JP2011502111A - 非グリカン化ポリペプチドの癌治療での使用 - Google Patents
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Abstract
Description
世界中で報告される癌患者の増加は重大な問題である。現在、特定タイプの癌に利用できる治療はわずかしかない上、絶対に成功するという保証はない。特に、卵巣癌は女性の癌で(皮膚癌以外で)5番目に多い。卵巣癌は女性の癌死で5番目に多い原因である。米国癌協会では、2004年の米国での新たな卵巣癌患者は約25,580人となると推定される。約16,090人がこの病気で亡くなる。
国立癌研究所、SEER Cancer. Statistics Review 1973-1997, 2001
本発明は特に、配列番号1および配列番号2から成る群の中から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってポリペプチドがそのグリコシル化に関与する一種以上のアミノ酸残基で突然変異するポリペプチドの、癌予防または治療用薬剤の製造での使用に関する。
本発明のさらに別の対象は、上記定義の突然変異ポリペプチドをコードする核酸および発現カセット、および、対応する組換えベクターおよび組換え宿主細胞にある。これらはそれ自体で癌に対する薬剤として使用することもできる。
特に、本発明では、非グリカン化形態のエンドカンがインビボで腫瘍の成長を抑制する能力を有することがわかった。
ヒトエンドカンは、以前は、癌患者、特に肺癌、腎臓癌、乳癌または血管内皮癌患者の血漿中に高濃度で見られる内皮細胞由来の糖タンパク質として知られていた。
Bechard et al., 2001, J Biol Chem, Vol. 278(Nー51) : 48341-48349
Scherpereel et al., 2003, Cancer Research, Vol. 63 : 6084-6089
エンドカン単独ではHGF/SFの分裂促進活性の増加以外の影響はない、
エンドカンの共分裂促進活性はそのグリカンによってのみ模倣される、
非グリカン化エンドカンは単独でもHGF/SFの存在下でも細胞増殖への影響はない。
さらに、HEK293またはHT29細胞中の野生型または非グリカン化エンドカンの安定な形質移入によってこれらの細胞の成長速度は変わらなかった。
従って、インビトロ研究では、非グリカン化エンドカンによって、HEK293またはHT29細胞のような腫瘍上皮細胞株の成長速度は変わらない。従って、SCIDマウスの皮膚に注射したときに腫瘍を誘発しない非グリカン化エンドカンを過剰発現するHEK293に関して最初に説明したように、非グリカン化エンドカンは、異種移植片モデルでは抗腫瘍活性をもたないと思われていた(Scherpereel et al Cancer Res, 2003)。
Scherpereel et al Cancer Res, 2003
特に、本発明の実施例では、癌性細胞が組み換え技術で非グリカン化形態のエンドカンを発現する場合は、癌性細胞はインビボで腫瘍に進行しないことがわかった。さらに、組換え非グリカン化エンドカンは(i)この組換え非グリカン化エンドカンが局所的に存在するときと、(ii)この組換え非グリカン化エンドカンが全身投与されたときに、標的固形腫瘍の進行を抑制することがわかった。いずれの場合も、非グリカン化エンドカンを投与した動物の腫瘍部位で間質炎症反応が誘発され、これによって、非グリカン化エンドカンの特に癌免疫療法のアジュバント化合物としての有用性が立証される。
本発明者は、さらに驚くべきことに、複数の変形形態のエンドカンの非腫瘍化特性と、腫瘍に対するその抑制特性との間に特に関係がないことを見出した。例えば、(i)F116Aおよび(ii)F115AおよびF116A突然変異エンドカンは従来技術では非腫瘍化ポリペプチドと完全に同じ挙動を有すると示されていたが、本発明では、F116A非グリカン化エンドカンは腫瘍抑制剤であり、F115A、F116A非グリカン化エンドカンは腫瘍抑制活性を全くもたないことがわかった。
配列番号1のアミノ酸配列は長さが165アミノ酸の分泌形態のヒトエンドカンのアミノ酸配列から成る。
配列番号2のアミノ酸配列は長さが165アミノ酸の分泌形態のマウスエンドカンのアミノ酸配列から成る。
(i)長さが0〜250アミノ酸残基のN−末端アミノ酸配列、
(ii)配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列、
(iii)長さが0〜250アミノ酸残基のC−末端アミノ酸配列。
いくつかの好ましい実施例では、上記のN−末端アミノ酸配列(i)は対応する非分泌形態のヒトまたはマウスエンドカンポリペプチドのN−末端配列の全部または一部からなり、このヒトまたはマウスN−末端配列は長さが19アミノ酸のシグナルペプチドから成る。非分泌形態のヒトエンドカンポリペプチドのアミノ酸配列は本明細書の配列番号3のアミノ酸配列から成る。非分泌形態のマウスエンドカンポリペプチドのアミノ酸配列は本明細書の配列番号4のアミノ酸配列から成る。従って、上記のN−末端配列(i)は長さが0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19アミノ酸であるのが好ましい。
(a)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、配列番号1の137位置にあるセリンアミノ酸残基は異なるアミノ酸残基で置換される
(b)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、配列番号2の138位置にあるセリン残基は異なるアミノ酸残基で置換される。
上記の使用の好ましい別の実施例では、配列番号1または配列番号2と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、それらに含まれるシステイン残基のいずれか一つの欠失も置換もない。
この好ましい別の実施例では、配列番号1と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号1の9, 18, 32, 35, 46, 58, 64, 80, 83, 92, 96, 98, 103および110位置にあるシステインアミノ酸残基の欠質も置換もなく、このシステイン残基はジスルフィド架橋に関与する。また、この好ましい別の実施例では、配列番号1と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号1の9, 13, 18, 24, 32, 34, 35, 38, 46, 58, 64, 80, 83, 92, 96, 98, 103および110位置にあるシステインアミノ酸残基の欠質も置換もない。
本発明の実施例からわかるように、非グリカン化エンドカンの抗腫瘍活性は、配列番号1または配列番号2の116位置にあるフェニルアラニン残基が異なるアミノ酸で置換されるときに、さらに高まる。
(a)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、(i)配列番号1の137位置にあるセリンアミノ酸残基は異なるアミノ酸残基で置換され、(ii)配列番号1の116位置にあるフェニルアラニン残基は異なるアミノ酸残基で置換される
(b)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、(i)配列番号2の138位置にあるセリン残基は異なるアミノ酸残基で置換され、(ii)配列番号2の116位置にあるフェニルアラニン残基は異なるアミノ酸残基で置換される。
(a)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、(i)配列番号1の137位置にあるセリンアミノ酸残基は異なるアミノ酸残基で置換され、(ii)配列番号1の115位置にあるフェニルアラニン残基は異なるアミノ酸残基で置換される
(b)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、配列番号2の138位置にあるセリン残基は異なるアミノ酸残基で置換され、(ii)配列番号2の115位置にあるフェニルアラニン残基は異なるアミノ酸残基で置換される。
本発明のさらに別の対象は、配列番号5、6、7、8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを含む医薬組成物にある。
上記定義の医薬組成物では、上記ポリペプチドは有効成分から成る。
本発明の別の実施例では、少なくとも一種の本発明のポリペプチド有効成分を医薬上許容可能な媒体中で含む癌治療用の医薬組成物が提供される。
好ましい実施例では、本発明の医薬組成物を肺癌、乳癌、腎臓癌、膵癌、結腸癌、および、悪性黒色腫から成る群の中から選択される癌の治療に使用できる。
本発明では、本発明のいずれか一つの抗腫瘍ポリペプチド有効成分によってインビボでの腫瘍成長が抑制されることがわかる。ある実施例では、本発明のポリペプチド有効成分によって発揮される抗腫瘍活性を追加の抗癌治療によって完成させることができる。
従って、本発明はさらに、治療上有効量の本明細書に記載のポリペプチド有効成分を人体または動物体に投与することを含むこれらの生物体の治療または予防方法を提供する。本発明の方法は必要に応じて一種以上の一般的な治療法(例えば放射線療法、化学療法および/または外科手術)と併用して実施できる。複数の治療手段を用いることによって癌患者がより広範囲にわたって治療介入できる。
本発明のポリペプチド有効成分は、(i)本発明のヌクレオチド配列を用いて形質転換した微生物または真核生物細胞を培養する段階、および(ii)この微生物または真核生物細胞によって産生したペプチドを回収する段階を含む遺伝子工学技術によって得ることができる。
組換えDNA技術I, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai; Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 646, 1991
マウスエンドカンをコードする核酸は配列番号10から成る。
実際には、当業者は、本明細書に記載の種々の非グリカン化エンドカン由来ポリペプチドをコードするいずれか一つの核酸配列を、周知な組換えDNA技術、例えば部位特異的突然変異誘発技術を用いて容易に合成または産生できる。
特に、いずれか一つの本発明のポリペプチド有効成分をコードする核酸は、例えば下記文献に記載の当業者に周知な技術を用いて化学合成および遺伝子工学によってによって調製できる。
Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989
(a)配列番号7および配列番号8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b)配列番号7および配列番号8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(a)配列番号7および配列番号8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
(b)配列番号7および配列番号8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列から成るポリペプチド。
従って、本発明の別の対象は、本発明のポリペプチド有効成分をコードする核酸を含む組換え発現ベクターおよびその発現に必要な手段にある。発現に必要なこのような手段は当技術分野で周知であり、宿主細胞、発現ベクターおよび所望の発現レベルに応じて変えることができる。
<<Nonviral Vectors for gene Therapy>>, 2001, edited by M. Findeis, Humana Press <<Adenoviral Vectors for Gene Therapy>>, 2002, edited by Curiel and Douglas, Elsevier Science, Academic Press <<Vaccinia Virus and poxyirology>>, 2004, edited by S. Isaacs, Humana Press
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(a)配列番号7および配列番号8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b)配列番号7および配列番号8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(a)配列番号7および配列番号8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
(b)配列番号7および配列番号8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列から成るポリペプチド。
実際には、本発明の組換え宿主細胞のいずれか一つは対応するポリペプチド抗腫瘍有効成分を発現する。
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(A)下記から成る群の中から選択される本発明のポリペプチド有効成分をコードする核酸:
(a)配列番号7および配列番号8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b)配列番号7および配列番号8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(B)上記(A)に定義の核酸が挿入された組換えベクター、および、
(C)(i)上記(A)に定義の核酸または(ii)上記(B)に定義の組換えベクターによって形質転換された組換え宿主細胞。
以下、本発明の実施例を説明する。
A.材料と方法
A.1.細胞培養 293、NIH3T3、B16F10、HT-29細胞を10% FCSと2mM L-グルタミンを添加したDMEM中にルーチン的に培養した。CHO DG44を10% FCSとHT-Suppと2mM L-グルタミンを添加したα-MEM中にルーチン的に培養した。ハイブリドーマ細胞を10% FCS、5 mM HEPES、HT-サプリメントまたは無血清のハイブリドーマ-SFM培地(全ての培地はInvitrogen, Cergy Pontoise, Franceから購入) を添加したRPMI 1640中に培養した。
A.2.マウスエンドカンのクローニング マウスエンドカンcDNAクローニング。クローニングはPCRによって行った。第1PCRはヒト(X89426)とラットエンドカン(U80818)配列(5'-AGAAACTTGCTACCG-3' [配列番号11]および5'-GCCGTAGGGACAGTC-3' [配列番号12])間の100%相同配列中でデザインされたプライマーで開始した。125 bp PCR断片をBALB/cByJIco (BALB/c) Marathon Readyマウス肺cDNA (Invitrogen, Cergy Pontoise, France)から得た。この断片をpCR2.1ベクター (TA クローニングキット, Invitrogen, Cergy Pontoise, France)中でクローニングし、Applied Biosystems (Genoscreen, Pasteur Institute of Lille, France)社製の3730 XL装置で配列決定した。次いで、cDNA端の5'および3'迅速増幅(RACE)をメーカー(Invitrogen)が推奨するMarathon Readyマウス肺cDNAで行い、 pCR2.1中でクローニングし、配列決定した。さらに、完全長マウスエンドカン配列を次いでクローニングした(GenBank登録番号AJ249354)。マウスエンドカン遺伝子クローニング。ゲノムDNAの5'および3'迅速増幅をcDNA-特異的プライマーを用いて行った。簡単に言うと、マウスゲノムDNAをBALB/c脾細胞(Qiagen)から抽出した。EcoR I-消化ゲノムDNAを、EcoR I付着端とPCR-ベースの5'および3'増幅に特異的な配列とを有するアダプタを用いてリゲートした。完全なマウスesm-1遺伝子を次いでクローニングした(GenBank登録番号AJ416379)。
従って、ヒト配列では、マウス推定O-グリカン化部位のセリン138を、メーカー(Stratagene)が推奨するQuick-Change部位特異的突然変異誘発キットを用いてPCRによって、アラニンコドンで置換した。マウスエンドカンおよびマウスエンドカン/S138A cDNAを、Hind IIIおよびEcoR I制限部位を有するプライマーによって増幅させ、Hind III - EcoR I-直線化pcDNA3.1 (+)ベクター(Invitrogen)に挿入した。ヒトIgG1のFcドメインに融合したマウスエンドカンの完全読み枠を含むキメラDNA配列も、既に述べたようにpcDNA3.1(+)に挿入した。pcDNA3.1 (+)中の1マイクログラムの作成物を293, CHO DG44, B16F10に、NIH3T3およびHT-29の場合はFugene (Roche)またはリポフェクトアミン(Invitrogen)と一緒に形質移入した。安定に形質移入された細胞を、G418 (293, HT-29およびCHO DG44の場合にそれぞれ200, 300, 1000 オg/ml)を用いて選択し、既に述べた24ように限界希釈法によってクローニングした。
A.材料と方法
A.1.材料 野生型エンドカンまたは非グリカン化エンドカンcDNAを含むpcDNA3ベクターを突然変異させ、迅速部位特異的突然変異誘発キット(Quick Site Directed Mutagenesis Kit)(Stratagene)を用いてF115またはF116または両方をアラニン残基で置換し、その配列をABIプリズム装置(Genoscreen, Lille, France)で検証した。
以下のように種々の作成物を示す:
E1:エンドカン(野生型)
E11:S137Aエンドカン=非グリカン化エンドカン
E12:F115Aエンドカン
E13:F116Aエンドカン
E14:F115AおよびF116Aエンドカン
E15:F115A非グリカン化エンドカン
E16:F116A非グリカン化エンドカン
E17:F115AおよびF116A非グリカン化エンドカン。
cDNAをリポフェクトアミン成分を用いてHT-29に形質移入し、次いで、300 オg/mL G418の付加によって選択した。次いで、細胞をG418の存在下で限界希釈によって継代培養し、特異的な特許ELISAを用いてその上清中のエンドカンの検出でクローンを選択した。細胞をそのエンドカン産生レベルによって特徴付けした。マイコプラズマを含まない細胞クローンをU774の万能細胞バンクに貯蔵した(Inserm U774, Pasteur Institute of Lille, Lille, France)。
E1 (ここではBL10)またはE11を過剰発現するHT29細胞のSCIDマウスへの皮下注射によって、3週目から4週目の間に、臨床的に触知可能な腫瘍が形成された。しかし、腫瘍の成長速度には大きな差があった。すなわち、[図3]に示すように、E1を発現するHT29細胞は、親細胞より速く成長した。一方で、E11(非グリカン化エンドカン)を過剰発現するHT29細胞はE1を過剰発現するHT29細胞より成長が遅く、さらに、親HT29細胞より成長が遅かった。
腫瘍の病理分析によって、HT29とHT29-E1腫瘍は両方とも、ほとんど腫瘍細胞、および、血管のみを含む非常に弱い間質を含むことが明らかになった。対照的に、HT29-E11腫瘍は腫瘍細胞、および、血管、血管周囲白血球および線維症を含む有意な間質炎症反応を含んでいた。
免疫組織化学によって、ヒトエンドカンが腫瘍細胞によって排他的に産生されることおよびマウスエンドカンが腫瘍血管内で排他的に検出されることがわかった。
E1またはE11を過剰発現する3つの個別のHT29細胞クローンをSCIDマウスに皮下注射した(マウス一匹当たり2×105細胞、クローン一つ当たり4匹のマウス)(Classeur des clones)。マウスを毎週検査した。7週でマウスを犠牲にし、腫瘍を顕微鏡で分析した。
[図4]に示す結果から、成長速度は同じ分子を過剰発現する各クローンで似ていることがわかった。特に、HT29-E11の遅い成長速度は各クローンで定期的に見られ、これは成長速度の原因がクローンバイアスではなく、むしろ細胞によって産生される組換え分子にあることが示された。3つのクローン(12マウス)の平均のMean+/−SD。組織学的にHT29-E11腫瘍のみが間質炎症反応を示す(上記の組織学的図のように)。
B.3.1.抗腫瘍活性におけるF115およびF116の異なる役割
E11、E15、E16またはE17を過剰発現する3つのHT29細胞クローンをSCIDマウスに皮下注射した(クローン一つ当たり4匹のマウス)。
結果を[図5]に示す。HT29-E17の成長速度は親HT29細胞の成長速度と同様である。すなわち、F115とF116の両方がE11の抗腫瘍活性に必要である。HT29-E15の成長速度はHT29-E11の成長速度と同様である。すなわち、抗腫瘍活性にF115は必須ではなく、F116で補償できるように見える。HT29-E16の成長速度はHT29-E11の成長速度より遅い。すなわち、F115はF116との関係に置いて重要な役割を果たす。
結果を[図6]および[図7]に示す。
血中E1、E11、E15、E16およびE17を5〜50 ng/mLのレベルで検出する。このレベルは時間とともに上昇し、ある程度、腫瘍のサイズの増大に関係する。
HT29-E16腫瘍は、汎白血球浸潤、線維芽細胞、線維症および腫瘍血管(HE x 100)を含む激しい間質再構築を示すことがわかった。
エンドカンはLFA-1に結合し、ICAM-1 _ LFA-1相互作用を抑制する。従って、E11およびそのより効率的な誘導体E16はエンドカンの受容体LFA-1の競合的アンタゴニストの役目をすると考えられる。E16の最高効率はそのより大きいLFA-1親和性によって説明できる。
上記の結果から、腫瘍内のE16の局所的過剰発現によって、HT29腫瘍異種移植片の成長速度が親HT29腫瘍に比べてかなり遅くなることがわかった。E16の全身投与がHT29腫瘍に与える影響を調べるために二重腫瘍モデルを開発した。このモデルはSOURCE HT29-E16細胞の右肩甲部への注射と、TARGET親HT29細胞の対側背への注射を同時に行うことにある。
SOURCEおよびTARGET腫瘍を顕微鏡で観察した(データは示さず)。予想通り、HT29-E11およびHT29-E16腫瘍でのみ、間質炎症反応を認めた。驚くべきことに、このような炎症反応を血中E16の存在下で親HT29腫瘍内に認めた。
Claims (11)
- 配列番号1および配列番号2から成る群の中から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの非グリカン化形態の癌予防または治療用薬剤の製造での使用。
- ポリペプチドが下記から成る群の中から選択されるアミノ酸配列を含む請求項1に記載の使用:
(a)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、配列番号1の137位置にあるセリンアミノ酸残基は異なるアミノ酸残基で置換される、
(b)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、配列番号2の138位置にあるセリン残基は異なるアミノ酸残基で置換される。 - ポリペプチドが下記から成る群の中から選択されるアミノ酸配列を含む請求項1または2に記載の使用:
(a)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、(i)配列番号1の137位置にあるセリンアミノ酸残基は異なるアミノ酸残基で置換され、(ii)配列番号1の116位置にあるフェニルアラニン残基は異なるアミノ酸残基で置換される、
(b)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、配列番号2の138位置にあるセリン残基は異なるアミノ酸残基で置換され、(ii)配列番号2の116位置にあるフェニルアラニン残基は異なるアミノ酸残基で置換される。 - ポリペプチドが配列番号5および配列番号6から成る群の中から選択されるアミノ酸配列を含む請求項1または2に記載の使用。
- ポリペプチドが配列番号7および配列番号8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列を含む請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
- 配列番号7および配列番号8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列を含む非グリカン化ポリペプチド。
- 配列番号5、6、7、8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む医薬組成物。
- 請求項5または6に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 請求項8に記載の核酸が挿入された組換えベクター。
- 請求項8に記載の核酸または請求項9に記載の組換えベクターで形質転換された、且つ、配列番号5、6、7、8から成る群の中から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する組換え宿主細胞。
- 下記(a)〜(c)から成る群の中から選択される有効成分を含む医薬組成物:
(a)請求項8に記載の核酸、
(b)請求項9に記載の組換えベクター、
(c)請求項10に記載の組換え宿主細胞。
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