6f). 이들 데이터는 Gr-1+ CD11blo 세포에서의 IDO1 발현이 그 자체로 혈관신생을 촉진하는 기능적 능력을 결정하는 것이 아니라 오히려 국소 IFNγ의 항혈관신생 효과로부터 유도된 혈관신생 구조를 보호하는 데 중요하다는 결론을 지지한다.
IDO1+ 혈관화 하위집단은 CD11c 및 아시알로-GM1의 높은 수준의 자가형광 및 표면 발현을 특징으로 한다
Gr-1+ CD11blo 분담부(contingent) 내에서, 추가 유세포 측정법 및 형광 현미경 분석은 IDO1 발현이 고도의 자가형광에 의해 구별 가능한 세포의 하위세트와 연관되었음을 보여주었다(도 7a 및 도 13a). Gr-1+ CD11blo 집단이 높고 낮은 자가형광(AFhi 및 AFlo)에 기초하여 분리되었을 때, 마트리겔 플러그 내에서 혈관신생을 촉진하는 능력은 높은 자가형광 신호로 분리되었다(도 7b). 자가형광 신호는 3개의 여기/방출 채널 488/530, 450/407 및 488/585에서 특히 강하였지만, 633/660 및 633/780 채널에서는 약하였다(도 13b).
더 약한 자가형광 채널을 사용하여, 상이한 세포 표면 마커를 검출하기 위한 일련의 항체를 AFhi 세포 집단 상에서 평가하였다. CD11c 및 아시알로-GM1에 대해 지시된 이 패널로부터의 2개의 항체는 배경보다 강한 형광 강도 천이를 갖는 별개의 하위집단을 명확하게 표시하였다(도 14a). 이들 2개의 마커에 대한 게이팅은 AFhi 집단을 CD11chi 아시알로-GM1hi 세포 및 CD11clo 아시알로-GM1lo 세포의 2개의 우세한 군으로 분기시켰다(도 7c 및 도 14b).
IDO1 발현은 형태학적으로 더 이질적인 CD11clo 아시알로-GM1lo 집단과 대조적으로 형태학적으로 동질적인 집단으로 나타난 CD11chi 아시알로-GM1hi 집단과 거의 독점적으로 분리되었다(도 7d). 본 발명자들의 이전의 조직 염색 데이터와 일치하여, Ido1-/- 또는 Ifng-/- 마우스로부터 단리된 CD11chi 아시알로-GM1hi 세포에서는 IDO1 발현이 관찰되지 않았지만, Il6-/- 및 Gcn2-/- 마우스로부터의 세포에서는 유지되었다(도 14c). CD11chi 아시알로-GM1hi 세포 집단 상에서 CD11c 및 아시알로-GM1뿐만 아니라 CD45에 대한 양성은 이들 세포에 내재된 높은 배경 자가형광에 기인하지 않는 것으로 확인되었으며(도 15), 이는 이들 마커와 IDO1-발현 세포 집단과의 연관성을 확증시켜 주었다.
예기치 않게, WT 세포가 WT 수용자에게 전달되었을 때, CD11chi 아시알로-GM1hi(IDO1+) 집단과 CD11clo 아시알로-GM1lo(IDO1-) 집단 둘 다 마트리겔 검정에서 혈관신생을 촉진할 수 있었다(도 7e 및 도 16a). 혈관 밀도의 상응하는 감소가 CD11chi 아시알로-GM1hi 집단과 CD11clo 아시알로-GM1lo 집단 사이에서 너무 유사하기 때문에 이러한 설명을 수용하기 위해, 플러그 내에 혼입된 세포의 수를 줄이는 것은 CD11clo 아시알로-GM1lo 집단 내에 존재하는 IDO1+ 세포의 작은 잔류 집단에 기인하는 이러한 활성에 대해 주장하였다(도 16b). 대신, Ido1-/- 공여자에서 WT 수용자에 이르는 세포로 마트리겔 검정을 수행하면 이러한 방식으로 분리될 때 CD11clo 아시알로-GM1lo 집단은 혈관신생을 촉진하기 위해 IDO1을 더 이상 필요로 하지 않았으며, 한편 CD11chi 아시알로-GMhi 집단은 IDO1-의존성을 유지하는 것으로 나타났다(도 7e 및 도 16a). 마찬가지로, CD11clo 아시알로-GM1lo 집단은 GCN2와 IL6 둘 다에 대한 요건을 상실하였으며, 한편 CD11chi 아시알로-GMhi 집단은 그렇지 않았다(도 16c, 도 16d). 이러한 데이터는 IDO1+ 세포가 혈관신생을 촉진하지만 새로 형성된 혈관의 IFNγ-의존적 제거를 유도하는 능력, 다시 말해 IDO1을 유도하는 수반되는 능력에 의해 구별 가능한 더 큰 AFhi 세포 집단의 일부라는 것과 일치한다. 혈관신생을 촉진하는 손상된 능력을 구현하기 위해 Ido1-/-, Il6-/- 및 Gcn2-/- 마우스의 CD11chi 아시알로-GMhi 공여자 세포에 숙주 IFNγ가 존재해야 하는 요건은 Ifng-/- 수용자와 함께 마트리겔 검정을 수행하여 확인되었다(도 7e 및 도 17). IDVC(IDO1-의존성 혈관화 세포) 집단의 초기 식별을 위한 CD11c 및 아시알로-GM1 마커의 이용은 CD11b 및 Gr-1 상태의 추가 특징화를 가능하게 하였다. CD11b는 낮긴 하지만 부재하지 않는 것으로 결정되었으며(도 18), 한편 구성요소 분자인 Ly6C 및 Ly6G와 함께 복합 마커 Gr-1의 수준은 모두 중간 수준으로 존재하는 것으로 밝혀졌고(도 19), 이는 IDVC 표면 마커 프로파일을 종래의 MDSC와 추가로 구별한다(표 5).
[표 5]
실시예 3: 논의
T 세포 반응을 약화시키는 IDO1의 능력에 대한 연구에서 나온 상세한 통찰과는 대조적으로(26), 염증성 혈관신생의 통합 매개인자로서의 IDO1의 역할에 대한 사례는 지금까지 고도로 개념적이었다(7). 본원에서 본 발명자들은 IDO1 생물학의 지금까지 인식되지 않은 양태의 분자 및 세포 기반을 설명한다. 면역형광 현미경을 이용한 혈관신생 영역과 관련된 IDO1-발현 세포의 검출은 IDO1의 유도를 통해 IFNγ의 항혈관신생 활성에 반대할 수 있고 새로운 혈관의 생체내 형성을 촉진할 수 있는 종래의 MDSC와 구별 가능하지만 중간에 존재하는 면역 세포의 독특한 하위세트를 식별하게 하였다. 이들 세포에서 IDO1 유도가 어떻게 IFNγ를 상쇄하는지에 대한 조사는 GCN2에 의해 개시되고 ISR 경로를 통해 전파되어 혈관신생을 촉진하는 데 필요한 IL6의 유도로 이어지는 신호전달의 다운스트림 관련을 설명하였다. 전체적으로, 이러한 발견은 IDO1 생물학의 이러한 새로운 양태에 대한 근본적이고 새로운 통찰을 보여준다.
트립토판 분해를 개시함으로써, IDO1은 트립토판의 결핍과 이화산물의 생성 둘 다를 통해 잠재적으로 신호전달을 할 수 있고, 이들 2개의 가능한 신호전달 기전 중 어느 것이 가장 관련이 있는지에 대한 지속적인 논쟁이 있었다(27,28). 이화작용 생성물인 키누레닌에 반응하여 AHR을 통한 신호전달 및 트립토판 결핍에 반응하여 GCN2를 통한 신호전달에 대한 생물학적 증거가 보고되었다(15,29). 혈관신생에 미치는 IDO1의 영향과 관련하여, 본 발명자들의 데이터는 분명히 트립토판 결핍 측면에 있다. GCN2, CHOP 및 ATF4를 포함한 생체내 ISR의 주요 구성요소를 표적화하는 것은 모두 IDO1 또는 IL6의 손실이 혈관신생에 미치는 효과를 표현형개체화한다. 중요하게는, ISR의 주요 구성요소를 붕해시키는 것이 IDO1을 제거하는 것과 표현형적으로 필적하긴 하지만, IDO1 발현 및 활성은 상승된 채로 있었다. 면역 조절 기전에 대한 논쟁에서, 트립토판 결핍 가설에 대한 주요 반대 의견 중 하나는 전신 수준의 트립토판은 IDO1-발현 DC가 결핍-기반 작용 기전을 통해 T 세포 기능에 외부적으로 영향을 미치기에는 너무 높다는 것이었다(30). 그러나, IDO1이 혈관신생에 미치는 영향의 경우, 이러한 우려는 시험관내 및 생체내 둘 다에서 IDO1-매개 트립토판 이화작용의 IFNγ-구동 유도가 내재적으로 세포 내에서 작용하여 ISR 경로 활성화 및 다운스트림 IL6 유도를 개시한다는 증거에 의해 논거가 된다. 4T1 종양이 있는 마우스에서 발생하는 MDSC의 대규모 확장을 감안할 때, MDSC 및 호중구의 계통 마커인 Gr-1이 4T1 전이에서 IDO1 발현과 중첩된다는 본 발명자들의 결정은 이러한 IDO1-발현 세포가 종래의 MDSC일 것이라는 초기 가정으로 이어졌다. 그러나, PMN- 및 M-MDSC 둘 다의 다른 특징적인 계통 마커인 CD11b와 IDO1 발현 사이의 중첩의 결여는 IDO1+ 세포(이 연구에서는 IDO1-의존성 혈관 형성 세포 또는 IDVC라고 함)를 MDSC의 벌크에서 현재 정의된 바와 같이 분화시켰다(31). 높은 수준의 고유 자가형광은 후속적으로 IDO1+ 세포 집단과 관련된 물리적 특징을 정의하는 것으로 식별되었으며, 이는 IDO1+ 세포의 추가 정제를 가능하게 하였으며 또한 유세포 측정법-기반 특징화에 대해 부가적인 복잡성을 제시하였다. 자가형광 신호가 가장 낮은 채널을 이용하여, IDO1-발현 세포는 수지상 세포와 자연 살해 세포를 각각 식별하는 데 전형적으로 사용되는 2개의 세포 표면 마커인 CD11c 및 아시알로-GM1과 거의 동질성으로 추가로 설명되었다. AFhi 세포 집단 둘 다 마트리겔 검정에서 혈관신생을 유도할 수 있었지만, CD11chi 아시알로-GM1hi 하위세트만 IDO1 또는 다운스트림 구성요소 GCN2 및 IL6을 필요로 하였다. 단리된 CD11clo 아시알로-GM1lo 세포는 마트리겔 혈관신생을 효과적으로 촉진하기 위해 더 이상 IOD1을 필요로 하지 않았으며, 한편 CD11clo 아시알로-GM1lo 세포와 CD11chi 아시알로-GM1hi 세포의 혼합 집단은 그러하였다는 관찰은 이와 관련하여, IDO1-발현 CD11chi 아시알로-GM1hi 집단이 IFNγ-매개 항혈관신생 반응을 상쇄시킬 뿐만 아니라 이를 촉발시키는 데에도 담당하고 있음을 내포한다.
종래의 Gr-1+ CD11bhi MDSC의 광범위한 집단에서 검출 가능한 IDO1 발현의 결여는 본 발명자들의 이전의 발견과 일치하지만(9), MDSC에서 직접 IDO1 발현에 대한 공개된 증거도 보고되었다. 뮤린 MDSC의 경우, 증거는 일반적으로 PCR 또는 웨스턴 블롯 분석에 의한 세포 집단 내 발현 분석으로 구성되었다(32-34). 개별 세포 수준에서 IDO1 발현을 검사하지 않음으로써, 이러한 연구는 본원에서 식별된 IDVC에 의한 종래의 MDSC 집단의 오염으로 인해 오도될 위험이 있다. 또한 IDO1 발현을 검출하기 위해 상업적으로 입수 가능한 많은 항체가 가짜 양성 결과로 이어질 수 있는 특이성이 결여된다는 우려도 있으며(35), 이 문제는 확증을 위해 생식계열 넉아웃 계통을 사용하여 마우스 조직에서 IDO1을 특이적으로 인식하는 항체의 개발에 의해 현재 연구에서 해결되었다(36). 따라서, IDO1의 상승된 발현이 통상적으로 정의된 뮤린 MDSC에서 발생한다는 널리 퍼진 개념은 보다 결정적인 증거가 제공될 수 있을 때까지 회의적으로 보아야 한다.
기능적으로, 신혈관형성을 촉진하는 능력은 현재 종래의 MDSC의 특징을 정의하는 것 중 하나이지만(4), 본 발명자들의 데이터는 이 속성의 재평가가 필요할 수도 있음을 시사한다. 이 연구에서 식별된 AFhi 세포의 부 하위집단은 생착된 마트리겔 플러그 내에서 혈관신생을 촉진하는 데 고도로 효과적이었지만, 종래의 MDSC는 이에 비해 상당히 효과가 없었다. 이것은 일반적으로 종래의 MDSC에 기인하는 전혈관신생(proangiogenic) 활성이 AFhi 세포의 이러한 부 하위세트로 제한될 수 있는 가능성을 높인다. 예를 들어, 마트리겔 플러그 검정을 사용하여 수행된 연구는 표면적으로 단리된 MDSC를 신혈관형성 활성과 연관시켰다. 그러나, MDSC가 Gr-1+(또는 Ly6C/Ly6G) 상태만을 기준으로 단리된 경우(37), Gr-1+ CD11blo AFhi 세포에 의한 의도치 않은 오염 가능성이 분명히 있다. MDSC가 조합된 Gr-1+ CD11b+ 상태에 기초하여 단리되었더라도(38), CD11blo AFhi 세포에 의한 교차 오염은 CD11b 컷오프의 불충분한 엄격성 또는 비특이적 자가형광에 대한 부주의한 게이팅으로 인해 여전히 문제가 될 수 있다. 이러한 발견에 기초하여, 종래의 MDSC의 신혈관형성 활성을 신중하게 재평가해야 한다.
이러한 연구에서 IDO1은 단순히 IDVC와 MDSC를 구별하는 마커가 아니라 이들 세포가 혈관신생을 촉진하는 데 기능적으로 필요하다는 것이 분명하다. 그러나 IDO1은 VEGF와 같이 새로운 혈관의 형성을 직접적으로 촉진하는 신혈관형성 인자는 아니다. 오히려, 본 발명자들의 결과는 IDVC에서 IDO1의 주요 역할이 IFNγ의 항신생혈관 효과를 상쇄시키는 것임을 실증한다. 기계적으로 IFNγ가 항혈관신생 효과를 발휘하는 방법은 완전히 이해되어야 한다. 최근 연구는 IFNγ가 내피 세포에 직접적으로 작용한다는 것을 실증하였는데, 이는 면역 세포가 아닌 내피 세포에서 IFNGR의 표적 결실이 맥관 구조(39)를 보호하기에 충분하고 내피 세포에서 Dll4(델타-유사 리간드 4)/Notch 신호전달의 하향조절이 이 과정과 관련이 있었기 때문이다(40). 이러한 데이터는 기전을 설명하기 위한 잠재적 핵심이 IFNγ를 상쇄시키는 IDVC에 의해 생성된 IL6의 관찰된 능력에 있을 수 있음을 시사한다. IL6이 VEGF-독립적 기전을 통해 새로운 혈관 형성을 자극하는 것으로 실증되었지만(41), 본 발명자들의 데이터는 IDVC에 의한 IL6 생성이 신혈관형성의 직접적인 프로모터보다는 IFNγ의 항혈관신생 활성을 확인하는 데 더 관련이 있음을 시사한다. 부가적으로, 현재 연구는 혈관신생에 초점을 맞추고 있지만, IL6은 기능적으로 억제하는 MDSC를 유발하는 것과 관련된 다면발현성(pleiotropic) 사이토카인이다(42). 본 발명자들의 이전 연구는 4T1 종양을 가진 Ido1-/- 마우스에서 얻은 MDSC가 IL6을 이소적으로 발현하는 변형된 종양 세포의 이식에 의해 복원될 수 있는 감소된 억제 활성을 나타내었음을 보여주었다(9). IDVC에 의한 IDO1-의존성 IL6 생성이 혈관신생 촉진과 함께 MDSC가 완전한 억제 잠재력을 개발하는 데 기여할 수 있는지의 여부를 조사하기 위한 향후 연구가 필요할 것이다.
유전적 연구는 염증성 혈관신생에서 IDO1의 통합적 역할을 실증하는 한편, 에파카도스타트를 이용한 부가적인 연구는, 혈관신생 과정이 일단 개시되면 혈관 무결성(integrity)을 유지하는 데 있어서 IDO1에 대한 지속적인 역할과 일치하여 IDO1 저해제가 이 과정을 역전시킬 수 있음을 나타냄으로써 이러한 개념을 더욱 더 확장시킨다. VEGF-표적화제를 이용한 항신혈관형성 치료법의 과제 중 하나는 후천적 내성의 발달이다. 이와 관련하여, MDSC의 모집과 IL6 신호전달은 둘 다 환자에서 VEGF-지시(directed) 항체 치료법의 실패와 관련이 있어 왔다(43,44). 이들 관찰은 VEGF 항체 치료법에 대한 후천적 내성에 기여하는 본 연구에서 식별된 뮤린 IDVC에 대한 인간 등가물의 존재와 일치한다.
명세서 전반에 걸쳐 인용된 웹사이트 및 다른 간행물을 포함하여 각각의 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 인용되어 본원에 포함된다. 본 발명은 특정 구현예를 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 사상을 벗어나지 않으면서 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
참조문헌
1. Folkman J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery? Nat Rev Drug Discov 2007;6(4):273-86.
2. Dvorak HF. Tumors: wounds that do not heal-redux. Cancer Immunol Res 2015;3(1):1-11.
3. Gabrilovich DI. Myeloid-Derived Suppressor Cells. Cancer Immunol Res 2017;5(1):3-8.
4. Johnson BW, Achyut BR, Fulzele S, Mondal AK, Kolhe R, Arbab AS. Delineating Pro-Angiogenic Myeloid Cells in Cancer Therapy. Int J Mol Sci 2018;19(9).
5. Nilsson MB, Langley RR, Fidler IJ. Interleukin-6, secreted by human ovarian carcinoma cells, is a potent proangiogenic cytokine. Cancer Res 2005;65(23):10794-800.
6. Qin Z, Blankenstein T. CD4+ T cell--mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity 2000;12(6):677-86.
7. Mondal A, Smith C, DuHadaway JB, Sutanto-Ward E, Prendergast GC, Bravo-Nuevo A, et al. IDO1 is an Integral Mediator of Inflammatory Neovascularization. EBioMedicine 2016;14:74-82.
8. Taylor MW, Feng GS. Relationship between interferon-gamma, indoleamine 2,3-dioxygenase, and tryptophan catabolism. FASEB J 1991;5(11):2516-22.
9. Smith C, Chang MY, Parker KH, Beury DW, Duhadaway JB, Flick HE, et al. IDO Is a nodal pathogenic driver of lung cancer and metastasis development. Cancer Discov 2012;2(8):722-35.
10. Metz R, Smith C, DuHadaway JB, Chandler P, Baban B, Merlo LM, et al. IDO2 is critical for IDO1-mediated T-cell regulation and exerts a non-redundant function in inflammation. Int Immunol 2014;26(7):357-67.
11. Liu H, Huang L, Bradley J, Liu K, Bardhan K, Ron D, et al. GCN2-dependent metabolic stress is essential for endotoxemic cytokine induction and pathology. Mol Cell Biol 2014;34(3):428-38.
12. Sharma MD, Hou DY, Liu Y, Koni PA, Metz R, Chandler P, et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase controls conversion of Foxp3+ Tregs to TH17-like cells in tumor-draining lymph nodes. Blood 2009;113(24):6102-11.
13. Litzenburger UM, Opitz CA, Sahm F, Rauschenbach KJ, Trump S, Winter M, et al. Constitutive IDO expression in human cancer is sustained by an autocrine signaling loop involving IL-6, STAT3 and the AHR. Oncotarget 2014;5(4):1038-51.
14. Prendergast GC, Malachowski WP, DuHadaway JB, Muller AJ. Discovery of IDO1 Inhibitors: From Bench to Bedside. Cancer Res 2017;77(24):6795-811.
15. Munn DH, Sharma MD, Baban B, Harding HP, Zhang Y, Ron D, et al. GCN2 Kinase in T Cells Mediates Proliferative Arrest and Anergy Induction in Response to Indoleamine 2,3- Dioxygenase. Immunity 2005;22(5):633-42.
16. Dey S, Sutanto-Ward E, Kopp KL, DuHadaway J, Mondal A, Ghaban D, et al. Peptide vaccination directed against IDO1-expressing immune cells elicits CD8 + and CD4 + T-cellmediated antitumor immunity and enhanced anti-PD1 responses. J Immunother Cancer 2020;8(2):e000605.
17. Connor KM, Krah NM, Dennison RJ, Aderman CM, Chen J, Guerin KI, et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nat Protoc 2009;4(11):1565-73.
18. Muller AJ, DuHadaway JB, Jaller D, Curtis P, Metz R, Prendergast GC. Immunotherapeutic suppression of indoleamine 2,3-dioxygenase and tumor growth with ethyl pyruvate. Cancer Res 2010;70(5):1845-53.
19. Thevenot PT, Sierra RA, Raber PL, Al-Khami AA, Trillo-Tinoco J, Zarreii P, et al. The stress-response sensor CHOP regulates the function and accumulation of myeloid-derived suppressor cells in tumors. Immunity 2014;41(3):389-401.
20. Ron D. Translational control in the endoplasmic reticulum stress response. J Clin Invest 2002;110(10):1383-88.
21. Matsushita N, Sogawa K, Ema M, Yoshida A, Fujii-Kuriyama Y. A factor binding to the xenobiotic responsive element (XRE) of P-4501A1 gene consists of at least two helix-loophelix proteins, Ah receptor and Arnt. J Biol Chem 1993;268(28):21002-06.
22. Sidrauski C, Acosta-Alvear D, Khoutorsky A, Vedantham P, Hearn BR, Li H, et al. Pharmacological brake-release of mRNA translation enhances cognitive memory. Elife 2013;2:e00498.
23. Schmees N, Gutcher I, Roehn U, Irlbacher H, Stoeckigt D, Bader B, et al. Identification of BAY-218, a potent and selective small-molecule AhR inhibitor, as a new modality to counteract tumor immunosuppression [abstract]. In: Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting 2019; 2019 Mar 29-Apr 3; Atlanta, GA. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2019;79(13 Suppl): Abstract nr 4454.
24. Sinha P, Clements VK, Ostrand-Rosenberg S. Reduction of myeloid-derived suppressor cells and induction of M1 macrophages facilitate the rejection of established metastatic disease. J Immunol 2005;174(2):636-45.
25. Bosiljcic M, Cederberg RA, Hamilton MJ, LePard NE, Harbourne BT, Collier JL, et al. Targeting myeloid-derived suppressor cells in combination with primary mammary tumor resection reduces metastatic growth in the lungs. Breast Cancer Res 2019;21(1):103.
26. Munn DH, Mellor AL. Indoleamine 2,3 dioxygenase and metabolic control of immune responses. Trends Immunol 2013;34(3):137-43.
27. Mellor AL, Munn DH. Tryptophan catabolism and T-cell tolerance: immunosuppression by starvation? Immunol Today 1999;20:469-73.
28. Moffett JR, Namboodiri MA. Tryptophan and the immune response. Immunol Cell Biol 2003;81(4):247-65.
29. Opitz CA, Litzenburger UM, Sahm F, Ott M, Tritschler I, Trump S, et al. An endogenous tumour-promoting ligand of the human aryl hydrocarbon receptor. Nature 2011;478(7368):197-203.
30. Badawy AA, Namboodiri AM, Moffett JR. The end of the road for the tryptophan depletion concept in pregnancy and infection. Clin Sci (Lond) 2016;130(15):1327-33.
31. Bronte V, Brandau S, Chen SH, Colombo MP, Frey AB, Greten TF, et al. Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards. Nat Commun 2016;7:12150.
32. Novitskiy SV, Pickup MW, Gorska AE, Owens P, Chytil A, Aakre M, et al. TGF-beta receptor II loss promotes mammary carcinoma progression by Th17 dependent mechanisms. Cancer Discov 2011;1(5):430-41.
33. Schafer CC, Wang Y, Hough KP, Sawant A, Grant SC, Thannickal VJ, et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase regulates anti-tumor immunity in lung cancer by metabolic reprogramming of immune cells in the tumor microenvironment. Oncotarget 2016;7(46):75407-24.
34. Yu J, Wang Y, Yan F, Zhang P, Li H, Zhao H, et al. Noncanonical NF-kappaB activation mediates STAT3-stimulated IDO upregulation in myeloid-derived suppressor cells in breast cancer. J Immunol 2014;193(5):2574-86.
35. Van de Velde LA, Gingras S, Pelletier S, Murray PJ. Issues with the Specificity of Immunological Reagents for Murine IDO1. Cell Metab 2016;23(3):389-90.
36. Thomas S, DuHadaway J, Prendergast GC, Laury-Kleintop L. Specific in situ detection of murine indoleamine 2, 3-dioxygenase. J Cell Biochem 2014;115(2):391-6.
37. Zhao T, Ding X, Du H, Yan C. Myeloid-derived suppressor cells are involved in lysosomal acid lipase deficiency-induced endothelial cell dysfunctions. J Immunol 2014;193(4):1942- 53.
38. Fainaru O, Hantisteanu S, Hallak M. Immature myeloid cells accumulate in mouse placenta and promote angiogenesis. Am J Obstet Gynecol 2011;204(6):544 e18-23.
39. Kammertoens T, Friese C, Arina A, Idel C, Briesemeister D, Rothe M, et al. Tumour ischaemia by interferon-gamma resembles physiological blood vessel regression. Nature 2017;545(7652):98-102.
40. Deng J, Liu X, Rong L, Ni C, Li X, Yang W, et al. IFN-responsiveness of endothelial cells leads to efficient angiostasis in tumours involving down-regulation of Dll4. J Pathol 2014;233:170-82.
41. Gopinathan G, Milagre C, Pearce OM, Reynolds LE, Hodivala-Dilke K, Leinster DA, et al. Interleukin-6 Stimulates Defective Angiogenesis. Cancer Res 2015;75(15):3098-107.
42. Bunt SK, Yang L, Sinha P, Clements VK, Leips J, Ostrand-Rosenberg S. Reduced inflammation in the tumor microenvironment delays the accumulation of myeloid-derived suppressor cells and limits tumor progression. Cancer Res 2007;67(20):10019-26.
43. Middleton K, Jones J, Lwin Z, Coward JI. Interleukin-6: an angiogenic target in solid tumours. Crit Rev Oncol Hematol 2014;89(1):129-39.
44. Condamine T, Ramachandran I, Youn JI, Gabrilovich DI. Regulation of tumor metastasis by myeloid-derived suppressor cells. Annu Rev Med 2015;66:97-110.
45. Hoffmann D, Dvorakova T, Stroobant V, Bouzin C, Daumerie A, Solvay M, et al. Tryptophan 2,3-Dioxygenase Expression Identified in Human Hepatocellular Carcinoma Cells and in Intratumoral Pericytes of Most Cancers. Cancer Immunol Res 2020;8(1):19-31.
46. Tian L, Goldstein A, Wang H, Ching Lo H, Sun Kim I, Welte T, et al. Mutual regulation of tumour vessel normalization and immunostimulatory reprogramming. Nature 2017;544(7649):250-54.
47. Jain RK. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science 2005;307(5706):58-62.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (35)

  1. 대상체에서 망막병증(retinopathy)을 치료하거나 병리학적 혈관신생(neovascularization)을 저해하는 방법으로서,
    대상체의 눈에서 IDO-의존성 혈관화 세포(IDVC: IDO-dependent vascularizing cell)를 제거하거나 저해하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 IDVC는 혈관신생에서 역할을 하는 것을 기능적으로 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    혈관신생의 확립 및 유지는 IDVC 내에서 IDO1의 유도를 필요로 하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    IDVC 활성의 저해는 IDO1의 저해에 의해 달성되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IDVC는 IDVC의 세포-표면 마커에 대한 항체를 사용하여 저해되거나 제거되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    세포 표면 마커는 CD33, CD11b, CD15 및 CD66으로부터 선택되는, 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    세포 표면 마커는 CD274(PDL1), MHC 부류(class) II, CD4, CD31(PECAM-1), CD202B(TIE2), CD205(DEC-205), Siglec 8 및 EMR1로부터 선택되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    IDVC에서 통합 스트레스 반응(ISR: integrated stress response)을 차단하거나 저해하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    안구 조직에서 통합 스트레스 반응(ISR)을 차단하거나 저해하는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    망막 또는 맥락막에서 통합 스트레스 반응(ISR)을 차단하거나 저해하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    ISR 경로 노드(node)의 발현, 유도, 활성 및/또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    (a) GCN2의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계; 및/또는
    (b) ATF4의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계; 및/또는
    (c) CHOP의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, IL-6을 차단하거나 저해하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 대상체에서 망막병증을 치료하거나 병리학적 혈관신생을 저해하는 방법으로서,
    통합 스트레스 반응의 신호전달 분자 다운스트림을 차단하거나 저해하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 신호전달 분자는 사이토카인인, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 사이토카인은 IL-6인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    임의의 형태의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달을 차단하거나 저해하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    VEGF 저해제는 유일한 치료제로서 투여되는 것보다 덜 빈번하게 투여되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    인돌아민 2,3 디옥시게나제-1(IDO1)의 발현, 유도, 활성 또는 신호전달의 저해제와 병용되어 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    IDVC는 눈의 망막에 위치하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    IDVC는 눈의 맥락막에 위치하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료제의 투여 경로는 경구 투여, 정맥내 주사, 비강내 투여, 설하 투여, 유리체내 주사, 안구내 주사, 데폿 제형 또는 장치를 통한 투여 또는 점안액을 통한 투여를 포함하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    IDO-1의 차단제 또는 저해제는 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 방법:
    i. 1-메틸-D-트립토판(인독시모드(indoximod)), 1-메틸-L-트립토판, 1-메틸-D-트립토판과 1-메틸-L-트립토판의 라세미 혼합물, 에파카도스타트(epacadostat), 나복시모드(navoximod)(GDC-0919) 및 NLG802, 또는 이의 염, 거울상이성질체 또는 전구약물;
    ii. 1-R-D-트립토판 또는 1-R-L-트립토판, 여기서 R은 C1-C12 알킬임;
    iii. 메틸티오히단토인-DL-트립토판(MTH-Trp), β-(3-β)-DL-알라닌, β-(3-벤조(b)티에닐)-DL-알라닌, 6-니트로-L-트립토판, 인돌 3-카르비놀, 3,3'-디인돌릴메탄, 에피갈로카테킨 갈레이트, 5-Br-4-Cl-인독실 1,3-디아세테이트, 9-비닐카르바졸, 아세메타신(acemetacin), 5-브로모-DL-트립토판, 5-브로모인독실 디아세테이트, 나프토퀴논-기초, S-알릴-브라씨닌, S-벤질-브라씨닌, 5-브로모-브라씨닌, 페닐이미다졸-기초, 4-페닐이미다졸, 엑시구아민 A(Exiguamine A) 및 NSC401366; 또는
    iv. BMS-986205/ONO-7701, PF-06840003/ EOS200271, MK-7162/IOM2983, LY3381916, KHK2455, HTI-1090/SHR9146, DN1406131, RG70099, Roxyl-WL, TPST-8844, 에틸 피루베이트, Amg-1 또는 DX-03-12, 또는 이의 염, 거울상이성질체 또는 전구약물 또는 임의의 치료적 유효 제형.
  24. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    VEGF 저해제는 하기 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    라니비주맙(ranibizumab)(Lucentis®), 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin®), 아플리베르셉트(aflibercept)(Eylea®), 브롤루시주맙(brolucizumab)(Boevu®), 페갑타닙(pegaptanib)(Macugen®), 아비시파르 페골(Abicipar pegol), 라니비주맙 바이오시밀러 FYB201, PF582, SB11 및 엑스루칸(Xlucane), 아플리베르셉트 바이오시밀러 MYL-1701P/M-710, 또는 콘베르셉트(conbercept), 파리시맙/RG7716(이중특이적 항체 VEGF-A + Ang-2), OPT-302(VEGF-C/D '트랩(trap)'), KS301(Kodiak Sciences - 항-VEGF 중합체 접합 생물제제), KS501(Kodiak Sciences - 항-VEGF 트랩 + 항-IL6 항체 융합).
  25. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    ISR 경로 노드는 상기 ISR 경로 노드의 번역 또는 전사를 저해하는 저분자에 의해 저해되는, 방법.
  26. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    ISR 경로 노드는 상기 ISR 경로 노드의 번역 또는 전사를 저해하는 생물학적 분자에 의해 저해되는, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    생물학적 분자는 항체 또는 이의 단편인, 방법.
  28. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    ISR 경로 노드는 상기 ISR 경로 노드의 번역 또는 전사를 저해하는 핵산 분자에 의해 저해되는, 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA인, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    GCN2 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    GCN2 저해제는 GCN2-IN-1(A-92), GCN2iA, GZD824, 트리아졸로[4,5-d]피리미딘 스캐폴드에 기초한 저해제로부터 선택되는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    CHOP 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    ATF4 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    ATF4 저해제는 우르솔릭산(ursolic acid), 토마티딘(tomatidine), GSK2606414 및 TRIB3으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제25항에 있어서,
    ISR 경로-차단 약물은 GSK-2606414, RPT-GCN2i, AMG-PERK44 및 trans-ISRIB로부터 선택되는, 방법.
KR1020237022126A 2020-12-07 2021-12-07 혈관신생과 관련된 병리학적 증상을 치료하기 위한ido1-의존성 혈관화 세포를 이용한 방법 및 조성물 KR20230140614A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063122121P 2020-12-07 2020-12-07
US63/122,121 2020-12-07
PCT/US2021/062217 WO2022125553A1 (en) 2020-12-07 2021-12-07 Methods and compositions utilizing ido1-dependent vascularizing cells for the treatment of pathological conditions involving neovascularization

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230140614A true KR20230140614A (ko) 2023-10-06

Family

ID=81973971

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237022126A KR20230140614A (ko) 2020-12-07 2021-12-07 혈관신생과 관련된 병리학적 증상을 치료하기 위한ido1-의존성 혈관화 세포를 이용한 방법 및 조성물

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20240084002A1 (ko)
EP (1) EP4255423A1 (ko)
JP (1) JP2024501582A (ko)
KR (1) KR20230140614A (ko)
CN (1) CN116806149A (ko)
CA (1) CA3204497A1 (ko)
WO (1) WO2022125553A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024077092A1 (en) * 2022-10-04 2024-04-11 Hibercell, Inc. Gcn2 inhibitor for treating metastases

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10525035B2 (en) * 2014-12-18 2020-01-07 Lankenau Institute For Medical Research Methods and compositions for the treatment of retinopathy and other ocular diseases

Also Published As

Publication number Publication date
CN116806149A (zh) 2023-09-26
JP2024501582A (ja) 2024-01-12
EP4255423A1 (en) 2023-10-11
CA3204497A1 (en) 2022-06-16
US20240084002A1 (en) 2024-03-14
WO2022125553A1 (en) 2022-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7189860B2 (ja) ヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗原受容体を用いたがんの処置
JP7194146B2 (ja) 炎症を処置および予防するための組成物および方法
US20210023135A1 (en) Cellular immunotherapy compositions and uses thereof
JP7186196B2 (ja) 腫瘍免疫寛容を破綻させるためのｙａｐの阻害方法
CN110023332B (zh) 包含sasp调节剂和衰老衰减剂的组合物及其用于调节细胞衰老的用途
US20170020964A1 (en) Methods and compositions for treatment of metastatic and refractory cancers and tumors
US11197890B2 (en) Methods of treating cancer, infectious disease, and autoimmune disease using CXC chemokines
WO2018085275A1 (en) Targeting lats1/2 and the hippo intracellular signaling pathway for cancer immunotherapy
US10695341B2 (en) Compositions and methods for treating endometriosis
CA3125368A1 (en) Targeting minimal residual disease in cancer with cd36 antagonists
US20160209425A1 (en) Use of dectin-1 activators for treatment of liver disorders
WO2012064967A2 (en) Cancer cell-derived receptor activator of the nf-kb ligand drives bone and soft tissue metastases
KR20230140614A (ko) 혈관신생과 관련된 병리학적 증상을 치료하기 위한ido1-의존성 혈관화 세포를 이용한 방법 및 조성물
Shen et al. AUY922 induces retinal toxicity through attenuating TRPM1
US20230107770A1 (en) Method of enhancing immunotherapy using er stress pathway inhibitors
CN118251406A (zh) 血管活性肠肽(vip)受体拮抗剂
JP2023526453A (ja) 膵炎の治療及び膵臓がんの予防のための方法
KR20230058408A (ko) 암 면역 미세 환경 조절 물질 및 그에 따른 예방·진단·치료적 이용
US20230338423A1 (en) Targetable immune checkpoint for immunotherapy
Fu Tarloxotinib amplifies the anti-tumour efficacy of immune checkpoint inhibitors through multiple mechanisms
JP7334249B2 (ja) 敗血症の治療に使用するための初期アポトーシス細胞
CA3210477A1 (en) Methods of treating cancers using sting agonists
JP2017057173A (ja) Ｔｉｍ−３をターゲットとする脳損傷疾患治療用組成物及びこのスクリーニング方法
WO2023107538A2 (en) Binders of chondroitin sulfate proteoglycan (cspg4) polypeptides
Frusteri Targeting immune dysregulation mediated by FLIP and putative FLIP-related pathways to develop new therapeutic approaches

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant