JP2011507903A - Nogginに対する感受性が低下したBMP変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2007年12月21日に出願された米国仮特許出願第61/008,754号(この内容は、参考として本明細書に援用される)への優先権およびその利益を主張する。
本発明は、BMP−6およびBMP−9が、タンパク質阻害剤Nogginによる阻害に対して、BMPサブファミリーの他のメンバーよりも高い耐性を示すとの観察に関する。詳細には、本発明は、NogginおよびNoggin様タンパク質に対して感受性が低下している、設計または改変された骨形成タンパク質、ならびに上記設計または改変された骨形成タンパク質を利用する組成物の作製および使用方法に関する。
骨形成タンパク質
BMPは、TGF−βスーパーファミリーに属する。TGF−βスーパーファミリータンパク質は、6個の保存されたシステイン残基を特徴とするサイトカインである(Landerら、(2001年)Nature、409巻:860〜921頁)。ヒトゲノムは、TGF−βスーパーファミリータンパク質をコードする約42のオープンリーディングフレームを含む。TGF−βスーパーファミリータンパク質は、配列類似性およびそれらが活性化する特定のシグナル伝達経路に基づいて、少なくともBMPサブファミリーおよびTGF−βサブファミリーに分類することができる。BMPサブファミリーには、BMP−2、BMP−3(オステオゲニン)、BMP−3b(GDF−10)、BMP−4(BMP−2b)、BMP−5、BMP−6、BMP−7(骨形成タンパク質−1またはOP−1)、BMP−8(OP−2)、BMP−8B(OP−3)、BMP−9(GDF−2)、BMP−10、BMP−11(GDF−11)、BMP−12(GDF−7)、BMP−13(GDF−6、CDMP−2)、BMP−15(GDF−9)、BMP−16、GDF−1、GDF−3、GDF−5(CDMP−1)およびGDF−8(ミオスタチン)が含まれるが、これらに限定されない。BMPは、骨形成タンパク質(OP)、成長分化因子(GDF)または軟骨由来形態形成タンパク質(CDMP)と呼ばれることもある。BMPは、他の動物種にも存在する。さらに、ヒト集団の異なるメンバー間で、BMP配列に多少の対立遺伝子変異が存在する。本明細書で用いるように、特に別途指示されない限り、「BMPサブファミリー」、「BMP」、「BMPリガンド」およびそれらの文法同等物は、BMPサブファミリーメンバーを指す。
BMPとそれらのアンタゴニストとの間の相互作用
Nogginのような溶解性BMPアンタゴニストは、BMPに結合することができる。BMP上のNoggin結合部位は、I型およびII型両方の受容体の結合部位と重なる。例えば、BMP−7−Noggin複合体を、図10に図示する。さらに、BMP−7へのNoggin結合は、BMP−7がその受容体に結合することおよび/またはそれを活性化することを阻止し得るであろうBMP−7の立体配座変化を誘導する。NogginのようなDANファミリーアンタゴニストは、システインノットタンパク質ファミリーのメンバーである。DANファミリータンパク質およびNogginはこの構造モチーフを共有するので、それらは類似した方法でBMPに結合し得るであろう。コーディン(Chordin)/SOGアンタゴニストは、同様の方法でBMPに結合すると提案されている。したがって、本発明は、Nogginおよび/または他のNoggin様アンタゴニストによる阻害を逃れることができるBMPタンパク質を設計することを企図する。
改変BMPの生成
本明細書で用いるように、「設計されたBMP」、「改変BMP」、「キメラBMP」、「突然変異体BMP」および「変異体BMP」は、特に明記しない限り同等物として用いられる。本明細書で、「設計されたBMP」または「改変BMP」、およびそれらの文法同等物は、野生型または親のBMPと、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失または置換が異なる、天然に存在しないBMPを意味する。特に明記しない限り、設計または改変BMPのすべての位置番号付けは、成熟した天然BMPの配列に基づく点に留意する必要がある。設計されたBMPは、変異の所定の性質によって特徴づけられ、それは、BMP配列の天然の対立遺伝子または種間変異からそれらを区別する特徴である。BMP変異体は、1つまたは複数の細胞型で、野生型BMP活性の少なくとも50%を保持しなければならず、それは、下で記載される適当なアッセイを用いて測定される。野生型活性の少なくとも75%、80%、85%、90%または95%を保持する変異体がより好ましく、野生型よりも活性である変異体が特に好ましい。設計または改変BMPは、N末端、C末端または内部に、挿入、欠失および/または置換を含むことができる。好ましい実施形態では、設計または改変BMPは、最も類似するヒトBMP配列と異なる少なくとも1つの残基を有し、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の異なる残基がより好ましい。
改変BMPをコードする核酸の調製
本発明は、本明細書に記載される改変BMPをコードする核酸も含む。本明細書に記載される改変BMPをコードする核酸は、当技術分野で公知である方法によって調製することができる。
発現ベクター
好ましい実施形態では、下記成分、および本発明の改変BMPをコードする遺伝子を含む発現ベクターが調製される。様々な宿主細胞のための多種類の適当な発現ベクターおよび適する調節配列が、当技術分野で公知である。発現ベクターは、それらに限定されないが、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、転写終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびに、エンハンサーまたはアクティベーター配列を含む、転写および翻訳の調節配列を含むことができる。好ましい実施形態では、調節配列には、プロモーターならびに転写開始および終止配列が含まれる。さらに、発現ベクターは追加の要素を含むことができる。例えば、発現ベクターは2つの複製系を有することができ、このように、2つの生物体で、例えば発現のためには哺乳動物または昆虫の細胞で、またクローニングおよび増幅のためには原核生物の宿主でそれが維持されることを可能にする。さらに、発現ベクターを組み込むために、発現ベクターは宿主細胞のゲノムと相同的な少なくとも1つの配列を、好ましくは、発現構築物に連なる2つの相同配列を含む。組み込まれるベクターは、ベクター内に含ませるために適当な相同配列を選択することによって、宿主細胞の特定の遺伝子座に誘導することができる。ベクターを組み込むための構築物は、当技術分野においては周知である。さらに、好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当技術分野で周知であり、用いる宿主細胞によって異なる。発現ベクターは、自己複製型の染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターであることができる。
トランスフェクション/形質転換
改変BMP核酸は、核酸の以降の発現に適する方法で、単独で、または発現ベクターと一緒に細胞に導入される。導入の方法は、標的細胞型によってほぼ決定される。例示的な方法には、CaPO4沈殿、リポソーム融合(例えば、試薬Lipofectin(登録商標)またはFuGeneを用いる)、エレクトロポレーション、ウイルス感染(例えば、PCT/US97/01019に概説されている)、デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、直接微量注入などが含まれる。改変BMP核酸は、宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれることができるか、細胞質中に一時的に、または安定して存在することができる。
改変BMPの発現のための宿主
改変BMPの発現に適当な宿主細胞には、酵母、細菌、古細菌、真菌類、ならびに、哺乳動物の細胞を含む昆虫および動物の細胞が含まれる。特に興味があるのは、Saccharomyces cerevisiaeおよびPichia pastorisなどの真菌類、ならびに、293(例えば、293−Tおよび293−EBNA)、BHK、CHO(例えば、CHOK1およびDG44)、COS、Jurkat、NIH3T3などを含む哺乳動物細胞系である。(ATCC細胞系カタログを参照)。改変BMPは、それらに限定されないが、植物(例えばトウモロコシ、タバコおよび藻)および動物(例えばニワトリ、ヤギ、ウシ)を含む、より複雑な生物体で生成することもできる;例えば、Dove, Nature Biotechnol.、20巻:777〜779頁(2002年)を参照。一実施形態では、細胞は、さらに遺伝子操作すること、すなわち、改変BMP核酸を含む発現ベクター以外の外来性の核酸を含むことができる。
発現方法
本発明の改変BMPは、改変BMPをコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、改変BMPの発現を誘導するかまたは引き起こすのに適当な条件下で培養することによって生成される。一時的または安定したトランスフェクション方法を用いることができる。改変BMPの発現に適当な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって異なり、常用の実験を通して当分野の技術者によって容易に確認される。
精製
好ましい実施形態では、改変BMPは発現後に精製または単離される。標準の精製方法には、電気泳動技術、分子技術、免疫学的技術、ならびに、イオン交換、疎水性、親和性および逆相HPLCクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー技術、ならびにクロマトフォーカシングが含まれる。例えば、改変BMPは、標準の抗組換え体タンパク質抗体カラムを用いて精製することができる。タンパク濃縮と併用される、限外ろ過およびダイアフィルトレーション技術も有用である。適する精製技術の一般指針については、Scopes, R.、Protein Purification、Springer−Verlag、NY、第3版(1994年)を参照。必要な精製度は所望の使用によって異なり、一部の例では、精製を必要としない。
翻訳後修飾および誘導体化
作製されると、改変BMPは共有結合的に修飾することができる。したがって、タンパク質の共有結合的および非共有結合的修飾は、本発明の範囲に含まれる。ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択される側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、そのような修飾を改変BMPポリペプチドに導入することができる。修飾のための最適部位は、それらに限定されないが、目視検査、構造解析、配列分析および分子シミュレーションを含む様々な基準を用いて選択することができる。修飾のための部位は、プロドメインまたは成熟したドメインに位置してもよい。
設計されたBMPの生物物理および生化学特性評価
本発明の設計されたBMPは、当技術分野で公知の方法、例えばBiacore方法を用いて、Nogginなどの阻害剤へのそれらの応答によって特徴づけることができる。改変BMPは、骨形成および軟骨形成因子の評価で通常用いられる細胞ベースおよびインビボのアッセイ、例えば、アルカリホスファターゼアッセイ、骨芽細胞増殖アッセイ、骨ノジュールアッセイ、qPCRに基づく遺伝子発現アッセイ、またはBMP−応答要素(BRE)ルシフェラーゼアッセイを用いて特徴づけることもできる。改変BMPの生物物理的および生物化学的特性評価を、下に詳述する。
改変BMPの活性の分析
好ましい実施形態では、野生型および改変BMPの活性は、インビトロ受容体結合アッセイ、細胞ベースの活性アッセイまたはインビボ活性アッセイを用いて分析される。
受容体結合アッセイ
1つまたは複数のBMP受容体に結合する改変BMPの能力に及ぼすNogginの影響は、受容体結合アッセイで測定することができる。例えば、ALK−2、ALK−3、ALK−6、ActRII、ActRIIbまたはBMPRIIへの親和性を測定することができる。適する結合アッセイには、ELISA、蛍光異方性および強度、シンチレーション近接検定(SPA)、Biacore(Pearceら、Biochemistry 38巻:81〜89頁(1999年))、DELFIAアッセイ、およびAlphaScrceen(商標)(PerkinElmer;Bosse R.(Illy C,、およびChelsky D(2002年)から市販)が含まれるが、これらに限定されない。
細胞ベースの活性アッセイ
BMPは、いくつかの型の細胞の増殖および分化を促進する。BMP活性は、例えば、ヒト骨髄由来の間葉性幹細胞(hMSC)、MC3T3−E1(マウスの頭蓋冠に由来する骨芽細胞様細胞)、C3H10T1/2(胚性結合組織に由来するマウス間葉性幹細胞系)、ATDC5(マウス胚性癌腫細胞)、L−6(ラット筋芽細胞細胞系)またはC2C12(マウス筋芽細胞の細胞系)細胞のBMPによって誘導される分化の測定によって監視することができる。分化は、例えば、アルシアンブルーまたはPNPPなどのアルカリホスファターゼまたは熱量測定試薬の発光レポーターを用いて監視することができる(Laveryら、(2008年)、JBC、283巻:20948〜20958頁;Asahinaら(1996年)Exp. Cell Res.、222巻:38〜47頁;Inadaら(1996年)Biochem. Biophys. Res. Commun.、222巻:317〜322頁;Jortikkaら(1998年)Life Sci.、62巻:2359〜2368頁;Chengら(2003年)J. Bone Joint Surgery 95A巻:1544〜1552頁)。
BMP活性の動物モデル
一般的に、動物のBMP活性は、皮下注射に続く骨誘導によって測定される。好ましい実施形態では、1つまたは複数の改変BMPの活性は、BMP応答性疾患または状態の動物モデルで測定される。例えば、腎疾患の動物モデルには、それらに限定されないが、ラット腎毒性血清腎炎モデル(Zeisbergら、2003年)、ラット慢性シクロスポリンA誘発腎症モデル(Liら(2004年)Am. J. Physiol. Renal Physiol.、286巻:F46〜57頁)、マウス片側尿管閉塞モデル(Schanstraら(2003年)Thromb. Haemost.、89巻:735〜740頁)、ストレプトゾトシン誘発糖尿病ネフロパシー(Tanedaら(2003年)J. Am. Soc. Nephrol.、14巻:968〜980頁)、抗thy 1.1 mAbおよびHabuヘビ毒誘発糸球体腎炎モデル(Dimmlerら(2003年)Diagn. Mol. Pathol.、12巻:108〜117頁)、およびラット5/6レムナント腎臓モデル(Romeroら(1999年)Kidney Int.、55巻:945〜955頁)が含まれる。肝臓疾患の動物モデルには、それらに限定されないが、ラット胆管連結/切断モデル(Parkら(2000年)Pharmacol. Toxicol.、87巻:261〜268頁)、CCI4プラスエタノール誘発肝損傷(Hallら(1991年)Hepatology、12巻:815〜819頁)、ジメチルニトロソアミン誘発肝硬変(Kondouら(2003年)J. Hepatol.、39巻:742〜748頁)、およびチオアセタミド誘発肝損傷(Mullerら(1988年)Exp. Pathol.、34巻:229〜236頁)が含まれる。肺疾患の動物モデルには、それらに限定されないが、オボアルブミン誘発気道線維症(Kenyonら(2003年)Toxicol. Appl. Pharmacol.、186巻:90〜100頁)、ブレオマイシン誘発肺線維症(Izbickiら(2002年)Int. J. Exp. Pathol.、83巻:111〜119頁)、モノクロタリン誘発肺線維症(Hayashiら(1995年)Toxicol. Pathol.、23巻:63〜71頁)、および選択的照射(Pauluhnら(2001年)Toxicology、161巻:153〜163頁)が含まれる。神経系疾患の動物モデルには、それらに限定されないが、パーキンソン病の動物モデル、例えば6−水酸化ドーパミン(6−OHDA)片側病巣ラットモデル、およびMPTP誘発パーキンソン病、ALSの動物モデル、例えば突然変異体SOD1を発現するラットまたはマウス(Shibataら(2002年)Neuropathology、22巻:337〜349頁)、および、エンドセリンまたはキノリン酸の皮質内微量注入(Gilmourら(2004年)Behav. Brain Res.、150巻:171〜183頁)または大脳動脈閉塞(Merchenthalerら(2003年)Ann. NY Acad. Sci. 1007巻:89〜100頁)によって誘発される脳卒中の動物モデルが含まれる。
製剤および投与
本発明の設計されたBMPは、哺乳動物、好ましくは医薬組成物の一部としてそれを必要とするヒトへの投与のために製剤化することができる。組成物は任意の適する手段、例えば非経口的、経口的または局所的に投与することができる。設計されたBMPが、所望の組織部位に、例えば注射によって局所的に投与されるか、または、例えば静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼内、心室内、頭蓋内、包内、脊椎内、くも膜内、腹腔内、口内、直腸、膣、鼻腔内もしくはエアゾール投与によって全身的に投与される場合、組成物は好ましくは水溶液を含む。哺乳動物へのその投与が哺乳動物の正常な電解質および流体容量均衡に悪影響を与えないように、溶液は、好ましくは生理的に許容される。したがって、水溶液は、例えば、正常な生理食塩液(0.9%NaCl、0.15M)、pH7〜7.4を含むことができる。
治療使用
本発明の改変BMPは、骨および軟骨の形態形成の発達カスケードを誘導することができる。したがって、本発明の改変BMPは、体の様々な場所での骨および軟骨の増殖を誘導するために用いることができる。例えば、膝、肘、足首および指関節などの関節の修復が、本発明によって企図される。例えば、本発明の改変BMPは、関節炎または他の軟骨変性疾患の罹患患者で、軟骨を再生するために指示される。さらに、本発明の改変BMPは、損傷による軟骨の裂傷を治療するために指示される。さらに、本発明の改変BMPは、患者で骨増殖を誘導するのに有用である。例えば、本発明の改変BMPは、骨折もしくは骨の切断、骨粗しょう症の患者、または脊椎固定が必要な患者の治療での使用、または、脊柱、脊椎などの修復のために指示される。
アルカリホスファターゼ活性のBMP誘導
ラット骨肉腫細胞系ROS 17/2.8でアルカリホスファターゼ(ALP)活性を誘導するBMP−2、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP−7、GDF−5およびGDF−6の能力を検査した。各成長因子を、9点用量応答において3反復で試験した。詳細には、ROS 17/2.8細胞を、96ウェル組織培養プレートに平板培養した。BMP/GDFを以下の投薬量、6000、2000、666、222、74、24、8、2および0.9ng/mlで細胞に加え、48時間インキュベートした。細胞をその後溶解し、ALP活性を誘導する成長因子の効力を、試料の平均光学濃度(OD)の非線形回帰から誘導されたEC50に基づいて評価した(図26を参照)。
一団の例示的なBMPおよび関連タンパク質のNoggin阻害
NogginによるBMP阻害は、当初、ROS 17/2.8細胞において、当技術分野で認められるアルカリホスファターゼに基づくアッセイを用いて評価した。簡潔には、ROS 17/2.8細胞を、96ウェル組織培養プレートに平板培養した。BMP−2、−4、−6および−7を、濃度を段々と高めたNogginと混合し、室温で30分間インキュベートした。その後、各BMPの最終濃度が50ng/mlであるように、この混合物をROS細胞に加えた。アッセイは、3反復で実施した。対照ウェルは、Nogginの非存在下で各BMP単独で処理した細胞からなった。処理後48時間、細胞をインキュベートした。細胞をその後溶解し、BMPによって誘導されたアルカリホスファターゼ総活性を、標準のプロトコルに従って測定した。Nogginに対する各BMPの感受性は、阻害率で報告した。試験したNoggin濃度の各々について、阻害率を以下の式によって計算した:
阻害率=((AP対照−AP Noggin)/AP対照)×100
上式で、「AP対照」は、Nogginを含まない対照ウェルでの平均(n=3)アルカリホスファターゼ活性であり;「AP Noggin」は、Nogginの指示濃度で処理されたウェルでの平均(n=3)アルカリホスファターゼ活性である。
阻害率=((Luc対照−Luc Noggin)/Luc対照)×100
上式で、「Luc対照」は、Nogginを含まない対照ウェルでの平均(n=3)ルシフェラーゼ活性であり;「Luc Noggin」は、Nogginの指示濃度で処理されたウェルでの平均(n=3)ルシフェラーゼ活性である。
一次ヒト骨髄由来間葉性幹細胞における下流遺伝子のBMP−6誘導は、Noggin阻害に対してより低感受性である。
Noggin阻害への顕著な耐性を有するBMP−7変異体タンパク質
BMP−6がNoggin阻害に耐性であることを考慮すると、この特徴の原因を判断してそれを利用することは、Nogginに同じく耐性である他のBMPの変異体を作出することを可能にするであろう。この目的のために、BMP−6のアミノ酸配列、および、noggin阻害にかなりより感受性であるその最も近いパラログ、BMP−7を比較した。図13は、成熟したBMP−7およびBMP−6の略図を示す。これらの2つのタンパク質は、非常に相同的である。しかし、多様なアミノ酸は、図13に表す3つの領域、領域1〜40、45〜80および90〜120に分類される。BMP−6およびBMP−7の成熟ペプチドの配列アラインメントは、これらの分子がそれらのアミノ末端(図16の残基1〜40)で最も異なることを明らかにした。成熟ペプチドの第一のシステイン以外に、11個の残基だけがBMP−7とBMP−6の間で異なることがわかった(図16を参照)。
BMP−6の単一の残基が、Noggin阻害に対する耐性の媒介で必要不可欠な役割を演ずる
BMP−6およびBMP−7の成熟ペプチドのアラインメントは、残基45〜80から延長する領域の中で、7つの残基がBMP−6とBMP−7との間で異なることを示した(図16を参照)。noggin耐性を与える役割を担う残基(複数可)をさらに絞り込むために、野生型BMP−7と異なる80−1の7つの残基の各々を、図29Aに示すようにBMP−7のその対応する残基に戻し突然変異させた。この方法で生成された80−1の復帰突然変異体(「Rev」と命名)は、前述の通りに、nogginの3つの濃度(N1=100ng/ml、N2=500ng/mlおよびN3=1000ng/ml)に対するそれらの感受性について試験した。結果を、図29A〜Bに要約する。
Noggin感受性を媒介することにおけるBMP−6のK60の機能は、進化の過程で保存されている
細胞外のアンタゴニストとのBMPの相互作用は、これらの成長因子の活性を調節するための重要な負のフィードバックループ機構である。noggin感受性のために重要であることがわかった位置60のBMP−7グルタミン酸残基が他のBMPの間で保存されているかどうかを判断するために、BMP−2、4、5、6、7および9を含む一団のBMPの、この残基を囲むアミノ酸配列を比較したが、それらを、図31Aに示す(アミノ酸はBMP−7に従って番号付けした)。BMP−6およびBMP−9の配列だけが、位置60にリジンを含む。対照的に、BMP−2、−4、−5および−7は、この位置にプロリン残基かグルタミン酸残基を有する。
BMP−6の他の残基がnoggin耐性を与える。
本発明によるBMP突然変異体は、インビボ活性を有する。
ラットモデル
本発明の様々な突然変異体BMPの機能を、インビボバイオアッセイで評価する。参照により本明細書で組み込まれるSampathおよびReddi((1983年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA80 6591 6595)によって記載される骨誘導のバイオアッセイを用いて、移植された突然変異体の軟骨内性骨分化活性を監視する。このアッセイは、エーテル麻酔下のレシピエントラットの皮下部位に、検査試料を移植することからなる。28〜32日齢の雄のLong−Evansラットを用いる。無菌条件下で胸部上の皮膚に垂直切開(1cm)を設け、ブラントジセクションによってポケットを作る。適するマトリックスで運ばれる突然変異体BMPの約25mgの試験試料をポケット内に深く移植し、金属皮膚クリップで切開を閉じる。対照ラットには、何も移植しない。移植の日は、実験の1日目と指定する。インプラントは、12日目に除去する。ヘテロトロピック部位は、直伸部位の使用から生じる可能性のある曖昧性なしで、骨誘導の試験を可能にする。
ウサギモデル
X線によって実証される骨端閉鎖をもつ、8匹の成熟した(10ポンド未満)ニュージーランドホワイトウサギを試験する。本発明による1つの突然変異体BMP種をそれぞれ含むマトリックスを移植したウサギに、1.5cmの欠損を形成する。対照欠損には、何も移植しない。
本発明によるBMP突然変異体は、野生型BMPよりも低い量で、インビボ骨形成活性を誘導する。
本発明のBMP突然変異体は、ヒト患者で低い濃度で骨および軟骨の増殖を誘導することにおいて選択的である。
参照による組込み
本出願で引用されるすべての配列および構造のアクセス番号、刊行物および特許文書は、各個々の刊行物または特許文書の内容が本明細書に組み込まれるのと同程度に、すべての目的のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。
TGF−βスーパーファミリータンパク質および野生型BMP−6のキメラを含むタンパク質であって、野生型BMP−6の1つまたは複数のアミノ酸配列が、上記TGF−βスーパーファミリータンパク質における対応する残基位置のアミノ酸配列を置換し、上記キメラは上記TGF−βスーパーファミリータンパク質のアンタゴニストによる阻害に耐性であり、上記TGF−βスーパーファミリータンパク質の生物活性よりも大きな生物活性を示し、さらに、上記TGF−βスーパーファミリータンパク質は野生型BMP−6ではないタンパク質。
改変骨形成タンパク質(BMP)または改変成長分化因子(GDF)を含むタンパク質であって、上記改変BMPまたはGDFは、対応する未改変の野生型BMPまたは野生型GDFよりも、アンタゴニストによって阻害されず、上記対応する未改変の野生型BMPまたはGDFよりも大きな生物活性を有するタンパク質。
上記アンタゴニストが、Noggin、Noggin様タンパク質、Cerberus/DANファミリータンパク質、Chordin/SOGファミリータンパク質および上のいずれかの機能的同等物からなる、システインノットタンパク質アンタゴニストの群から選択される、項目1または2に記載のタンパク質。
NogginまたはNoggin様タンパク質による阻害に耐性であるタンパク質であって、改変骨形成タンパク質(BMP)または改変成長分化因子(GDF)を含み、
(a)ヒトBMP−6のVal45、Gln48、Asp49、Lys50、Gln53、Ile57、Lys60、Gly61、Ala63、Asn65、Tyr66、Asp68、Glu70、Ser72、Asn76、Ala77、His78、Met79およびAsn80からなる群より選択される少なくとも3つの置換アミノ酸が、野生型BMPまたは野生型GDFにおける対応する位置の少なくとも3つのアミノ酸を置換し、かつ
(b)上記少なくとも3つの置換アミノ酸が、上記野生型BMPまたは上記野生型GDFの、対応する位置の上記少なくとも3つのアミノ酸と異なる
タンパク質。
NogginまたはNoggin様タンパク質による阻害に耐性であるタンパク質であって、改変骨形成タンパク質(BMP)または改変成長分化因子(GDF)を含み、
(a)野生型ヒトBMP−6のVal45〜Asn80が、他の点では野生型のヒトBMPまたはヒトGDFにおける対応するセグメントを置換し、かつ
(b)置換された上記対応するセグメントが、野生型BMP−6の上記Val45〜Asn80と同一ではない
タンパク質。
D22S、S24Q、V26L、N29Q、V33I、P36K、H39A、F41N、H44D、P48S、A52N、D53AおよびL55Mからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む改変BMP−2タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型BMP−2と同一であるか、または野生型BMP−2のC末端領域における保存されたシステインドメインと少なくとも93%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
D24S、S26Q、V28L、N31Q、V35I、P38K、Q41A、F43N、H46D、D48E、P50S、A54N、D55AおよびL57Mからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む改変BMP−4タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型BMP−4と同一であるか、または野生型BMP−4のC末端領域における保存されたシステインドメインと少なくとも93%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
R41Q、E53KおよびF58Nからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む改変BMP−5タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型BMP−5と同一であるか、または野生型BMP−5のC末端領域における保存されたシステインドメインと少なくとも93%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
R48Q、E60K、E68D、A72SおよびS77Aからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む改変BMP−7タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型BMP−7と同一であるか、または野生型BMP−7のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも89%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
R48Q、E60K、Y65N、E68D、A72SおよびS77Aからなる群より選択される少なくとも2つのアミノ酸置換を含む改変BMP−7タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型BMP−7と同一であるか、または野生型BMP−7のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも89%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
R48Q、E60K、Y65N、E68D、A72S、S77AおよびY78Hからなる群より選択される少なくとも3つのアミノ酸置換を含む改変BMP−7タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型BMP−7と同一であるか、または野生型BMP−7のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも89%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
N27S、K29Q、M31L、D34Q、L41K、E42G、E44A、F46N、H47Y、E49D、L51E、E53S、R57N、S58A、L60MおよびE61Nからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む改変GDF−5タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型GDF−5と同一であるか、または野生型GDF−5のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも87%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
N27S、K29Q、E30D、D34Q、L41K、E42G、E44A、Y46N、H47Y、E48D、V51E、D53S、R57N、S58A、L60MおよびE61Nからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む改変GDF−6タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型GDF−6と同一であるか、または野生型GDF−6のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも97%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
D36S、K38Q、E39D、D43Q、L50K、D51G、E53A、Y55N、H56Y、E58D、L60E、D62S、R66N、S67A、L69M、E70Nからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む改変GDF−7タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型GDF−7と同一であるか、または野生型GDF−7のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも87%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
NogginまたはNoggin様タンパク質による改変骨形成タンパク質(BMP)または改変成長分化因子(GDF)の阻害を調節するための方法であって、
改変骨形成タンパク質(BMP)または改変成長分化因子(GDF)を提供する工程を含み、
(a)ヒトBMP−6のVal45、Gln48、Asp49、Lys50、Gln53、Ile57、Lys60、Gly61、Ala63、Asn65、Tyr66、Asp68、Glu70、Ser72、Asn76、Ala77、Met79およびAsn80からなる群より選択される少なくとも2つの置換アミノ酸が、野生型BMPまたは野生型GDFにおける対応する位置の少なくとも2つのアミノ酸を置換し、かつ
(b)上記少なくとも2つの置換アミノ酸が、上記野生型BMPまたは上記野生型GDFにおける対応する位置の上記少なくとも2つのアミノ酸と異なり、かつ
(c)上記提供する工程が、上記BMPまたはGDFの野生型対応物と比較して、NogginまたはNoggin様タンパク質による上記BMPまたはGDFの阻害の調節をもたらす
方法。
NogginまたはNoggin様タンパク質による骨形成タンパク質(BMP)または成長分化因子(GDF)の阻害を調節するための方法であって、
改変BMPまたはGDFタンパク質を提供する工程であり、上記改変タンパク質は、ヒトBMPまたはヒトGDFにおける対応するセグメントを野生型ヒトBMP−6のVal45〜Asn80で置換することから生成される工程を含み、置換された上記対応するセグメントは、野生型BMP−6の上記Val45〜Asn80と同一でなく、上記提供する工程は、BMPまたはGDFの野生型対応物と比較してNogginまたはNoggin様タンパク質による上記BMPまたはGDFの阻害の調節をもたらす
方法。
野生型のBMPまたはGDFタンパク質に対応するN末端アミノ酸配列およびC末端アミノ酸配列を含む天然に存在しないペプチドであって、
(a)上記天然に存在しないペプチドのN末端アミノ酸配列およびC末端アミノ酸配列の各々が、上記野生型のBMPまたはGDFタンパク質と少なくとも97%のアミノ酸配列同一性を共有し、かつ
(b)上記BMPがBMP−6ではないという条件で、上記天然に存在しないペプチドが、Val45、Gln48、Asp49、Lys50、Gln53、Ile57、Lys60、Gly61、Ala63、Asn65、Tyr66、Asp68、Glu70、Ser72、Asn76、Ala77、Met79およびAsn80からなる群より選択されるBMP−6アミノ酸残基に対応する位置の少なくとも2つのアミノ酸残基を有する、
天然に存在しないペプチド。
上記N末端アミノ酸配列または上記C末端アミノ酸配列が上記野生型BMPまたはGDFタンパク質と同一である、項目17に記載の天然に存在しないペプチド。
上記ペプチドが、その野生型のBMPまたはGDF対応物と比較して、NogginまたはNoggin様タンパク質による生物活性阻害の低減を示す、項目17に記載の天然に存在しないペプチド。
項目17に記載のペプチドを、薬学的に許容される担体と混合されて含む医薬組成物。
アミノ酸置換P36Kを含む、項目6に記載の改変BMP−2。
アミノ酸置換P38Kを含む、項目7に記載の改変BMP−4。
アミノ酸置換E53Kを含む、項目8に記載の改変BMP−5。
アミノ酸置換E60Kを含む、項目9に記載の改変BMP−7。
アミノ酸置換R48QおよびS77Aを含む、項目10に記載の改変BMP−7。
アミノ酸置換R48QおよびE60Kを含む、項目10に記載の改変BMP−7。
アミノ酸置換E60KおよびY765Nを含む、項目10に記載の改変BMP−7。
アミノ酸置換Y65NおよびY78Hを含む、項目10に記載の改変BMP−7。
アミノ酸置換R134Eをさらに含む、項目28に記載の改変BMP−7。
アミノ酸置換R48Q、E60KおよびS77Aを含む、項目11に記載の改変BMP−7。
アミノ酸置換R48Q、E60KおよびY65Nを含む、項目11に記載の改変BMP−7。
アミノ酸置換E60K、Y65NおよびA72Sを含む、項目11に記載の改変BMP−7。
アミノ酸置換R48Q、E60K、Y65NおよびA72Sを含む、項目11に記載の改変BMP−7。
アミノ酸置換L41Kを含む、項目12に記載の改変GDF−5。
アミノ酸置換L41Kを含む、項目13に記載の改変GDF−6。
アミノ酸置換L50Kを含む、項目14に記載の改変GDF−7。
項目1から14および21から36に記載のタンパク質のいずれか1つをコードする核酸。
項目37に記載の核酸を含むベクター。
項目1から14および21から36に記載のタンパク質のいずれか1つを、薬学的に許容される担体と混合されて含む医薬組成物。
骨または軟骨修復が必要な患者を治療する方法であって、上記患者に項目39に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
上記患者がヒトである、項目40に記載の方法。
R48、E60、Y65、E68、A72、S77およびY78からなる群より選択される少なくとも1つの位置でアミノ酸置換を含む改変BMP−7であって、BMP−7活性を有する改変BMP−7。
置換が位置60で起こる、項目42に記載の改変BMP−7。
上記位置60の置換がK、R、H、NまたはQ残基である、項目43に記載の改変BMP−7。
置換が位置48で起こる、項目42に記載の改変BMP−7。
上記位置48の置換がQ、N、W、YまたはF残基である、項目45に記載の改変BMP−7。
置換が位置65で起こる、項目42に記載の改変BMP−7。
上記位置65の置換がN、Q、H、KまたはR残基である、項目47に記載の改変BMP−7。
置換が位置72で起こる、項目42に記載の改変BMP−7。
上記位置72の置換がS、T、Y、NまたはQ残基である、項目49に記載の改変BMP−7。
置換が位置48、60、65および72で起こる、項目42に記載の改変BMP−7。
置換が位置48、60および65で起こる、項目42に記載の改変BMP−7。
NogginまたはNoggin様タンパク質による改変骨形成タンパク質(BMP)または改変成長分化因子(GDF)の阻害を調節するための方法であって、
改変骨形成タンパク質(BMP)または改変成長分化因子(GDF)を提供する工程を含み、
(a)ヒトBMP−9のAsn77、Glu79、Ile81、Asp84、Ser85、Ile88、Lys91、Glu92、Glu94、Tyr96、Glu97、Lys99、Gly101、Phe103、Ala107、Asp108、Asp109、Val110またはThr111からなる群より選択される少なくとも2つの置換アミノ酸が、野生型BMPまたは野生型GDFにおける対応する位置の少なくとも2つのアミノ酸を置換し、かつ
(b)上記少なくとも2つの置換アミノ酸が、上記野生型BMPまたは上記野生型GDFにおける対応する位置の上記少なくとも2つのアミノ酸と異なり、かつ
(c)上記提供する工程が、上記BMPまたはGDFの野生型対応物と比較して、NogginまたはNoggin様タンパク質による上記BMPまたはGDFの阻害の調節ももたらす
方法。
NogginまたはNoggin様タンパク質による骨形成タンパク質(BMP)または成長分化因子(GDF)の阻害を調節するための方法であって、
改変BMPまたはGDFタンパク質を提供する工程であり、上記改変タンパク質は、ヒトBMPまたはヒトGDFにおける対応するセグメントを野生型ヒトBMP−9のVal76〜Thr111で置換することから生成される工程を含み、置換された上記対応するセグメントは、野生型BMP−9の上記Val76〜Thr111と同一でなく、上記提供する工程は、BMPまたはGDFの野生型対応物と比較してNogginまたはNoggin様タンパク質による上記BMPまたはGDFの阻害の調節をもたらす
方法。
野生型のBMPまたはGDFタンパク質に対応するN末端アミノ酸配列およびC末端アミノ酸配列を含む天然に存在しないペプチドであって、
(a)上記天然に存在しないペプチドのN末端アミノ酸配列およびC末端アミノ酸配列の各々が、上記野生型のBMPまたはGDFタンパク質と少なくとも97%のアミノ酸配列同一性を共有し、さらに、
(b)上記天然に存在しないペプチドが、Asn77、Glu79、Ile81、Asp84、Ser85、Ile88、Lys91、Glu92、Glu94、Tyr96、Glu97、Lys99、Gly101、Phe103、Ala107、Asp108、Asp109、Val110またはThr111からなる群より選択されるBMP−9アミノ酸残基に対応する位置の少なくとも2つのアミノ酸残基を有し、かつ上記BMPがBMP−9でない
天然に存在しないペプチド。
Claims (44)
- NogginまたはNoggin様タンパク質による阻害に耐性であるタンパク質であって、改変骨形成タンパク質(BMP)を含み、
(a)ヒトBMP−6の第一の置換アミノ酸Lys60ならびにヒトBMP−6のVal45、Gln48、Asp49、Lys50、Gln53、Ile57、Gly61、Ala63、Asn65、Tyr66、Asp68、Glu70、Ser72、Asn76、Ala77、His78、Met79およびAsn80からなる群より選択される第二の置換アミノ酸が、野生型BMPにおける対応する位置の少なくとも2つのアミノ酸を置換し、かつ
(b)前記第一および第二の置換アミノ酸が、前記野生型BMPの、対応する位置の前記少なくとも2つのアミノ酸と異なる
タンパク質。 - NogginまたはNoggin様タンパク質による阻害に耐性であるタンパク質であって、改変骨形成タンパク質(BMP)を含み、
(a)野生型ヒトBMP−6のVal45〜Asn80が、他の点では野生型のヒトBMPにおける対応するセグメントを置換し、かつ
(b)置換された前記対応するセグメントが、野生型BMP−6の前記Val45〜Asn80と同一ではない
タンパク質。 - D22S、S24Q、V26L、N29Q、V33I、P36K、H39A、F41N、H44D、P48S、A52N、D53AおよびL55Mからなる群より選択される少なくとも2つのアミノ酸置換を含む改変BMP−2タンパク質であって、一つの置換は、P36Kであり、かつ他のすべての残基が、野生型BMP−2と同一であるか、または野生型BMP−2のC末端領域における保存されたシステインドメインと少なくとも93%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
- 位置P36におけるアミノ酸置換を含む改変BMP−2タンパク質であって、前記改変BMP−2は、野生型BMP−2のC末端領域における保存されたシステインドメインと少なくとも93%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
- D24S、S26Q、V28L、N31Q、V35I、P38K、Q41A、F43N、H46D、D48E、P50S、A54N、D55AおよびL57Mからなる群より選択される少なくとも2つのアミノ酸置換を含む改変BMP−4タンパク質であって、一つの置換は、P38Kであり、他のすべての残基が、野生型BMP−4と同一であるか、または野生型BMP−4のC末端領域における保存されたシステインドメインと少なくとも93%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
- R41Q、E53KおよびF58Nからなる群より選択される少なくとも2つのアミノ酸置換を含む改変BMP−5タンパク質であって、一つの置換は、E53Kであり、他のすべての残基が、野生型BMP−5と同一であるか、または野生型BMP−5のC末端領域における保存されたシステインドメインと少なくとも93%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
- アミノ酸置換E60KならびにR48Q、Y65N、E68D、A72S、S77AおよびY78Hからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む改変BMP−7タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型BMP−7と同一であるか、または野生型BMP−7のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも89%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
- R48Q、Y65N、E68D、A72SおよびS77Aからなる群より選択される少なくとも2つのアミノ酸置換を含む改変BMP−7タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型BMP−7と同一であるか、または野生型BMP−7のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも89%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
- R48Q、E68D、A72S、S77A、Y78Hからなる群より選択される少なくとも2つのアミノ酸置換を含む改変BMP−7タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型BMP−7と同一であるか、または野生型BMP−7のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも89%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
- アミノ酸置換E60KならびにR48Q、Y65N、E68D、A72S、S77AおよびY78Hからなる群より選択される少なくとも2つのアミノ酸置換を含む改変BMP−7タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型BMP−7と同一であるか、または野生型BMP−7のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも89%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
- R48Q、E60K、Y65N、E68D、A72S、S77AおよびY78Hからなる群より選択される少なくとも3つのアミノ酸置換を含む改変BMP−7タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型BMP−7と同一であるか、または野生型BMP−7のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも89%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
- アミノ酸置換E60KならびにR48Q、Y65N、E68D、A72S、S77AおよびY78Hからなる群より選択される少なくとも3つのアミノ酸置換を含む改変BMP−7タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型BMP−7と同一であるか、または野生型BMP−7のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも89%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
- R48Q、E60K、Y65N、E68D、A72S、S77AおよびY78Hからなる群より選択される少なくとも4つのアミノ酸置換を含む改変BMP−7タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型BMP−7と同一であるか、または野生型BMP−7のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも89%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
- N27S、K29Q、M31L、D34Q、L41K、E42G、E44A、F46N、H47Y、E49D、L51E、E53S、R57N、S58A、L60MおよびE61Nからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む改変GDF−5タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型GDF−5と同一であるか、または野生型GDF−5のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも87%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
- N27S、K29Q、E30D、D34Q、L41K、E42G、E44A、Y46N、H47Y、E48D、V51E、D53S、R57N、S58A、L60MおよびE61Nからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む改変GDF−6タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型GDF−6と同一であるか、または野生型GDF−6のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも97%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
- D36S、K38Q、E39D、D43Q、L50K、D51G、E53A、Y55N、H56Y、E58D、L60E、D62S、R66N、S67A、L69M、E70Nからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む改変GDF−7タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型GDF−7と同一であるか、または野生型GDF−7のC末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも87%のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
- 前記タンパク質が、前記改変タンパク質の野生型BMPの対応物と比較して、NogginまたはNoggin様タンパク質による生物活性阻害の低減を示す、請求項1に記載の改変骨形成タンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質を、薬学的に許容される担体と混合されて含む医薬組成物。
- アミノ酸置換R48QおよびS77Aを含む、請求項8または9に記載の改変BMP−7。
- アミノ酸置換R48QおよびE60Kを含む、請求項7に記載の改変BMP−7。
- アミノ酸置換E60KおよびY65Nを含む、請求項7に記載の改変BMP−7。
- アミノ酸置換R48Q、E60KおよびS77Aを含む、請求項10に記載の改変BMP−7。
- アミノ酸置換R48Q、E60KおよびY65Nを含む、請求項10に記載の改変BMP−7。
- アミノ酸置換E60K、Y65NおよびA72Sを含む、請求項10に記載の改変BMP−7。
- アミノ酸置換R48Q、E60K、Y65NおよびA72Sを含む、請求項12に記載の改変BMP−7。
- アミノ酸置換L41Kを含む、請求項14に記載の改変GDF−5。
- アミノ酸置換L41Kを含む、請求項15に記載の改変GDF−6。
- アミノ酸置換L50Kを含む、請求項16に記載の改変GDF−7。
- 請求項1から28に記載のタンパク質のいずれか1つをコードする核酸。
- 請求項29に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項1から28に記載のタンパク質のいずれか1つを、薬学的に許容される担体と混合されて含む医薬組成物。
- 骨または軟骨修復が必要な患者を治療する方法であって、前記患者に請求項31に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
- 前記患者がヒトである、請求項32に記載の方法。
- 位置E60ならびにR48、Y65、E68、A72、S77およびY78からなる群より選択される少なくとも1つの他の位置でアミノ酸置換を含む改変BMP−7であって、BMP−7活性を有する改変BMP−7。
- 前記位置60の置換がK、R、H、NまたはQ残基である、請求項34に記載の改変BMP−7。
- 置換が位置48で起こる、請求項34に記載の改変BMP−7。
- 前記位置48の置換がQ、N、W、YまたはF残基である、請求項36に記載の改変BMP−7。
- 置換が位置65で起こる、請求項34に記載の改変BMP−7。
- 前記位置65の置換がN、Q、H、KまたはR残基である、請求項38に記載の改変BMP−7。
- 置換が位置65および72で起こる、請求項34に記載の改変BMP−7。
- 前記位置72の置換がS、T、Y、NまたはQ残基である、請求項40に記載の改変BMP−7。
- 置換が位置48、60、65および72で起こる、請求項34に記載の改変BMP−7。
- 置換が位置48、60および65で起こる、請求項34に記載の改変BMP−7。
- 置換が位置48、60および77で起こる、請求項30に記載の改変BMP−7。
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