JP2011508739A - メラノコルチン−４受容体に対するモノクローナル抗体およびその結合断片と、悪液質および関連病状および疾患の治療におけるそれらの使用 - Google Patents
メラノコルチン−４受容体に対するモノクローナル抗体およびその結合断片と、悪液質および関連病状および疾患の治療におけるそれらの使用 Download PDFInfo
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Abstract
ヒトメラノコルチン−４受容体に対する、モノクローナル抗体、結合断片、およびその誘導体、ならびにこれらを含む医薬組成物、およびこのようなモノクローナル抗体、結合断片、誘導体、および医薬組成物を使用して、悪液質および関連病状および疾患を治療する方法を含む、治療上の使用が開示される。
【選択図】図２
【選択図】図２
Description
本発明は、ヒトメラノコルチン−４受容体に対するモノクローナル抗体およびその結合断片と、このようなモノクローナル抗体および結合断片を使用して悪液質および関連病状および疾患を治療する方法に関し、このようなモノクローナル抗体および結合断片を含む医薬組成物、ならびにこのような組成物の治療上の使用にさらに関する。
癌または感染症などの慢性疾患がある患者は、食欲の低下または減退（食欲不振症）を示すことが多く、それは長時間にわたると、患者が脂肪および骨格筋量を失う病状である悪液質をもたらし、それは炎症状態を伴うことが多い。悪液質はますます、病的状態および死亡の独立した危険因子として認識されようになっている。
悪液質の従来の治療法としては、食生活の改善、およびそのためにプレドニゾロンなどのコルチコステロイド、酢酸メゲストロールや酢酸メドロキシプロゲステロンなどのプロゲステロン作用薬、およびシプロヘプタジンなどのセロトニン拮抗薬を含むいくつかの薬剤が使用されるかもしれない薬物療法が挙げられる（この点については例えばＣａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６の表１４４−２「癌悪液質の薬物治療（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｃａｃｈｅｘｉａ）」を参照されたい）。しかしこれらの薬剤は、慢性病状の結果としてこのような副作用によって悪化するかもしれない悪液質を示す患者では特に懸念されるかもしれない、既知の副作用を有するので、このような治療法は、理想的とはほど遠い。したがって、悪液質および関連病状の治療で使用される新しい治療薬の開発に対する継続的な必要性がある。
この点において、このような慢性疾患を患っている患者は典型的に、食欲不振症そしてやがては悪液質につながるＭＣＲ４−Ｒを活性化するサイトカイン産生増大を示すことから、中枢食欲低下（食欲抑制）経路の一部であるヒトメラノコルチン−４受容体（「ＭＣ４−Ｒ」）が研究対象の標的であった。例えば国際公開第９７／４７３１６号パンフレットは、ＭＣ４−Ｒに基づく、体重障害を治療するのに有用な治療薬を同定するための薬剤スクリーニングアッセイを開示する。
ＭＣ４−ＲはＧ−タンパク質共役型の受容体（ＧＰＣＲ）であり、それは主として脳内で発現されることが示されており（ガンツ（Ｇａｎｔｚ）ら，１９９３年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５１７４〜１５１７９；マウントジョイ（Ｍｏｕｎｔｊｏｙ）ら，１９９４年，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．８：１２９８〜１３０８）、エネルギー収支において重要な役割を果たすことが知られている（カウリー（Ｃｏｗｌｅｙ），ＭＡ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８０：３〜１１、２００３年；エリーズ（Ｅｌｉｅｓ），Ｒ．らＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５１：６５９〜６６６，１９９８年）。様々な生物におけるＭＣ４−Ｒの配列が文献で報告されている。この点に関しては、例えば欧州特許出願公開第１１６７３８６号明細書（イヌおよびネコの配列）および米国特許第５，７０３，２２０号明細書、および米国特許第６，１１７，９７５号明細書（ヒトの配列）を参照されたい。
ＭＣ４−Ｒの活性に影響を及ぼす非抗体化合物について報告されている（この点に関しては、例えば米国特許第７，１６９，７７７号明細書、米国特許出願公開第２００４／００８２７７９号明細書、欧州特許出願第１１６７３８６号明細書、および国際公開第０１／０８５９３０号パンフレット、および国際公開第９８／１００６８号パンフレットを参照されたい）。さらにＭＣ４−Ｒに対するポリクローナル抗体が作り出されている（ピーター（Ｐｅｔｅｒ）ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９２：Ｒ２１５１からＲ２１５８，２００７年）が、ＭＣ４−Ｒに対するモノクローナル抗体は報告されていない。
したがって当該技術分野で、治療薬、特にＭＣ４−Ｒ活性を調節するモノクローナル抗体の開発を含む、悪液質および関連病状治療のための新しい改善された治療薬を開発する必要性がある。本発明はこれらの必要性に向けたものである。
メラノコルチン−４受容体およびメラノコルチン−４受容体の部分に対するモノクローナル抗体、それらの治療上の使用、およびこのようなモノクローナル抗体および結合断片を使用して悪液質および関連病状および疾患を治療する方法を提供することが、本発明の目的である。このようなモノクローナル抗体および結合断片を含み、追加的治療薬とも併用される医薬組成物、およびこのような組成物の治療上の使用を提供することもさらなる本発明の目的である。
この点に関して一実施態様では、メラノコルチン−４受容体またはメラノコルチン−４受容体の一部に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片が提供される。
本発明のいくつかの実施態様では、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むメラノコルチン−４受容体の一部に結合する。
本発明のいくつかの実施態様では、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片は、単離されたモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含む。
本発明のいくつかの実施態様では、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片は、単離されたモノクローナル抗体の軽鎖可変領域を含む。
本発明のいくつかの実施態様では、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片は、配列番号５、配列番号７、および配列番号９に記載のアミノ酸配列の１つ以上を含む。
本発明のいくつかの実施態様では、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片は、配列番号４、配列番号６、および配列番号８に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列の１つ以上を含む。
本発明のいくつかの実施態様では、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片は、メラノコルチン−４受容体の拮抗薬または逆作動薬である。
本発明のいくつかの実施態様では、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片は、組み換え的に産生される。
本発明のいくつかの実施態様では、前述の実施態様のいずれかに記載の治療的に有効量の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片を含む医薬組成物が提供される。
本発明のいくつかの実施態様では、医薬組成物は単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片と併用される、それとは異なる活性治療薬をさらに含む。
本発明のいくつかの実施態様では、前述の実施態様のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片を食欲が低下している哺乳類に投与するステップを含む、哺乳類の食欲を刺激する方法が提供される。
本発明のいくつかの実施態様では、悪液質の症状を示す哺乳類において、前述の実施態様のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片を哺乳類に投与することにより、このような症状を治療する方法が提供される。
本発明のいくつかの実施態様では、配列番号５、配列番号７、および配列番号９に記載のアミノ酸配列の１つ以上を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片が提供される。
本発明のいくつかの実施態様では、哺乳類の食欲を増大させるのに治療的に効果的な量で組成物中に存在する、配列番号５および配列番号７に記載のアミノ酸配列の１つ以上を含む、治療的に有効量の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片を含む医薬組成物が提供される。
本発明のいくつかの実施態様では、医薬組成物は、悪液質の症状を示す患者において、このような症状を治療するのに治療的に有用である。
本発明のいくつかの実施態様では、メラノコルチン−４受容体またはメラノコルチン−４受容体の一部に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片を哺乳類に投与するステップと含む、哺乳類の食欲を刺激する方法が提供される。
本発明のいくつかの実施態様では、哺乳類の食欲を刺激する方法は、配列番号５、配列番号７、および配列番号９に記載のアミノ酸配列の１つ以上を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片を投与するステップを含む。
本発明のいくつかの実施態様では、メラノコルチン−４受容体またはメラノコルチン−４受容体の一部に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片を含む、医薬組成物を哺乳類に投与するステップを含む、悪液質の症状を示す哺乳類において症状を治療する方法が提供される。
本発明のいくつかの実施態様では、悪液質の症状を治療する方法は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むメラノコルチン−４受容体の一部に結合する、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体結合断片を含む、医薬組成物を哺乳類に投与するステップを含む。
本発明のいくつかの実施態様では、哺乳類において食欲を増大させるのに有用な薬剤を調製するための、メラノコルチン−４受容体またはメラノコルチン−４受容体の一部に結合するモノクローナル抗体またはその結合断片の使用が提供される。
本発明のいくつかの実施態様では、悪液質および関連病状を治療するのに有用な薬剤を調製するために、メラノコルチン−４受容体またはメラノコルチン−４受容体の一部に結合するモノクローナル抗体またはその結合断片の使用が提供される。
さらなる実施態様では、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片は、前記単離されたモノクローナル抗体の軽鎖可変領域に由来する環式ペプチドを含む。
別の好ましい実施態様では、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片は、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列の環式ペプチドを含む。
さらなる実施態様では、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片は、前記単離されたモノクローナル抗体の重鎖可変領域に由来する環式ペプチドを含む。
さらなる好ましい実施態様では、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片は、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列の環式ペプチドを含む。
上で言及される本発明の環式ペプチドは、約１．５ｋＤａの分子量を有する。モノクローナル抗体が全体として約１５０ｋＤａの分子量を有するのに対し、モノクローナル抗体の可変領域の一本鎖断片（ｓｃＦｖ）は約２６ｋＤａの分子量を有する。
医薬組成物は、前記環式ペプチドおよび／またはモノクローナル抗体の可変領域の一本鎖断片（ｓｃＦｖ）を含んでいてもよい。
本発明のより完全な理解のために、本発明についてさらに説明してその理解を助けるために提示される添付図と併せて、以下のその様々な例示的かつ非限定的実施態様の説明についてここで述べる。本発明の図では、核酸およびアミノ酸配列はそれらの従来の配向で、それらの標準一文字略語によって表される。
本発明は、ヒトメラノコルチン−４受容体（「ＭＣ４−Ｒ」）に対するモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）、結合断片、およびその誘導体（本発明に関してここで集合的に「モノクローナル抗体」および／または「抗体」と称される）、および悪液質を含む特定の病状および疾患の治療におけるそれらの使用に関し、さらに本発明のｍＡｂを含む医薬組成物にも関する。ここで論じられるように、本発明のｍＡｂは、本発明において、ＭＣ４−Ｒに対して、特にＭＣ４−Ｒの構成的活性Ｎ末端（ＮＴ）領域の短いペプチド配列に対して、薬理学的に活性であることが示されており、食欲を刺激する効果を有することがさらに示されている。
特に断りのない限り、ここで使用される全ての用語には、当業者には見てすぐに分かるそれらの従来技術分野で認められている定義が与えられる。例えばそして限定されずに、「モノクローナル抗体」は、腫瘍細胞と抗体産生細胞とを融合させることで形成されるハイブリドーマによって産生される抗体を含み、したがってそれは同一である。さらにここで述べられているＭＣ４−Ｒの免疫原性構成要素に対する本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、既知の技術によって産生できる。
以下の非限定的実施例は、本発明の抗体産生で利用される材料と方法、およびそれに対して実施される生体外および生体内実験法について述べる。
実施例Ｉ：材料と方法
Ａ．ＭＣ４−Ｒに対するｍＡｂの産生
１．ＮＴ４およびＮＴ３ペプチド合成
図１に示すようにラットＭＣ４−Ｒのアミノ酸配列は３３２個のアミノ酸残基からなる（配列番号１；ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ０３７２３１）。本発明では、ＭＣ４−Ｒ（「ＮＴ４ペプチド」、図２で図示される）のＮ末端領域およびＭＣ３−Ｒ（「ＮＴ３ペプチド」）のＮ末端領域に対応するペプチドを合成した。ＮＴ４ペプチドは、ラットＭＣＲ４−Ｒの残基１１〜２５からなるアミノ酸配列ＴＳＬＨＬＷＮＲＳＳＨＧＬＨＧ（配列番号２）を有する（ピーター（Ｐｅｔｅｒ）ＪＣら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、ｉｏｌ．２００７；２９２（６）：Ｒ２１５１−８を参照されたい）。ＮＴ３ペプチドは、ラットＭＣ３−Ｒ（配列番号３）の残基２６〜４４からなるアミノ酸配列ＡＳＮＲＳＧＳＧＦＣＥＱＶＦＩＫＰＥＶ（配列番号３）を有する。ペプチドはニーマーク（Ｎｅｉｍａｒｋ）Ｊおよびブリアン（Ｂｒｉａｎｄ）ＪＰ，Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．１９９３；６（４）：２１９〜２８で述べられるようにして合成した。
Ａ．ＭＣ４−Ｒに対するｍＡｂの産生
１．ＮＴ４およびＮＴ３ペプチド合成
図１に示すようにラットＭＣ４−Ｒのアミノ酸配列は３３２個のアミノ酸残基からなる（配列番号１；ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ０３７２３１）。本発明では、ＭＣ４−Ｒ（「ＮＴ４ペプチド」、図２で図示される）のＮ末端領域およびＭＣ３−Ｒ（「ＮＴ３ペプチド」）のＮ末端領域に対応するペプチドを合成した。ＮＴ４ペプチドは、ラットＭＣＲ４−Ｒの残基１１〜２５からなるアミノ酸配列ＴＳＬＨＬＷＮＲＳＳＨＧＬＨＧ（配列番号２）を有する（ピーター（Ｐｅｔｅｒ）ＪＣら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、ｉｏｌ．２００７；２９２（６）：Ｒ２１５１−８を参照されたい）。ＮＴ３ペプチドは、ラットＭＣ３−Ｒ（配列番号３）の残基２６〜４４からなるアミノ酸配列ＡＳＮＲＳＧＳＧＦＣＥＱＶＦＩＫＰＥＶ（配列番号３）を有する。ペプチドはニーマーク（Ｎｅｉｍａｒｋ）Ｊおよびブリアン（Ｂｒｉａｎｄ）ＪＰ，Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．１９９３；６（４）：２１９〜２８で述べられるようにして合成した。
２．免疫化
２５μｇの遊離ペプチドＮＴ４を完全なフロイントアジュバント中に乳化し、皮下注射して、Ｃ５８ＢＬ／６マウスを免疫化した。免疫化の４週間後、不完全なフロイントアジュバント中の２５μｇの追加免疫注射を行った。４週間後、融合のために脾臓細胞を採取する３日前に、０．９％ＮａＣｌ中に溶解した１０μｇのペプチドを静脈内注射した。
２５μｇの遊離ペプチドＮＴ４を完全なフロイントアジュバント中に乳化し、皮下注射して、Ｃ５８ＢＬ／６マウスを免疫化した。免疫化の４週間後、不完全なフロイントアジュバント中の２５μｇの追加免疫注射を行った。４週間後、融合のために脾臓細胞を採取する３日前に、０．９％ＮａＣｌ中に溶解した１０μｇのペプチドを静脈内注射した。
ハイブリドーマ形成
米国セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ））からのポリエチレングリコール１５００を用いて、骨髄腫細胞１個あたり脾細胞２個の比率で融合を実施した。Ｃ５８Ｂ１６マウスの腹膜マクロファージによって１０００細胞／ウェルでプレコートした９６ウェルプレート内で、ハイブリドーマを培養した。５％ＣＯ２雰囲気下の３７℃加湿恒温器内で、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、２００ｍＭグルタミン、１００ｍＭナトリウムピルビン酸、スイス国メットメンシュテテンのイムニラブ（Ｏｍｎｉｌａｂ（Ｍｅｔｔｍｅｎｓｔｅｔｔｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））からの１％ペニシリンストレプトマイシン、スイス国ルツェルンのギブコ（Ｇｉｂｃｏ（Ｌｕｃｅｒｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））からの３％ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ）を添加したＩＭＤＭ培地中の細胞をウェルあたり５×１０５個に分配した。
米国セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ））からのポリエチレングリコール１５００を用いて、骨髄腫細胞１個あたり脾細胞２個の比率で融合を実施した。Ｃ５８Ｂ１６マウスの腹膜マクロファージによって１０００細胞／ウェルでプレコートした９６ウェルプレート内で、ハイブリドーマを培養した。５％ＣＯ２雰囲気下の３７℃加湿恒温器内で、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、２００ｍＭグルタミン、１００ｍＭナトリウムピルビン酸、スイス国メットメンシュテテンのイムニラブ（Ｏｍｎｉｌａｂ（Ｍｅｔｔｍｅｎｓｔｅｔｔｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））からの１％ペニシリンストレプトマイシン、スイス国ルツェルンのギブコ（Ｇｉｂｃｏ（Ｌｕｃｅｒｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））からの３％ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ）を添加したＩＭＤＭ培地中の細胞をウェルあたり５×１０５個に分配した。
スクリーニング
クローンは酵素免疫測定法によってスクリーニングし、オイ（Ｏｉ）ＶＴ，ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８０；１５１（５）：１２６０〜７４に従って限界希釈によりサブクローニングした。
クローンは酵素免疫測定法によってスクリーニングし、オイ（Ｏｉ）ＶＴ，ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８０；１５１（５）：１２６０〜７４に従って限界希釈によりサブクローニングした。
４．酵素免疫測定法
デンマーク国ロスキレのヌンク（Ｎｕｎｃ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ））からの９６ウェルマキシソープ（ＭＡＸＩＳＯＲＰ）マイクロタイタープレート内で、ＮＴ４ペプチド（２μＭ）を５０μｌ／ウェルで３７℃で２時間インキュベートし、炭酸塩緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３ １５ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ３５ｍＭ、ｐＨ９．６）に吸着させた。プレートを米国カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの３％粉乳およびスイス国ブフスのフルカ（Ｆｌｕｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））からの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加した、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｎａ２ＨＰＯ４ １０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＫＣｌ ２７ｍＭ、ｐＨ７．４）（ＰＢＳ−Ｔミルク）で３７℃で１時間飽和した。
デンマーク国ロスキレのヌンク（Ｎｕｎｃ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ））からの９６ウェルマキシソープ（ＭＡＸＩＳＯＲＰ）マイクロタイタープレート内で、ＮＴ４ペプチド（２μＭ）を５０μｌ／ウェルで３７℃で２時間インキュベートし、炭酸塩緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３ １５ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ３５ｍＭ、ｐＨ９．６）に吸着させた。プレートを米国カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ））からの３％粉乳およびスイス国ブフスのフルカ（Ｆｌｕｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））からの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加した、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｎａ２ＨＰＯ４ １０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＫＣｌ ２７ｍＭ、ｐＨ７．４）（ＰＢＳ−Ｔミルク）で３７℃で１時間飽和した。
免疫されたマウス血清または１：１０希釈ハイブリドーマ培養上清をプレートに入れて、３７℃でインキュベートした。次にプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、１／５０００希釈のヤギ抗マウス免疫グロブリンＨ＋Ｌホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合体（バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））と共に、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−ＴおよびＰＢＳで洗浄後、０．０４％Ｈ２Ｏ２存在下で、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の添加によって、酵素反応を室温で実施した。１５分後にＨＣｌ（１Ｎ）の添加によって反応を停止させた。米国カリフォルニア州フリーモントのパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｉｍｅｒ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ））からのビクター・ワラック（Ｖｉｃｔｏｒ Ｗａｌｌａｃ）マイクロプレートリーダーを使用して、光学濃度を４５０ｎｍで測定した。
Ｂ．ｍＡｂの特性決定
１．ｍＡｂ可変領域のｃＤＮＡクローニング
米国のバイオジェンテクス（Ｂｉｏｇｅｎｔｅｘ（ＵＳＡ））からのＲＮＡｎｏｗキットを使用して、１０７個の新鮮にサブクローニングしたハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製し、米国カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ））からのｉＳｃｒｉｐｔＴｍ ｃＤＮＡ合成キットを使用して、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）からのＩｇＧプライマーセットを使用して、ＰＣＲによってＶＨおよびＶＬ鎖領域を増幅した。５０μｌのＰＣＲ混合物は、５０ｎｇのハイブリドーマｃＤＮＡ、各２０ｐｍｏｌの適切なプライマー、各２５０μＭのｄＮＴＰ、１×Ｔａｑ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）、および１Ｕのサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼを含有した。
１．ｍＡｂ可変領域のｃＤＮＡクローニング
米国のバイオジェンテクス（Ｂｉｏｇｅｎｔｅｘ（ＵＳＡ））からのＲＮＡｎｏｗキットを使用して、１０７個の新鮮にサブクローニングしたハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製し、米国カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ））からのｉＳｃｒｉｐｔＴｍ ｃＤＮＡ合成キットを使用して、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）からのＩｇＧプライマーセットを使用して、ＰＣＲによってＶＨおよびＶＬ鎖領域を増幅した。５０μｌのＰＣＲ混合物は、５０ｎｇのハイブリドーマｃＤＮＡ、各２０ｐｍｏｌの適切なプライマー、各２５０μＭのｄＮＴＰ、１×Ｔａｑ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）、および１Ｕのサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼを含有した。
増幅は、ＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）からのサーモサイクラー（ＰＴＣ−１５０）内において、９４℃で１．５分間、５５℃で２．５分間、および７２℃で３分間を５０サイクル含んだ。増幅されたＤＮＡを米国ウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ））からのｐＧＥＭＴベクターにライゲートし、組み換えプラスミドをキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）からのミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キットを使用して精製した。プリズム・サイクル・シーケンシング（ＰＲＩＳＭ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）キット（ＡＢＩ）とＭ１３順方向および逆方向プライマーを使用して、クローンされたＶＨおよびＶＬ挿入断片のＤＮＡ配列を判定した。Ｖ遺伝子の配列は、独立した２バッチのＲＮＡ調製品上で判定して正確さを確保した。
２．アイソタイプ判定
製造業者（ザイメド・ラブ（Ｚｙｍｅｄ ｌａｂ））の使用説明書に従ってＭｏｎｏＡｂｉＤキットを使用し、選択されたｍＡｂのアイソタイプを判定した。
製造業者（ザイメド・ラブ（Ｚｙｍｅｄ ｌａｂ））の使用説明書に従ってＭｏｎｏＡｂｉＤキットを使用し、選択されたｍＡｂのアイソタイプを判定した。
３．ｍＡｂ精製
製造業者の使用説明書に従って、スウェーデン国ウプサラのアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））からの活性化ＣＮＢｒ−セファロース４ＢカラムにＮ末端で結合させたＮＴ４ペプチド上で、抗ＮＴ４ｍＡｂをアフィニティ精製した。培養上清を４℃でカラムに装入した。ｍＡｂを０．２ＭグリシンｐＨ２．７で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８を含有する試験管に収集し、引き続いてＰＢＳに対して４℃で一晩透析し、最後に−２０℃で保存した。
製造業者の使用説明書に従って、スウェーデン国ウプサラのアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））からの活性化ＣＮＢｒ−セファロース４ＢカラムにＮ末端で結合させたＮＴ４ペプチド上で、抗ＮＴ４ｍＡｂをアフィニティ精製した。培養上清を４℃でカラムに装入した。ｍＡｂを０．２ＭグリシンｐＨ２．７で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８を含有する試験管に収集し、引き続いてＰＢＳに対して４℃で一晩透析し、最後に−２０℃で保存した。
Ｃ．アッセイ
１．細胞培養
３７℃で５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気内において、スイス国アルシュヴィルのバイオコンセプト（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ（Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））からの１０％ウシ胎仔血清、米国ニューヨーク州グランドアイランドのギブコ（Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ））からの１％ペニシリン／ストレプトマイシン、およびシグマ（Ｓｉｇｍａ）からの６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する、米国ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））からのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、ヒト（ｈ）ＭＣ４−Ｒを発現するＨＥＫ−２９３細胞を培養した。
１．細胞培養
３７℃で５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気内において、スイス国アルシュヴィルのバイオコンセプト（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ（Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））からの１０％ウシ胎仔血清、米国ニューヨーク州グランドアイランドのギブコ（Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ））からの１％ペニシリン／ストレプトマイシン、およびシグマ（Ｓｉｇｍａ）からの６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する、米国ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））からのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、ヒト（ｈ）ＭＣ４−Ｒを発現するＨＥＫ−２９３細胞を培養した。
２．ｃＡＭＰアッセイ
処置の１２時間前に細胞を２４ウェル培養プレートに移し、次にシグマ（Ｓｉｇｍａ）からの培養液（ＤＭＥＭ）で３時間洗浄して、０．１％ＢＳＡおよびシグマ（Ｓｉｇｍａ）からの３−イソブチル−ｌ−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を添加したＰＢＳ中で３０分間インキュベートした。細胞を精製されたｍＡｂの連続希釈物で３０分間処理し、または１００ｎＭのｍＡｂで３０分間プレインキュベートして、次にα−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ、１０９〜１０−５Ｍ）の連続希釈物で１５分間処理した。
処置の１２時間前に細胞を２４ウェル培養プレートに移し、次にシグマ（Ｓｉｇｍａ）からの培養液（ＤＭＥＭ）で３時間洗浄して、０．１％ＢＳＡおよびシグマ（Ｓｉｇｍａ）からの３−イソブチル−ｌ−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を添加したＰＢＳ中で３０分間インキュベートした。細胞を精製されたｍＡｂの連続希釈物で３０分間処理し、または１００ｎＭのｍＡｂで３０分間プレインキュベートして、次にα−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ、１０９〜１０−５Ｍ）の連続希釈物で１５分間処理した。
引き続いて細胞をバイオトラック（Ｂｉｏｔｒａｋ）ｃＡＭＰ溶解緩衝液で溶解し、スウェーデン国ウプサラのアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））からのバイオトラック（Ｂｉｏｔｒａｋ）ｃＡＭＰ酵素免疫測定システムを使用して、製造業者の使用説明書に従ってｃＡＭＰを測定した。米国イリノイ州リックフォードのピアス（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ））からのＢＣＡキットを使用してタンパク質濃度を判定した。ｃＡＭＰの濃度はｆｍｏｌ ｃＡＭＰ／μｇタンパク質で表された。
３．脳室内カニューレ挿入
医療用酸素中のイソフルラン（誘導では４％麻酔維持では２％）を用いて、オスのスプラーグドーリーラット（２７５ｇ〜３２５ｇ）を麻酔した。ブレグマに対して以下の座標を使用して、ステンレス鋼カニューレ（２６ゲージ、１０ｍｍ長）を第３の脳室空洞中に埋め込んだ。体軸方向から−２．３ｍｍ、正中線から０ｍｍ側方、および頭蓋表面から−７．５ｍｍ腹側。
医療用酸素中のイソフルラン（誘導では４％麻酔維持では２％）を用いて、オスのスプラーグドーリーラット（２７５ｇ〜３２５ｇ）を麻酔した。ブレグマに対して以下の座標を使用して、ステンレス鋼カニューレ（２６ゲージ、１０ｍｍ長）を第３の脳室空洞中に埋め込んだ。体軸方向から−２．３ｍｍ、正中線から０ｍｍ側方、および頭蓋表面から−７．５ｍｍ腹側。
３個のステンレス鋼スクリューとガラス−イオノマーセメント（３Ｍ）を用いてガイドカニューレを定位置に固定し、吻針を挿入して使用時までカニューレを閉鎖した。外科手術後２日間にわたりテムゲシック（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ）（０．０３ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。外科手術からの回復の７日後に、５ｐｌの注入量中の２０ｐｍｏｌのアンギオテンシンＩＩのｉｃｖ注射に対する口渇誘発性反応（１５分以内の少なくとも５ｍｌの即時の飲水）を測定することによって、第３脳室中のカニューレ配置の正確さを試験した。
４．脳室内注射
ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）シリンジを使用して９：００ａｍに、容積５ｐｌ中の０．１ｐｇの用量で精製ｍＡｂを緩慢に（１分間）ｉｃｖ注射した。これらの用量は比較生体外研究の結果に基づいて選択された。ラットＡｂの注射に続いて、３日間にわたり１時間間隔で、ドイツ国バートホンブルクのＴＳＥシステムズ（ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））からの自動食物摂取量装置を使用して、食物摂取量を続く３日間連続的に記録した。ウサギＡｂの注射後、続く３日間食物摂取量を９：００ａｍおよび５：００ｐｍに測定した。
ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）シリンジを使用して９：００ａｍに、容積５ｐｌ中の０．１ｐｇの用量で精製ｍＡｂを緩慢に（１分間）ｉｃｖ注射した。これらの用量は比較生体外研究の結果に基づいて選択された。ラットＡｂの注射に続いて、３日間にわたり１時間間隔で、ドイツ国バートホンブルクのＴＳＥシステムズ（ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））からの自動食物摂取量装置を使用して、食物摂取量を続く３日間連続的に記録した。ウサギＡｂの注射後、続く３日間食物摂取量を９：００ａｍおよび５：００ｐｍに測定した。
Ｄ．データ分析
全てのデータは、指定のように平均±ＳＤまたはＳＥＭとして表される。ボンフェローニのポストホックテストによる二元配置分散分析反復測定によって、またはグラフパッドプリズム（Ｇｒａｐｈ ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）４ソフトウェアを使用したスチューデントｔ検定によって、データを分析した。ｃＡＭＰ濃度応答実験では、最良適合曲線をそれらの最小、最大、およびＥＣ５０についてＦ検定を使用して比較した。
全てのデータは、指定のように平均±ＳＤまたはＳＥＭとして表される。ボンフェローニのポストホックテストによる二元配置分散分析反復測定によって、またはグラフパッドプリズム（Ｇｒａｐｈ ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）４ソフトウェアを使用したスチューデントｔ検定によって、データを分析した。ｃＡＭＰ濃度応答実験では、最良適合曲線をそれらの最小、最大、およびＥＣ５０についてＦ検定を使用して比較した。
実施例ＩＩ：結果
Ａ．ｍＡｂのペプチド特異性
遊離ペプチドＮＴ４およびＮＴ３について酵素免疫測定を実施した。図３Ａに示すように、ハイブリドーマ産生のために使用したマウスの血清は、ＭＣ４−ＲのＮ末端部分に由来する免疫原性ペプチドＮＴ４に対して高度に特異的かつ明白な応答を示したが、ＭＣ３−ＲのＮ末端部分に由来するＮＴ３ペプチドに対しては示さなかった。ポリクローナル応答は高かったが、どちらもＩｇＭ抗体であるｍＡｂ １Ｅ８ａおよびｍＡｂ ２Ｇ２の２クローンのみが、サブクローニングおよび増幅まで保存できた。図３Ｂに示すように、ｍＡｂ １Ｅ８ａのＮＴ４ペプチドに対する特異性はポリクローナルマウス応答に対応する。
Ａ．ｍＡｂのペプチド特異性
遊離ペプチドＮＴ４およびＮＴ３について酵素免疫測定を実施した。図３Ａに示すように、ハイブリドーマ産生のために使用したマウスの血清は、ＭＣ４−ＲのＮ末端部分に由来する免疫原性ペプチドＮＴ４に対して高度に特異的かつ明白な応答を示したが、ＭＣ３−ＲのＮ末端部分に由来するＮＴ３ペプチドに対しては示さなかった。ポリクローナル応答は高かったが、どちらもＩｇＭ抗体であるｍＡｂ １Ｅ８ａおよびｍＡｂ ２Ｇ２の２クローンのみが、サブクローニングおよび増幅まで保存できた。図３Ｂに示すように、ｍＡｂ １Ｅ８ａのＮＴ４ペプチドに対する特異性はポリクローナルマウス応答に対応する。
Ｂ．パラトープ配列
ｍＡｂ １Ｅ８ａの重鎖および軽鎖可変領域、およびｍＡｂ ２Ｇ２の重鎖可変領域をクローンして配列決定した。
ｍＡｂ １Ｅ８ａの重鎖および軽鎖可変領域、およびｍＡｂ ２Ｇ２の重鎖可変領域をクローンして配列決定した。
ｍＡｂ １Ｅ８ａの重鎖可変領域の核酸およびコードされるアミノ酸配列をそれぞれ図４Ａ（配列番号４）および図４Ｂ（配列番号５）に、相補性決定領域に下線を引いて示す。ｍＡｂ １Ｅ８ａの軽鎖可変領域の核酸およびコードされるアミノ酸配列をそれぞれ図５Ａ（配列番号６）および図５Ｂ（配列番号７）に、相補性決定領域に下線を引いて示す。
ｍＡｂ ２Ｇ２の重鎖可変領域の核酸およびコードされるアミノ酸配列をそれぞれ図６Ａ（配列番号８）および図６Ｂ（配列番号９）に、相補性決定領域に下線を引いて示す。ｍＡｂ １Ｅ８ａおよび２Ｇ２の定常部は、このサブタイプ中の全てのマウス抗体に共通である。
Ｃ．ｍＡｂ １Ｅ８ａおよびｍＡｂ ２Ｇ２の生体外薬理学的活性
双方のｍＡｂの逆作動活性を検出するために、ＨＥＫ−２９３細胞を精製されたｍＡｂ ２Ｇ２およびｍＡｂ １Ｅ８ａで処理した。図７Ａ（左パネル）の濃度応答曲線で示されるように、ＭＣ４−Ｒで形質移入したＨＥＫ−２９３細胞をｍＡｂ ２Ｇ２の増大する濃度（１ｐＭ〜０．１μＭ）に曝露しても、ｃＡＭＰの減少は測定されなかった。図７Ａ（右パネル）に示すように、ｍＡｂ ２Ｇ２の存在はα−ＭＳＨの濃度応答曲線に影響を与えなかった。
双方のｍＡｂの逆作動活性を検出するために、ＨＥＫ−２９３細胞を精製されたｍＡｂ ２Ｇ２およびｍＡｂ １Ｅ８ａで処理した。図７Ａ（左パネル）の濃度応答曲線で示されるように、ＭＣ４−Ｒで形質移入したＨＥＫ−２９３細胞をｍＡｂ ２Ｇ２の増大する濃度（１ｐＭ〜０．１μＭ）に曝露しても、ｃＡＭＰの減少は測定されなかった。図７Ａ（右パネル）に示すように、ｍＡｂ ２Ｇ２の存在はα−ＭＳＨの濃度応答曲線に影響を与えなかった。
反対に図７Ｂ（左パネル）に示すように、ＭＣ４−Ｒで形質移入したＨＥＫ−２９３細胞をｍＡｂ １Ｅ８ａの増大する濃度（１ｐＭ〜０．１ＭＭ）に曝露すると、濃度に依存してｃＡＭＰ形成が最高４０％減少し、ｍＡｂ ２Ｇ２の存在がα−ＭＳＨの濃度応答曲線を変化させなかったのに対し、１００ｎＭのｍＡｂ １Ｅ８ａの存在は、図７Ｂ（右パネル）に示すようにα−ＭＳＨの最大効果を顕著に（ｐ＜０．００１、Ｆ検定）低下させた。細胞内ｃＡＭＰ含量の濃度依存性減少は、ｍＡｂ １Ｅ８ａの逆作動効果を示す。
ｍＡｂ １Ｅ８ａの存在下で低下した最大有効性からは、それが非競合的拮抗薬として作用することが提案される。データは、３回の独立した実験から計算される平均±ＳＤとして示される。
ｍＡｂ １Ｅ８ａおよびｄｍＡｂ ２Ｇ２の生体内薬理学的活性
０．１μｇの精製されたｍＡｂ ２Ｇ２および１Ｅ８ａＡｂをラットの第３脳室内に注射した。図８Ａに示すように、１μｇのｍＡｂ １Ｅ８ａを投与されたラットは、ＭＣ４−Ｒに対して不活性のｍＡｂ ２Ｇ２を投与されたラットよりも３３％多い食物を９６時間内に摂取した（データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示される、＊＊：ｐ＜０．０１、ボンフェローニのポストホックテストによる反復測定二元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝５）。
０．１μｇの精製されたｍＡｂ ２Ｇ２および１Ｅ８ａＡｂをラットの第３脳室内に注射した。図８Ａに示すように、１μｇのｍＡｂ １Ｅ８ａを投与されたラットは、ＭＣ４−Ｒに対して不活性のｍＡｂ ２Ｇ２を投与されたラットよりも３３％多い食物を９６時間内に摂取した（データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示される、＊＊：ｐ＜０．０１、ボンフェローニのポストホックテストによる反復測定二元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝５）。
図８Ｂに示すようにｍＡｂ ＩＥ８ａを投与されたラットの体重は変化しなかったのに対し、ｍＡｂ ２Ｇ２を投与されたラットでは体重が減少した（＊：ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定、ｎ＝５）。
図９Ａ〜９Ｃは、ｍＡｂ １Ｅ８ａの特異性を図示する。図９ａは、蛍光標識されたｍＡｂ １Ｅ８ａで染色されたヒトＭＣＲ４を発現する、培養されたＨＥＫ−２９３細胞を示す。顕著なレベルの発現されたｈＭＣＲ４が検出された。図９Ｂおよび９Ｃは、ｈＭＲＣ３を発現するＨＥＫ−２９３細胞図９Ａと同一手順で染色され、またはｈＭＣＲ４を発現する細胞がｍＡｂ ２Ｇ２（対照抗体）で染色された生体外細胞培養を示す。どちらの場合も顕著な染色は起きなかった。
図１０は、ＭＣＲ４またはＭＣＲ３のどちらかを発現し、ｍＡｂ １Ｅ８ＡまたはｍＡｂ ２Ｇ２（対照ｍＡｂ）で染色された細胞の免疫細胞化学的染色を要約する。さらにＮＴ４ペプチドに対するｍＡｂ １Ｅ８ａの結合定数Ｋｄは、２．３×１０−９Ｍと判定された。
図１１は、ｃＡＭＰに対するｍＡｂ １Ｅ８ａおよび対照ｍＡｂ ２Ｇ２の生体外薬理学的効果を示す。増大する量のｍＡｂ １Ｅ８ａの添加が明らかに細胞内ｃＡＭＰレベルの低下をもたらし（左パネル）、α−ＭＳＨに対する濃度応答曲線もまた低下させたのに対し、どちらも対照として使用されたｍＡｂ ２Ｇ２およびＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）は、α−ＭＳＨの濃度応答曲線に顕著な影響を及ぼさなかった（右パネル）。結果は図７Ａおよび７Ｂで示されるものに匹敵する。データは平均±ＳＤとして示される、ｎ＝３；＊＊＊：ｐ＜０．００１、二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定。
図１２は、ｍＡｂの脳室内（ｉｃｖ）注射後のｍＡｂ １Ｅ８ａおよび２Ｇ２（１μｇ）の生体内効果を示す。モノクローナル抗体はどちらも、上述の通り明期中９：００ａｍに投与された（実験プロトコル）。結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして示される、＊＊：ｐ＜０．０１；二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定、ボンフェローニのポストホック検定；§§：ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。図１２の左パネルは、ｍＡｂ １Ｅ８ａの投与が、ｍＡｂ ２Ｇ２と比較して、注射後相において測定された食物取り込みの顕著な増大をもたらすことを示す。右パネルは、体重変化を図示する。ｍＡｂ １Ｅ８ａを注射されたラットの体重は、注射後相において減少しなかった。それどころかそれらの体重は増大した。他方ｍＡｂ ２Ｇ２を注射されたラットは、注射後相において顕著な体重減少を示した。
図１３では、ｍＡｂ １Ｅ８ａおよび２Ｇ２（１μｇ）の脳室内（ｉｃｖ）注射＋ＬＰＳの腹腔内（ｉｐ）注射の生体内効果が示される。ここでも結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして示される。＊：ｐ＜０．０５、二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定、ボンフェローニのポストホック検定。実験プロトコルは、３日間続けての明期中４：３０ｐｍのｍＡｂ １Ｅ８ａまたは２Ｇ２どちらかの脳室内注射を含んでいた。２日目に、ＬＰＳ（リポ多糖類）を腹腔内（ｉｐ）注射した。（活性）ｍＡｂ １Ｅ８ａを投与されたラットは、２回目のｉｃｖ注射後に測定された食物摂取量の増大を示しただけでなく、さらにそれらの体重減少は、ｍＡｂ ２Ｇ２を注射された対照群ラットと比較して顕著に低下した。
図１４は、ｍＡｂ １Ｅ８ａおよび２Ｇ２（３００μｇ／ｋｇ）の静脈内（ｉｖ）注射の生体内効果を示す。結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示される。実験プロトコルは、どちらかのｍＡｂ（１Ｅ８ａまたは２Ｇ２）の静脈内（ｉｖ）注射を含む。注射は明期中の９：００ａｍに実施した。２群間で累積食物摂取量に有意差は検出できなかった。
図１５は、ｃＡＭＰレベルに対する１Ｅ８ａおよび２Ｇ２の一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）生体外効果を示す。ＰＢＳをさらなる対照として使用したところ、それは２Ｇ２のｓｃＦｖと同様に、α−ＭＳＨの濃度応答曲線に影響を与えなかった。結果は図１１に示されるものと同様であった。
図１６は、ｍＡｂ １Ｅ８ａおよび２Ｇ２の一本鎖断片（ｓｃＦｖ）（１．７μｇ）のｉｃｖ注射の生体内効果を示す。結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして示される。＊：ｐ＜０．０５、二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定、ボンフェローニのポストホック検定、§：ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。
実験プロトコルに従って、明期中の９：００ａｍにｓｃＦｖを脳室内注射した。１Ｅ８ａのｓｃＦｖの投与は、注射後に測定された累積食物摂取量を顕著に増大させた。しかしどちらのラット群も注射後期に体重減少を示した。しかし１Ｅ８ａのｓｃＦｖを投与されたラットにおける体重減少は、顕著に低下した体重減少を示した。
図１７では、１Ｅ８ａのｓｃＦｖ（３００μｇ／ｋｇ）のｉｖ注射の生体内効果が示される。結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして示される。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定、ボンフェローニのポストホック検定。Ｃｔは不活性溶出液を意味し、１Ｅ８ａはｔｈｅ活性溶出液を表す。実験プロトコルに従って、１Ｅ８ａまたは２Ｇ２のｓｃＦｖを明期中の９：００ａｍに静脈内（ｉｖ）注射した。１Ｅ８ａのｓｃＦｖは、明期中の顕著により高い累積食物摂取量（中央パネル）、ならびに注射後相におけるより高い体重変化を引き起こした。
図１８は、ｓｃＦｖ １Ｅ８ａおよび２Ｇ２のｉｖ注射＋ＬＰＳのｉｐ注射（３００μｇ／ｋｇ）の生体内効果を示す。結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示される。実験プロトコルは、４：３０ｐｍの１Ｅ８ａまたは２Ｇ２どちらかのｓｃＦｖの静脈内（ｉｖ）注射と、１時間後５：３０ｐｍのＬＰＳの腹腔内（ｉｐ）注射とを含む。１Ｅ８ａのｓｃＦｖで処置されたラットは、ｓｃＦｖ注射後の期間中に観察された累積食物摂取量増大の明らかな傾向を示す。
図１９は、環式ペプチドＨ１（配列番号１０）、Ｈ２（配列番号１１）、Ｈ３（配列番号１２）、Ｌｌ（配列番号１３）、Ｌ２（配列番号１４）、およびＬ３（配列番号１５）のアミノ酸配列を示す。
図２０は、環式ペプチドＬ３およびＨ２（１μｇ）の脳室内（ｉｃｖ）注射の生体内効果を示す。結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして示される。＊：ｐ＜０．０５、二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定、ボンフェローニのポストホック検定。実験プロトコルに従って、ペプチドＬ３およびＨ２を明期中の９：００ａ．ｍに投与した。ＴＲＩＳ緩衝液をさらなる対照として使用した。環式ペプチドＬ３は、注射後相において観察された累積食物摂取量を増大させる傾向を示す。
図２１はｍＡｂ １Ｅ８ａのｍＡｂパラトープのアミノ酸配列を示す。上側パネルは重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１６）を示し、下側パネルは軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１７）を示す。
上の実施例に示すように、ＭＣ４−Ｒに対して産生されたｍＡｂ、特にｍＡｂ １Ｅ８ａは、食欲に対して、結果的には体重減少に対して顕著な効果を有し、悪液質と関連病状および疾患に対するそれらの治療的な用途が示唆される。
本発明の治療的なｍＡｂは、あらゆる既知の適切な方法で投与されてもよい。例えば特定の実施態様では、それらは、臨床状況においてＭＣ４−Ｒを発現する特異的標的細胞にそれらが注入される、標準モノクローナル抗体治療プロトコルに従って投与されてもよい。いくつかの実施態様では、それらはそれぞれこのような投与に適した形態で、非経口的に投与されても、経口的に投与されても、または副鼻腔、喉または肺に投与されてもよい。それらは特定の実施態様では、当該技術分野において承認されている技術に従ってさらに変性されてもよく、例えばそれらは様々な治療的な目的のために、キメラ化されヒト化されてもよい。
さらにそれらは、その他の活性治療薬と組み合わされて提供されてもよく、特定の実施態様では免疫複合体を形成してその他の治療薬をＭＣ４Ｒに方向づけてもよい。ここで提供される教示を与えられると、当業者はこのような投与方法および形態、組み合わせその他を判断できるであろう。
同様に当業者は、当業者に認識された技術を使用して、このような治療薬および製剤の適切な投薬を判断できるであろう（投与計画に影響を与えることが知られている要素としては、例えば限定されずに、特定薬剤の薬力学的特徴およびその投与様式と経路；受容者の生物種、年齢、性別、総体的な健康、疾患、食餌、および体重；症状の性質および程度；併用療法の種類；治療頻度；投与時間；投与経路；患者の腎および肝機能；および所望の効果が挙げられる）。さらにＭＣ４−Ｒに対して所望の治療活性を有する、ここで開示されるｍＡｂの断片および誘導体（相同体、類似体などを含む）は本発明の範囲内であり、治療的な化合物の調合物中で使用できる。
本発明の範囲と趣旨を逸脱することなく、上の組成物および方法には様々な変更を行えるので、上の説明中に含まれ、添付の図面に示され、または添付の特許請求の範囲で定義される全ての主題は、限定を意図しない例示的なものとして解釈されることが意図される。
ここで引用される全ての特許、特許出願、発表論文、書籍、リファレンスマニュアル、教科書および要約書の内容は、本発明が関連する従来技術についてより完全に述べるために、その全体が参照によって援用される。
Claims (25)
- メラノコルチン−４受容体またはメラノコルチン−４受容体の一部に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片。
- 抗体またはその結合断片が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むメラノコルチン−４受容体の一部に結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片。
- 結合断片が単離されたモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片。
- 結合断片が単離されたモノクローナル抗体の軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片。
- 配列番号５、配列番号７、および配列番号９に記載のアミノ酸配列の１つ以上を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片。
- 配列番号４、配列番号６、および配列番号８に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列の１つ以上を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片。
- 単離されたモノクローナル抗体の軽鎖可変領域に由来する環式ペプチドを含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片。
- 配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列の環式ペプチドを含む、請求項９に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片。
- 単離されたモノクローナル抗体の重鎖可変領域に由来する環式ペプチドを含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片。
- 配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列の環式ペプチドを含む、請求項９に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片。
- 単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片がメラノコルチン−４受容体の拮抗薬または逆作動薬である、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片。
- 単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片が組み換え的に産生される、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片。
- 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の治療的に有効量の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片を含む医薬組成物。
- 前記単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片と組み合わさった、それとは異なる活性治療薬をさらに含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
- 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片を食欲低下を有する哺乳類に投与するステップを含む、哺乳類の食欲を刺激する方法。
- 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片を悪液質の症状を示す哺乳類に投与するステップを含む、哺乳類において悪液質の症状を治療する方法。
- 配列番号５、配列番号７、および配列番号９に記載のアミノ酸配列の１つ以上を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片。
- 哺乳類の食欲を増大させるのに治療的に効果的な量で組成物中に存在する配列番号５および配列番号７に記載のアミノ酸配列の１つ以上を含む、治療的に有効量の単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片を含む、医薬組成物。
- 前記組成物が悪液質の症状を示す患者において前記症状を治療するのに治療的に有用である、請求項１４に記載の医薬組成物。
- メラノコルチン−４受容体またはメラノコルチン−４受容体の一部に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片を哺乳類に投与するステップを含む、哺乳類の食欲を刺激する方法。
- 前記単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片が、配列番号５、配列番号７、および配列番号９に記載のアミノ酸配列の１つ以上を含む、請求項２０に記載の哺乳類の食欲を刺激する方法。
- メラノコルチン−４受容体またはメラノコルチン−４受容体の一部に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその結合断片を含む医薬組成物を哺乳類に投与するステップを含む、悪液質の症状を示す哺乳類において前記症状を治療する方法。
- 配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むメラノコルチン−４受容体の一部に結合する配列番号５および配列番号７に記載のアミノ酸配列の１つ以上を含む、モノクローナル抗体結合断片を含む、医薬組成物を哺乳類に投与するステップを含む、請求項１８に記載の哺乳類において悪液質の症状を治療する方法。
- 哺乳類において食欲を増大させるのに有用な薬剤を調製するためのメラノコルチン−４受容体またはメラノコルチン−４受容体の一部に結合するモノクローナル抗体またはその結合断片の使用。
- 悪液質および関連病状を治療するのに有用な薬剤を調製するためのメラノコルチン−４受容体またはメラノコルチン−４受容体の一部に結合するモノクローナル抗体またはその結合断片の使用。
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