JP2011502108A - 癌の予防・治療剤 - Google Patents

癌の予防・治療剤 Download PDF

Info

Publication number
JP2011502108A
JP2011502108A JP2010528585A JP2010528585A JP2011502108A JP 2011502108 A JP2011502108 A JP 2011502108A JP 2010528585 A JP2010528585 A JP 2010528585A JP 2010528585 A JP2010528585 A JP 2010528585A JP 2011502108 A JP2011502108 A JP 2011502108A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cancer
activity
trail
signal activator
stk17b
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2010528585A
Other languages
English (en)
Inventor
伸介 荒木
晃 堀
裕介 中山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Publication of JP2011502108A publication Critical patent/JP2011502108A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

【課題】癌におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの同定、それらを用いた癌患者におけるTRAILシグナル活性化薬感受性の診断方法の提供、TRAILシグナル活性化薬感受性癌患者に対してTRAILシグナル活性化薬を投与するテイラーメイド型医療の提供。
【解決手段】TRAILシグナル活性化薬を含有してなる、TRAILシグナル活性化薬感受性患者のための癌の予防または治療剤であって、該患者が、被験者から採取した試料におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現または活性が変動していることを指標として選別される剤。TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーとして、AIM1、STK17B、LOC93349、CASP8等が挙げられる。
【選択図】なし

Description

本発明は、癌患者のTRAILシグナル活性化薬に対する感受性の診断方法、該方法により選別されるTRAILシグナル活性化薬感受性患者に投与される、TRAILシグナル活性化薬を含有する癌の予防・治療剤、TRAILシグナル活性化薬に対する感受性に影響する分子の調節薬を含有する癌の予防・治療剤、並びにTRAILシグナル活性化薬に対する感受性に影響する分子の阻害／活性化を指標とする抗癌作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
TNFファミリーに属するTRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand)はTRAIL受容体に結合することによりアポトーシスを誘導する。TRAILは、Death domainを有するアポトーシスシグナルを伝えるTRAILR1（TNFRSF10A、DR4、およびAPO2などとも呼ばれる）およびTRAILR2（TNFRSF10B、DR5などとも呼ばれる）と、アポトーシスシグナルを伝えない、デコイ受容体DcR1（TNFRSF10C、TRAILR3、LIT、TRIDなどとも呼ばれる）、DcR2（TNFRSF10D、TRUNDD、TRAILR4とも呼ばれる）および膜結合領域のない可溶型受容体Osteoprotegerin（OPG、TNFRSF11B、OCIFとも呼ばれる）とが知られている。TRAIL、TRAILR1のアゴニスト抗体およびTRAILR2のアゴニスト抗体はdeath domainを有するTRAIL受容体を発現する癌細胞のアポトーシスを誘導することから、癌治療薬としての臨床試験が行なわれている（非特許文献１）。
TRAILやTRAILR1もしくはTRAILR2アゴニスト抗体等のTRAILシグナルを活性化する薬剤（TRAILシグナル活性化薬）がdeath domainを有するTRAIL受容体に結合すると、Fas associated death domain (FADD) と pro-caspase-8により、death-inducing signalling complex (DISC)が形成され、caspaseカスケードの初期反応であるcaspase-8の活性化が起こる。下流のシグナル伝達経路は2つ知られている（非特許文献１）。１つ目は、caspase-8が直接、実行型caspase-3、-6および-7を活性化することによりアポトーシスを誘導する経路であり、もう一つは、活性型caspase-8がBcl-2ファミリーのBidを切断し、切断されたBidがミトコンドリアに移動して膜の透過性を亢進させることにより間接的に実行型caspase-3、-6および-7を活性化する経路である。Bidがミトコンドリアに移動した結果、ミトコンドリアからは、Apaf-1の活性化を介してcaspaseカスケードを活性化するチトクロームCやAIF、Smac/DIBLOが放出され、実行型caspase-3、-6および-7を活性化してアポトーシスが起こる。
一方、TRAILシグナルの研究により、TRAIL誘導アポトーシスに対して抵抗性の癌細胞が存在することが明らかになり、これまで、death domainを含む受容体（TRAILR1またはTRAILR2）の発現低下、デコイ受容体の高発現、caspase-8の変異および発現低下、DISCでのcaspase-8活性化を阻害するc-FLIP（cellular FADD-like interleukin-1beta-converting enzyme-inhibitory protein）の発現亢進、チトクロ−ムCの放出とApaf-1の活性化を抑制するBcl-2、Bcl-XLの高発現、caspaseを阻害するIAP（inhibitor of apoptosis proteins）ファミリー（XIAPやsurvivin等）の発現亢進など、TRAIL受容体とその下流のアポトーシスを制御する様々な蛋白質の異常、またMAPKやNFκBなどの増殖、抗アポトーシスシグナルの活性化、さらにTRAILR1およびTRAILR2をグリコシル化するグリコシル転移酵素GALNT14、GALNT3、およびフコシル化するフコシル転移酵素FUT6、FUT3がTRAIL抵抗性に関与していることが報告されている（非特許文献２〜５）。
しかしながら、癌細胞がTRAIL誘導アポトーシスに対して感受性であるか否か、言い換えれば癌患者がTRAILシグナル活性化薬に対して感受性であるか否かを、簡便かつ高確度に判定することができるバイオマーカー、即ちTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーといえるものは、これまで知られていない。
Duiker E.W.ら, Eur. J. Cancer, 2006, 42: 2233-40 Caroline M.M.ら, Drug Resist. Updat., 2004, 7: 345-58 Zhang L.とFang B., Cancer Gene Ther., 2005, 12: 228-37 Pasquini L.ら, Cancer Ther., 2006, 4: 47-72 Wagner K.W.ら, Nat. Med., 2007, 13: 1070-7
したがって、本発明の目的は、癌におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーを同定し、それらを用いた癌患者におけるTRAILシグナル活性化薬感受性の診断方法を提供することにより、TRAILシグナル活性化薬感受性癌患者に対してTRAILシグナル活性化薬を投与するテイラーメイド型医療を提供することである。本発明のさらなる目的は、TRAILシグナル活性化薬に対する感受性／非感受性に関与する因子を同定し、それらをターゲットとしたTRAILシグナル活性化薬感受性の増強方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、上記TRAILシグナル活性化薬に対する感受性／非感受性に関与する因子の発現・機能の調節を指標として、抗癌作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供することである。
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、数種のTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーを同定することに初めて成功し、これらのマーカーを用いて癌患者のTRAILシグナル活性化薬感受性を高確度に判定し得る診断方法を確立した。さらに本発明者らは、これらのマーカーの発現または機能を調節することにより、癌細胞におけるTRAILシグナル活性化薬感受性を変化させ得ることを明らかにし（以下、「TRAILシグナル活性化薬感受性関連因子」ともいう）、該マーカーの調節薬自体が癌の予防・治療薬として有用であることを実証した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
［１］TRAILシグナル活性化薬を含有してなる、TRAILシグナル活性化薬感受性患者のための癌の予防または治療剤であって、該患者が、被験者から採取した試料におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現または活性が変動していることを指標として選別される剤；
［２］TRAILシグナル活性化薬感受性患者が、被験者から採取した試料における(i) AIM1の発現または活性が亢進していないこと、並びに(ii) STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27およびRHOBTB3からなる群より選択される２以上の発現または活性が亢進していることを指標として選別される、上記［１］記載の剤；
［３］TRAILシグナル活性化薬感受性患者が、被験者から採取した試料におけるAIM1の発現又は活性が低下しており、かつSTK17Bおよび／またはLOC93349および／またはCASP8の発現または活性が亢進していることを指標として選別される、上記［１］記載の剤；
［４］TRAILシグナル活性化薬感受性患者が、被験者から採取した試料におけるSTK17Bの発現または活性が亢進していることを指標として選別される、上記［１］記載の剤；
［５］TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーがAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8であり、
（１）２以上の既知TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞および２以上の既知TRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞におけるAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8の発現量または活性を測定し、
（２）(i) （１）で測定したTRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞およびTRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞のうち、乳癌または大腸癌細胞におけるAIM1の発現量または活性とTRAILシグナル活性化薬感受性との関係から、癌細胞のTRAILシグナル活性化薬に対する感受性の有無を正しく判定することができる相対発現量または相対活性の値を基準値とし、(ii) （１）で測定したTRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞およびTRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の発現量または活性とTRAILシグナル活性化薬感受性との関係から、癌細胞のTRAILシグナル活性化薬感受性を正しく判定することができる相対発現量または相対活性の値を上方基準値、癌細胞のTRAILシグナル活性化薬非感受性を正しく判定することができる相対発現量または相対活性の値を下方基準値としたとき、
以下の（ａ）または（ｂ）に該当する被験者をTRAILシグナル活性化薬感受性患者として選別することを特徴とする、上記［１］記載の剤；
（ａ）被験者が乳癌または大腸癌患者の場合には、被験者から採取した試料におけるAIM1の発現量または活性が該基準値未満である、および、被験者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の発現量または活性が該上方基準値以上である場合にプラス１ポイント、下方基準値以上かつ上方基準値未満である場合にゼロポイント、下方基準値未満である場合に、マイナス１ポイントとして、STK17B、LOC93349およびCASP8のポイントの総和が正である
（ｂ）被験者が乳癌および大腸癌以外の癌患者の場合には、被験者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の発現量または活性が該上方基準値以上である場合にプラス１ポイント、下方基準値以上かつ上方基準値未満である場合にゼロポイント、下方基準値未満である場合にマイナス１ポイントとして、STK17B、LOC93349およびCASP8のポイントの総和が正である
［６］TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーがAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8であり、
（１）２以上の既知TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞および２以上の既知TRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞におけるAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8の発現量または活性を測定し、
（２）(i) （１）で測定したTRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞およびTRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞の中から任意に選択された1つの細胞（基準癌細胞）におけるAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8の発現量または活性を1.0として、他の癌細胞におけるAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8の相対発現量または相対活性を算出し、
(ii) （１）で測定した他の細胞におけるAIM1の相対発現量（小数点下２ケタ）または相対活性（小数点下２ケタ）とTRAILシグナル活性化薬感受性の有無との関係を比較し、TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞群における最も大きい相対発現量Aまたは相対活性Aを選択し、ついでTRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞群において当該相対発現量Aまたは相対活性Aよりも大きく、かつ最も近い相対発現量Bまたは相対活性Bを選択し、当該相対発現量Bまたは相対活性Bの小数点下２ケタ目を削除した値を基準値とし、
(iii) （１）で測定した他の細胞におけるSTK17B, LOC93349, およびCASP8の相対発現量（小数点下２ケタ）または相対活性（小数点下２ケタ）とTRAILシグナル活性化薬感受性の有無との関係を比較し、TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞群における相対発現量または相対活性の中央値の80%値を上方基準値とし、TRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞群における相対発現量または相対活性の中央値の120%値を下方基準値としたとき、
以下の（ａ）または（ｂ）に該当する被験者をTRAILシグナル活性化薬感受性患者として選別することを特徴とする、上記［５］記載の剤；
（ａ）被験者が乳癌または大腸癌患者の場合には、被験者から採取した試料におけるAIM1の発現量または活性が該基準値未満である、および、被験者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の発現量または活性が該上方基準値以上である場合にプラス１ポイント、下方基準値以上かつ上方基準値未満である場合にゼロポイント、下方基準値未満である場合に、マイナス１ポイントとして、STK17B、LOC93349およびCASP8のポイントの総和が正である
（ｂ）被験者が乳癌および大腸癌以外の癌患者の場合には、被験者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の発現量または活性が該上方基準値以上である場合にプラス１ポイント、下方基準値以上かつ上方基準値未満である場合にゼロポイント、下方基準値未満である場合にマイナス１ポイントとして、STK17B、LOC93349およびCASP8のポイントの総和が正である；
［７］AIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8の発現量がそれらをコードするmRNAの発現量であり、相対発現量がCOLO205細胞株における発現量に対する相対値であり、AIM1における基準値が2.2であり、STK17Bにおける上方基準値が1.036、下方基準値が0.514であり、LOC93349における上方基準値が0.666、下方基準値が0.211であり、CASP8における上方基準値が0.833、下方基準値が0.519である、上記［６］記載の剤；
［８］試料が癌細胞、癌組織、血液、血清、血漿または尿である、上記［１］記載の剤；［９］TRAILシグナル活性化薬がTRAIL、TRAILR1アゴニスト化合物またはTRAILR2アゴニスト化合物である、上記［１］〜「８］のいずれかに記載の剤；
［１０］癌患者のTRAILシグナル活性化薬に対する感受性を診断する方法であって、該患者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349およびCASP8の発現または活性を調べることを含む方法；
［１１］乳癌または大腸癌患者のTRAILシグナル活性化薬に対する感受性を診断する方法であって、該患者から採取した試料におけるAIM1の発現または活性をさらに調べることを含む、上記［１０］記載の方法；
［１２］TRAILシグナル活性化薬がTRAIL、TRAILR1アゴニスト化合物またはTRAILR2アゴニスト化合物である、上記［１０］記載の方法；
［１３］STK17B、LOC93349およびCASP8の発現または活性を検出し得る試薬を含んでなる、癌患者のTRAILシグナル活性化薬に対する感受性の診断薬；
［１４］AIM1の発現または活性を検出し得る試薬をさらに含んでなる、乳癌または大腸癌患者用である、上記［１３］記載の診断薬；
［１５］AIM1阻害薬を含有してなる癌の予防または治療剤；
［１６］AIM1阻害を指標とする、抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
［１７］STK17B、LOC93349、SP110、NOD27またはRHOBTB3活性化薬を含有してなる癌の予防または治療剤；
［１８］STK17B、LOC93349、SP110、NOD27またはRHOBTB3活性化を指標とする、抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法：
を提供する。
さらに、本発明は、
［１９］被験者から採取した試料におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現または活性が変動していることを指標として選別されたTRAILシグナル活性化薬感受性患者に対して、TRAILシグナル活性化薬の有効量を投与することを特徴とする癌の予防または治療方法；
［２０］哺乳動物に対して、AIM1阻害薬の有効量を投与することを特徴とする癌の予防または治療方法；
［２１］哺乳動物に対して、STK17B、LOC93349、SP110、NOD27またはRHOBTB3活性化薬の有効量を投与することを特徴とする癌の予防または治療方法；
［２２］TRAILシグナル活性化薬感受性患者のための癌の予防または治療剤を製造するための、TRAILシグナル活性化薬の使用であって、該患者が、被験者から採取した試料におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現または活性が変動していることを指標として選別される使用；
［２３］癌の予防または治療剤を製造するためのAIM1阻害薬の使用；
［２４］癌の予防または治療剤を製造するための、STK17B、LOC93349、SP110、NOD27またはRHOBTB3活性化薬の使用：
を提供する。
癌患者における、本発明のTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現または活性を調べることにより、迅速かつ簡便なTRAILシグナル活性化薬感受性の診断が可能となる。また、TRAILシグナル活性化薬を含有する本発明の癌の予防・治療剤は、TRAILシグナル活性化薬感受性癌患者に対して選択的に投与されるので、より有効に癌を予防および／または治療することができる。さらに、本発明のTRAILシグナル活性化薬感受性関連因子の調節薬は、癌患者におけるTRAILシグナル活性化薬感受性を高めることができるので、例えばTRAILシグナル活性化薬と併用することにより、有効に癌を予防および／または治療することができる。
［発明の詳細な説明］
１．TRAILシグナル活性化薬含有癌予防・治療剤
本発明は、TRAILシグナル活性化薬を含有してなる、TRAILシグナル活性化薬感受性患者のための癌の予防または治療剤を提供する。ここで「TRAILシグナル活性化薬」とは、TRAILからTRAILR1またはTRAILR2を介して最終的に細胞にアポトーシスを誘導するシグナル伝達を活性化し得る物質である限り、特に限定されないが、好ましくは、TRAILR1またはTRAILR2に結合してFADD、pro-caspase-8にシグナルを伝達し、caspase-8の活性化を引き起こす物質であり、例えば、TRAIL、あるいはTRAILR1もしくはTRAILR2のアゴニスト化合物等が挙げられる。個々のTRAILシグナル活性化薬の詳細については後述する。
「TRAILシグナル活性化薬感受性」とは、TRAILシグナル活性化薬の作用により癌細胞におけるTRAILシグナルの伝達が活性化され、癌の予防および／または治療上有効な程度に癌細胞にアポトーシスが誘導されることをいう。
本明細書において「患者」とは、癌に罹患している者、あるいは細胞が癌化の過程にあり、近い将来癌を発症するおそれのある者を意味する。また、「患者」はヒトだけでなく他の哺乳動物（例、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、モルモット、ウサギ、ラット、マウス等）をも包含する意味で用いることとするが、好ましくはヒトである。癌の種類に特に制限はなく、例えば、乳癌（例、浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、炎症性乳癌など）、前立腺癌（例、ホルモン依存性前立腺癌、ホルモン非依存性前立腺癌など）、膵癌（例、膵管癌など）、胃癌（例、乳頭腺癌、粘液性腺癌、腺扁平上皮癌など）、肺癌（例、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫など）、結腸癌（例、消化管間質腫瘍など）、直腸癌（例、消化管間質腫瘍など）、大腸癌（例、家族性大腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、消化管間質腫瘍など）、小腸癌（例、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍など）、食道癌、十二指腸癌、舌癌、咽頭癌（例、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌など）、唾液腺癌、脳腫瘍（例、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫など）、神経鞘腫、肝臓癌（例、原発性肝癌、肝外胆管癌など）、腎臓癌（例、腎細胞癌、腎盂と尿管の移行上皮癌など）、胆管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌（例、上皮性卵巣癌、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍など）、膀胱癌、尿道癌、皮膚癌（例、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌など）、血管腫、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、甲状腺癌（例、甲状腺髄様癌など）、副甲状腺癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、骨腫瘍（例、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫、軟部組織肉腫など）、血管線維腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形癌（例、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍など）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、白血病（例、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病など）等が挙げられるが、好ましくは乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、膵癌、前立腺癌、卵巣癌、血液癌などである。
TRAILシグナル活性化薬を含有する本発明の癌の予防・治療剤の投与対象となるTRAILシグナル活性化薬感受性患者は、被験者から採取した試料における１以上のTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現または活性が変動しているか否かを指標として選別されることを特徴とする。これまではTRAILシグナル活性化薬感受性のバイオマーカーが知られていなかったので、投与対象を限定してTRAILシグナル活性化薬を使用することができなかった。従って、本発明はまた、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーを初めて提供する。
本発明における「TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー」としては、例えばAIM1、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27およびRHOBTB3が挙げられる。AIM1、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27およびRHOBTB3はNCBI（National Center for Biotechnology Information）の設定した遺伝子記号であるが、本明細書において単に「AIM1」、「STK17B」、「LOC93349」、「CASP8」、「SP110」、「NOD27」または「RHOBTB3」と記載される場合、その文脈に応じて遺伝子を指す場合、それにコードされる蛋白質を指す場合、あるいはその両方を包括的に指す場合がある。
AIM1遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含む遺伝子であり、悪性黒色腫における腫瘍抑制に関与することが知られている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 3229-34, 1997）。12の膜貫通ドメイン（βγ-クリスタリンモチーフ）を有し、細胞膜に局在することが示唆されている。
STK17B遺伝子は、配列番号３で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含む遺伝子であり、アポトーシスシグナルの伝達への関与が示唆されているセリン／スレオニンキナーゼをコードしている（J. Biol. Chem., 273(44): 29066-71, 1998）。
LOC93349遺伝子は、配列番号５で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含む遺伝子であり、機能未知の蛋白質をコードしている（Nat. Genet., 36(1): 40-5, 2004）。
CASP8遺伝子は、配列番号７で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含む遺伝子であり、カスペースカスケードの頂点にあるcaspase-8をコードしている（Duiker E.W.ら, Eur. J. Cancer, 2006, 42: 2233-40）。
SP110遺伝子は、配列番号９で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含む遺伝子であり、核体の構成成分で、核内ホルモン受容体の転写コアクチベータとして機能することが示唆されている蛋白質をコードしている（Mol. Cell. Biol., 20(16): 6138-46, 2000）。
NOD27遺伝子は、配列番号１１で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含む遺伝子であり、Apaf-1と相同なドメイン（ヌクレオチド結合性多量体化ドメイン）を含む機能未知の蛋白質をコードしている（Biochem. Biophys. Res. Commun. 302(3): 575-580, 2003）。
RHOBTB3遺伝子は、配列番号１３で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含む遺伝子であり、Rho GTPaseのサブファミリーのメンバーである蛋白質をコードするが、該遺伝子はいくつかの癌細胞株でアップレギュレートされていることから、該蛋白質の発癌への関与が示唆されている（Gene, 298(2): 147-57, 2002）。
ここで「配列番号ｎ（ｎ＝１、３、５、７、９、１１または１３）で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含む遺伝子」とは、配列番号ｎで表される塩基配列を含むヒトcDNAをコードするヒト遺伝子のスプライシングバリアントや、アレル変異体（例えば、アレル頻度1%未満）、遺伝子多型（例えば、マイナーアレル頻度1%以上）等のように、天然に見出される、配列番号ｎで表される塩基配列とは完全に一致しないが同一の機能を有するヒト遺伝子を意味する。例えば、CASP8には4つのスプライシングバリアントが知られており、配列番号７にはその中で最長のvariant Aの塩基配列（Refseq No. NM_001228.4）を示しているが、他にRefseq No. NM_033355.2として登録されるvariant B、NM_033356.2として登録されるvariant C、NM_033358.2として登録されるvariant Eがある。また、SP110には3つのスプライシングバリアントが知られており、配列番号９にはその中で最長のvariant Cの塩基配列（Refseq No. NM_080424.1）を示しているが、他にRefseq No. NM_004509.2として登録されるvariant A、NM_004510.2として登録されるvariant Bがある。
上記変異体もしくは多型遺伝子は、通常、配列番号ｎで表される塩基配列と約90%以上、好ましくは約95%以上、より好ましくは約97%以上、特に好ましくは約98%以上、最も好ましくは約99%以上の相同性を有する塩基配列を含む。尚、本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4:11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
上述の通り、TRAILシグナル活性化薬を含有する本発明の癌予防・治療剤は、ヒト以外の哺乳動物にも広く適用可能である。したがって、本発明におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子は、上記ヒト遺伝子だけでなく他の哺乳動物におけるそれらのオルソログをも包含することは明らかである。この場合、該オルソログとヒト遺伝子との相同性は特に制限されず、高いことが望ましいが、例えば約50%以上、好ましくは約60%以上、より好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%、特に好ましくは約90%以上であってよい。他の哺乳動物におけるオルソログは、配列番号ｎで表される塩基配列自体もしくは公共データベースのaccession番号（例えばRefseq No.の場合、AIM1はNM_001624.2、STK17BはNM_004226.2、LOC93349はNM_138402.4、CASP8はNM_001228.4、SP110はNM_080424.1、NOD27はNM_032206.3、RHOBTB3はNM_014899.3である）をクエリーにして、ヒト以外の哺乳動物のゲノムおよび/またはcDNAのデータベースに対してBLASTやFASTAを用いて検索をかけるか、あるいは、例えばJackson研究所から提供されるMouse Genome Informatics（http://www.informatics.jax.org/）でaccession番号や遺伝子記号/遺伝子名をキーワードにして検索をかけ、ヒットしたデータのMammalian Orthologyの情報にアクセスする等によって、その配列情報を取得することができる。例えば、AIM1遺伝子の場合、GenBankにBC059272.1として登録されているマウスオルソログ、Refseq No. XM_518660.2として登録されているチンパンジーオルソログ、Refseq No. XM_532248.2として登録されているイヌオルソログが知られている。
TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの「発現（量）」とは、(1) AIM1、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27またはRHOBTB3遺伝子からのmRNA発現（量）、あるいは (2) 該mRNAからの蛋白質発現（量）の両方を含む。一方、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの「活性」とは、AIM1、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27またはRHOBTB3蛋白質の生理活性を意味し、例えば、STK17Bであればキナーゼ（自己リン酸化および蛋白質リン酸化）活性、CASP8であればプロテアーゼ活性が挙げられる。
TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現は、被験者から採取した試料中に含まれる該マーカーのmRNAまたは蛋白質の量を測定することにより調べることができる。また、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの活性は、該試料中に含まれる該マーカー蛋白質の生理活性を、各蛋白質について自体公知の手法を用いて測定することにより調べることができる。
ここで用いられる試料としては、被験者である上記哺乳動物から採取されるものであって、検出対象である遺伝子産物（例、mRNA、蛋白質など）を含有するものであれば特に制限されない。例えば、生検により得られる癌細胞もしくは癌組織標本の他、全血、血液の細胞画分（末梢血遊離癌細胞（CTC）を含み得る）、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液、精液、尿、汗、唾液、関節液等の体液もしくはそのフラクション、粘膜などが挙げられる。本発明のTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーが、種々のTRAILシグナル活性化薬感受性および非感受性癌細胞における発現比較から抽出された点を考慮すると、癌細胞もしくは癌組織を用いることが望ましいが、迅速且つ簡便に採取することができ、動物への侵襲が少ないなどの点から、血液やそのフラクションを用いることもまた好ましい。
本発明においては、上記７種のTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーから選ばれる少なくとも１種の発現または活性を調べればよい。好ましくは、上記した７種のうちのいずれか２種以上、より好ましくは３種以上、さらに好ましくは４種以上を測定対象とする方法が挙げられる。
特に好ましくは、STK17B、LOC93349およびCASP8の３種のマーカーを用いる方法が挙げられ、被験者が乳癌または大腸癌患者の場合には、さらにAIM1を測定対象とすることが望ましい。
被験者である哺乳動物から採取した試料におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の発現は、該試料からRNA（例：全RNA、mRNA）画分を調製し、該画分中に含まれる該マーカー遺伝子の転写産物を検出することにより調べることができる。RNA画分の調製は、グアニジン-CsCl超遠心法、AGPC法など公知の手法を用いて行うことができるが、市販のRNA抽出用キット（例：RNeasy Mini Kit; QIAGEN製等）を用いて、微量試料から迅速且つ簡便に高純度の全RNAを調製することができる。RNA画分中のTRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の転写産物を検出する手段としては、例えば、ハイブリダイゼーション（ノーザンブロット、ドットブロット、DNAチップ解析等）を用いる方法、あるいはPCR（RT-PCR、競合PCR、リアルタイムPCR等）を用いる方法などが挙げられる。微量試料から迅速且つ簡便に定量性よくTRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の発現変動を検出できる点で競合PCRやリアルタイムPCRなどの定量的PCR法が、また、複数のマーカー遺伝子の発現変動を一括検出することができ、検出方法の選択によって定量性も向上させ得るなどの点でDNAチップ解析が好ましい。
ノーザンブロットまたはドットブロットハイブリダイゼーションによる場合、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の検出は、該遺伝子の転写産物とハイブリダイズし得る核酸（プローブ）を用いて行うことができる。そのような核酸としては、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の転写産物、即ち、(i)配列番号ｎ（ｎ＝１、３、５、７、９、１１または１３）で表される塩基配列または(ii)前記(i)の塩基配列を含むヒト遺伝子の他の哺乳動物におけるオルソログの塩基配列を有する核酸（センス鎖＝コード鎖）とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸が挙げられる。「ハイストリンジェントな条件」とは、配列番号ｎに示される各塩基配列を有する核酸と、オーバーラップする領域において約80%以上、好ましくは約90%以上、より好ましくは約95%以上の相補性を有する塩基配列を有する核酸とがハイブリダイズし得る条件をいい、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC／0.1％ SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。
プローブとして用いられる核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、アンチセンス鎖を用いることができる。該核酸の長さは標的核酸と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、例えば約15塩基以上、好ましくは約30塩基以上である。該核酸は、標的核酸の検出・定量を可能とするために、標識剤により標識されていることが好ましい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕、〔32P〕、〔33P〕、〔35S〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート、シアニン蛍光色素などが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、プローブと標識剤との結合にビオチン-(ストレプト)アビジンを用いることもできる。
ノーザンハイブリダイゼーションによる場合は、上記のようにして調製したRNA画分をゲル電気泳動にて分離した後、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等のメンブレンに転写し、上記のようにして調製された標識プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液中、上記「ハイストリンジェントな条件下で」ハイブリダイゼーションさせた後、適当な方法でメンブレンに結合した標識量をバンド毎に測定することにより、各TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の発現量を測定することができる。ドットブロットの場合も、RNA画分をスポットしたメンブレンを同様にハイブリダイゼーション反応に付し（各TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子についてそれぞれ行う）、スポットの標識量を測定することにより、各マーカー遺伝子の発現量を測定することができる。
DNAチップ解析による場合、例えば、上記のようにして調製したRNA画分から、逆転写反応によりT7プロモーター等の適当なプロモーターを導入したcDNAを合成し、さらにRNAポリメラーゼを用いてcRNAを合成する（この時ビオチンなどで標識したモノヌクレオチドを基質として用いることにより、標識されたcRNAが得られる）。この標識cRNAを、上記したプローブを固相化したチップと接触させてハイブリダイゼーション反応させ、固相上の各プローブに結合した標識量を測定することにより、各TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の発現量を測定することができる。当該方法は、検出するTRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子（従って、固相化されるプローブ）の数が多くなるほど、迅速性および簡便性の面で有利である。
別の好ましい実施態様によれば、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の発現量を測定する方法として定量的PCR法が用いられる。定量的PCRとしては、例えば、競合PCRやリアルタイムPCRなどがある。
PCRにおいてプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、各TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子転写産物のセンス鎖（コード鎖）およびアンチセンス鎖（非コード鎖）とそれぞれ特異的にハイブリダイズすることができ、それらに挟まれるDNA断片を増幅し得るものであれば特に制限はなく、例えば、各々約15〜約100塩基、好ましくは各々約15〜約50塩基の長さを有し、約100bp〜数kbpのDNA断片を増幅するようにデザインされたオリゴDNAのセットが挙げられる。より具体的には、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、(i)配列番号ｎに示される塩基配列または(ii)前記(i)の塩基配列を含むヒト遺伝子の他の哺乳動物におけるオルソログの塩基配列を有する核酸（センス鎖）とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、および前記(i)または(ii)の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸（アンチセンス鎖）とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸が挙げられる。ここで「ハイストリンジェントな条件」とは前記と同義である。
競合RT-PCRとは、目的のDNAを増幅し得るプライマーのセットにより増幅され得る既知量の他の鋳型核酸をcompetitorとして反応液中に共存させて競合的に増幅反応を起こさせ、増幅産物の量を比較することにより、目的DNAの量を算出する方法をいう。したがって、競合RT-PCRによる場合、上記したプライマーセットに加えて、該プライマーセットで増幅でき、増幅後に標的核酸（すなわち、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の転写産物）の増幅産物と区別することができる（例えば、増幅サイズが異なる、制限酵素処理断片の泳動パターンが異なるなど）既知量のcompetitor核酸が用いられる。標的核酸とcompetitor核酸とはプライマーを奪い合って増幅が競合的に起こるので、増幅産物の量比が元の鋳型の量比を反映することになる。competitor核酸はDNAでもRNAでもよい。DNAの場合、上記のようにして調製されるRNA画分から逆転写反応によりcDNAを合成した後に、上記プライマーセットおよびcompetitorの共存下でPCRを行えばよく、RNAの場合は、RNA画分にcompetitorを添加して逆転写反応を行い、さらに上記プライマーセットを添加してPCRを実施すればよい。後者の場合、逆転写反応の効率も考慮に入れているので、元のmRNAの絶対量を推定することができる。
一方、リアルタイムPCRは、蛍光試薬を用いて増幅量をリアルタイムでモニタリングする方法であり、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置を必要とする。このような装置は市販されている。用いる蛍光試薬によりいくつかの方法があり、例えば、インターカレーター法、TaqManTMプローブ法、Molecular Beacon法等が挙げられる。いずれも、上記のようにして調製されるRNA画分から逆転写反応によりcDNAを合成した後に、上記プライマーセットとSYBR Green I、エチジウムブロマイド等の二本鎖DNAに結合することにより蛍光を発する試薬（インターカレーター）、上記プローブとして用いることができる核酸（但し、該核酸は増幅領域内で標的核酸にハイブリダイズする）の両端をそれぞれ蛍光物質（例：FAM、HEX、TET、FITC等）および消光物質（例：TAMRA、DABCYL等）で修飾したもの（TaqManTMプローブまたはMolecular Beaconプローブ）などの蛍光試薬（プローブ）とを、それぞれPCR反応系に添加するというものである。インターカレーターは合成された二本鎖DNAに結合して励起光の照射により蛍光を発するので、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型cDNA量を推定することができる。TaqManTMプローブは両端を蛍光物質と消光物質をそれぞれで修飾した、標的核酸の増幅領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであり、アニーリング時に標的核酸にハイブリダイズするが消光物質の存在により蛍光を発せず、伸長反応時にDNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解されて蛍光物質が遊離することにより蛍光を発する。従って、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型cDNA量を推定することができる。Molecular Beaconプローブは両端を蛍光物質と消光物質をそれぞれで修飾した、標的核酸の増幅領域にハイブリダイズし得るとともにヘアピン型二次構造をとり得るオリゴヌクレオチドであり、ヘアピン構造をとっている時は消光物質の存在により蛍光を発せず、アニーリング時に標的核酸にハイブリダイズして蛍光物質と消光物質との距離が広がることにより蛍光を発する。従って、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型cDNA量を推定することができる。リアルタイムRT-PCRは、PCRの増幅量をリアルタイムでモニタリングできるので、電気泳動が不要で、より迅速にTRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の発現を解析可能である。
上記のようにして測定されるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の発現量は、各癌細胞における発現量を、GAPDH、β-グロビン、PGK1などのハウスキーピング遺伝子を内部標準として補正した後に比較することが望ましい。
被験者である哺乳動物から採取した試料におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカー蛋白質の発現は、該試料から蛋白質画分を調製し、該画分中に含まれる該マーカー遺伝子の翻訳産物（即ち、マーカー蛋白質）を検出することにより調べることができる。マーカー蛋白質の検出は、各蛋白質に対する抗体を用いて、免疫学的測定法（例：ELISA、FIA、RIA、ウェスタンブロット、免疫組織染色等）によって行うこともできるし、酵素などの測定可能な生理活性を示す蛋白質においては、該生理活性を、各マーカー蛋白質について公知の手法を用いて測定することによっても行い得る。あるいはまた、マーカー蛋白質の検出は、MALDI-TOFMS等の質量分析法を用いても行うことができる。
尚、各マーカー蛋白質に対する抗体は、配列番号ｎ（ｎ＝１、３、５、７、９、１１または１３）に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含む遺伝子または該配列番号に示される塩基配列を含むヒト遺伝子の他の哺乳動物におけるオルソログにコードされる蛋白質あるいはその部分ペプチド、より具体的には、配列番号ｎ（ｎ＝２、４、６、８、１０、１２または１４）に示されるアミノ酸配列と、同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列を含む蛋白質、あるいは該蛋白質の他の哺乳動物におけるオルソログあるいはその部分ペプチドを感作抗原として、通常使用されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体作製技術に従って取得することができる。ここで「実質的に同一のアミノ酸配列」とは前記「実質的に同一の塩基配列」によりコードされるアミノ酸配列を意味する。
個々の免疫学的測定法をTRAILシグナル活性化薬感受性マーカー蛋白質の検査に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてTRAILシグナル活性化薬感受性マーカー蛋白質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)、渡辺慶一ら編「酵素抗体法」（学際企画、平成４年発行）などを参照することができる。
被験者である哺乳動物から採取した試料におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカー蛋白質の活性は、各マーカー蛋白質の生理活性に応じて自体公知の手法を用いて測定することができる。
例えば、STK17Bの活性は、基質蛋白質もしくはペプチドのリン酸化を検出することにより行うことができる。STK17Bは自己リン酸化活性を有するので、STK17B自体のリン酸化を検出すれば他の基質を反応系に添加することは必須ではないが、所望により、例えば、STK17Bの生理的な基質蛋白質であるミオシン軽鎖キナーゼもしくはその標的リン酸化部位を含むフラグメント、あるいはセリン／スレオニンキナーゼのアッセイ用基質として公知の各種合成ペプチドなどを用いることもできる。リン酸化反応は、試料を適当な緩衝液［例：リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ約４〜約１０、望ましくはｐＨ約６〜約８）等］に溶解し、さらにリン酸基供与体（例えば、ＡＴＰ等）および必要に応じて基質蛋白質（ペプチド）を添加して、通常約２０〜約４０℃、好ましくは約３０〜約３７℃で３０分〜数時間程度インキュベートすることにより行われる。リン酸化の測定は、例えば、標識したリン酸基供与体（例えば、［γ-32Ｐ］ＡＴＰ等）を用いて反応を行わせ、STK17Bおよび／または他の基質蛋白質（ペプチド）における標識量を検出することにより行うことができる。あるいは、反応液を蛋白質（ペプチド）を吸着し得る素材（例：ＤＥ８１膜、セルロース膜、ＰＶＤＦ膜等）と接触させ、該素材に結合した標識量を測定することもできる。また、基質のリン酸化定は総電荷の変化や分子量の変化を指標として検出することもできる。さらに、リン酸化基質に特異的な抗体が入手できる場合には、抗原抗体反応を用いて基質蛋白質（ペプチド）のリン酸化を検出することもできる。
CASP8の活性は、caspase（カスペース）-8活性のアッセイ用基質として公知の合成ペプチドなどを用いることもできる。
上記のようにして測定される、試料中のTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現または活性の「変動」は、例えば、以下の手法により予め算出される基準値（カットオフ値）との比較により評価することができる。
まず、２以上の既知TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞および２以上の既知TRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞（学習用癌細胞）における各TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現量または活性を、上記と同様の方法により測定する。ここで使用される癌細胞に特に制限はないが、被験者と同一種の哺乳動物由来であることが好ましい。どの組織の癌であるかは特に制限されず、前記したいかなる癌由来の細胞も用いることができる。癌細胞のTRAILシグナル活性化薬に対する感受性／非感受性は、癌細胞を種々の濃度のTRAILシグナル活性化薬（例、TRAIL、抗TRAILR1アゴニスト抗体、抗TRAILR2アゴニスト抗体等）の存在下で培養し、一定以上の増殖阻害効果が得られる癌細胞を感受性であると定義することにより決定することができる。一定以上の増殖阻害効果としては、例えばIC50が100nM以下であること等が挙げられるが、それらに限定されず、当業者であれば他の適切な基準を任意に設定することが可能である。学習用癌細胞として、好ましくはそれぞれ５以上、より好ましくはそれぞれ１０以上のTRAILシグナル活性化薬感受性および非感受性癌細胞を試験することが望ましい。
「既知TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞」とは、TRAILシグナル活性化薬に感受性であることが分かっている癌細胞をいい、癌細胞自体が公知であるか、公知でないかは問わない。
「既知TRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞」とは、TRAILシグナル活性化薬に非感受性であることが分かっている癌細胞をいい、癌細胞自体が公知であるか、公知でないかは問わない。
使用しようとする癌細胞が、TRAILシグナル活性化薬に感受性であるか、非感受性であるか分かっていない場合は、例えば、後記実施例１の方法に準じて確認することができる。
次に、上記学習用癌細胞の中から任意に選択した癌細胞を基準癌細胞と定める。基準癌細胞はTRAILシグナル活性化薬感受性であっても非感受性であってもよい。また、どの組織の癌細胞であってもよい。該基準癌細胞における各TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現量または活性に対する他の癌細胞における相対発現量または相対活性を算出する。
本発明におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現量（活性）の基準値（カットオフ値）の設定方法の１つ（方法１）は、各癌細胞におけるマーカーの相対発現量または相対活性とTRAILシグナル活性化薬感受性との関係から、学習用癌細胞のTRAILシグナル活性化薬に対する感受性の有無を正しく判定することができる相対発現量または相対活性の値を、該マーカーの基準値とする方法である。ここで「正しく判定する」とは、学習用癌細胞全体のうちの60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上の癌細胞におけるTRAILシグナル活性化薬に対する感受性／非感受性を正しく判定できることを意味する。感受性または非感受性の両方を正しく判定できてもよいし、いずれか一方のみを正しく判定できてもよい。
基準癌細胞におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現量または活性に対する、被験者から採取した試料中のTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの相対発現量または相対活性が、上記のようにして決定される基準値に照らして感受性側の値をとれば、該被験者をTRAILシグナル活性化薬感受性患者として選択する。一方、相対発現量または相対活性が基準値に照らして非感受性側の値をとれば、該被験者をTRAILシグナル活性化薬非感受性患者とみなして、TRAILシグナル活性化薬の投与対象から除外することができる。基準値以上が感受性であるか非感受性であるかは、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーにより異なるが、被験者が乳癌または大腸癌患者の場合におけるAIM1については、基準値以上である場合にTRAILシグナル活性化薬非感受性と判定する。一方、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27およびRHOBTB3については、癌の種類にかかわらず、1つ以上、好ましくは２つ以上が基準値以上である場合にTRAILシグナル活性化薬感受性、1つ以上、好ましくは２つ以上が基準値未満である場合にTRAILシグナル活性化薬非感受性と判定することができる。
AIM1の基準値は、例えば、上記した他の癌細胞におけるAIM1の相対発現量（小数点下２ケタ）または相対活性（小数点下２ケタ）とTRAILシグナル活性化薬感受性の有無との関係を比較し、TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞群における最も大きい相対発現量A（表２および４の場合、大腸癌DLD1の1.93）または相対活性Aを選択し、ついでTRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞群において当該相対発現量Aまたは相対活性Aよりも大きく、かつ最も近い相対発現量B（表２および４の場合、乳癌Zr75-1の2.27）または相対活性Bを選択し、当該相対発現量Bまたは相対活性Bの小数点下２ケタ目を削除した値（表２および４の場合、2.2）である。
STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27またはRHOBTB3の基準値は、上記した他の癌細胞におけるSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27およびRHOBTB3の相対発現量（小数点下２ケタ）または相対活性（少数点下２ケタ）とTRAILシグナル活性化薬感受性の有無との関係を比較し、TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞群における相対発現量または相対活性の中央値の80%値〜120%値、好ましくは中央値である。より好ましい態様としては、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27またはRHOBTB3の基準値を各相対発現量（小数点下２ケタ）の中央値とし、各相対発現量のうち２以上の発現が基準値以上の場合は、TRAILシグナル活性化薬感受性と判定し、また各相対発現量のうち２以上の発現が基準値未満の場合は、TRAILシグナル活性化薬非感受性と判定する。
本発明におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現量（活性）の基準値（カットオフ値）の別の設定方法（方法２）として、各癌細胞におけるマーカーの相対発現量または相対活性とTRAILシグナル活性化薬感受性との関係から、癌細胞のTRAILシグナル活性化薬感受性を正しく判定することができる相対発現量または相対活性の値を、該マーカーの上方基準値とし、癌細胞のTRAILシグナル活性化薬非感受性を正しく判定することができる相対発現量または相対活性の値を、該マーカーの下方基準値とする方法が挙げられる。ここで「TRAILシグナル活性化薬感受性を正しく判定する」とは、測定値が上方基準値以上であった癌細胞全体に対する感受性癌細胞の割合が60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上であることを意味し、「TRAILシグナル活性化薬非感受性を正しく判定する」とは、測定値が下方基準値未満であった癌細胞全体に対する非感受性癌細胞の割合が60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上であることを意味する。
基準癌細胞におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現量または活性に対する、被験者から採取した試料中のTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの相対発現量または相対活性が、上記のようにして決定される上方基準値以上であれば、該被験者をTRAILシグナル活性化薬感受性患者として選択する。一方、相対発現量または相対活性が下方基準値未満であれば、該被験者をTRAILシグナル活性化薬非感受性患者とみなして、TRAILシグナル活性化薬の投与対象から除外することができる。また、下方基準値以上かつ上方基準値未満の場合は判定不能とすることができる。
上述のように、本発明の好ましい態様においては、上記７種のTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーから選ばれる２種以上、より好ましくは３種以上、さらに好ましくは４種以上のマーカーの測定値に基づいて、TRAILシグナル活性化薬感受性患者が選択される。この場合、各マーカー毎に、上記の方法１または２のいずれかを選択して基準値（カットオフ値）を設定することができる。また、最初から複数のマーカーについて同一の基準値を設けた場合に、学習用癌細胞におけるTRAILシグナル活性化薬感受性／非感受性を正しく判定することができる数値を、それらのマーカーについての統一基準値として設定しておくこともできる。
２種以上のマーカーを用いた場合にマーカー毎に判定が異なる場合があるが、例えば各マーカーについての判定を点数化し、総合点に応じてTRAILシグナル活性化薬感受性／非感受性を判定することができる。例えば、単一の基準値を設定したマーカーについては、測定値が基準値より感受性側であれば加点し、非感受性側であれば加点しないもしくは減点するという方式を採ることができる。一方、上方基準値と下方基準値を設定したマーカーについては、測定値が上方基準値以上であれば加点し、下方基準値以上かつ上方基準値未満であればポイント０とし、下方基準値未満であれば減点するという方式を採ることができる。
また、各マーカーに応じて点数に重みをつけることもできる。より感受性／非感受性の判定に寄与するマーカーの点数を他のマーカーの点数より高くすることができる。
本発明の好ましい一態様においては、AIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8をTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーとして、以下の判定基準に従ってTRAILシグナル活性化薬感受性患者が選択される。
(i) AIM1については上記の方法１に従って基準値（TRAILシグナル活性化薬非感受性を正しく判定できる基準値）を設定する。
(ii) STK17B、LOC93349およびCASP8については、上記の方法２に従って上方基準値および下方基準値を設定する。
（iii） 以下の（ａ）または（ｂ）に該当する被験者をTRAILシグナル活性化薬感受性患者として選別する。
（ａ）被験者が乳癌または大腸癌患者の場合には、被験者から採取した試料におけるAIM1の発現量または活性が該基準値未満である、および、被験者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の発現量または活性が該上方基準値以上である場合にプラス１ポイント、下方基準値以上かつ上方基準値未満である場合にゼロポイント、下方基準値未満である場合に、マイナス１ポイントとして、STK17B、LOC93349およびCASP8のポイントの総和が正である。
（ｂ）被験者が乳癌および大腸癌以外の癌患者の場合には、被験者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の発現量または活性が該上方基準値以上である場合にプラス１ポイント、下方基準値以上かつ上方基準値未満である場合にゼロポイント、下方基準値未満である場合にマイナス１ポイントとして、STK17B、LOC93349およびCASP8のポイントの総和が正である。
AIM1における基準値、STK17B、LOC93349およびCASP8における基準値は、学習用癌細胞において選ばれる基準癌細胞の種類や、学習用癌細胞における正診率をどの程度に設定するか等によって異なる。
例えば、本発明のより好ましい一態様においては、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーがAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8であり、
（１）２以上の既知TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞および２以上の既知TRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞におけるAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8の発現量または活性を測定し、
（２）(i) （１）で測定したTRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞およびTRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞の中から任意に選択された1つの細胞（基準癌細胞）におけるAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8の発現量または活性を1.0として、他の癌細胞におけるAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8の相対発現量または相対活性を算出し、
(ii) （１）で測定した他の細胞におけるAIM1の相対発現量（小数点下２ケタ）または相対活性（小数点下２ケタ）とTRAILシグナル活性化薬感受性の有無との関係を比較し、TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞群における最も大きい相対発現量A（表２および４の場合、大腸癌DLD1の1.93）または相対活性Aを選択し、ついでTRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞群において当該相対発現量Aまたは相対活性Aよりも大きく、かつ最も近い相対発現量B（表２および４の場合、乳癌Zr75-1の2.27）または相対活性Bを選択し、当該相対発現量Bまたは相対活性Bの小数点下２ケタ目を削除した値（表２および４の場合、2.2）を基準値とし、
(iii) （１）で測定した他の細胞におけるSTK17B, LOC93349, およびCASP8の相対発現量（小数点下２ケタ）または相対活性（少数点下２ケタ）とTRAILシグナル活性化薬感受性の有無との関係を比較し、TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞群における相対発現量または相対活性の中央値の80%値を上方基準値とし、TRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞群における相対発現量または相対活性の中央値の120%値を下方基準値としたとき、
以下の（ａ）または（ｂ）に該当する被験者をTRAILシグナル活性化薬感受性患者として選別することを特徴とする。
（ａ）被験者が乳癌または大腸癌患者の場合には、被験者から採取した試料におけるAIM1の発現量または活性が該基準値未満である、および、被験者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の発現量または活性が該上方基準値以上である場合にプラス１ポイント、下方基準値以上かつ上方基準値未満である場合にゼロポイント、下方基準値未満である場合に、マイナス１ポイントとして、STK17B、LOC93349およびCASP8のポイントの総和が正である
（ｂ）被験者が乳癌および大腸癌以外の癌患者の場合には、被験者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の発現量または活性が該上方基準値以上である場合にプラス１ポイント、下方基準値以上かつ上方基準値未満である場合にゼロポイント、下方基準値未満である場合にマイナス１ポイントとして、STK17B、LOC93349およびCASP8のポイントの総和が正である。
具体的には、後記実施例４（２）に示されるとおり、AIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8の発現量がそれらをコードするmRNAの発現量であり、相対発現量がCOLO205細胞株における発現量に対する相対値であり、AIM1における基準値が2.2であり、STK17Bにおける上方基準値が1.036、下方基準値が0.514であり、LOC93349における上方基準値が0.666、下方基準値が0.211であり、CASP8における上方基準値が0.833、下方基準値が0.519である。
また、例えば、後記実施例４(１）に示されるとおり、基準細胞をヒト結腸腺癌細胞株であるCOLO205細胞株（Cancer Res., 38: 1345 (1978)；大日本住友製薬より市販されている）として選択し、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現をmRNA発現量を指標として評価する場合、AIM1における基準値を2.2に設定し、STK17B、LOC93349およびCASP8における上方基準値を0.7、下方基準値が0.5に設定することにより、きわめて高確度にTRAILシグナル活性化薬感受性患者を選択することもできる。
上述のように、本発明の癌の予防または治療剤に含有されるTRAILシグナル活性化薬は、好ましくは、TRAIL、あるいはTRAILR1もしくはTRAILR2のアゴニスト化合物等である。
本発明に用いられるTRAILは、配列番号１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。TRAILは、ヒトもしくは他の温血動物 (例えば、サル, ウシ, ウマ, ブタ, ヒツジ, ヤギ, ウサギ, マウス, ラット, モルモット, ハムスター, ニワトリなど) の細胞 [例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞 (例: マクロファージ, T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など] またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官 [例えば、脳、脳の各部位 (例: 嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管 (例: 大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織 (例: 褐色脂肪組織、白色脂肪組織)、骨格筋など]などに由来する天然のTRAIL蛋白質であってもよく、また、後述のように、化学的に、もしくは無細胞蛋白質合成系を用いて生化学的に合成された蛋白質であってもよい。あるいは、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
配列番号１６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号１６で表されるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて2つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント (好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである) における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合 (%) を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸 (Phe, Trp, Tyr)、脂肪族アミノ酸 (Ala, Leu, Ile, Val)、極性アミノ酸 (Gln, Asn)、塩基性アミノ酸(Lys, Arg, His)、酸性アミノ酸 (Glu, Asp)、水酸基を含むアミノ酸 (Ser, Thr)、側鎖の小さいアミノ酸 (Gly, Ala, Ser, Thr, Met) などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない (即ち、保存的アミノ酸置換である) ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている(例えば、Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990) を参照)。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記した塩基配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
配列番号１６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質とは、上記した「配列番号１６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」を含み、且つ配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有するような蛋白質をいう。実質的に同質の活性としては、例えば、TRAILR1およびTRAILR2への結合活性、TRAILシグナルの伝達活性 [例えば、カスペース-8活性化活性、実行型カスペース（カスペース-3、-6、-7、-9等）活性化活性、アポトーシス誘導活性等] などが挙げられる。「実質的に同質」とは、それらの性質が定性的に (例: 生理学的に、または薬理学的に) 同一であることを意味する。したがって、上記の活性の程度といった量的要素については、同等であることが好ましいが、異なっていてもよい (例えば、約0.01〜約100倍、好ましくは約0.1〜約10倍、より好ましくは約0.5〜約2倍)。TRAILの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行うことができる。
また、本発明で用いられるTRAILとしては、例えば、(1) 配列番号１６で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上 [好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2)配列番号１６で表されるアミノ酸配列に1または2個以上 [好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(3) 配列番号１６で表されるアミノ酸配列に1または2個以上 [好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4) 配列番号１６で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上 [好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(5) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含む蛋白質であって、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質も含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、当該蛋白質の活性を損なわない限り、特に限定されない。
本明細書においてアミノ酸配列により特定される蛋白質は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がN末端 (アミノ末端)、右端がC末端 (カルボキシル末端) である。配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をはじめとする、本発明で用いられるTRAILは、C末端がカルボキシル基(-COOH)、カルボキシレート (-COO-)、アミド (-CONH2) またはエステル (-COOR) の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル, エチル, n-プロピル, イソプロピル, n-ブチルなどのC1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル, シクロヘキシルなどのC3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル, α-ナフチルなどのC6-12アリール基、例えば、ベンジル, フェネチルなどのフェニル-C1-2アルキル基もしくはα-ナフチルメチルなどのα-ナフチル-C1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられる蛋白質がC末端以外にカルボキシル基 (またはカルボキシレート) を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられる蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられる蛋白質には、N末端のアミノ酸残基 (例: メチオニン残基)のアミノ基が保護基 (例えば、ホルミル基, アセチル基などのC1-6アルカノイルなどのC1-6アシル基など) で保護されているもの、生体内で切断されて生成するN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 (例えば、-OH, -SH, アミノ基, イミダゾール基, インドール基, グアニジノ基など) が適当な保護基(例えば、ホルミル基, アセチル基などのC1-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など) で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明で用いられる蛋白質の具体例としては、例えば、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるヒトTRAILあるいは他の哺乳動物におけるそのオルソログ等が挙げられる。他の哺乳動物のオルソログのアミノ酸配列は、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子のオルソログについて前記したと同様の方法により入手することができる。
本発明で用いられるTRAILの部分ペプチドは、配列番号１６で表されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記した本発明で用いられるTRAILと実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものでもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同義である。また、「実質的に同質の活性」の測定は、上記と同様にして行うことができる。
具体的には、該部分ペプチドとしては、本発明で用いられるTRAILの構成アミノ酸配列のうち少なくとも50個以上、好ましくは70個以上、より好ましくは100個以上のアミノ酸配列からなるペプチドなどが用いられる。また、本発明で用いられるTRAILの部分ペプチドは、(1) そのアミノ酸配列中の1または2個以上 [好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が欠失し、または、(2) そのアミノ酸配列に1または2個以上 [好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が付加し、または、(3) そのアミノ酸配列に1または2個以上 [好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が挿入され、または、(4) そのアミノ酸配列中の1または2個以上 [好ましくは1〜10個程度、より好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよく、あるいは(5) それらが組み合わされていてもよい。
本発明で用いられるTRAILの部分ペプチドは、C末端がカルボキシル基 (-COOH)、カルボキシレート (-COO-)、アミド (-CONH2) またはエステル (-COOR) の何れであってもよい。ここでエステルにおけるRとしては、TRAILについて上記したと同様のものが挙げられる。また、該部分ペプチドがC末端以外にカルボキシル基 (またはカルボキシレート) を有している場合、該カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるTRAILの部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、C末端のエステルと同様のものが例示される。さらに、該部分ペプチドには、TRAILの場合と同様に、N末端のアミノ酸残基 (例: メチオニン残基) のアミノ基が保護基で保護されているもの、N末端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられるTRAILまたはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸 (例: 無機酸, 有機酸) や塩基 (例: アルカリ金属) などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸, リン酸, 臭化水素酸, 硫酸) との塩、あるいは有機酸 (例えば、酢酸, ギ酸, プロピオン酸, フマル酸, マレイン酸, コハク酸, 酒石酸, クエン酸, リンゴ酸, 蓚酸, 安息香酸, メタンスルホン酸, ベンゼンスルホン酸) との塩などが用いられる。
本発明で用いられるTRAILまたはその塩は、前述したヒトや他の温血動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法によって調製することができる。具体的には、該動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるTRAILもしくはその部分ペプチドまたはその塩 (以下、「TRAILs」と包括的に略記する場合がある) は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法, 液相合成法のいずれであってもよい。本発明の蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を含む場合は保護基を脱離することにより、目的とする蛋白質を製造することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の (1) および (2) に記載された方法に従って行われる。
(1) M. Bodanszky and M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(2) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, NewYork (1965)
本発明のTRAILsの合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂, ヒドロキシメチル樹脂, ベンズヒドリルアミン樹脂, アミノメチル樹脂, 4-ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂, 4-メチルベンズヒドリルアミン樹脂, PAM樹脂, 4-ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂, ポリアクリルアミド樹脂, 4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-ヒドロキシメチル)フェノキシ樹脂, 4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-Fmocアミノエチル)フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α-アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質等の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC,N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド, N-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロリル)カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 (例えば、HOBt, HOOBt) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、あるいは、対称酸無水物またはHOBtエステルもしくはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行った後に、樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、N,N-ジメチルホルムアミド, N,N-ジメチルアセトアミド, N-メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン, クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン, ジオキサン, テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル, プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル, 酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常、約-20℃〜50℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は、通常、1.5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には、保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより、十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、並びにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは、公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Z, Boc, t-ペンチルオキシカルボニル, イソボルニルオキシカルボニル, 4-メトキシベンジルオキシカルボニル, Cl-Z, Br-Z, アダマンチルオキシカルボニル, トリフルオロアセチル, フタロイル, ホルミル, 2-ニトロフェニルスルフェニル, ジフェニルホスフィノチオイル, Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化(例えば、メチル, エチル, プロピル,ブチル, t-ブチル, シクロペンチル, シクロヘキシル, シクロヘプチル, シクロオクチル, 2-アダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状アルキルエステル化)、アラルキルエステル化 (例えば、ベンジルエステル, 4-ニトロベンジルエステル, 4-メトキシベンジルエステル, 4-クロロベンジルエステル, ベンズヒドリルエステル化)、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、t-ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級 (C1-6) アルカノイル基, ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基, エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基, テトラヒドロピラニル基, t-ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl, Cl2-Bzl, 2-ニトロベンジル, Br-Z, t-ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos, 4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル, DNP, ベンジルオキシメチル, Bum, Boc, Trt, Fmocなどが用いられる。
保護基の除去 (脱離) 方法としては、例えば、Pd-黒あるいはPd-炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素, メタンスルホン酸, トリフルオロメタンスルホン酸, トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン, トリエチルアミン, ピペリジン, ピペラジンなどによる塩基処理、また、液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約-20℃〜40℃の温度で行われるが、酸処理においては、例えば、アニソール, フェノール, チオアニソール, メタクレゾール, パラクレゾール, ジメチルスルフィド, 1,4-ブタンジチオール, 1,2-エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール, 1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液, 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物, アジド, 活性エステル [アルコール (例えば、ペンタクロロフェノール, 2,4,5-トリクロロフェノール, 2,4-ジニトロフェノール, シアノメチルアルコール, パラニトロフェノール, HONB, N-ヒドロキシスクシミド, N-ヒドロキシフタルイミド, HOBt) とのエステル] などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
蛋白質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα-カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド (蛋白質) 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のN末端のα-アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質または部分ペプチドとC末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質または部分ペプチドとを製造し、これらの蛋白質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質またはペプチドを得ることができる。この粗蛋白質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
蛋白質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシル末端アミノ酸のα-カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合してアミノ酸エステルとした後、蛋白質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望の蛋白質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられるTRAILの部分ペプチドまたはその塩は、上述もしくは後述のいずれかの方法により得られるTRAILまたはその塩を、適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
このようにして得られた本発明のTRAILsは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られる蛋白質または部分ペプチドが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に蛋白質が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のTRAILsは、TRAILまたはその部分ペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養してTRAILsを生成せしめ、得られる培養物からTRAILsを分離・精製することによって製造することもできる。
TRAILまたはその部分ペプチドをコードする核酸としては、前述した本発明で用いられるTRAILのアミノ酸配列もしくはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであればいかなるものでもよい。該核酸は、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。
TRAILまたはその部分ペプチドをコードするDNAは、ゲノムDNA、ヒトもしくは他の温血動物 (例えば、サル, ウシ, ウマ, ブタ, ヒツジ, ヤギ, ウサギ, マウス, ラット, モルモット, ハムスター, ニワトリなど) の細胞 [例えば、肝細胞, 脾細胞, 神経細胞, グリア細胞, 膵β細胞, 骨髄細胞, メサンギウム細胞, ランゲルハンス細胞, 表皮細胞, 上皮細胞, 杯細胞, 内皮細胞, 平滑筋細胞, 線維芽細胞, 線維細胞, 筋細胞, 脂肪細胞, 免疫細胞 (例: マクロファージ, T細胞, B細胞, ナチュラルキラー細胞, 肥満細胞, 好中球, 好塩基球, 好酸球, 単球) , 巨核球, 滑膜細胞, 軟骨細胞, 骨細胞, 骨芽細胞, 破骨細胞, 乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など] またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官 [例えば、脳, 脳の各部位 (例: 嗅球, 扁桃核, 大脳基底球, 海馬, 視床, 視床下部, 大脳皮質, 延髄, 小脳), 脊髄,下垂体, 胃, 膵臓, 腎臓, 肝臓, 生殖腺, 甲状腺, 胆嚢, 骨髄, 副腎, 皮膚, 筋肉, 肺,消化管 (例: 大腸, 小腸), 血管, 心臓, 胸腺, 脾臓, 顎下腺, 末梢血, 前立腺, 睾丸, 卵巣, 胎盤, 子宮, 骨, 関節, 脂肪組織 (例: 褐色脂肪組織, 白色脂肪組織), 骨格筋など]などに由来するcDNA、あるいは合成DNAなどが挙げられる。TRAILまたはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNA画分および全RNAもしくはmRNA画分をそれぞれ鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction(以下、「PCR法」と略称する) およびReverse Transcriptase-PCR (以下、「RT-PCR法」と略称する) によって直接増幅することもできる。あるいは、TRAILまたはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNAおよび全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ, プラスミド, コスミド, ファージミドなどいずれであってもよい。
TRAILをコードするDNAとしては、例えば、配列番号１５で表される塩基配列を含むDNA、あるいは配列番号１５で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、前記した配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするDNAなどが挙げられる。
配列番号１５で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号１５で表される塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含むDNAなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、以下の条件 (期待値=10; ギャップを許す; フィルタリング=ON; マッチスコア=1; ミスマッチスコア=-3) にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning, 第2版 (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行うことができる。
ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約19〜約40 mM、好ましくは約19〜約20 mMで、温度が約50〜約70℃、好ましくは約60〜約65℃の条件 (特に、ナトリウム塩濃度が約19 mMで温度が約65℃の場合が好ましい) などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
TRAILをコードするDNAは、好ましくは配列番号１５で表される塩基配列を含むヒトTRAIL cDNAもしくはそのアレル変異体または他の温血動物 (例えば、マウス, ラット, モルモット, ハムスター, ウサギ, ヒツジ, ヤギ, ブタ, ウシ, ウマ, トリ, ネコ, イヌ, サル, チンパンジーなど) におけるそのオルソログ等である。
TRAILの部分ペプチドをコードするDNAは、配列番号１６で表されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムDNA、上記した細胞・組織由来のcDNA、合成DNAのいずれでもよい。
具体的には、該部分ペプチドをコードするDNAとしては、例えば、(1) 配列番号１５で表される塩基配列を含むDNAの部分塩基配列、または(2) 配列番号１５で表される塩基配列を含むDNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、且つ該DNAにコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするDNAなどが用いられる。
配列番号１５で表される塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、該塩基配列中の対応する部分と約60%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含むDNAなどが用いられる。
TRAILまたはその部分ペプチドをコードするDNAは、該蛋白質またはペプチドをコードする塩基配列の一部分を含む合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだDNAを、TRAILの一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを標識したものとハイブリダイゼーションさせることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning, 第2版 (前述) に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km (宝酒造 (株)), MutanTM-K (宝酒造 (株)) 等を用いて、ODA-LAPCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
クローン化されたDNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA, TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。
上記のTRAILまたはその部分ペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該蛋白質またはペプチドを製造することができる。
TRAILまたはその部分ペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、TRAILをコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例: pBR322, pBR325, pUC12, pUC13)、枯草菌由来のプラスミド(例: pUB110, pTP5, pC194)、酵母由来プラスミド (例: pSH19, pSH15)、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス, ワクシニアウイルス, バキュロウイルスなどの動物ウイルス、pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neoなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター, SV40プロモーター, LTRプロモーター, CMV (サイトメガロウイルス) プロモーター, HSV-tkプロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVＶプロモーター, SRαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、trpプロモーター, lacプロモーター, recAプロモーター, λPLプロモーター, lppプロモーター, T7プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター, SPO2プロモーター, penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、PHO5プロモーター, PGKプロモーター, PGKプロモーター, ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター, P10プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジン (以下、SV40oriと略称する場合がある) などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素 (以下、dhfrと略称する場合がある) 遺伝子 [メソトレキセート (MTX) 耐性]、アンピシリン耐性遺伝子 (以下、Amprと略称する場合がある)、ネオマイシン耐性遺伝子 (以下、Neorと略称する場合がある、G418耐性) 等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列(シグナルコドン) を、TRAILまたはその部分ペプチドをコードするDNAの5’末端側に付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合、PhoA・シグナル配列, OmpA・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合、α-アミラーゼ・シグナル配列, サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合、MFα・シグナル配列, SUC2・シグナル配列などが、宿主が動物細胞である場合、インシュリン・シグナル配列, α-インターフェロン・シグナル配列, 抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌, バチルス属菌, 酵母, 昆虫細胞, 昆虫, 動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、Escherichia coli K12・DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60: 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981), JA221 [J. Mol. Biol., 120: 517 (1978)], HB101 [J. Mol. Biol., 41: 459 (1969)], C600 [Genetics, 39: 440 (1954)] などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24: 255 (1983)], 207-21 [J. Biochem., 95: 87 (1984)] などが用いられる。
酵母としては、例えば、Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12; Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036; Pichia pastoris KM71などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell; Sf細胞), Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞, Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞, Mamestra brassicae由来の細胞, Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞 (Bombyx mori N 細胞; BmN細胞) などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞 (ATCC CRL1711), Sf21細胞 (以上、Vaughn, J.L. et al., In Vivo, 13: 213-217 (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる [Maeda et al., Nature, 315: 592 (1985)]。
動物細胞としては、例えば、サル由来のCOS-7, Vero細胞、チャイニーズハムスター由来のCHO, dhfr遺伝子欠損CHO (CHO (dhfr-)) 細胞、マウス由来のL,AtT-20, ミエローマ細胞、ラット由来のGH3細胞、ヒト由来のFL, HEK293, HepG2, HeLa細胞などが用いられる。
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972) や Gene, 17: 107 (1982) などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、Mol. Gen. Genet., 168: 111 (1979) などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、Meth. Enzymol., 194: 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978) などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、Biotechnology (N.Y.), 6: 47-55 (1988) などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊8 新細胞工学実験プロトコール, 263-267 (1995)(秀潤社発行), Virology, 52: 456 (1973) に記載の方法に従って形質転換することができる。
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース, デキストリン, 可溶性澱粉, ショ糖などが、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類, 硝酸塩類, コーンスチープ・リカー, ペプトン, カゼイン, 肉エキス, 大豆粕, バレイショ抽出液などの無機または有機物質が、無機物としては、例えば、塩化カルシウム, リン酸二水素ナトリウム, 塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス, ビタミン類, 生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約5〜8である。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース, カザミノ酸を含むM9培地[Miller, J. Exp. Mol. Genet., 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約15〜43℃で、約3〜24時間行われる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約30〜40℃で、約6〜24時間行われる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、Burkholder最小培地 [Bostian, K.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4505 (1980)] や0.5% カザミノ酸を含有するSD培地 [Bitter, G.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5330 (1984)] などが挙げられる。培地のpHは、好ましくは約5〜8である。培養は、通常約20℃〜35℃で、約24〜72時間行われる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Medium [Grace, T.C.C., Nature, 195: 788 (1962)] に非働化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6.2〜6.4である。培養は、通常約27℃で、約3〜5日間行われる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含むMEM培地 [Science, 122: 501 (1952)], DMEM培地[Virology, 8: 396 (1959)], RPMI1640培地 [J. Am. Med. Assoc., 199: 519 (1967)], 199培地 [Proc. Soc. Biol. Med., 73: 1 (1950)] などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜8である。培養は、通常約30℃〜40℃で、約15〜60時間行われる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にTRAILsを生成させることができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、TRAILsを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、TRAILsを培養菌体あるいは細胞から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンX-100TMなどの界面活性剤を含んでいてもよい。
このようにして得られた可溶性画分中に含まれるTRAILsの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法, 限外ろ過法, ゲルろ過法, およびＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
かくして得られるTRAILまたはその部分ペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生するTRAILsを、精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン, キモトリプシン, アルギニルエンドペプチダーゼ, プロテインキナーゼ, グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られるTRAILsの存在は、特異的な抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
さらに、TRAILまたはその部分ペプチドは、それをコードするDNAに対応するRNAを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート, コムギ胚芽ライセート, 大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。あるいは、さらにRNAポリメラーゼを含む無細胞転写/翻訳系を用いて、TRAILまたはその部分ペプチドをコードするDNAを鋳型としても合成することができる。無細胞蛋白質 (転写/) 翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液はPratt J.M. et al., “Transcription and Tranlation”, Hames B.D. and Higgins S.J. eds., IRL Press, Oxford179-209 (1984) に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはE.coli S30 extract system (Promega社製) やRTS 500 Rapid Tranlation System (Roche社製) 等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate System (Promega社製) 等、さらにコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSTM (TOYOBO社製) 等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばJohnston F.B. et al., Nature, 179: 160-161 (1957) あるいはErickson A.H. et al., Meth. Enzymol., 96: 38-50 (1996) 等に記載の方法を用いることができる。
蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法[Pratt, J.M. et al. (1984) 前述] や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム [Spirin A.S. et al., Science, 242: 1162-1164 (1988)]、透析法 (Kigawa et al., 第21回日本分子生物学会, WID6)、あるいは重層法 (PROTEIOSTM Wheat germ cell-free protein synthesis core kit取扱説明書: TOYOBO社製) 等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のRNA、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法 (特開2000-333673) 等を用いることができる。
TRAILR1もしくはTRAILR2のアゴニスト化合物としては、例えば、TRAIL (AMG951 (Genentech/Amgen))、TRAILR1に対するアゴニスト（シグナリング）抗体（例、配列番号：２４であらわされるアミノ酸配列を有する抗体）、TRAILR2に対するアゴニスト（シグナリング）抗体 (CS-1008（Daiichi Sankyo Inc.）、AMG655（Amgen）)が挙げられる（Uta Schaeferら、Frontiers in Bioscience 12, 3813-3824, May 1, 2007参照）。また、TRAILおよびTRAILR1もしくはTRAILR2を用いたスクリーニングにより選択される、該受容体に対するアゴニスト等が挙げられる。
TRAILR1もしくはTRAILR2に対するアゴニスト（シグナリング）抗体は、通常の抗体作製技術を用いて製造された該受容体に対する抗体の中から、TRAILシグナル伝達の活性化（例えば、カスペースの活性化、アポトーシス誘導等）を指標に選択され得る。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。抗体の断片化により、完全抗体の場合よりもアゴニスト（シグナル伝達）活性を顕著に増大させ得る場合がある。
好ましい一実施態様において、TRAILR1もしくはTRAILR2に対するアゴニスト抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、該抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、ヒト抗体産生マウスやファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
TRAILおよびTRAILR1もしくはTRAILR2（以下、包括してTRAILRという場合がある）を用いたスクリーニングは、例えば、以下のようにして行うことができる。
(1) 標識したTRAILをTRAILRに接触させた場合と、標識したTRAILおよび試験化合物をTRAILRに接触させた場合における、標識したTRAILのTRAILRに対する結合量を測定・比較することにより、TRAILと競合的にTRAILRと結合する化合物またはその塩をスクリーニングする。
(2) 標識したTRAILを、TRAILRを産生する細胞またはその膜画分に接触させた場合と、標識したTRAILおよび試験化合物をTRAILRを産生する細胞またはその膜画分に接触させた場合における、標識したTRAILの該細胞または膜画分に対する結合量を測定・比較することにより、TRAILと競合的にTRAILRと結合する化合物またはその塩をスクリーニングする。
(3) 標識したTRAILを、TRAILRをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したTRAILRに接触させた場合と、標識したTRAILおよび試験化合物を、TRAILRをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したTRAILRに接触させた場合における、標識したTRAILのTRAILRに対する結合量を測定・比較することにより、TRAILと競合的にTRAILRと結合する化合物またはその塩をスクリーニングする。
(4) TRAILを、TRAILRを細胞膜上に発現する細胞に接触させた場合と、試験化合物を、TRAILRを細胞膜上に発現する細胞に接触させた場合における、TRAILRを介した細胞刺激活性 (例えば、カスペース活性化、アポトーシス誘導など) を測定・比較することにより、TRAILRとの結合によってTRAILシグナルを活性化させる化合物またはその塩をスクリーニングする。
(5) TRAILを、TRAILRをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したTRAILRに接触させた場合と、試験化合物を、TRAILRをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したTRAILRに接触させた場合における、TRAILRを介した細胞刺激活性 (例えば、カスペース活性化、アポトーシス誘導など) を測定・比較することにより、TRAILRとの結合によってTRAILシグナルを活性化させる化合物またはその塩をスクリーニングする。
尚、上記(1 or 4)〜(5)の方法において、TRAILの代わりに上記のTRAILRアゴニスト化合物を用いることもできる。
あるいは、(1)〜(3)の方法を、TRAILを用いずに直接試験化合物のTRAILRとの結合を検出することにより、TRAILと非競合的にTRAILRに結合してシグナリングを活性化する化合物をも取得することができる。当該方法は以下のように行い得る。
(1a) 試験化合物をTRAILRに接触させた場合における、試験化合物のTRAILRに対する結合量を測定することにより、TRAILRと結合する化合物またはその塩をスクリーニングする。(2a) 試験化合物を、TRAILRを産生する細胞またはその膜画分に接触させた場合における、試験化合物の該細胞または膜画分に対する結合量を測定することにより、TRAILRと結合する化合物またはその塩をスクリーニングする。
(3a) 試験化合物を、TRAILRをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したTRAILRに接触させた場合における、試験化合物のTRAILRに対する結合量を測定することにより、TRAILRと結合する化合物またはその塩をスクリーニングする。
ここで試験化合物のTRAILRに対する結合量は、個々の試験化合物を標識してTRAILRに結合した標識量を測定することにより調べることもできるし、あるいは表面プラズモン共鳴などの手法を用いて非標識で測定することもできる。
以下に本発明のスクリーニング方法を具体的に説明する。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるTRAILR1としては、配列番号１８と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分ペプチドが、TRAILR2としては、配列番号２０もしくは２２と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分ペプチドが挙げられる。これらの蛋白質およびその発現細胞は、TRAILについて前記したと同様の方法を用いて取得することができる。好ましくは、TRAILRを産生する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が用いられるが、ヒト由来の臓器は入手が困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のTRAILRなどが適している。
TRAILRを製造するには、TRAILRをコードするDNA（例えば、配列番号１７、１９もしくは２１）を哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現させることにより行なうことが好ましい。目的とする蛋白質部分をコードするDNA断片にはcDNAが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成DNAを用いてもよい。TRAILRをコードするDNA断片を宿主動物 (昆虫) 細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該DNA断片を、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、SRαプロモーター、昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス(nuclear polyhedrosis virus; NPV) のポリヘドリンプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。
したがって、本発明のスクリーニング方法において用いられるTRAILRは、それ自体公知の方法に従って精製したTRAILRであってもよいし、TRAILRを産生する細胞またはその細胞膜画分として用いてもよい。
上記スクリーニング方法において、TRAILRを産生する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
TRAILRを産生する細胞とは、TRAILRを発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
前記細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（500rpm〜3000rpm）で短時間（通常、約1〜10分）遠心し、上清をさらに高速（15000rpm〜30000rpm）で通常30分〜2時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したTRAILRと細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
TRAILRを産生する細胞やその膜画分中のTRAILRの量は、１細胞あたり103〜108分子であるのが好ましく、105〜107分子であるのがより好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのTRAIL結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
TRAILと競合的にTRAILRと結合する化合物をスクリーニングする上記の(1)〜(3)を実施するためには、例えば、適当なTRAILR含有膜画分と標識したTRAILが必要である。
TRAILR含有膜画分としては、天然型のTRAILR含有膜画分か、またはそれと同等の活性を有する組換えTRAILR含有膜画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のTRAIL結合活性、シグナル伝達作用などをいう。
標識したTRAILとしては、常法に従って、例えば [3H]、[32P]、[125I]、[14C] などで標識されたものが用いられる。
具体的には、TRAILと競合的にTRAILRと結合する化合物のスクリーニングを行なうには、まずTRAILRを産生する細胞またはその膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりTRAILR標品を調製する。バッファーは、pH4〜10（望ましくはpH6〜8）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのTRAILRとTRAILとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、CHAPS、Tween-80TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるTRAILRの分解を抑える目的でPMSF、ロイペプチン、E-64（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。0.01〜10mlのTRAILR懸濁液に、一定量（5,000cpm〜500,000cpm）の標識したTRAILを添加し、同時に10-4M〜10-10Mの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（NSB）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は約0〜約50℃、望ましくは約4〜約37℃で、約3〜約30時間、望ましくは約20〜約24時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ-カウンターで計測する。拮抗する物質（試験化合物）がない場合のカウント (B0) から非特異的結合量（NSB）を引いたカウント（B0-NSB）を100％とした時、特異的結合量（B-NSB）が、例えば、50％以下になる試験化合物をTRAIと競合的にTRAILRに結合する能力のある化合物、即ちTRAILRアゴニスト化合物の候補物質として選択することができる。
TRAILRとの結合によってTRAILシグナルを活性化させる化合物をスクリーニングする上記の(4)〜(5)の方法を実施するためには、例えば、TRAILRを介する細胞刺激活性 (例えば、カスペース活性化、アポトーシス誘導など) を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、TRAILRを産生する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては、前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。
アポトーシス誘導活性を測定してスクリーニングを行なうには、TRAILRを膜上に発現した適当な細胞が必要である。TRAILRを発現した細胞としては、天然型のTRAILRを産生する細胞株、前述の組換えTRAILRを発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
TRAILと競合的にTRAILRと結合する化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、TRAILR、TRAILRを産生する細胞またはその膜画分などを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
（Ｉ）スクリーニング用試薬
(1) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、0.05％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径0.45μmのフィルターで濾過滅菌し、4℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
(2) TRAILR標品
TRAILRを発現させたCHO細胞を、12穴プレートに5×105個／穴で継代し、37℃、5％CO2、95％airで2日間培養したもの。
(3) 標識TRAIL
市販の [3H]、[32P]、[125I]、[14C] などで標識したTRAIL (アナログを含む)
水溶液の状態のものを4℃あるいは-20℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて1μMに希釈する。
(4) TRAIL標準液
TRAIL (アナログを含む) を0.1％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むPBSで1mMとなるように溶解し、-20℃で保存する。
（II）測定法
(1) 12穴組織培養用プレートにて培養したTRAILR発現CHO細胞を、測定用緩衝液1mlで2回洗浄した後、490μlの測定用緩衝液を各穴に加える。
(2) 10-3〜10-10Mの試験化合物溶液を5μl加えた後、標識TRAILを5μl加え、室温にて1時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに10-3MのTRAIL標準液を5μl加えておく。
(3) 反応液を除去し、1mlの洗浄用緩衝液で3回洗浄する。細胞（またはプレート）に結合した標識TRAILを0.2N NaOH-1％SDSで溶解し、4mlの液体シンチレーターA（和光純薬製）と混合する。
(4) 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（PMB）を次の式で求める。
PMB=[(B-NSB)/(B0-NSB)]×100
PMB：Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB：Non-specific Binding（非特異的結合量）
B0 ：最大結合量
細胞刺激活性としてアポトーシス誘導を指標とする場合には、例えば、光学顕微鏡、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡などを用いた形態学的観察により膜のブレッビング（blebbing）、細胞サイズの縮小化、クロマチン凝縮、ＤＮＡ断片化等を検出することにより調べることができる。例えば、マルチウェルプレート中で細胞を培養し、プレートから剥離した細胞あるいは膜のブレッビングを生じた細胞を顕微鏡下で計数し、視野中の全細胞に占める死細胞の割合（％）を計算する。数視野で観察を行ってそれらの平均値を細胞死誘導率とする。また、トリパンブルー、エリスロシンＢ、ネグロシン、エオシンＹ、フルオレッセンジアセテート、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイド等の色素を用いて死細胞を染色、顕微鏡下で計数することによっても細胞死誘導率を導出することができる。さらに、ＤＡＰＩやヘキスト３３３４２等の蛍光色素を用いてＤＮＡを染色し、蛍光顕微鏡下でクロマチン凝縮の起こっている細胞を計数することもできる。あるいは、断片化されたＤＮＡの３’末端にターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いてビオチンや蛍光色素などで標識したｄＵＴＰを付加させ（ＴＵＮＥＬ法）、強く染色された細胞数を光学顕微鏡、蛍光顕微鏡などを用いて計数することにより、アポトーシス誘導率を算出することもできる。
また、粒子サイズ測定装置（例：Coulter multisizer等）を用いて細胞サイズ分布を測定することにより縮小化・断片化した細胞数を計数し、アポトーシス誘導率を計算することができる。あるいは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて細胞サイズの縮小・アポトーシス小体への断片化を検出することにより、生死細胞を分離、細胞死誘導率を算出することもできる。
さらには、常法を用いて細胞から染色体ＤＮＡを抽出し、ゲル電気泳動してＤＮＡの断片化の度合をデンシトメーターなどを用いて測定することにより、生化学的にアポトーシスを検出することもできる。あるいは、3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide（ＭＴＴ）が生細胞によりホルマザンに還元されることを利用して、マイクロプレートリーダーを用いて５７０−６３０ｎｍにおける吸光度の減少を測定することにより細胞死誘導率を算出することもできる。
上記のスクリーニングの結果、試験化合物の存在下において細胞刺激活性(例えば、カスペース活性、アポトーシス誘導活性など) が増大した場合に、該化合物をTRAIL−TRAILR相互作用を介して細胞刺激活性を有する化合物、即ちTRAILRに対するアゴニスト化合物として選択することができる。
TRAILシグナル活性化薬は、前記のようにして選択されるTRAILシグナル活性化薬感受性患者における癌、例えば、乳癌（例、浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、炎症性乳癌など）、前立腺癌（例、ホルモン依存性前立腺癌、ホルモン非依存性前立腺癌など）、膵癌（例、膵管癌など）、胃癌（例、乳頭腺癌、粘液性腺癌、腺扁平上皮癌など）、肺癌（例、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫など）、結腸癌（例、消化管間質腫瘍など）、直腸癌（例、消化管間質腫瘍など）、大腸癌（例、家族性大腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、消化管間質腫瘍など）、小腸癌（例、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍など）、食道癌、十二指腸癌、舌癌、咽頭癌（例、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌など）、唾液腺癌、脳腫瘍（例、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫など）、神経鞘腫、肝臓癌（例、原発性肝癌、肝外胆管癌など）、腎臓癌（例、腎細胞癌、腎盂と尿管の移行上皮癌など）、胆管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌（例、上皮性卵巣癌、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍など）、膀胱癌、尿道癌、皮膚癌（例、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌など）、血管腫、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、甲状腺癌（例、甲状腺髄様癌など）、副甲状腺癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、骨腫瘍（例、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫、軟部組織肉腫など）、血管線維腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形癌（例、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍など）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、白血病（例、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病など）等、好ましくは乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、膵癌、前立腺癌、卵巣癌、血液癌の予防および／または治療に有効である。TRAILシグナル活性化薬を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
TRAILシグナル活性化薬は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、TRAILシグナル活性化薬と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってもよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体もしくは低分子化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体や低分子化合物は、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mg含有されていることが好ましい。
TRAILシグナル活性化薬を含有する上記医薬の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきTRAILシグナル活性化薬を、約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、TRAILシグナル活性化薬の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきTRAILシグナル活性化薬を、約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
なお前記した各組成物は、TRAILシグナル活性化薬との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分（例えば、他の抗癌剤など）を含有してもよい。また、他の活性成分（例えば、他の抗癌剤など）と併用してもよい。
該活性成分（例えば、他の抗癌剤など）の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該活性成分を、約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該活性成分の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該活性成分を、約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
２．TRAILシグナル活性化薬感受性の診断方法
TRAILシグナル活性化薬を含有する本発明の癌予防・治療剤は、癌患者から採取した試料におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現または活性を指標にして選別される、TRAILシグナル活性化薬感受性患者を対象にして投与されることを特徴とする。従って、本発明はまた、本発明のTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーを用いることによる、患者のTRAILシグナル活性化薬感受性の診断方法を提供する。
好ましくは、本発明は、癌患者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349およびCASP8の発現または活性を調べることを含む、該患者のTRAILシグナル活性化薬感受性の診断方法を提供する。当該診断方法が適用可能な癌の種類、患者から採取される試料、各TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現量または活性の測定方法、得られる測定値からのTRAILシグナル活性化薬感受性／非感受性の判定手法などは、TRAILシグナル活性化薬含有癌予防・治療剤について記載されるのとすべて同様である。
好ましい判定手法としては、上記の方法２に従って、各マーカーにおける上方基準値と下方基準値とを設定し、３種のマーカーに関してすべて同じ重みで点数化する方法が挙げられる。例えば、被験者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の（学習用癌細胞の中の基準癌細胞における発現量または活性に対する相対的な）発現量または活性が該上方基準値以上である場合にプラス１ポイント、下方基準値以上かつ上方基準値未満である場合にゼロポイント、下方基準値未満である場合に、マイナス１ポイントとして、STK17B、LOC93349およびCASP8の各マーカーにおけるポイントの総和を求めるというものである。
その結果、総和が正の値（＋１〜＋３）の場合は、被験者はTRAILシグナル活性化薬感受性であると判定する。逆に総和が負の値（−１〜−３）の場合は、被験者はTRAILシグナル活性化薬非感受性であると判定する。尚、総和がゼロの場合には、判定不能とすることができる。
被験者が乳癌または大腸癌患者である場合には、上記３種のマーカーに加えてAIM1をTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーとして用いることがより好ましい。本発明の当該診断方法は、AIM1による非感受性の判定が、他の３種のマーカーによる総合判定に対して優先されることを特徴とする。即ち、AIM1による単独での判定結果が非感受性（AIM1の発現量または活性が基準値以上）であれば、他の３種のマーカーによる判定結果が感受性であるか非感受性であるかにかかわらず、被験者はTRAILシグナル活性化薬非感受性であると判定される。一方、AIM1による単独での判定結果が判定不能、すなわちAIM1の発現量または活性が基準値未満の場合には、他の３種のマーカーによる総合判定が優先され、その結果が感受性であれば、被験者はTRAILシグナル活性化薬感受性であると判定される。
好ましくは、AIM1についての感受性／非感受性判定のための基準値（カットオフ値）は、上記の方法１に従って設定される。
３．TRAILシグナル活性化薬感受性の診断薬
本発明はまた、上記本発明の診断方法を実施するのに適した診断薬を提供する。本発明のTRAILシグナル活性化薬感受性の診断薬は、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー、好ましくはSTK17B、LOC93349およびCASP8の発現または活性をそれぞれ検出し得る試薬を含む。該試薬成分は検出対象に応じて異なるが、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子のmRNAを検出対象とする場合はそれを検出し得る核酸であり、該マーカーの蛋白質を検出対象とする場合はそれに対する抗体であり、該蛋白質の活性を検出する場合には、該活性測定用試薬である。
TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子、特にSTK17B、LOC93349およびCASP8のmRNAを検出し得る核酸としては、下記(a)および／または(b)：
(a)(i)配列番号ｎ（ｎ＝３、５、７および９）のいずれかに示される塩基配列、または(ii)前記(i)の塩基配列を含むヒト遺伝子の他の哺乳動物におけるオルソログの塩基配列を有する核酸とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸
(b)前記(i)または(ii)の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸
が挙げられる。
ここで「ハイストリンジェントな条件」とは、配列番号ｎに示される各塩基配列を有する核酸と、オーバーラップする領域において約80%以上、好ましくは約90%以上、より好ましくは約95%以上の相補性を有する塩基配列を有する核酸とがハイブリダイズし得る条件をいい、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC／0.1％ SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。
該核酸としては、TRAILシグナル活性化薬含有癌予防・治療剤の項において前記したプローブ用核酸もしくはプライマー用オリゴヌクレオチドが挙げられる。TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の発現を検出し得るプローブとして機能する核酸は、該遺伝子の転写産物の一部もしくは全部を増幅し得る上記プライマーセットを用い、哺乳動物（例：ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット等）のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋など］由来のcDNAもしくはゲノムDNAを鋳型としてPCR法によって所望の長さの核酸を増幅するか、前記した細胞・組織由来のcDNAもしくはゲノムDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション等により上記熱射病マーカー遺伝子もしくはcDNAをクローニングし、必要に応じて制限酵素等を用いて適当な長さの断片とすることにより取得することができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（前述）に記載の方法などに従って行なうことができる。あるいは、該核酸は、配列番号ｎ（ｎ＝３、５、７、９）で表される各塩基配列情報に基づいて、該塩基配列および／またはその相補鎖配列の一部もしくは全部を市販のDNA/RNA自動合成機等を用いて化学的に合成することによっても得ることができる。また、シリコンやガラス等の固相上で該核酸を直接in situ（on chip）合成することにより、該核酸が固相化されたチップを作成することもできる。
TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の転写産物の一部もしくは全部を増幅し得るプライマーとして機能する核酸は、配列番号ｎ（ｎ＝３、５、７、９）で表される各塩基配列情報に基づいて、該塩基配列およびその相補鎖配列の一部を市販のDNA/RNA自動合成機等を用いて化学的に合成することによって得ることができる。
TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の発現を検出し得る核酸は、乾燥した状態もしくはアルコール沈澱の状態で、固体として提供することもできるし、水もしくは適当な緩衝液（例：TE緩衝液等）中に溶解した状態で提供することもできる。標識プローブとして用いられる場合、該核酸は予め上記のいずれかの標識物質で標識した状態で提供することもできるし、標識物質とそれぞれ別個に提供され、用時標識して用いることもできる。
あるいは、該核酸は、適当な固相に固定化された状態で提供することもできる。固相としては、例えば、ガラス、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等が挙げられるが、これらに限定されない。また、固定化手段としては、予め核酸にアミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチンなどの官能基を導入しておき、一方、固相上にも該核酸と反応し得る官能基（例：アルデヒド基、アミノ基、SH基、ストレプトアビジンなど）を導入し、両官能基間の共有結合で固相と核酸を架橋したり、ポリアニオン性の核酸に対して、固相をポリカチオンコーティングして静電結合を利用して核酸を固定化するなどの方法が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸プローブが固相に固定化された状態で提供される好ましい一例として、High Throughput Genomics社より提供されるArrayPlateTM等が挙げられる。ArrayPlateTMは96ウェルプレートの各ウェル底面に種々の核酸プローブが規則正しく配置した状態（例、4×4アレイ）で固定化されたものである。プローブとハイブリダイズし得る一端と標的核酸とハイブリダイズし得る他端とを有する核酸をスペーサーとして介在させることで、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を固相表面上ではなく液相中で行わせることができ、標的核酸の定量的な測定が可能となる。従って、単一のウェルで種々の熱射病マーカー遺伝子の発現変動を同時に一括検出することができ、十分な定量性が得られれば、各マーカー遺伝子の発現変動を別個に検出するリアルタイムＰＣＲよりもさらに効率がよいという利点を有する。
各試薬中に含有される核酸は、同一の方法（例：ノーザンブロット、ドットブロット、DNAアレイ技術、定量RT-PCR等）によりTRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の発現を検出し得るように構築されていることが特に好ましい。
本発明の診断薬の構成として、上記の試薬がそれぞれ別個に提供されるもの［例：核酸が標識プローブ（特にドットブロット解析の場合）やPCR（特にリアルタイム定量PCR）用プライマーとして機能する場合等］、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の発現を検出し得る核酸が同一の試薬中に含有されて提供されるもの［例：核酸がPCR（特に、増幅産物のサイズ等により各マーカー遺伝子を区別し得る場合）や標識プローブ（特に、ノーザンブロット解析で転写産物のサイズにより各マーカー遺伝子を区別し得る場合）として機能する場合等］、あるいは、異なるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカー遺伝子の発現を検出し得る核酸が、同一の固相の別個の領域にそれぞれ固定化されて提供されるもの［例：標識cRNA等とのハイブリダイゼーション用プローブとして機能する場合等］などが例示されるが、これらに限定されない。
本発明の診断薬が、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー蛋白質に対する抗体を含有する試薬を構成として含む場合、該抗体としては、TRAILシグナル活性化薬含有癌予防・治療剤の項において前記した抗TRAILR抗体と同様の方法で得られる、各マーカー蛋白質に対する抗体が挙げられる。この場合、該抗体はアゴニスト抗体であるか中和抗体であるかを問わない。
本発明の診断薬が、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカー蛋白質の活性を検出するものである場合、これに含まれる試薬としては、TRAILシグナル活性化薬含有癌予防・治療剤の項において前記した各マーカー蛋白質の活性測定に必要な試薬が挙げられる。
本発明の診断薬が、乳癌または大腸癌患者におけるTRAILシグナル活性化薬感受性の診断用として用いられる場合、STK17B、LOC93349およびCASP8の発現または活性を検出し得る試薬に加えて、AIM1の発現または活性を検出し得る試薬をさらに含むことがより好ましい。
本発明の診断薬を構成する試薬は、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現を検出し得る核酸や抗体に加えて、該マーカーの発現を検出するための反応において必要な他の物質であって、共存状態で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない物質をさらに含有することができる。あるいは、該試薬は、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現を検出するための反応において必要な他の物質を含有する別個の試薬とともに提供されてもよい。例えば、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現を検出するための反応がPCRの場合、当該他の物質としては、例えば、反応緩衝液、dNTPs、耐熱性DNAポリメラーゼ等が挙げられる。競合PCRやリアルタイムPCRを用いる場合は、competitor核酸や蛍光試薬（上記インターカレーターや蛍光プローブ等）などをさらに含むことができる。また、TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現を検出するための反応が抗原抗体反応の場合、当該他の物質としては、例えば、反応緩衝液、compeptitor抗体、標識された二次抗体（例えば、一次抗体がウサギ抗ヒト熱射病マーカー抗体の場合、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ等で標識されたマウス抗ウサギIgGなど）、ブロッキング液等が挙げられる。
４．TRAILシグナル活性化薬感受性関連因子の調節薬を含有する医薬
本発明のTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーは、例えば、癌細胞におけるその発現をsiRNA等を用いて抑制すると、TRAILシグナル活性化薬に対する感受性が変化する（例えばAIM1の発現又は活性を阻害、あるいはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27またはRHOBTB3の発現又は活性を増強すると、TRAILシグナル活性化薬に対する感受性は増大する）。したがって、これらのマーカーは単なるTRAILシグナル活性化薬感受性の診断マーカーではなく、患者の癌細胞におけるTRAILシグナル活性化薬に対する感受性／非感受性を決定づける因子（TRAILシグナル活性化薬感受性関連因子）でもあり、従って、癌患者のTRAILシグナル活性化薬に対する感受性を高めてTRAILシグナル活性化薬の薬効を増強するための、有望な治療ターゲット候補でもある。
すなわち、本発明はまた、哺乳動物における(A)AIM1の発現または活性を阻害するか、あるいは(B)STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27またはRHOBTB3の発現または活性を増強することによる、該動物における癌の予防または治療方法、特にTRAILシグナル活性化薬感受性の増強方法を提供する。
具体的には、上記(A)の方法は、AIM1の発現または活性を阻害する物質（「AIM1阻害薬」という）を、癌、好ましくはTRAILシグナル活性化薬に対する感受性が低下している、もしくは非感受性である癌の、予防および／または治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む。したがって、本発明はまた、AIM1阻害薬を含有してなる、癌の予防または治療剤を提供する。
本発明において「AIM1の発現を阻害する物質」とは、AIM1遺伝子の転写レベル、転写後調節のレベル、蛋白質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、AIM1の発現を阻害する物質としては、例えば、AIM1遺伝子の転写を阻害する物質、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAの分解を促進する物質、mRNAから蛋白質への翻訳を阻害する物質、AIM1初期翻訳産物の翻訳後修飾を阻害する物質などが含まれる。いずれの段階で作用するものであっても好ましく用いることができるが、AIM1蛋白質の産生を直接的に阻害するという意味では、mRNAから蛋白質への翻訳を阻害する物質が好ましい。
AIM1のmRNAから蛋白質への翻訳を特異的に阻害し得る物質として、好ましくは、これらのmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸が挙げられる。
AIM1のmRNAの塩基配列と実質的に相補的な塩基配列とは、哺乳動物体内の生理的条件下において、該mRNAの標的配列に結合してその翻訳を阻害し得る程度の相補性を有する塩基配列を意味し、具体的には、例えば、該mRNAの塩基配列と完全相補的な塩基配列（すなわち、mRNAの相補鎖の塩基配列）と、オーバーラップする領域に関して、約80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上の相同性を有する塩基配列である。
ここで「塩基配列の相同性」は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。
より具体的には、AIM1のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列としては、(a)配列番号１で表される塩基配列または(b)該塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする配列と、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列が挙げられる。ここで「実質的に同質の活性」とは前記と同義である。ハイストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC／0.1％ SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。
前述のように、AIM1のmRNAは、好ましくは、配列番号１に示される塩基配列を含むヒトAIM1 mRNA、あるいは他の哺乳動物におけるそれらのホモログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体やスプライシングバリアントである。
「AIM1のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列の一部」とは、AIM1のmRNAに特異的に結合することができ、且つ該mRNAからの蛋白質の翻訳を阻害し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的もしくは実質的に相補的な部分を少なくとも10塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約20塩基以上含むものである。
具体的には、AIM1のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸として、以下の(a)〜(c)のいずれかのものが好ましく例示される。
(a) AIM1のmRNAに対するアンチセンス核酸
(b) AIM1のmRNAに対するsiRNA
(c) AIM1のmRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
(a) AIM1のmRNAに対するアンチセンス核酸
本発明における「AIM1のmRNAに対するアンチセンス核酸」とは、該mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、蛋白質合成を抑制する機能を有するものである。
アンチセンス核酸は、2-デオキシ-D-リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、D-リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN-グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、DNA:RNAハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
上記の通り、アンチセンス核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、AIM1遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。例えば、ヒトの場合、AIM1遺伝子は第6番染色体の6q21領域に存在するので、この領域のゲノム配列と、配列番号１で表されるヒトAIM1 cDNA塩基配列とをBLAST、FASTA等のホモロジー検索プログラムを用いて比較して、イントロン配列を決定することができる。
本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてAIM1蛋白質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、これら蛋白質をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約10塩基程度、長いものでmRNAもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約10〜約40塩基、特に約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。具体的には、AIM1遺伝子の5'端ヘアピンループ、5'端６−ベースペア・リピート、5'端非翻訳領域、翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3'端非翻訳領域、3'端パリンドローム領域または3'端ヘアピンループなどが、アンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されない。
さらに、本発明のアンチセンス核酸は、AIM1のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。
アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、天然型のDNAもしくはRNAでもよいが、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2'位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2'-O-Me）、CH2CH2OCH3（2'-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。
RNAの糖部のコンフォーメーションはC2'-endo（S型）とC3'-endo（N型）の２つが支配的であり、一本鎖RNAではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとN型に固定される。したがって、標的RNAに対して強い結合能を付与するために、2'酸素と4’炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したRNA誘導体であるBNA(LNA)（Imanishi, T. et al., Chem. Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. et al., Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004）やENA（Morita, K. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21, 2003）もまた、好ましく用いられ得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、AIM1のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも自体公知の手法により、化学的に合成することができる。
(b) AIM1のmRNAに対するsiRNA
本明細書においては、AIM1のmRNAに相補的なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、いわゆるsiRNAもまた、AIM!のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として汎用されている。siRNAは標的となるmRNAの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：RNAi Designer; Invitrogen）を用いて適宜設計することができる。具体的には、後述の実施例において使用されるsiRNA等が本発明のsiRNAとして好ましく例示され得るが、それらに限定されない。
siRNAを構成するリボヌクレオシド分子もまた、安定性、比活性などを向上させるために、上記のアンチセンス核酸の場合と同様の修飾を受けていてもよい。但し、siRNAの場合、天然型RNA中のすべてのリボヌクレオシド分子を修飾型で置換すると、RNAi活性が失われる場合があるので、RISC複合体が機能できる最小限の修飾ヌクレオシドの導入が必要である。
siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるショートヘアピンRNA（shRNA）を合成し、これをダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
(c) AIM1のmRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
本明細書においては、生体内で上記のAIM1のmRNAに対するsiRNAを生成し得るようにデザインされた核酸もまた、AIM1のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。そのような核酸としては、上記したshRNAやそれを発現するように構築された発現ベクターなどが挙げられる。shRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば15から25塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結した塩基配列を含むオリゴRNAをデザインし、これをDNA/RNA自動合成機で合成することにより調製することができる。shRNAの発現カセットを含む発現ベクターは、上記shRNAをコードする二本鎖DNAを常法により作製した後、適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。shRNAの発現ベクターとしては、U6やH1などのPol III系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該発現ベクターを導入された動物細胞内で転写されたshRNAは、自身でループを形成した後に、内在の酵素ダイサー（dicer）などによってプロセシングされることにより成熟siRNAが形成される。
AIM1のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の他の好ましい例としては、該mRNAをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイムが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。AIM1 mRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
AIM1のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸は、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療に適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の3'端または5'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3'端または5'端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
これらの核酸のAIM1蛋白質発現阻害活性は、AIM1遺伝子を導入した形質転換体、生体内や生体外のAIM1遺伝子発現系、または生体内や生体外のAIM1蛋白質翻訳系を用いて調べることができる。
本発明におけるAIM1蛋白質の発現を阻害する物質は、上記のようなAIM1のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に限定されず、AIM1蛋白質の産生を直接的または間接的に阻害する限り、低分子化合物や抗体などの他の物質であってもよい。そのような物質は、例えば、後述する本発明のスクリーニング方法により取得することができる。
本発明において「AIM1蛋白質の活性を阻害する物質」とは、いったん機能的に産生されたAIM1蛋白質が、その生理活性を発揮するのを阻害する限りいかなるものでもよく、例えば、AIM1の細胞膜への輸送を阻害する物質、AIM1蛋白質のフォールディングを阻害する物質や、細胞膜上でのAIM1蛋白質の機能を阻害する物質などが挙げられる。
具体的には、AIM1蛋白質の活性を阻害する物質として、例えば、AIM1蛋白質に対する中和抗体が挙げられる。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
好ましい一実施態様において、AIM1蛋白質に対する抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、該抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、ヒト抗体産生マウスやファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
AIM1に対してドミナントネガティブに作用するAIM1の変異体もしくはそれをコードする核酸は、AIM1の活性を阻害することができるので、AIM1の活性を阻害する物質として好適に使用することができる。
AIM1に対するアプタマーも、AIMの活性や機能を阻害することができるので、AIM1の活性を阻害する物質として好適に使用することができる。アプタマーは、公知の方法、例えばSELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法（Annual Review of Medicine 56巻，555-583頁，2005年）を用いて取得する。アプタマーの構造は、公知の方法を用いて決定することができ、その構造を基に公知の方法に従いアプタマーを製造する。
AIM1蛋白質は細胞膜に局在する可能性があるので、AIM1の活性を阻害する物質は、抗体のような細胞内移行性に劣る物質であっても好ましく用いることができるが、AIM1蛋白質の活性を阻害する別の好ましい物質としては、Lipinski's Ruleに見合った低分子化合物が挙げられることはいうまでもない。そのような化合物は、例えば、後述するスクリーニング法を用いて取得することができる。
一方、上記(B)の方法は、具体的には、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3の発現または活性を増強する物質（「STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3の活性化薬」という）を、癌、好ましくはTRAILシグナル活性化薬に対する感受性が低下している、もしくは非感受性である癌の、予防および／または治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む。したがって、本発明はまた、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3の活性化薬を含有してなる、癌の予防または治療剤を提供する。
本発明において「STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3の発現を増強する物質」とは、生体内でのSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3の量を増大させる物質をいい、例えば、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質自体もしくはその部分ペプチド、それをコードする核酸などが挙げられる。また、「STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3の活性を増強する物質」としては、例えば、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3に対するアゴニスト抗体やSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3に対してアゴニスト活性を示す低分子化合物等が挙げられる。
STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質は、それを産生する細胞もしくは組織から周知慣用の蛋白質分離精製技術、例えば、溶媒抽出、蒸留、等電点電気泳動、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどを用いて単離することができる。あるいは、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質もしくはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法、例えば、固相合成法、液相合成法に従って製造することもできる。即ち、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質を構成する部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の(1)および(2)に記載された方法に従って行われる。
(1) M. BodanszkyおよびM.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年)
(2) SchroederおよびLuebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965年)
あるいはまた、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から該蛋白質を分離精製することによって製造することもできる。
STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質またはその部分ペプチドをコードするDNAとしては、ゲノムDNA、哺乳動物の任意の細胞もしくは組織由来のcDNA、合成DNAなどが挙げられる。STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質またはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNA画分および全RNAもしくはmRNA画分をそれぞれ鋳型として用い、PCR法およびRT-PCR法によって直接増幅することもできる。あるいは、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質またはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNAおよび全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、それぞれクローニングすることもできる。さらに、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質またはその部分ペプチドは、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質またはその部分ペプチドをコードするDNAに対応するRNAを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ合成することができる。あるいは、さらにRNAポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質またはその部分ペプチドをコードするDNAを鋳型としても合成することができる。
STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質に対するアゴニスト抗体は、上記したTRAILRに対するアゴニスト抗体と同様の手法を用いて取得することができる。また、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質に対してアゴニスト活性を示す低分子化合物は、例えば、後述する本発明のスクリーニング法を用いて取得することができる。
本発明においては、AIM1阻害薬またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3の活性化薬を、常套手段に従って製剤化し、癌の予防または治療剤として用いることができる。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記活性成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記アンチセンス核酸は、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。また、例えば、前記のアンチセンス核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウ随伴ウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンス核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンス核酸を単独またはリポソームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下、関節腔内、癌病変部等に投与してもよい。上記二重鎖ＲＮＡ（siRNA、shRNA）、リボザイム、上記本発明で用いられる蛋白質に対してドミナントネガティブに作用する、本発明で用いられる蛋白質の変異体もしくはそれをコードする核酸などは、上記アンチセンス核酸と同様にして製剤化し、投与することができる。
上記抗体、アプタマーなどは、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、静脈注射）に適する剤形として提供される。好ましくは吸入剤として提供される。
なお前記した各組成物は、上記活性成分との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分（例えば、他の抗癌剤など）を含有してもよい。また、他の活性成分（例えば、他の抗癌剤など）と併用してもよい。好ましくは、他の活性成分としてTRAILシグナル活性化薬が挙げられる。AIM1阻害薬およびSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3の活性化薬は、癌患者のTRAILシグナル活性化薬に対する感受性を高めることができるので、併用によりTRAILシグナル活性化薬の薬効を顕著に向上させることができる。他の活性成分としてTRAILシグナル活性化薬を用いる場合、TRAILシグナル活性化薬の投与量は前記と同様である。
４．TRAILシグナル活性化薬感受性関連因子の調節薬のスクリーニング
本発明はまた、（A)AIM1の発現または活性の阻害活性、あるいは（B)STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3の活性化活性を指標として、抗癌作用を有する化合物またはその塩をスクリーニングする方法を提供する。
AIM1蛋白質の活性を阻害する、またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質の活性を増強する化合物またはその塩をスクリーニングする場合、該スクリーニング方法は、AIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質を産生する能力を有する細胞を、試験化合物の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該蛋白質の活性を比較することを含む。
上記のスクリーニング方法において用いられるAIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質を産生する能力を有する細胞としては、それらを生来発現しているヒトもしくは他の哺乳動物細胞またはそれを含む生体試料（例、血液、組織、臓器等）であれば特に制限はないが、例えばTRAILシグナル活性化薬抵抗性癌細胞等が好ましく挙げられる。非ヒト動物由来の血液、組織、臓器等の場合は、それらを生体から単離して培養してもよいし、あるいは生体自体に試験化合物を投与し、一定時間経過後にそれら生体試料を単離してもよい。
また、AIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質あるいはその部分ペプチドを産生する能力を有する細胞としては、公知慣用の遺伝子工学的手法により作製された各種の形質転換体が例示される。宿主としては、例えば、H4IIE-C3細胞、HepG2細胞、HEK293細胞、COS7細胞、CHO細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。
具体的には、AIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質あるいはその部分ペプチドをコードするDNA（即ち、配列番号１、３、５、７、９、１１または１３で表される塩基配列もしくは該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含むDNA）を、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結して宿主動物細胞に導入することにより調製することができる。
AIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質あるいその部分ペプチドをコードするDNAは、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１または１３で表される塩基配列に基づいて、適当なオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして合成し、AIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質を産生する細胞・組織由来のcDNAもしくはcDNAライブラリーから、ハイブリダイゼーション法やPCR法を用いてクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第2版（J. Sambrook et al., Cold Spring HarborLab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
クローン化されたDNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該DNAはその5'末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3'末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。
発現ベクターとしては、動物細胞発現プラスミド（例：pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）；λファージなどのバクテリオファージ；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点（以下、SV40 oriと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、dhfrと略称する場合がある、メソトレキセート（MTX）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、amprと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、neorと略称する場合がある、G418耐性）等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。
AIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質をコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換することにより、AIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質発現細胞を製造することができる。
宿主としては、哺乳動物細胞、例えば、HepG2細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、ヒトFL細胞、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、CHO細胞と略記）、dhfr遺伝子欠損CHO細胞（以下、CHO(dhfr-)細胞と略記）、マウスL細胞，マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞、ラットH4IIE-C3細胞、ラットGH3細胞などが用いられ得る。
形質転換は、リン酸カルシウム共沈殿法、PEG法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などにより行うことができる。例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），52巻，456 (1973)に記載の方法を用いることができる。
上記のようにして得られる形質転換細胞や生来AIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質を産生する能力を有する哺乳動物細胞または該細胞を含む組織・臓器は、例えば、約5〜20%の胎仔牛血清を含む最小必須培地（MEM）〔Science，122巻,501(1952)〕，ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔Virology,8巻,396(1959)〕，RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association,199巻,519(1967)〕，199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などの培地中で培養することができる。培地のpHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30〜40℃で行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
試験化合物の上記細胞との接触は、例えば、上記の培地や各種緩衝液（例えば、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）の中に試験化合物を添加して、細胞を一定時間インキュベートすることにより実施することができる。添加される試験化合物の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）により異なるが、例えば、約0.1nM〜約100nMの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約10分〜約24時間が挙げられる。
AIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質を産生する細胞が、非ヒト哺乳動物個体の形態で提供される場合、該動物個体の状態は特に制限されない。使用される動物の飼育条件に特に制限はないが、SPFグレード以上の環境下で飼育されたものであることが好ましい。試験化合物の該細胞との接触は、該動物個体への試験化合物の投与によって行われる。投与経路は特に制限されないが、例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、経口投与、気道内投与、直腸投与等が挙げられる。投与量も特に制限はないが、例えば、１回量として約0.5〜20 mg／kgを、1日1〜5回、好ましくは1日1〜3回、1〜14日間投与することができる。
上記のスクリーニング方法におけるAIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質活性の測定は、各蛋白質について前記した方法に従って行うことができる。活性測定のための被験試料としては、AIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質を産生する細胞が細胞培養、組織、臓器培養の形態で提供される場合は該培養物の抽出液が、該細胞がそれを含む非ヒト哺乳動物個体として提供される場合は、該個体から分離した細胞、組織、臓器の抽出物あるいはそれらの組織切片等のホモジネートなどが挙げられる。
例えば、上記のスクリーニング方法において、試験化合物の存在下におけるAIM1蛋白質の活性が、試験化合物の非存在下における活性に比べて、約20％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは約50％以上阻害された場合に、該試験化合物またはその塩を、AIM1蛋白質の阻害薬、従って、TRAILシグナル活性化薬感受性改善作用、抗癌作用を有する物質の候補として選択することができる。また、試験化合物の存在下におけるSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質の活性が、試験化合物の非存在下における活性に比べて、約20％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは約50％以上増強された場合に、該試験化合物またはその塩を、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質の活性化薬、従って、TRAILシグナル活性化薬感受性改善作用、抗癌作用を有する物質の候補として選択することができる。
本発明はまた、AIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質を産生する能力を有する細胞における該蛋白質（遺伝子）の発現を、試験化合物の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本方法において用いられる細胞、試験化合物の種類、試験化合物と細胞との接触の態様などは、上記したAIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質の活性を指標とする方法と同様である。
AIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質の発現量は、前記したAIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質をコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、即ち、配列番号１、３、５、７、９、１１または１３で表される塩基配列もしくはそれと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸（以下、「本発明の検出用核酸」という場合がある）を用いて、AIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3のmRNAを検出することにより、RNAレベルで測定することができる。あるいは、該発現量は、前記したAIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質に対する抗体（以下、「本発明の検出用抗体」という場合がある）を用いて、これらの蛋白質を検出することにより、蛋白質レベルで測定することもできる。
従って、より具体的には、本発明は、
（a）AIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該蛋白質をコードするmRNAの量を、本発明の検出用核酸を用いて測定、比較することを特徴とする、抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（b）AIM1蛋白質またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質
を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該蛋白質の量を、本発明の検出用抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
例えば、AIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3のmRNA量または蛋白質量の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。
（i）正常あるいは疾患（例えば、担癌）モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、薬剤などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の組織（例えば、癌組織）を得る。
得られた細胞に含まれるAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3のmRNAは、例えば、通常の方法により細胞等からmRNAを抽出し、例えば、RT-PCRなどの手法を用いることにより定量することができ、あるいは自体公知のノーザンブロット解析により定量することもできる。一方、AIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳述する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。
（ii）AIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質をコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体を上記の方法に従って作製し、該形質転換体に含まれるAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質あるいはそれをコードするmRNAを、上記（i）と同様にして定量、解析することができる。
AIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3の発現量を変化させる物質のスクリーニングは、
（i）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤などを与える一定時間前（30分前〜24時間前、好ましくは30分前〜12時間前、より好ましくは1時間前〜6時間前）もしくは一定時間後（30分後〜3日後、好ましくは1時間後〜2日後、より好ましくは1時間後〜24時間後）、または薬剤などと同時に試験化合物を投与し、投与から一定時間が経過した後（30分後〜3日後、好ましくは1時間後〜2日後、より好ましくは1時間後〜24時間後）、該動物から単離した細胞に含まれるAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3をコードするmRNA量、あるいはAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質量を定量、解析することにより、あるいは（ii）形質転換体を常法に従って培養する際に試験化合物を培地もしくは緩衝液中に添加し、一定時間インキュベート後（1日後〜7日後、好ましくは1日後〜3日後、より好ましくは2日後〜3日後）、該形質転換体に含まれるAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3をコードするmRNA量、あるいはAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質量を定量、解析することにより行うことができる。
上記（b）のスクリーニング方法におけるAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質の量の測定は、具体的には、例えば、
（i）本発明の検出用抗体と、試料液および標識化されたAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された蛋白質を検出することにより試料液中のAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質を定量する方法、
（ii）試料液と、担体上に不溶化した本発明の検出用抗体および標識化された別の本発明の検出用抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、試料液中のAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質を定量する方法等が挙げられる。
上記（ii）の定量法においては、2種の抗体はAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質の異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体が該2蛋白質のＮ端部を認識する抗体であれば、他方の抗体として該蛋白質のＣ端部と反応するものを用いることができる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕、〔32P〕、〔33P〕、〔35S〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート、シアニン蛍光色素などが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
本発明の検出用抗体を用いるAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、試料液中の抗原量に対応した、抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。感度、特異性の点で、例えば、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の検出用抗体に試料液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の検出用抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量もしくは活性を測定することにより、試料液中のAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明の検出用抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。
競合法では、試料液中のAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質と標識したAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ、Ｆいずれかの標識量を測定することにより、試料液中のAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体（１次抗体）に対する２次抗体などを用いてＢ／Ｆ分離を行う液相法、および、１次抗体として固相化抗体を用いるか（直接法）、あるいは１次抗体は可溶性のものを用い、２次抗体として固相化抗体を用いる（間接法）固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、試料液中のAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質と固相化したAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは試料液中のAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化したAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質を加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し試料液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中のAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質の量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、前記した総説、成書などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の検出用抗体を用いることによって、細胞におけるAIM1またはSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3蛋白質の量を感度よく定量することができる。
例えば、上記（a）および（b）のスクリーニング法において、試験化合物の存在下におけるAIM1の発現量（mRNA量または蛋白質量）が、試験化合物の非存在下における場合に比べて、約20%以上、好ましくは約30％以上、より好ましくは約50％以上阻害された場合、該試験化合物を、またはその塩を、AIM1の阻害薬、従って、TRAILシグナル活性化薬感受性改善作用、抗癌作用を有する物質の候補として選択することができる。また、試験化合物の存在下におけるSTK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3の発現量（mRNA量または蛋白質量）が、試験化合物の非存在下における場合に比べて、約20%以上、好ましくは約30％以上、より好ましくは約50％以上増強された場合、該試験化合物を、またはその塩を、STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27もしくはRHOBTB3の活性化薬、従って、TRAILシグナル活性化薬感受性改善作用、抗癌作用を有する物質の候補として選択することができる。
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ ：セレノシステイン（selenocysteine）
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
AIM1をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
AIM1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
STK17BをコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
STK17Bのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
LOC93349をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
LOC93349のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
CASP8をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
CASP8のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
SP110をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
SP110のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１〕
NOD27をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
NOD27のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３〕
RHOBTB3をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
RHOBTB3のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１５〕
TRAILをコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
TRAILのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１７〕
TRAILR1をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
TRAILR1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１９〕
TRAILR2（Long form）をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
TRAILR2（Long form）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２１〕
TRAILR2（Short form）をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
TRAILR2（Short form）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２３〕
TRAILR1アゴニスト抗体をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
TRAILR1アゴニスト抗体のアミノ酸配列を示す。
配列番号：２４で表されるアミノ酸配列を有するTRAILR1アゴニスト抗体をコードするcDNAを保持する細胞株TRAIL(NSO) 14G03 No.39 P:14 7/2/01は、２００１年７月３０日からAmerican Type Culture Collection（ATCC）に寄託番号ＰＴＡ−３５７０として寄託されている。ＡＴＣＣは、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに位置する。ＡＴＣＣへの受託は、特許手続上の目的のための微生物の受託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に準拠させた。
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１. ヒト癌細胞株におけるTRAILR1 アゴニスト抗体の増殖抑制検討
TRAILR1 アゴニスト抗体は TRAILシグナルを活性化し、細胞にアポトーシスを誘導する。TRAILR1 アゴニスト抗体の感受性を以下の細胞株で検定した。ヒト大腸癌細胞株COLO205、HCT15、DLD1、COLO201、COLO320DM、ヒト肺癌細胞株NCI-H460、NCI-H2122、NCI-H358、PC14、NCI-H1703、NCI-H23、ヒト乳癌細胞株Zr75-1、BT474、胃癌細胞株SNU-668について、10％牛胎仔血清（JRH社）および50 μg/ml ペニシリン・ストレプトマイシン（Invitrogen社）を含むRPMI1640培地（Sigma社）10 mlに懸濁し、5%炭酸ガス気流下、37℃で10 cm培養皿を用いて培養した。同様に、ヒト大腸癌細胞株HCT116、ヒト肺癌細胞株A549、ヒト乳癌細胞株MCF7、SKBr3は、10％牛胎仔血清（JRH社）および50 μg/ml ペニシリン・ストレプトマイシン（Invitrogen社）を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地（Sigma社）10 mlに懸濁し、5%炭酸ガス気流下、37℃で10 cm培養皿を用いて培養した。また、ヒト大腸癌細胞株SW480、SW48、SW620、ヒト乳癌細胞株MDA-MB-435S、MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-175VII、MDA-MB-468は、10％牛胎仔血清（JRH社）および50 μg/ml ペニシリン・ストレプトマイシン（Invitrogen社）を含むLeibovitz’s L-15培地（Invitrogen社）10 mlに懸濁し、自然気流下、37℃で10 cm培養皿を用いて培養した。ヒト大腸癌細胞株WiDr、LS180は、10％牛胎仔血清（JRH社）および50 μg/ml ペニシリン・ストレプトマイシン（Invitrogen社）を含む最小必須培地（MEM、Invitrogen社）10 mlに懸濁し、5%炭酸ガス気流下、37℃で10 cm培養皿を用いて培養した。上記計２８細胞株について、トリプシン・ETDA (Invitrogen社)を用いてそれぞれの細胞を回収し、5.0ｘ103個/50 μlとなるように各培養液に懸濁し、96穴プレートの1ウェルずつにそれぞれ50 μlを播種した。この時、Leibovitz’s L-15培地で培養していた細胞株はダルベッコ改変型イーグル最少培地に変更し、全て５%炭酸ガス気流下、37 ℃で培養した。２４時間後、培養している細胞と同じ培養液で希釈した各種濃度の50 μlのTRAILR1 アゴニスト抗体（配列番号２３で表される塩基配列にコードされるscFv抗体）を添加した。48時間後、10 μlのcell counting kit-8 (Dojin社)を添加し、3時間後に生細胞数の指標として450 nmにおける吸光度を測定した。TRAILR1 アゴニスト抗体無添加時の吸光度を100%としてIC50を計算した。IC50が100 nM以下のものをTRAILR1 アゴニスト抗体感受性とした。これらのヒト細胞株の入手先と、抵抗性、感受性については表１にまとめた。このように、TRAILシグナルの感受性は細胞株により大きく異なることが分かった。
Figure 2011502108
実施例２ TRAIL感受性診断マーカーの検討（網羅的遺伝子発現解析）
TRAIL誘導アポトーシスに対する効果予測の判別に用いる遺伝子を選択する目的で、以下の実験を行った。実施例１に記載したTRAILR1 アゴニスト抗体に感受性を示すヒト癌細胞株3種 (COLO205、NCI-H2122、およびSNU668)、非感受性を示すヒト癌細胞株4種 (COLO320DM、SW620、およびNCI-H23)の計６種類の全てTRAILR1を細胞膜上に発現している癌細胞株より、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社）を用いてtotal RNAを抽出した。このtotal RNAを材料とし、oligonucleotide microarray (Human Genome U133 plus 2.0；Affymetrix社) を用いて遺伝子発現解析を行った。実験方法は、Affymetrix社の実験手引き書 (Expression analysis technical manual) に従った。得られた実験結果について、GeneSpring (アジレント・テクノロジー社)を用いて解析した。
各遺伝子のdetection callが１例以上でPresentと判定された遺伝子を対象として、感受性株と抵抗性株で発現変動が認められる遺伝子を選択した。Student’s t-検定およびSignal to Noise法 (((平均値1)-(平均値2))/((SD1)+(SD2)))によって2群間での発現変動有無に関する確率値を各遺伝子に対して算出した結果、２つの検定の両者で確率値が0.005未満となる発現変動遺伝子は２７２個であった。これらの遺伝子の一つ、あるいは複数用いて、その発現量、蛋白質量あるいは活性を測定することにより、TRAIL誘導アポトーシスの感受性が予測されると考えられた。
実施例３ 選択遺伝子の定量的PCRの実施
実施例２記載の発現変動遺伝子から、Gene Logic 社の遺伝子発現データベースを参照し、さらに選択した遺伝子について、実施例1（表１）記載のヒト癌細胞株２８株に対し、FAM標識したTaqManプローブを用いた定量的PCR反応を行うことにより、各細胞株における遺伝子の発現量を測定した。該反応は上記細胞株よりトータルRNAを調製し、このトータルRNA（４００ ｎｇ）を鋳型としてランダムプライマーを用いた逆転写反応（TaqMan Reverse Transcription Reagents kit 、Applied Biosystems 社）でcDNAを準備した。定量的PCR反応における反応液の組成は、上記cDNA 1 μlを鋳型として使用し、TaqManTM Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems社）を10 μl、各プライマーとTaqManプローブがセットになったTaqManTM Gene Expression Assays（Applied Biosystems社）を2 μlとなるよう加え、20 μlの液量とした。ＰＣＲ反応は、50℃・2分、95℃・10分の後、95℃・15秒、60℃・1分のサイクルを40回繰り返した。内在性コントロールとしてGAPDH遺伝子の発現値で補正した後、COLO205細胞株の各発現値を1とした時に、これらの遺伝子の発現相対値を求めた。TRAILR1 アゴニスト抗体感受性株群とTRAILR1 アゴニスト抗体非感受性株群について、SAS前臨床パッケージVersion５．０（ＳＡＳインスティチュートジャパン社）を用いてStudent’s t-検定を行った。その結果、STK17B（配列番号：１、２）およびLOC93349（配列番号：３、４）はp<0.01、またCASP8（配列番号：５、６）、SP110（配列番号：７、８）、およびNOD27（配列番号：９、１０）はp<0.05で、有意な差が得られた。また、決定木の手法を用いた感受性/非感受性分類を行った際に分類に適していたＡＩＭ１（配列番号：１１、１２）、RHOBTB3（配列番号：１３、１４）も選択した。これらの遺伝子の一つ、あるいは複数を組み合わせ、その発現量、蛋白質量あるいは活性を測定することにより、TRAIL誘導アポトーシスの感受性が予測されると考えられた。
実施例４(１） 感受性予想クライテリアの設定
実施例３記載の遺伝子から、学習用細胞株（表１）での発現値を基に以下のような感受性予想クライテリアを検討した。その結果、STK17B、LOC93349、CASP8、およびAIM1の４遺伝子を選択し、感受性予測クライテリアを以下のように設定した。内在性コントロールとしてGAPDH遺伝子の発現値で補正した後、COLO205細胞株の各発現値を1とした時に、(1)大腸癌および乳癌においてAIM1の発現相対値が2.2以上の場合、無条件に非感受性とする。(2)(1)以外のサンプルはポイント制とし、STK17B、LOC93349、およびCASP8の発現相対値がそれぞれ0.7以上の時は「+1」、0.5以下の時は「-1」とする。発現値が0.5から0.7の間の場合は「0」とした。最終的に、各ポイントの和が正の場合は感受性とし、負の場合は非感受性とした。また、「0」の場合は判定不可とした。この感受性予測クライテリア適用の結果、実施例１記載の学習用サンプルでは２８株中２６株の予測が可能であり、この２６株中２５株の感受性を正確に予測可能であった (表２)。
Figure 2011502108
実施例４（２） 感受性予想クライテリアの設定
実施例３記載の遺伝子から、学習用細胞株（表１）での発現値を基に以下のような感受性予想クライテリアを検討した。その結果、STK17B、LOC93349、CASP8、およびAIM1の４遺伝子を選択し、感受性予測クライテリアを以下のように設定した。内在性コントロールとしてGAPDH遺伝子の発現値で補正した後、COLO205細胞株の各発現値を1とした時に、(1) 大腸癌および乳癌においてAIM1の発現相対値が2.2以上の場合、無条件に非感受性とする。
(2)(1)以外のサンプルはポイント制とし、
STK17Bの発現相対値が1.036以上の時は「+1」、0.514以下の時は「-1」とし、発現値が1.036から0.514の間の場合は「0」とした。
LOC93349の発現相対値が0.666以上の時は「+1」、0.211以下の時は「-1」とし、発現値が0.666から0.211の間の場合は「0」とした。
CASP8の発現相対値が0.833以上の時は「+1」、0.519以下の時は「-1」とする。発現値が0.833から0.519の間の場合は「0」とした。
最終的に、各ポイントの和が正の場合は感受性とし、負の場合は非感受性とした。また、「0」の場合は判定不可とした。この感受性予測クライテリア適用の結果、実施例１記載の学習用サンプルでは２８株中２７株の予測が可能であり、この２７株中２６株の感受性を正確に予測可能であった (表２’)。
Figure 2011502108
実施例４（３） 感受性予想クライテリアの設定
実施例３記載の遺伝子から、学習用細胞株（表１）での発現値を基に以下のような感受性予想クライテリアを検討した。その結果、STK17B、LOC93349、CASP8、およびAIM1の４遺伝子を選択し、感受性予測クライテリアを以下のように設定した。内在性コントロールとしてGAPDH遺伝子の発現値で補正した後、COLO205細胞株の各発現値を1とした時に、(1) 大腸癌および乳癌においてAIM1の発現相対値が2.2以上の場合、無条件にTRAILシグナル活性化薬非感受性と判定した。
また、STK17B、LOC93349およびCASP8の基準値は、各相対発現量（小数点下２ケタ）の中央値とし、各相対発現量のうち2以上の発現が基準値以上の場合は、TRAILシグナル活性化薬感受性と判定した。また、各相対発現量のうち2以上の発現が基準値未満の場合は、TRAILシグナル活性化薬非感受性と判定した。STK17Bの基準値（中央値）を0.94、LOC93349の基準値（中央値）を0.57、CASP8の基準値（中央値）を0.72とした。この感受性予測クライテリア適用の結果、実施例１記載の学習用サンプルでは２８株中２８株の予測が可能であり、この２８株中２５株の感受性を正確に予測可能であった(表２'’)。
Figure 2011502108
実施例５ 検証用細胞株のTRAILR1 アゴニスト抗体の感受性測定
検証用の細胞として、TRAILR1 アゴニスト抗体の感受性が未知であった、ヒト癌細胞株14株、すなわち、大腸癌細胞株；SW1116、SW1417、SW403、SW837、SW948、肺癌細胞株；NCI-H838、NCI-H226、NCI-H520、NCI-H522、NCI-H2347、乳癌細胞株；T47D、BT549、MDA-MB-157、MDA-MB-361を用いた（入手先は表３に示す）。培地はNCI-H838、NCI-H226、NCI-H520、NCI-H522、NCI-H2347、T47D、BT549はRPMI1640培地（SIGMA社）、SW1116、SW1417、SW403、SW837、SW948、MDA-MB-157、MDA-MB-361は、Leibovitz’s L-15培地（Invitrogen社）を用い、10％牛胎仔血清（JRH社）および50 μg/ml ペニシリン・ストレプトマイシン（Invitrogen社）を加えた。RPMI1640培地を用いたものは5%炭酸ガス気流下で、Leibovitz’s L-15培地を用いたものは自然気流下、37℃で培養した。
検証用細胞のTRAILR1 アゴニスト抗体感受性の測定は、実施例1記載の方法に従った。すなわち、トリプシン・ETDA (Invitrogen社)を用いてそれぞれの細胞を回収し、5.0ｘ103個を50 μlの各培養液に懸濁し、96穴プレートの1ウェルにそれぞれ播種した。この時、Leibovitz’s L-15培地で培養していた細胞株はダルベッコ改変型イーグル最少培地に変更し、全て5%炭酸ガス気流下、37℃で培養した。２４時間後、培養している細胞と同じ培養液で希釈した50 μlのTRAILR1 アゴニスト抗体を39.6 nMより12倍公比で３点添加した。48時間後、実施例１と同様にWST-8アッセイとして10 μlのcell counting kit-8 (Dojin社)を添加し、3時間後に生細胞数の指標として450 nmにおける吸光度を測定した。TRAILR1 アゴニスト抗体無添加時の吸光度を100%として生細胞の割合を調べた。また、同時にCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega社)を行い、細胞内ATPを測定した。TRAILR1 アゴニスト抗体無添加時の吸光度を100%として生細胞の割合を調べた。上記のWST-8またはATPアッセイで、TRAILR1 アゴニスト抗体の濃度が39.6 nMである時に細胞増殖阻害率が30%以上の細胞株をTRAILR1 アゴニスト抗体感受性株と判定した（表３）。
Figure 2011502108
実施例６(１） 感受性クライテリアの検証
実施例４(１）記載のクライテリアを用いて、実施例５記載の検証用細胞の感受性を予測できるか検証を行った。実施例５記載の検証用細胞、14細胞について、実施例３と同様にcDNAを調製し、定量的PCR反応よりSTK17B、LOC93349、CASP8、およびAIM1の４遺伝子の発現相対値を調べた。この感受性予測クライテリアを適用したところ、14細胞株中12細胞株のTRAILR1 アゴニスト抗体感受性が予測でき、１２株中９株において予測結果が実験結果と一致しており、検証用サンプルにおいても７５％の精度で予測できた（表４）。
このように、実施例２記載の遺伝子から選択した遺伝子の発現量を比較する事により、TRAIL誘導アポトーシスに対する感受性の予測が可能であることが示された。
Figure 2011502108
実施例６（２） 感受性クライテリアの検証
実施例４（２）記載のクライテリアを用いて、実施例５記載の検証用細胞の感受性を予測できるか検証を行った。実施例５記載の検証用細胞、14細胞について、実施例３と同様にcDNAを調製し、定量的PCR反応よりSTK17B、LOC93349、CASP8、およびAIM1の４遺伝子の発現相対値を調べた。この感受性予測クライテリアを適用したところ、14細胞株中13細胞株のTRAILR1 アゴニスト抗体感受性が予測でき、13株中10株において予測結果が実験結果と一致しており、検証用サンプルにおいても７６．９％の精度で予測できた（表４’）。
Figure 2011502108
実施例６（３） 感受性クライテリアの検証
実施例４（３）記載のクライテリアを用いて、実施例５記載の検証用細胞の感受性を予測できるか検証を行った。実施例５記載の検証用細胞、14細胞について、実施例３と同様にcDNAを調製し、定量的PCR反応よりSTK17B、LOC93349、CASP8、およびAIM1の４遺伝子の発現相対値を調べた。この感受性予測クライテリアを適用したところ、14細胞株中14細胞株のTRAILR1 アゴニスト抗体感受性が予測でき、14株中11株において予測結果が実験結果と一致していた（表４'’）。
Figure 2011502108
このように、実施例２記載の遺伝子から選択した遺伝子の発現量を比較する事により、TRAIL誘導アポトーシスに対する感受性の予測が可能であることが示された。
実施例７ STK17BのTRAILシグナルにおける関与
TRAILR1 アゴニスト抗体感受性マーカーとして選択したSTK17B遺伝子がTRAILR1 アゴニスト抗体感受性に関与しているか調べるため、STK17B遺伝子に対するsiRNAのTRAILR1 アゴニスト抗体感受性株に導入することにより、感受性が低下するかを調べた。細胞株は、TRAILR1 アゴニスト抗体感受性株である肺癌細胞株H460、大腸癌細胞株HCT116およびSW480を用い、実施例１記載の方法で培養した。トリプシン・ETDA (Invitrogen社)を用いてそれぞれの細胞を回収し、2.5ｘ103個/100 μlとなるように各培養液に懸濁し、96穴プレートの1ウェルずつにそれぞれ100 μlを播種した。２４時間培養後、289.5 μl の OPTI-MEM （Invitrogen社）、7.5 μl のLipofectamine RNAiMAX （Invitrogen社）、およびSTK17B遺伝子に対する3 μl のsiRNA（ON TARGETplus SMARTpool siRNA; Dharmacon社、50 μM）もしくは3 μlのNon Silencing siRNA (ON TARGETplus SMARTpool siRNA; Dharmacon社、50 μM)と混合し、室温で20分間静置した。この懸濁液を播種した細胞へそれぞれ10 μlずつ添加することにより、siRNAの導入をおこなった。アポトーシスの測定は、Cell Death Detection ELISA (Roche社)を用いた。STK17B遺伝子の発現量は実施例３記載の方法で測定した。Western解析の方法は細胞をPBSにて洗浄後、RIPA Buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.6)、150 mM NaCl、1% TritonX-100、Protease Inhibitor Cocktail Tablets)を用いて蛋白質を回収した。回収したサンプルに5 x Sample Buffer (125 mM Tris-HCl (pH6.8), 50% glycerol、5% SDS、0.02% Bromophenol Blue)を加えた。100℃で3分間、熱変性させた後、10％アクリルアミドゲル（アトー社）へアプライし、電気泳動した(20 mA, 80分)。ゲルから蛋白質をPVDF膜（アトー社）に転写 (200 mA, 60分)後、室温で60分間、ブロックエース（大日本住友製薬社）を用いてブロッキングを行った。一次抗体は3 μg/mlで抗STK17B抗体（サンタクルーズ社）を用いて室温で60分間反応させ、TBSTで3回、3分ずつ洗浄した。二次抗体はanti goat IgG-HRP (10000倍希釈、サンタクルーズ社)を用いて室温で60分間反応させ、TBSTで3回、3分ずつ洗浄した。その後、化学発光（ECL Plus Western Blotting Detection System、GEヘルスケアバイオサイエンス社）により目的とするバンドを検出した。
siRNAを導入72時間後の細胞にTRAILR1 アゴニスト抗体 (最終濃度6 nMおよび30 nM)を添加し、3時間後にアッセイを行った。この結果、STK17B遺伝子に対するsiRNAを導入した肺癌細胞株H460、大腸癌細胞株HCT116およびSW480はいずれも、90%以上STK17BのRNAおよび蛋白質の減少が確認され、TRAILR1 アゴニスト抗体によるアポトーシスが6 nMにおいてH460では55.9%、HCT116では40.2%、SW480では28.4%抑制され、30 nMにおいては順に44.1%、29.1%、25.9%抑制され、TRAILR1 アゴニスト抗体の感受性が低下していた。以上の結果より、STK17B蛋白質がTRAILR1 アゴニスト抗体感受性およびTRAILシグナルに重要な働きをしていることが分かり、STK17Bの発現を亢進させることにより、TRAIL誘導アポトーシスの感受性を向上させることが示された。
実施例８. ヒト癌細胞株におけるTRAIL感受性の検討
実施例1と同じ方法を用いて、表１に示した細胞株（MDA-MB-175VIIを除く）について、TRAILの感受性を検定した。IC50が1 nM以下のものをTRAIL感受性とした。IC50、抵抗性、感受性、およびTRAIL感受性とTRAILR1 アゴニスト抗体感受性との違いについて表５にまとめた。TRAILR1 アゴニスト抗体の感受性とTRAILの感受性は２７株中２４株で一致した。このように、TRAILR1 アゴニスト抗体とTRAILの感受性は複数の癌種および細胞株において類似していることが分かった。
Figure 2011502108
実施例９(１） TRAIL感受性クライテリアの検証
実施例４(１）記載の感受性予測クライテリアを用いて、実施例７記載の細胞のTRAIL感受性を予測できるか検証を行った。この結果、２７株中２５株の予測が可能であり、この２５株中２１株のTRAIL感受性を正確に予測可能であった (表６)。このように、本感受性予測クライテリアを用いることにより、TRAIL感受性の予測も可能であることが示された。
Figure 2011502108
実施例９（２） TRAIL感受性クライテリアの検証
実施例４（２）記載の感受性予測クライテリアを用いて、実施例７記載の細胞のTRAIL感受性を予測できるか検証を行った。この結果、２７株中２６株の予測が可能であり、この２６株中２２株のTRAIL感受性を正確に予測可能であった (表６’)。このように、本感受性予測クライテリアを用いることにより、TRAIL感受性の予測も可能であることが示された。
Figure 2011502108
実施例９（３） TRAIL感受性クライテリアの検証
実施例４（３）記載の感受性予測クライテリアを用いて、実施例７記載の細胞のTRAIL感受性を予測できるか検証を行った。この結果、２７株中２７株の予測が可能であり、この２７株中２１株のTRAIL感受性を正確に予測可能であった (表６'’)。このように、本感受性予測クライテリアを用いることにより、TRAIL感受性の予測も可能であることが示された。
Figure 2011502108
本発明によれば、迅速かつ簡便なTRAILシグナル活性化薬感受性の診断が可能となる。また、本発明の癌の予防・治療剤は、TRAILシグナル活性化薬感受性癌患者に対して選択的に投与されるので、より有効に癌を予防および／または治療することができる。さらに、本発明のTRAILシグナル活性化薬感受性関連因子の調節薬は、癌患者におけるTRAILシグナル活性化薬感受性を高めることができるので、例えばTRAILシグナル活性化薬と併用することにより、有効に癌を予防および／または治療することができる。
〔配列番号：２３〕
ヒト化抗TRAILR1 scFv抗体
〔配列番号：２４〕
ヒト化抗TRAILR1 scFv抗体
本出願は、日本において出願された特許出願である特願２００７−２６８４３３に基づいており、当該出願の内容は、ここで参照することにより、本出願に完全に包含される。

Claims (24)

  1. TRAILシグナル活性化薬を含有してなる、TRAILシグナル活性化薬感受性患者のための癌の予防または治療剤であって、該患者が、被験者から採取した試料におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現または活性が変動していることを指標として選別される剤。
  2. TRAILシグナル活性化薬感受性患者が、被験者から採取した試料における(i) AIM1の発現または活性が亢進していないこと、並びに(ii) STK17B、LOC93349、CASP8、SP110、NOD27およびRHOBTB3からなる群より選択される２以上の発現または活性が亢進していることを指標として選別される、請求項１記載の剤。
  3. TRAILシグナル活性化薬感受性患者が、被験者から採取した試料におけるAIM1の発現又は活性が低下しており、かつSTK17Bおよび／またはLOC93349および／またはCASP8の発現または活性が亢進していることを指標として選別される、請求項１記載の剤。
  4. TRAILシグナル活性化薬感受性患者が、被験者から採取した試料におけるSTK17Bの発現または活性が亢進していることを指標として選別される、請求項１記載の剤。
  5. TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーがAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8であり、（１）２以上の既知TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞および２以上の既知TRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞におけるAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8の発現量または活性を測定し、
    （２）(i) （１）で測定したTRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞およびTRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞のうち、乳癌または大腸癌細胞におけるAIM1の発現量または活性とTRAILシグナル活性化薬感受性との関係から、癌細胞のTRAILシグナル活性化薬に対する感受性の有無を正しく判定することができる相対発現量または相対活性の値を基準値とし、(ii) （１）で測定したTRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞およびTRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の発現量または活性とTRAILシグナル活性化薬感受性との関係から、癌細胞のTRAILシグナル活性化薬感受性を正しく判定することができる相対発現量または相対活性の値を上方基準値、癌細胞のTRAILシグナル活性化薬非感受性を正しく判定することができる相対発現量または相対活性の値を下方基準値としたとき、
    以下の（ａ）または（ｂ）に該当する被験者をTRAILシグナル活性化薬感受性患者として選別することを特徴とする、請求項１記載の剤。
    （ａ）被験者が乳癌または大腸癌患者の場合には、被験者から採取した試料におけるAIM1の発現量または活性が該基準値未満である、および、被験者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の発現量または活性が該上方基準値以上である場合にプラス１ポイント、下方基準値以上かつ上方基準値未満である場合にゼロポイント、下方基準値未満である場合に、マイナス１ポイントとして、STK17B、LOC93349およびCASP8のポイントの総和が正である；
    （ｂ）被験者が乳癌および大腸癌以外の癌患者の場合には、被験者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の発現量または活性が該上方基準値以上である場合にプラス１ポイント、下方基準値以上かつ上方基準値未満である場合にゼロポイント、下方基準値未満である場合にマイナス１ポイントとして、STK17B、LOC93349およびCASP8のポイントの総和が正である。
  6. TRAILシグナル活性化薬感受性マーカーがAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8であり、
    （１）２以上の既知TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞および２以上の既知TRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞におけるAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8の発現量または活性を測定し、
    （２）(i) （１）で測定したTRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞およびTRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞の中から任意に選択された1つの細胞（基準癌細胞）におけるAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8の発現量または活性を1.0として、他の癌細胞におけるAIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8の相対発現量または相対活性を算出し、
    (ii) （１）で測定した他の細胞におけるAIM1の相対発現量（小数点下２ケタ）または相対活性（小数点下２ケタ）とTRAILシグナル活性化薬感受性の有無との関係を比較し、TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞群における最も大きい相対発現量Aまたは相対活性Aを選択し、ついでTRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞群において当該相対発現量Aまたは相対活性Aよりも大きく、かつ最も近い相対発現量Bまたは相対活性Bを選択し、当該相対発現量Bまたは相対活性Bの小数点下２ケタ目を削除した値を基準値とし、
    (iii) （１）で測定した他の細胞におけるSTK17B, LOC93349, およびCASP8の相対発現量（小数点下２ケタ）または相対活性（小数点下２ケタ）とTRAILシグナル活性化薬感受性の有無との関係を比較し、TRAILシグナル活性化薬感受性癌細胞群における相対発現量または相対活性の中央値の80%値を上方基準値とし、TRAILシグナル活性化薬非感受性癌細胞群における相対発現量または相対活性の中央値の120%値を下方基準値としたとき、
    以下の（ａ）または（ｂ）に該当する被験者をTRAILシグナル活性化薬感受性患者として選別することを特徴とする、請求項５記載の剤。
    （ａ）被験者が乳癌または大腸癌患者の場合には、被験者から採取した試料におけるAIM1の発現量または活性が該基準値未満である、および、被験者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の発現量または活性が該上方基準値以上である場合にプラス１ポイント、下方基準値以上かつ上方基準値未満である場合にゼロポイント、下方基準値未満である場合に、マイナス１ポイントとして、STK17B、LOC93349およびCASP8のポイントの総和が正である；
    （ｂ）被験者が乳癌および大腸癌以外の癌患者の場合には、被験者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349またはCASP8の発現量または活性が該上方基準値以上である場合にプラス１ポイント、下方基準値以上かつ上方基準値未満である場合にゼロポイント、下方基準値未満である場合にマイナス１ポイントとして、STK17B、LOC93349およびCASP8のポイントの総和が正である。
  7. AIM1、STK17B、LOC93349およびCASP8の発現量がそれらをコードするmRNAの発現量であり、相対発現量がCOLO205細胞株における発現量に対する相対値であり、AIM1における基準値が2.2であり、STK17Bにおける上方基準値が1.036、下方基準値が0.514であり、LOC93349における上方基準値が0.666、下方基準値が0.211であり、CASP8における上方基準値が0.833、下方基準値が0.519である、請求項６記載の剤。
  8. 試料が癌細胞、癌組織、血液、血清、血漿または尿である、請求項１記載の剤。
  9. TRAILシグナル活性化薬がTRAIL、TRAILR1アゴニスト化合物またはTRAILR2アゴニスト化合物である、請求項１〜８のいずれかに記載の剤。
  10. 癌患者のTRAILシグナル活性化薬に対する感受性を診断する方法であって、該患者から採取した試料におけるSTK17B、LOC93349およびCASP8の発現または活性を調べることを含む方法。
  11. 乳癌または大腸癌患者のTRAILシグナル活性化薬に対する感受性を診断する方法であって、該患者から採取した試料におけるAIM1の発現または活性をさらに調べることを含む、請求項１０記載の方法。
  12. TRAILシグナル活性化薬がTRAIL、TRAILR1アゴニスト化合物またはTRAILR2アゴニスト化合物である、請求項１０記載の方法。
  13. STK17B、LOC93349およびCASP8の発現または活性を検出し得る試薬を含んでなる、癌患者のTRAILシグナル活性化薬に対する感受性の診断薬。
  14. AIM1の発現または活性を検出し得る試薬をさらに含んでなる、乳癌または大腸癌患者用である、請求項１３記載の診断薬。
  15. AIM1阻害薬を含有してなる癌の予防または治療剤。
  16. AIM1阻害を指標とする、抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  17. STK17B、LOC93349、SP110、NOD27またはRHOBTB3活性化薬を含有してなる癌の予防または治療剤。
  18. STK17B、LOC93349、SP110、NOD27またはRHOBTB3活性化を指標とする、抗癌作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  19. 被験者から採取した試料におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現または活性が変動していることを指標として選別されたTRAILシグナル活性化薬感受性患者に対して、TRAILシグナル活性化薬の有効量を投与することを特徴とする癌の予防または治療方法。
  20. 哺乳動物に対して、AIM1阻害薬の有効量を投与することを特徴とする癌の予防または治療方法。
  21. 哺乳動物に対して、STK17B、LOC93349、SP110、NOD27またはRHOBTB3活性化薬の有効量を投与することを特徴とする癌の予防または治療方法。
  22. TRAILシグナル活性化薬感受性患者のための癌の予防または治療剤を製造するための、TRAILシグナル活性化薬の使用であって、該患者が、被験者から採取した試料におけるTRAILシグナル活性化薬感受性マーカーの発現または活性が変動していることを指標として選別される使用。
  23. 癌の予防または治療剤を製造するためのAIM1阻害薬の使用。
  24. 癌の予防または治療剤を製造するための、STK17B、LOC93349、SP110、NOD27またはRHOBTB3活性化薬の使用。
JP2010528585A 2007-10-15 2008-10-15 癌の予防・治療剤 Withdrawn JP2011502108A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007268433 2007-10-15
PCT/JP2008/069079 WO2009051268A2 (en) 2007-10-15 2008-10-15 Preventive/remedy for cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2011502108A true JP2011502108A (ja) 2011-01-20

Family

ID=40386390

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010528585A Withdrawn JP2011502108A (ja) 2007-10-15 2008-10-15 癌の予防・治療剤

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20100210545A1 (ja)
EP (1) EP2201140A2 (ja)
JP (1) JP2011502108A (ja)
WO (1) WO2009051268A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021501592A (ja) * 2017-11-03 2021-01-21 オックスフォード バイオダイナミックス リミテッド 遺伝子調節

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2828405A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Istituto Di Ricovero E Cura A Carattere Scientifico Materno-Infantile Bu Rlo Garofolo - Ospedale Di Alta Specializzazione E Di Rilievo Nazionale Apoptosis-inducing molecules and uses therefor
US11360077B2 (en) * 2017-03-10 2022-06-14 Cleveland State University Death receptors as markers for rhTRAIL-sensitivity

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004075839A2 (en) * 2003-02-21 2004-09-10 Irm Llc Methods and compositions for modulating apoptosis
WO2006135886A2 (en) * 2005-06-13 2006-12-21 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
ATE540318T1 (de) * 2005-08-16 2012-01-15 Genentech Inc Apoptosesensitivität gegenüber apo2l/trail mittels testen auf galnac-t14-expression in zellen/gewebe

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021501592A (ja) * 2017-11-03 2021-01-21 オックスフォード バイオダイナミックス リミテッド 遺伝子調節
US11840737B2 (en) 2017-11-03 2023-12-12 Oxford BioDynamics PLC Genetic regulation of immunoresponse by chromosome interactions

Also Published As

Publication number Publication date
EP2201140A2 (en) 2010-06-30
WO2009051268A3 (en) 2009-06-25
US20100210545A1 (en) 2010-08-19
WO2009051268A2 (en) 2009-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5076058B2 (ja) 骨・関節疾患感受性遺伝子およびその用途
JP4659736B2 (ja) スクリーニング方法
WO2005100998A2 (en) Membrane markers for use in cancer diagnosis and therapy
AU2009275110A1 (en) Novel oncogene NRF2
EP2050827A2 (en) Differentially Expressed Tumour-specific Polypeptides for use in the Diagnosis and Treatment of Cancer
EP1854473A1 (en) Preventive/therapeutic agent for cancer
JP7175526B2 (ja) 細胞遊走調節に関する疾患の予防・治療剤および肺間質の疾患の疾患活動性判定・予後評価
EP2402033B1 (en) Cell adhesion inhibitor and use thereof
JP2011502108A (ja) 癌の予防・治療剤
WO2009141440A1 (en) Netrin-1 overexpression as a biological marker and a survival factor for aggressive neuroblastoma
EP3516071B1 (en) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of lung cancer
EP2153847A1 (en) Gene sensitive to bone/joint disease and use thereof
WO2010008084A1 (ja) 糖鎖認識受容体の新規用途
JP5288494B2 (ja) 変形性関節症感受性遺伝子
US10865415B2 (en) Prevention, diagnosis and treatment of cancer overexpressing GPR160
WO2016031996A1 (ja) 関節炎の予防·治療剤、検査キット、並びに関節炎予防·治療薬のスクリーニング方法
US20100029561A1 (en) Ameliorating agent for insulin resistance
JPWO2008111520A1 (ja) 寿命延長関連遺伝子およびその用途
KR101927577B1 (ko) 간암 바이오 마커로서 ｈ２ａ．ｚ．１의 용도
US20090105454A1 (en) Prophylactic/therapeutic agent for cancer
US20100086911A1 (en) Preventive/therapeutic agent for cancer
JP2006223167A (ja) 椎間板変性関連疾患感受性遺伝子およびその用途
JP2009268381A (ja) 癌特異的酢酸代謝を標的とした癌バイオマーカー・検査方法・治療剤
CA2496236A1 (en) Preventives/remedies for cancer
JP2010111623A (ja) 糖鎖認識受容体の新規用途

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20120110