JP2011518212A

JP2011518212A - 自己免疫疾患の治療における、ｐａｔノナペプチドの使用

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Publication number: JP2011518212A
Application number: JP2011505547A
Authority: JP
Inventors: ジャマルテムサマニ; クロードラリュエル
Original assignee: セーエルエルファルマ
Priority date: 2008-04-21
Filing date: 2009-04-15
Publication date: 2011-06-23
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Abstract

本発明は、自己免疫疾患、特に、リウマチ様関節炎および慢性炎症性腸疾患（ＣＩＢＤ）、例えばクーロン病の治療における、サイムリン類似体であるＰＡＴノナペプチドの使用に関する。

Description

本発明は、自己免疫疾患の治療における薬物の製造における、ＰＡＴノナペプチドの使用に関する。

自己免疫疾患は、ある種の自己成分を不適切な方法で認識して異常免疫応答を引き起こす免疫系の機能障害による。身体は、自己の免疫系により「攻撃」される。今日、自己免疫疾患のリストは網羅されており、特に、クローン病及び出血性直腸結腸炎のような慢性炎症性腸疾患（chronic inflammatory bowel disease：ＣＩＢＤ）；多発性硬化症；乾癬性関節炎；バセドウ病；慢性関節；播種性紅斑性狼瘡；インシュリン依存型糖尿病；脊椎関節炎等を理解する。緊急の医学的必要性のある自己免疫疾患の中でも、本発明者らは、描写的であるが非制限的な方法で、クローン病、リウマチ様多発性関節炎、出血性直腸結腸炎、多発性硬化症及び乾癬を述べるであろう。クローン病、多発性関節炎のようなほとんどの自己免疫疾患において、ＴＮＦ−αのようなある種のサイトカインが健常組織の攻撃を誘導し、各病状に特徴的な種々の病変を引き起こす。

慢性炎症性腸疾患（ＣＩＢＤ）は、腸に影響を及ぼす慢性的な炎症により特徴づけられる疾患である。ＣＩＢＤに共通する生理病理学的メカニズムは、腸粘膜の炎症である。この炎症は、遺伝形質及び環境要因の両方によって引き起こされる腸内免疫系の活性化により引き起こされる。このＣＩＢＤの群には、危機により発生し、一生続く傾向にある、次の２つの大きな慢性的及び再発性の疾患が含まれる：
− 口から肛門までのほとんど全ての消化管、優先的には小腸の最後の部分及び結腸の開始部分に影響を及ぼし得るクローン病（診断は、慢性的な下痢、腹痛、肛門周囲の瘻孔又は膿瘍、痩せること及び発熱をベースとする。クローン病及び潰瘍性結腸炎における炎症の継続は、炎症促進性サイトカインの分泌の増加により一部はチェックされ得る（非特許文献１）。同じ文献により、結腸生検からの炎症促進性のＴＮＦ−α、ＩＬ−１−β及びＩＬ−６サイトカインの用量は、ＣＩＢＤに罹患した患者における粘膜炎症の重症度を観察する高感度法を示す。）；
− 直腸及び結腸にのみ見いだされる出血性直腸結腸炎（hemorrhagic rectocolitis：ＨＲＣ）。

ＣＩＢＤの重症型に対し、今日では、種々の治療により、徴候的発症を示す患者が治療され、抗炎症薬；コルチコイド；免疫抑制剤；生物療法及び手術を用いることにより、ある程度は患者をそうした状況から遠ざけることが可能である。抗炎症薬治療の中で、本発明者らは、毒性を誘導することの少ないサリチル酸誘導体を引用することができる。最新の医療によれば、メサラジンは、第１の炎症の発症の初期に投与される治療法である。その後、コルチゾンのようなより強力であるが毒性の強い抗炎症薬も用いられている。これらの治療法が有効でないと思われる場合、そのようなクローン病に対する、より最近の治療法；ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体に相当する、Remicade（登録商標）と呼ばれる新規な治療法を用いる可能性もある。これは高度な標的薬物であるが、非常に高価でもあり、例えば、コルチゾンによる治療に抵抗的な発症を治療することができ、クローン病を寛解期に維持することができる。維持療法として、患者が再発しないことを予防するため、免疫力を低下させるサリチル酸塩及び免疫抑制剤が用いられ；後者は前記疾患の１つに罹患した患者内で過剰発現する。残念なことに、しばしば、前記疾患の１つに罹患した患者において手術を行う必要があり；第１に、腸の短縮が現れる場合がよくあるので、発症の８〜１０年後に、クローン病に罹患した２人の患者のうちの１人以上が手術を受け；そうした場合の約２０％において、肛門の周囲に膿瘍が現れる場合がある。治療に抵抗性のある、出血性直腸結腸炎に罹患した患者の中で、その後、結腸及び直腸の切除からなる手術を行い；これは比較的重い治療介入である。しかし、クローン病に罹患した患者においては、手術が合併症のみを治療し、患者の手術後の疾患の再発を予防しない。

リウマチ性多発性関節炎（polyarthrite rhumatoide：ＰＲ）は、その正確な発生源が不明の自己免疫疾患であり、慢性多発性関節炎の最も頻発する原因である。これは、成人において最も多く見られる炎症性リウマチのタイプである。その有病率は、国によって０．３から０．８％と推定される。これは、しばしば左右の対称な関節の症状によって特徴づけられ、発作によって、冒された関節の変形及び破壊へと進行する。この疾患は、一般的に、多発性関節炎、すなわち、４つ以上の関節の炎症によって始まり、炎症性の時間的なの苦痛（夜間の覚醒、３０分を越える朝のウォーミングアップ）、関節の硬直、及び滑膜炎と呼ばれる腫れによって特徴づけられる。最も多くは、数十年にわたる進行が、予知できないリズムと期間の小康状態をはさんで発作によって進展する。発作の間、一般的な症状(微熱、無力症)と組合わされて、及びしばしば生物的炎症の兆候によって、関節の大部分が腫れて痛む。この疾患の活動状態の検査は、種々のスコアによって行うことができる。臨床上実際に最もよく利用されているのは、DAS28で、これは、４つのパラメータから計算される。そのパラメータとは、関節指標（痛みのある関節の数、但し相容れない足のくるぶしと腰を除く）、滑液指標（腫れた関節の数、但し足のくるぶしと腰を除く）、患者によって０から１００の尺度で評価される疾患の活動状態、及び血球沈降速度である。対症治療には、発作時の単純な休息、伝統的な鎮痛治療、非ステロイドの抗炎症薬、副作用を制限するための１０ｍｇ／日未満の少量のコルチコステロイドが含まれうる。疾患の深刻さに従った根本的な治療については、現在、一連の分子が存在し、これらは、特にメソトレクサート、アザチオプリンやシクロスポリンのような特定の免疫抑制剤、抗TNFアルファ、CTLA4の阻害剤、又は抗CD20として使用されうる。しかし、これらの分子の幾つかは、誘発される重大な副作用のため慎重に使用されなければならず、又は、特定の患者には充分に有効でなく、従って組み合わせて用いなければならない。

多発性硬化症（multiple sclerosis：ＭＳ）は、中枢神経系に影響を及ぼす炎症性疾患である。それは、特に、脳の白質及び骨髄内の炎症性脱髄、ミエリン崩壊に関与する。古い病変は星状細胞が増殖する位置にあり、神経組織の硬化により特徴づけられる。これらの脱髄病変は特異分布及びトポグラフィーを有している；びまん性ではないが斑状になっている。病変を特徴づける多発性という形態は、身内の者（family circle）が理解することを困難にし、医学界にとってそれを診断することは複雑である。現在の治療法は、炎症発症の頻度及び程度を制限することを目的とする。それらは、２つの部分：発症治療及び基本的治療を含む。発症治療として、経口ルートによる約３週間のリレーとしてコルチコステロイドが処方される場合があるが、これは、コルチコステロイドの副作用に関する予防方法と関連付けられる。基本的治療として、通常はベータインターフェロン及び酢酸グラチラマー（数種のアミノ酸のコポリマー）が処方される。重症型において、ミトキサントロンのような免疫抑制剤が処方され得る。ナタリズマブ（白血球のインテグリンα鎖に対する抗体）のような抗体及びRemicade（商標）（モノクローナル抗−ＴＮＦ−α）のような抗体も処方される。

乾癬は、皮膚病であるが、その起源は、部分的には遺伝によるものとされるが、あまり知られていない。この皮膚病変は、男女を問わず、人口の１〜３％に影響を及ぼす。数種の乾癬タイプがある：尋常性乾癬、突発的な乾癬（psoriasis eruptiva）、乾癬性紅皮症、膿疱性乾癬、乾癬性関節炎がある。その良性型において、乾癬は、頭皮、爪、膝、肘、足、手及び時には性器に限定される。重症の場合、それは全身にまで広がる。この慢性皮膚疾患は非常に独特な発症を示し、発疹を伴うが、寛解も伴い、その間は病変が消失する。その後、乾癬は「白くなる」といわれている。休止期間の長さにはかなりのばらつきがあり、寛解はしばしば不完全である。今日まで、乾癬からの完全な回復を可能にする治療的処置は知られていない；しかし、乾癬を抑制し、病変範囲を減少させ、患者の生活を向上させることは可能である。以下の種々のタイプの治療法がある；
− 重症でないタイプの局所治療であり、これは、コルチコステロイド、カルシポトリエン又はタザロテンを含むクリームを乾癬の領域に塗布することからなる：これらの治療法は、乾癬において有利な効果を有するが、残念ながら治療を停止すると、斑がしばしば再発する：最後の治療は脱感作の形態をも形成し、時間の経過とともに、投与量を増加させることが強いられる：更に、これらのポマードが広い領域に塗布される場合、効果は局所だけではない：従って、この治療形態は、短期間かつ限定された領域内での、急性又は非常に不快な形態に限定されるべきである；
− 光線療法：太陽光への暴露は、一般的に乾癬に有利な影響を有する。しかし、１０％の場合において、この暴露は有害であろう：その場合、患者は、日光を回避し、又は少なくとも直射日光を浴びることを回避しなければならないであろう；
− 全身治療：乾癬のほとんどの重症型について、開業医は、経口投与又は注射による治療を処方することができる：この場合、メトトレキサート、シクロスポリン又は抗−αＴＮＦ抗体が用いられ得る：これらの治療法は、全身的と呼ばれる：薬物が身体の全てに広まることが意図されるからである：しばしば、それらは、副作用を起こし、時には重い副作用を起こす場合もある。

これらの例から、自己免疫疾患を治療するための現在利用できる治療法は数に限定があり、時には非常に辛くて、効果がないと思われることが結論される。これは、この分野における研究の重要性を示している。いくつかの薬学の研究室及び大学が自己免疫疾患の薬物又は治療法を開発している。本発明者らは、例として、プリン含有治療薬（特許文献１および２）；抗−サイトカイン又は抗受容体抗体（特許文献３〜７）；ワクチン又は自己抗原（特許文献８〜１０）等を引用することができる。これらの治療分子は、いまだ基礎研究又は臨床研究中であり、現在、ヒトにおけるそれらの効果を評価することは困難である。

本出願人は、免疫系において活性なサイムリン（thymulin）類似体ペプチド、及び自己免疫疾患における治療に興味を持った。１９５０年代の終わりから、胸腺が、Ｔリンパ球の分化において中心的役割を果たしており、Ｔリンパ球は、特に、移植片拒絶、並びにウイルス及び特定の細菌に対する防御に関与することが知られている。その後、胸腺により分泌されるホルモンが９個のアミノ酸のペプチド；サイムリンとして同定された（非特許文献２〜３）。免疫系におけるサイムリンの特性は亜鉛依存性があることが示された。実際、ペプチドと関連する亜鉛は、このものに、分子の活性型に相当する四面体のコンホメーションを与える。亜鉛の非存在下では、サイムリンは免疫系において活性を有しなくなる。

本発明のサイムリンの類似ペプチドは、既に、炎症性及び神経原性の痛みの治療に関して文献に記載されている（特許文献１１、非特許文献４〜５）。後者の刊行物では、ラットについて足底内経路(i.pl)及び腹腔内経路(i.p)を経たエンドトキシン注入を用いて行われた一連の実験の結果、ＰＡＴペプチドが沈痛性及び抗炎症性の作用を示すことが報告されている。サイトカインの調合は、皮膚及び肝臓の組織の採取見本について行われた。これらの著者は、腸管の炎症性痛みについて関心がなく、リウマチ性関節炎に起因する痛みについても関心がないことを明記することは重要である。さらに、その出願に用いられたモデルは、ＣＩＢＤ（クローン病、出血性直腸結腸炎）又はリウマチ性多発性関節炎のような自己免疫性及び炎症性の疾患を研究するためのモデルとみなすことは全くできない。実際、カプサイシンのモデルは、内臓の痛みのモデルとしてこの研究に用いられている。カプサイシンは、焼けつく痛みや苦痛の感覚を生じさせる分子である。それは知覚神経のニューロンのレベルに関するもので、厳密な意味での炎症のレベルに関するものでないことを明記することは重要である。一例において、カプサイシンが、予めＰＡＴペプチドを受容したラットに注入され、次いで、カプサイシンによって生じた侵害受容(苦痛の知覚)のスコアが読み取られていることが記載されている。既にその作用モデルによって、カプサイシンのモデルが、ＣＩＢＤのような自己免疫疾患の研究に適していないことを確かめることができる。さらに、特許文献１１は、クローン病や出血性直腸結腸炎としてのＣＩＢＤのような自己免疫疾患に特定的に言及していない。

仏国特許出願公開第２８５１２４８号明細書国際公開第９６／１８３９７号パンフレット米国特許出願公開第２００３／２３２００９号明細書国際公開第０６／１２１８５２号パンフレット国際公開第０６／０９２５３０号パンフレット欧州特許出願公開第１５９３３９３号明細書国際公開第０７／００９０６５号パンフレット国際公開第０１／７４３７５号パンフレット欧州特許出願公開第１６２１２０８号明細書国際公開第０７／０４４３９４号パンフレット国際公開第０３／０３０９２７号パンフレット

レイネカー・エイチ・シー（Reinecker HC）ら著、Clin.Exp.Immunol、１９９３年、第９４巻、ｐ．１７４−１８１）バッハ・プロウ（Bach,Pleau）ら著、Immunol letters、１９７９年、第１巻、ｐ．１７９−１８２アモル（Amor）ら著、Annals of the Rheumatic Disease、１９８７年、第４６巻、ｐ．５４９−５５４サッデ（Saade）ら著、Neuroscience、２００３年、第１１９巻、第１号、ｐ．１５５−６５サフィ−ガラベディアン（Safieh-Garabedian）ら著、Br J Pharmacol.、２００２年７月、第１３６巻、第６号、ｐ．９４７−５５

本出願人は、無害性が確立されているＰＡＴノナペプチドを、ＣＩＢＤ、リウマチ様多発性関節炎、多発性硬化症又は乾癬のような自己免疫疾患を治療するための新規な薬物として見なすことができるかどうかを決定することに興味を持った。

本発明は、慢性炎症性腸疾患（ＣＩＢＤ）；リウマチ様多発性関節炎、多発性硬化症及び乾癬性関節炎の乾癬のような自己免疫疾患の治療用薬物の製造における、式（Ｉ）：
ＥＡＫＳＱＧＧＳＤ；
に対応するＰＡＴノナペプチド又は薬学的に許容されるその塩の１種の使用に関する。

本発明は、特に、ＣＩＢＤの治療におけるＰＡＴペプチドの治療使用に関する：クローン病が好ましい適応である。

好ましい別の実施態様によれば、本発明は、関節炎の治療におけるＰＡＴペプチドの治療使用に関する；リウマチ様多発性関節炎が好ましい適応である。

ＰＡＴペプチドは、ヒトまたは動物に、０．１〜５０ｍｇ、好ましくは１〜１０ｍｇの用量で投与される。

「薬学的に許容される塩」は、例えばかつ非限定的に酢酸塩、硫酸塩又は塩酸塩であると理解される。

本発明はまた、１個以上のアミノ酸がＤ配置である、式（Ｉ）の化合物の使用に関する。

本発明による医薬組成物は、
− 腹腔内、皮下、静脈内又は筋肉内経路に適した、注射可能な製剤の形態におけるような非経口経路；
− コーティングされているか又はされていない錠剤、カプセル剤、粉末、丸薬、懸濁液又は経口液剤の形態のような経口経路：経口経路による投与のためのそのような形態は、有効成分の即効性、持続性または遅延性の放出のいずれか与えることができる；持続性または遅延性の放出を伴うそのような形態は、例えば、特許出願EP 253104またはEP 576643に記載されている
− 直腸経路、例えば、座剤の形態；
− 局所経路、特に、パッチ、ポマード又はゲルの形態での経皮経路；
− エアロゾル及びスプレーの形態などでの鼻腔内経路；
−舌下経路；
−眼内経路
による投与に適した剤形で提示される。

薬学的に許容される賦形剤は、投与様式に従って現在用いられている賦形剤の中から選択され得る。

本発明の他の利点及び特徴は、以下の実施例を読む間に明らかとなろう。それは、添付図面に言及するであろう。

図１は、ＴＮＢＳ注射により大腸炎が誘導された動物の体重におけるＰＡＴノナペプチドの効果を示す。図２は、あらかじめＴＮＢＳにより引き起こされた大腸の炎症におけるＰＡＴノナペプチドの効果を示す。図３は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６炎症促進性サイトカイン、並びにＩＬ−１０抗炎症性サイトカインにおけるＰＡＴノナペプチドの効果を示す。図４は、関節炎のラットの脚の体積に関して参照用のＡＩＮＳ（インドメタシン）の効果と比較した（異なった2つの服用量の）ＰＡＴペプチドの効果を示す。図５は、関節炎のラットにおける肉眼観察される臨床スコアに関して参照用のＡＩＮＳ（インドメタシン）の効果と比較した（異なった2つの服用量の）ＰＡＴペプチドの効果を示す。図６は、関節炎のラットにおける足底テストによって測定された過敏症に関して参照用のＡＩＮＳ（インドメタシン）の効果と比較した（異なった2つの服用量の）ＰＡＴペプチドの効果を示す。図７は、関節炎のラットにおける赤血球沈降速度に関して参照用のＡＩＮＳ（インドメタシン）の効果と比較した（異なった2つの服用量の）ＰＡＴペプチドの効果を示す。

（実施例１：クローン病のマウスモデルにおけるＰＡＴノナペプチドの効果）
（実験手順）
（ノナペプチドの合成）
Foc/tu法に従って固相上でペプチドを製造し；それを開裂させ、トリフルオロ酢酸により脱保護し；次いで逆相分析及び分取用高圧液体クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥させた。その純度（＞９５％）及びその同定は、分析用ＨＰＬＣ及び質量分析により確認された。ノナペプチドの配列：８７７ｋＤａのＨ−ＥＡＫＳＱＧＧＳＤ−ＮＨ_２。

この合成時に、ペプチドPyroGlu-Ala-Lys-Ser-Glu-Gly-Ser-Aspの形成を生じさせるグルタミン(Glu)のピログルタミン(Pyro-Glu)への変質である頻発する分解産物を最大限に減少させるために、特に特別の注意が払われたことに注意すべきである。この分解産物は、本発明では、アセテートとの合成条件の最適化、サッカロースへのペプチドの溶液化、及び適切な製品の保管（−２０℃）によって減少させることができた。合成品は、この汚染を１．６８％含む。

（大腸炎の誘導）
実験的大腸炎の動物モデルにおいて、ＰＡＴノナペプチドを研究した。マウスにおいて、明確に確立されたＣＩＢＤ大腸炎モデルの１種は、トリニトロベンゼンスルホン酸（trinitrobenzene sulphonic acid：ＴＮＢＳ）の使用により誘発が実施されたものである。ＴＮＢＳはハプテンであり、これは、直腸内経路により投与された時に重篤な大腸貫壁性炎症を誘導する；誘導される効果は、クローン病により誘導される効果と多くの類似性を示す（Elson COらのExperimental models of inflammatory bowel disease。Gastroenterology 2003;10:1344-67；Strober WらのThe immunology of mucosal models of inflammation。Annu Rev Immunol 2002;20:495-49）。

Sugimoto K.ら（Gastroenterology 2002:123;1912-1922）により記載された手順に従い、直腸経路によりＴＮＢＳを投与した後、７〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに大腸炎を誘導する。１ｍＬのシリンジおよびポリエチレンキャニューレ（Intradermic PE-20, Becton Dickinson）を用いることによって大腸の管腔（３〜４ｃｍの長さにわたる）に、エタノール５０μＬに予め溶解したＴＮＢＳ２．５ｍｇを含有する溶液１００μＬの投与を直接的に実施する。投与後、マウスを垂直位置に３０秒間維持する。

（処置）
研究の設計は以下の通りである：
− エタノール／ＰＢＳ混合物（体積／体積）により処理された５匹のマウスの１つのコントロールバッチ；
− ＴＮＢＳ（５０％エタノール中、２．５ｍｇ）を投与する、１０匹のマウスの１つの試験バッチ；
− １μｇ／マウスの量でＴＮＢＳ及びノナペプチドを投与する、１０匹のマウスの１つの試験バッチ；
− ５μｇ／マウスの量でＴＮＢＳ及びノナペプチドを投与する、１０匹のマウスの１つの試験バッチ；
−２５μｇ／マウスの量でＴＮＢＳ及びノナペプチドを投与する、１０匹のマウスの１つのバッチ；
ＴＮＢＳによる大腸炎の誘導の３０分前に、腹腔内経路によりＰＡＴノナペプチドを投与する。ＴＮＢＳ誘導の１日後、数匹のマウス（各試験バッチの５匹；コントロールバッチの２匹）を殺処分にする。残りのマウス（各試験バッチの５匹；コントロールバッチの３匹）をＴＮＢＳ誘導の３日後に殺処分にする。

（測定されたパラメータ）
動物の体重
動物は、殺処分にするまで毎日体重測定される。

大腸の炎症
動物を殺処分にするとすぐに、大腸をサンプリングし、巨視的分析を実施する。

定量ＲＴ−ＰＣＲによるＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの発現
ＴＮＢＳ誘導後の１日及び３日に、動物を殺処分にし、大腸をサンプリングし、総ＲＮＡの抽出に進む。

チオシアン酸グアニジンを用いて変性させることによりこれを実施した；キット（Euromedex）を用いてＲＮＡ１μｇからｃＤＮＡ合成を開始する。定量ＰＣＲを実施する；ＳＹＢＲキット（Eurogentec）を用いることにより最終体積２５μＬ中で反応を実施する。基準ｃＤＮＡと比較した、各サイトカインについて刺激率（stimulation rate）を測定する。基準ｃＤＮＡは、３４Ｂ４リボソームリンタンパク質に対応するものである。

（結果）
（動物の体重）
図１において得られた結果により、直腸経路によるＴＮＢＳの注射がマウスの顕著な減量を誘導し、ＰＡＴノナペプチドの事前の投与が、この体重減少を、特に２５μｇ／マウスの投与量で制限することを可能にすることが示される。１μｇ及び５μｇ／マウスの投与量は有意な効果を示さない。

（大腸の炎症の測定）
本発明者らは、ＰＡＴノナペプチドが、ＴＮＢＳの直腸注射により引き起こされる炎症を有意な程度にまで減少させることを可能にすることを観察した。図２に示される結果によれば、この効果は濃度依存的であり、最大の効果は２５μｇ／マウスの投与量について観察される。平均すると、大腸は、コントロールマウスにおいては７ｃｍ；ＴＮＢＳ処理マウスにおいては５ｃｍ；ＴＢＮＳ−ＰＡＴ処理マウスにおいては６．５ｃｍの長さと測定される。

（炎症促進性サイトカイン投与）
図３において、本発明者らは、ＩＬ−１βサイトカインの発現がＴＮＢＳ処理マウスにおいて５０倍近くまで上昇することを観察した。ＰＡＴ２５μｇ投与後、ＩＬ−１βの発現は有意な程度にまで減少することが留意される。

ＩＬ−６の発現も、ＴＮＢＳ処理マウスにおいてかなり上昇している（約３０倍）。マウスあたり２５μｇのＰＡＴの存在下、ＩＬ−１βの発現は有意な程度にまで減少している。

ＴＮＦ−αに関して、ＴＮＢＳ処理マウスにおいて、その発現は非常にわずかに増加する（約４倍）。ＰＡＴを２５μｇ／マウスの投与量で投与すると、本発明者らは増加が顕著に低下することを観察した。

興味深いことに、本発明者らは、ＴＮＢＳ処理マウスにおいて、ＩＬ−１０抗炎症性サイトカインのレベルは上昇しないが、２５μｇ／マウスの用量でＰＡＴを前もって投与すると、このサイトカインの顕著な上昇（３倍超）を引き起こすことに気づいた。

前述したように、直腸内にＴＮＢＳを注射すると大腸の重度の炎症が誘導される。これは、クローン病により誘導される症状と、特に炎症促進性サイトカインの分泌において多くの類似点を示す。以前のものと関連づけられたこれらの結果は、ＰＡＴノナペプチドがＣＩＢＤのような自己免疫疾患の治療における優れた候補であることを主張することを可能にする。

（実施例２：ラットのリウマチ性関節炎の疾患モデルにおけるＰＡＴの効果）
（実験手順）
（リウマチ性関節炎のモデル）
Millan他の論文、J Neurosci 1986;6:899-906に記載されているようなフロインドアジュバントによって誘導された関節炎モデルを用いた。マイコバクテリウムブチリカムを受容したラットが、人間に進行するのと似た深刻な多発性関節炎を一般的に進展させた。約２００ｇの重量の系統OFA(SD)（Oncins France Strain A）のラットが右くるぶし関節部分で、１０ｍｇ／ｍＬのマイコバクテリウムブチリカム溶液の１００μＬの注入を受けた。

測定された全てのパラメータについて、ラットは以下のように、５つの群（８ラット／群）に振り分けられた。

− コントロール群：ラットが、マイコバクテリウムブチリカム溶液の代わりにパラフィン類の注射を受け（誘導された関節炎はない）、次いで腹腔内経路による生理食塩水の注射を受けた。

− 関節炎＋生理食塩水注射の群。

− 関節炎＋腹腔内経路による３ｍｇ／ｋｇのインドメタシン注射の群。インドメタシンは、このタイプのテストで基準として一般に用いられているＡＩＮＳである。

− 関節炎＋腹腔内経路による０．４μｇ／ｋｇのＰＡＴペプチドの注射の群。

− 関節炎＋腹腔内経路による４μｇ／ｋｇのＰＡＴペプチド注射の群。

それらの生成物が３週間、週当たり５回、投与された。実験の最初に（０日）、種々のパラメータ（脚部の体積、肉眼観察による臨床スコア、沈降速度及び過敏症）に関する基礎的値を決定する。

（測定されたパラメータ）
実験の間、以下の幾つかのパラメータが測定される。

− 脚部の体積（「脚部潜伏期間(paw latency duration)」）
− 赤血球沈降速度（「赤血球沈降速度(Erythrocyte Sedimentation Rate)」）及び
− 肉眼観察によるスコア
・“０”は如何なる関節炎の兆候も検出されなかったことを示す。

・“１”は１本の脚部レベルで腫れ又は炎症が検出されたことを示す。

・“２”は２本の脚部レベルで腫れ又は炎症が検出されたことを示す。

・“３”は少なくとも３本の脚部レベルで腫れ又は炎症が検出されたことを示す。

・“４”は４本の脚部レベルで腫れ又は炎症が検出されたことを示す。

− 足底テスト（「足底テスト(Plantar test)」）による過敏症：このテストを、Yukinori Nagakura他、Allodynia and hyperalgesia in adjuvant-induced arthritic rats: time course of progression and efficacy of analgesics, JPET306：490-497, 2003に従って、又はAndersen ML他、”Evacuation of acute and chronic treatments with Harpagophytum procumbens on Freund’s adjuvant-induced arthritis in rats”, J. Ethnopharmacol.2004 Apr; 91(2-3):325-30に基づいて行った。

− 赤血球沈降速度（VSG）：これが増加すると、誘導された関節炎の臨床的症状が一般的に生じる。Mahajan SGらの、Protective Effect of Ethanolic Extract of Seeds of Morinaga oleifera Lam. Against Inflammation Associated with Development of Arthritis in Rats. J Immunotoxicol. 2007 Jan;4(1):39-47の手順に従って、関節炎ラットにおけるVSG（日＝２１）をPAT又はインドメタシンの注入後1時間及び2時間で測定する。

（結果）
図４において、マイコバクテリウムブチリカムの投与後１０日から、ラットが炎症の症状を示し始めたことが観察された。指標ラットでは、脚部の体積の顕著な変化は見られなかった(図４)。フロインドアジュバントの注入によって、脚部の増大する腫れが生じ、これは、１９日まで続いた。ＰＡＴペプチド又はインドメタシンの投与による動物の治療は、最初の１２日間は顕著な効果がなかった。その反面、これらの治療は１４日から、炎症と脚部の体積の顕著な減少を生じさせた。この減少は２１日まで続いた。驚くべきことに、ＰＡＴペプチドは、２つの服用量０．４及び４μｇ／ｋｇで同じ効果を生じさせ、服用ー応答効果がないことを示唆することに注意すべきである。

図５は、ＰＡＴペプチドの投与後に臨床の肉眼観察によるスコアに関して生じた効果を、インドメタシンの投与後に生じた効果と比較して示す。塩含有溶液を受容した関節炎ラットにおいて疾患が進行し、スコアが２１日まで増加していることが観察される。それに対して、塩含有溶液を受容した関節炎ラットと比較した場合、ＰＡＴペプチド又はインドメタシンを受容した関節炎ラットにおいて肉眼観察によるスコアの大幅な減少が見られる。上記で観察されたように、腹腔内で４μｇ／ｋｇの服用量で投与されたＰＡＴペプチドは、０．４μｇ／ｋｇの服用量で投与された場合よりも少ない効果を示す。

図６は、関節炎ラットにおける足底テストによって測定された過敏症に関するＰＡＴの効果の結果を示す。０日で、潜伏期間は全ての群について同一である。１６日で、治療されない関節炎ラットの群で過敏症の非常に顕著な増加が見られ、一方、ＰＡＴペプチド（２つの服用量）によって又はインドメタシンによって治療された関節炎ラットのグループでは過敏症が非常に減少している。この過敏症は、コントロール群(治療されていない)の過敏症と同等である。

図７は、赤血球沈降速度(VSG)の結果を示す。これは、関節炎ラットにおいて相当に高い値である。反面、ＰＡＴペプチドによって又はＡＩＮＳインドメタシンによって治療された関節炎ラットにおいて大きく減少する。０．４μｇ／ｋｇの服用量の治療は、インドメタシンによる治療よりも一層VSGを減少させ（注入後1時間で測定された場合）、コントロールラットで測定されたVSGに近づくことが注目される。最後に、１０倍多いＰＡＴの服用量（４μｇ／ｋｇ）による治療は、VSGの減少について大きな効果を有さなかった。

（結論）
測定された種々のパラメータを参照すると、マイロバクテリウムによって関節炎が誘導されたラットは、人間において進行したものと似た一般的に深刻な多発性関節炎を進展させる。ＰＡＴペプチドは、少なくとも０．４μｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）の服用量で、関節炎の進行を非常に大幅に減少させることを可能とし、その作用状態は、体の種々の部分で（脚部、周辺の過敏症及び血液の沈降速度）検出可能であることが確認される。最後に、０．４μｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）の服用量で投与されたＰＡＴペプチドが、３ｍｇ／ｋｇの服用量で投与されたＡＩＮＳインドメタシンに類似した、それよりも優れた効能を有すること、すなわち、後者に対して７５００倍少ない服用量で効能を有することに注目することは興味深い。

Claims

自己免疫疾患の治療用薬物の製造における、式（Ｉ）：
ＥＡＫＳＱＧＧＳＤ
に対応するＰＡＴノナペプチドまたは薬学的に許容されるその塩の１種の使用。
自己免疫疾患は、慢性炎症性腸疾患（ＣＩＢＤ）であることを特徴とする請求項１に記載のＰＡＴノナペプチドの使用。
ＣＩＢＤは、クローン病であることを特徴とする請求項２に記載のＰＡＴノナペプチドの使用。
自己免疫疾患は、関節炎であることを特徴とする請求項１に記載のＰＡＴノナペプチドの使用。
関節炎は、リウマチ様多発関節炎であることを特徴とする請求項４に記載のＰＡＴノナペプチドの使用。
自己免疫疾患は、乾癬または多発性硬化症であることを特徴とする請求項１に記載のＰＡＴノナペプチドの使用。
ペプチドの少なくとも１種のアミノ酸は、Ｄ配置を示すことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１つに記載のＰＡＴノナペプチドの使用。
ノナペプチドが、非経口経路、経口経路、直腸経路又は他の許容される経路により投与可能な形態であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つに記載のＰＡＴノナペプチドの使用。
非経口経路に許容される用量は、０．１〜５０ｍｇであることを特徴とする請求項７に記載のＰＡＴノナペプチドの使用。
薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的に適切な剤形であることを特徴とする請求項８または９に記載のＰＡＴノナペプチドの使用。