JP2011246416A - ヒアルロン酸高分子量化剤および皮膚損傷回復促進剤 - Google Patents

Abstract

【課題】生体への浸透性に優れ、かつ生体中のヒアルロン酸を高分子量化させることができるヒアルロン酸高分子量化剤、および該化合物を含有する皮膚損傷回復促進剤の提供。
【解決手段】式（Ｉ）：

（式中、Ｒ¹〜Ｒ⁵は水素原子、炭素数１〜４のアルキル基等を示す。）で表される繰返し単位を有し、粘度平均分子量が５００〜２００００である化合物を含有するヒアルロン酸高分子量化剤、及び該化合物を含有する皮膚損傷回復促進剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒアルロン酸高分子量化剤および皮膚損傷回復促進剤に関する。さらに詳しくは、損傷皮膚の回復に有用なヒアルロン酸高分子量化剤および皮膚損傷回復促進剤に関する。

ヒトの皮膚の表皮層や真皮層には、細胞外マトリックスの主要成分として、ムコ多糖の一種であるヒアルロン酸などが存在している。かかるヒアルロン酸は、高い保水性を有することから、皮膚中の水分や当該皮膚の弾力性を維持する役割を果たしていると考えられている。

ヒトの皮膚中のヒアルロン酸の含有量の減少は、皮膚の乾燥、皮膚の萎縮、皮膚の弾力性の低下、しわの形成などの皮膚の状態の異常に関与していると考えられている。そこで、前記皮膚の状態の異常を改善するための保湿成分として、前記ヒアルロン酸が配合された皮膚用化粧料などが提案されている（例えば、特許文献１参照）。

前記ヒアルロン酸は、高分子量であるほど、親水性が高くなり、高い保水性を示す。しかしながら、高分子量のヒアルロン酸は、皮膚中に浸透しにくいため、その大部分が皮膚の表面に留まってしまうという欠点がある。また、皮膚の表面に留まったヒアルロン酸は、洗顔、入浴などによって皮膚の表面から洗い流されやすいため、皮膚の保湿効果を持続して得ることが困難であり、皮膚の状態を改善するのに十分な効果が得られないことがある。

一方、例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含有糖ベンジル誘導体を有効成分として含むヒアルロン酸合成促進剤などによってヒアルロン酸合成酵素の活性を上昇させ、ヒアルロン酸の合成量を増やすことが提案されている（例えば、特許文献２参照）。

しかしながら、生体内では、ヒアルロン酸の合成と分解とが繰り返されていることから、前記ヒアルロン酸合成促進剤によってヒアルロン酸合成酵素の活性を上昇させても、当該ヒアルロン酸合成酵素によって合成されたヒアルロン酸がすぐに分解されてしまい、高分子量のヒアルロン酸が得られないことがある。

特開２００２−３６３０８１号公報 特開２００９−１９１０３９号公報

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、生体への浸透性に優れ、かつ生体中のヒアルロン酸を高分子量化させることができるヒアルロン酸高分子量化剤を提供することを目的とする。また、本発明は、損傷皮膚への浸透性に優れ、損傷皮膚を早期に回復させることができる皮膚損傷回復促進剤を提供することを目的とする。

すなわち、本発明の要旨は、
（１）生体中のヒアルロン酸を高分子量化させるヒアルロン酸高分子量化剤であって、式（Ｉ）：

（式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴はそれぞれ独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ⁵は水素原子、アルカリ金属原子または炭素数１〜４のアルキル基を示す）
で表される繰返し単位を有し、粘度平均分子量が５００〜２００００である化合物を含有するヒアルロン酸高分子量化剤、
（２）前記式（Ｉ）において、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵がそれぞれ水素原子である前記（１）に記載のヒアルロン酸高分子量化剤、および
（３）損傷皮膚の回復を促進させるための皮膚損傷回復促進剤であって、前記（１）または（２）に記載のヒアルロン酸高分子量化剤を含有する皮膚損傷回復促進剤
に関する。

本発明のヒアルロン酸高分子量化剤によれば、生体への浸透性に優れ、かつ生体中のヒアルロン酸を高分子量化させることができるという優れた効果が奏される。また、本発明の皮膚損傷回復促進剤によれば、損傷皮膚への浸透性に優れ、損傷皮膚を早期に回復させることができるという優れた効果が奏される。

（ａ）は試験例１において、実施例１で得られた試料を接触させた線維芽細胞によって産生されたヒアルロン酸の泳動距離とピクセル強度との関係を示すグラフ、（ｂ）は試験例１において、比較例１の試料を接触させた線維芽細胞によって産生されたヒアルロン酸の泳動距離とピクセル強度との関係を示すグラフである。 試験例１において、試料の種類と分布曲線の曲線下面積との関係を示すグラフである。 試験例３において、経過日数と経表皮水分蒸散量の回復率との関係を示すグラフである。 （ａ）は試験例５において、実施例７で得られた試料を塗布したモデル損傷皮膚の凍結切片の核染色像の観察結果を示す図面代用写真、（ｂ）は試験例５において、前記モデル損傷皮膚の凍結切片の蛍光染色像の観察結果を示す図面代用写真を示す。 （ａ）は試験例５において、比較例５で得られた試料を塗布したモデル損傷皮膚の凍結切片の核染色像の観察結果を示す図面代用写真、（ｂ）は試験例５において、前記モデル損傷皮膚の凍結切片の蛍光染色像の観察結果を示す図面代用写真を示す。 （ａ）は試験例５において、試料の種類と蛍光標識剤の濃度との関係を示すグラフ、（ｂ）は試験例５において、試料の種類と蛍光標識剤の濃度との関係を示すグラフである。

［ヒアルロン酸高分子量化剤］
本発明のヒアルロン酸高分子量化剤は、前記したように、生体中のヒアルロン酸を高分子量化させるヒアルロン酸高分子量化剤であって、式（Ｉ）：

（式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴はそれぞれ独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ⁵は水素原子、アルカリ金属原子または炭素数１〜４のアルキル基を示す）
で表される繰返し単位を有し、粘度平均分子量が５００〜２００００である化合物（以下、「化合物Ａ」という）を含有することを特徴とする。

本発明者らは、前記化合物Ａを線維芽細胞と接触させたとき、線維芽細胞によって産生され、当該線維芽細胞外に分泌されるヒアルロン酸のうち、低分子量のヒアルロン酸の量が当該化合物Ａを線維芽細胞と接触させていないときと同程度であるにもかかわらず、高分子量のヒアルロン酸の量が多くなることを見出した。また、本発明者らは、かかる化合物Ａを損傷皮膚に塗布すると、前記化合物Ａが損傷皮膚の表面から真皮層に至る範囲にまで浸透し、しかも損傷皮膚の回復を促進することを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。

なお、本明細書において、「高分子量化」とは、生体中のヒアルロン酸のうち、高分子量のヒアルロン酸の量を増大させることをいう。また、本明細書において、「高分子量化剤」とは、生体、例えば、人体に適用したときに、生体中のヒアルロン酸のうち、高分子量のヒアルロン酸の量を増大させる薬剤をいう。本明細書において、「高分子量」とは、粘度平均分子量が３００００００〜５００００００であることをいう。

また、本明細書において、前記化合物Ａの粘度平均分子量は、
（ａ） 前記化合物Ａを含む試料溶液を複数種類調製するステップ、
（ｂ） ウベローデ粘度計を用いて、前記ステップ（ａ）で得られた試料溶液の測定温度３０℃における流下秒数（以下、「流下秒数Ａ」という）と前記試料溶液の溶媒の測定温度３０℃における流下秒数（以下、「流下秒数Ｂ」という）とを測定するステップ、
（ｃ） 前記ステップ（ｂ）で得られた流下秒数Ａの値および流下秒数Ｂの値を用い、式（ＩＩ）：

比粘度＝〔流下秒数Ａ／流下秒数Ｂ〕−１ （ＩＩ）

に基づいて、比粘度を算出するステップ、
（ｄ） 前記ステップ（ｃ）で得られた比粘度と、前記試料溶液中の前記化合物Ａの濃度（ｇ／１００ｍＬ）（以下、「濃度Ｃ」という）とを用い、式（ＩＩＩ）：

還元粘度＝比粘度／濃度Ｃ （ＩＩＩ）

に基づいて、還元粘度を算出するステップ、
（ｅ） 前記ステップ（ｄ）で得られた複数種類の試料溶液それぞれの還元粘度を縦軸とし、複数種類の試料溶液それぞれにおける濃度Ｃを横軸として、検量線を作成するステップ、
（ｆ） 前記ステップ（ｅ）で得られた検量線において、濃度Ｃ＝０を補外することにより、極限粘度を求めるステップ、および
（ｇ） 前記ステップ（ｆ）で得られた極限粘度の値を用い、式（ＩＶ）：

極限粘度＝ｋ×（分子量）^α （ＩＶ）

（式中、ｋおよびαは、それぞれ、前記化合物Ａの種類と試料溶液の溶媒の種類とによって定まる定数である）
に基づいて、分子量を求めるステップ
を行なうことによって求められた値である。このとき、前記化合物Ａが、例えば、式（Ｉ）において、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ^3、Ｒ⁴およびＲ⁵がそれぞれ水素原子である化合物であり、かつ溶媒が水である場合、前記ｋは０．０３６であり、αは０．７８である。

本発明のヒアルロン酸高分子量化剤は、前記化合物Ａを含有している点に１つの大きな特徴がある。

前記化合物Ａは、生体への浸透性に優れており、しかも生体に適用したときに、当該生体中におけるヒアルロン酸のうち、低分子量のヒアルロン酸の量を一定量に保ちつつ、高分子量のヒアルロン酸の量を増大させることができる。したがって、本発明のヒアルロン酸高分子量化剤によれば、生体中に良好に浸透させることができ、しかも生体中のヒアルロン酸を高分子量化させることができるので、損傷皮膚の回復を促進させることができるという優れた効果が奏される。

式（Ｉ）において、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は、それぞれ独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。アルキル基の炭素数は、水溶性を確保する観点から、１以上、好ましくは２以上であり、十分な親水性を確保し、生体への十分な浸透性を確保する観点から、４以下、好ましくは３以下である。炭素数１〜４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基およびブチル基が挙げられる。Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴のなかでは、十分な親水性を確保し、生体への十分な浸透性を確保する観点から、それぞれ水素原子が好ましい。

式（Ｉ）において、Ｒ⁵は水素原子、アルカリ金属原子または炭素数１〜４のアルキル基である。アルカリ金属原子としては、例えば、リチウム原子、ナトリウム原子、カリウム原子などが挙げられる。アルカリ金属原子のなかでは、十分な親水性を確保し、生体への十分な浸透性を確保する観点から、ナトリウム原子が好ましい。炭素数１〜４のアルキル基は、前記Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴における炭素数１〜４のアルキル基と同じである。Ｒ⁵のなかでは、十分な親水性を確保し、生体への十分な浸透性を確保する観点から、水素原子またはナトリウム原子が好ましい。

前記化合物Ａの両末端は、それぞれ水酸基または炭素数１〜４のアルキルオキシ基である。

前記粘度平均分子量は、生体中のヒアルロン酸のうち、高分子量のヒアルロン酸の量を増大させる効果を十分に発揮させる観点から、５００以上、好ましくは１０００以上、より好ましくは３０００以上であり、生体への十分な浸透性を確保する観点から、２００００以下、好ましくは１００００以下、より好ましくは５０００以下である。

前記化合物Ａのなかでは、十分な親水性を確保し、生体への十分な浸透性を確保する観点から、式（Ｉ）において、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵がそれぞれ水素原子である化合物が好ましい。

前記化合物Ａは、単一の分子量を有する化合物であってもよく、互いに異なる分子量を有する化合物の混合物であってもよい。

また、前記化合物Ａのなかでは、生体への十分な浸透性を確保する観点から、式（Ｉ）で表される繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基または炭素数１〜４のアルキルオキシ基であり、かつ粘度平均分子量が１００００以下である化合物（以下、「化合物Ａ１」という）の濃度が４０質量％以上であり、式（Ｉ）で表される繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基または炭素数１〜４のアルキルオキシ基であり、かつ粘度平均分子量が５００００以上である化合物（以下、「化合物Ａ２」という）の濃度が０．５質量％以下である化合物が好ましい。

前記化合物Ａ中における前記化合物Ａ１の濃度は、生体中のヒアルロン酸のうち、高分子量のヒアルロン酸の量を増大させる効果を十分に発揮させる観点から、４０質量％以上、好ましくは７０質量％以上である。前記化合物Ａ１の濃度の上限値は、ヒアルロン酸高分子量化剤の用途などによって異なるので、一概には決定することができない。

前記化合物Ａ中における前記化合物Ａ２の濃度は、浸透性を維持する観点から、０．５質量％以下、好ましくは０．１質量％以下である。前記化合物Ａ２の濃度の下限値は、ヒアルロン酸高分子量化剤の用途などによって異なるので、一概には決定することができない。

本発明のヒアルロン酸高分子量化剤においては、前記化合物Ａを単独で用いてもよく、前記化合物Ａを溶媒に溶解させた溶液として用いてもよい。

溶液である本発明のヒアルロン酸高分子量化剤の場合、本発明のヒアルロン酸高分子量化剤中における前記化合物Ａの含有量は、ヒアルロン酸高分子量化剤の用途、前記化合物Ａの種類、溶媒の種類、当該溶媒に対する化合物Ａの溶解性などによって異なるので、一概には決定することができないため、ヒアルロン酸高分子量化剤の用途、前記化合物Ａの種類、溶媒の種類、当該溶媒に対する化合物Ａの溶解性などに応じて適宜設定することが好ましい。通常、本発明のヒアルロン酸高分子量化剤中における前記化合物Ａの含有量は、生体中のヒアルロン酸のうち、高分子量のヒアルロン酸の量を増大させる効果を十分に発揮させる観点から、１０質量％以上であり、好ましくは２０質量％以上であり、製造の容易性の観点から、３０質量％以下である。

本発明のヒアルロン酸高分子量化剤は、本発明の目的が阻害されない範囲内で、例えば、生体中への前記化合物Ａの浸透をさらに促進させるための助剤、皮膚への塗布しやすさを調整する粘度調整剤などを含有していてもよい。

なお、本発明においては、本発明の目的が阻害されない範囲内であれば、本発明のヒアルロン酸高分子量化剤において、前記助剤などと前記化合物Ａとを反応させ、複合体や化合物を形成させたものを用いてもよい。

本発明のヒアルロン酸高分子量化剤によれば、生体中に良好に浸透させることができ、しかも生体中のヒアルロン酸を高分子量化させることができるので、損傷皮膚の回復を促進させることができる。したがって、本発明のヒアルロン酸高分子量化剤は、ヒアルロン酸の欠乏または減少に起因する生体の状態の異常、例えば、ヒトの皮膚の状態の異常を改善する用途などに有用である。かかる生体の状態の異常としては、例えば、ヒトの皮膚における損傷皮膚、老化に伴う皮膚の乾燥、皮膚の萎縮、皮膚の弾力性の低下、しわの形成、などが挙げられる。

［皮膚損傷回復促進剤］
本発明の皮膚損傷回復促進剤は、損傷皮膚の回復を促進させるための皮膚損傷回復促進剤であって、前記ヒアルロン酸高分子量化剤を含有していることを特徴とする。

本発明の皮膚損傷回復促進剤は、前記ヒアルロン酸高分子量化剤を含有している点に１つの大きな特徴がある。本発明の皮膚損傷回復促進剤は、当該皮膚損傷回復促進剤に含まれている前記ヒアルロン酸高分子量化剤が損傷皮膚によく浸透し、生体中のヒアルロン酸を高分子量化させることで、損傷皮膚を早期に回復させる。したがって、本発明の皮膚損傷回復促進剤によれば、損傷皮膚への浸透性に優れ、損傷皮膚を早期に回復させることができるという優れた効果が奏される。

損傷皮膚としては、例えば、紫外線による肌荒れ、接触皮膚炎、過度の脂質の洗浄による肌荒れなどが挙げられる。

本発明の皮膚損傷回復促進剤中における前記ヒアルロン酸高分子量化剤の含有量は、前記皮膚損傷回復促進剤の用途、前記皮膚損傷回復促進剤に含まれる前記化合物Ａの種類などによって異なるので、一概には決定することができないため、前記皮膚損傷回復促進剤の用途、前記化合物Ａの種類などに応じて適宜設定することが好ましい。例えば、本発明の皮膚損傷回復促進剤中におけるヒアルロン酸高分子量化剤が溶液であるヒアルロン酸高分子量化剤である場合、通常、本発明の皮膚損傷回復促進剤中における前記ヒアルロン酸高分子量化剤の含有量は、本発明の皮膚損傷回復促進剤中における前記化合物Ａの含有量が、損傷皮膚の回復を促進する効果を十分に発揮させる観点から、１０質量％以上、好ましくは２０質量％以上となり、製造の容易性の観点から、３０質量％以下となるように調整されることが望ましい。

本発明の皮膚損傷回復促進剤には、本発明の目的が妨げられない範囲で、例えば、水、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤、粘度調整剤、香料、紫外線吸収剤などの他の成分が配合されていてもよい。

本発明の皮膚損傷回復促進剤の剤形としては、特に限定されないが、例えば、エアゾール剤、液剤、軟膏剤、パップ剤などが挙げられる。

本発明の皮膚損傷回復促進剤によれば、当該皮膚損傷回復促進剤を前記損傷皮膚と接触させることにより、損傷皮膚の回復を促進させることができる。

本発明の皮膚損傷回復促進剤を損傷皮膚と接触させる際の前記皮膚損傷回復促進剤の使用量は、損傷皮膚の種類や範囲、前記皮膚損傷回復促進剤に含まれる前記化合物Ａの種類などによって異なるので、一概には決定することができないため、損傷皮膚の種類や範囲、前記化合物Ａの種類などに応じて適宜設定することが好ましい。通常、前記皮膚損傷回復促進剤の使用量は、損傷皮膚の面積１０ｃｍ²あたりの前記化合物Ａの量が、損傷皮膚の回復を促進させる効果を十分に確保する観点から、１０ｍｇ以上、好ましくは５０ｍｇ以上となり、前記皮膚損傷回復促進剤と損傷皮膚との接触時間を短縮させる観点から、３００ｍｇ以下、好ましくは１０００ｍｇ以下となる程度に調整されることが望ましい。

本発明の皮膚損傷回復促進剤と損傷皮膚との接触は、当該皮膚損傷回復促進剤の剤形などに応じた方法によって行なうことができる。

本発明の皮膚損傷回復促進剤によれば、損傷皮膚に良好に浸透させることができ、しかも生体中のヒアルロン酸を高分子量化させることができるので、損傷皮膚の回復を促進させ、損傷皮膚を早期に回復させることができる。したがって、本発明の皮膚損傷回復促進剤は、前記損傷皮膚を早期に回復させる用途などに有用である。

つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。

（製造例１）
攪拌機およびジャケットを備えた３００Ｌ容量のタンクに、硫酸含有アセトン水溶液〔組成：０．５質量％硫酸、８０質量％アセトン、残部水〕１１０Ｌを入れ、前記硫酸含有アセトン水溶液を攪拌しながら、温度が６０℃になるまで加熱した。

その後、前記硫酸含有アセトン水溶液の温度を６０℃に維持し、撹拌しながら、式（Ｉ）において、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴それぞれが水素原子であり、かつＲ⁵がナトリウム原子である繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基であり、粘度平均分子量が２１０００００である化合物の微粉末〔キユーピー（株）製、純度：９７％〕６ｋｇを前記硫酸含有アセトン水溶液に添加した。

得られた混合物を１５分間攪拌して硫酸含有アセトン水溶液中に前記化合物の微粉末を分散させた。得られた分散液を静置し、上清を除去して、沈殿物を得た。

得られた沈殿物に、６０℃に維持された硫酸含有アセトン水溶液１１０Ｌを添加した。その後、得られた混合物の温度を６０℃に維持しながら、当該混合物を１５分間攪拌した。その後、前記混合物を静置し、上清を除去して、沈殿物を得た。さらに、前記沈殿物を用い、前記と同様の操作を２回繰り返した。

つぎに、得られた沈殿物を、８０質量％アセトン水溶液１１０Ｌで洗浄した。洗浄後の沈殿物を１０００００×ｇ、６０分間遠心分離した。その後、前記沈殿物を室温で６時間真空乾燥させて当該沈殿物中の残存溶媒を除去し、式（Ｉ）において、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵それぞれが水素原子である繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基であり、粘度平均分子量が約９０００である化合物の白色微粉末５．３ｋｇ（収率約８８％）を得た。

（実施例１）
製造例１で得られた化合物を、濃度が１×１０^-4質量％となるように、１０質量％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に溶解させ、試料を得た。

（比較例１）
１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを比較例１の試料として用いた。

（試験例１）
培養面積１５０ｃｍ²のフラスコ上の１０質量％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）５０ｍＬ中において、５×１０^５細胞のヒト胎児皮膚由来線維芽細胞〔細胞名：ＴＩＧ−３Ｓ細胞、ヒューマンサイエンス研究資源バンク供給〕を、５体積％二酸化炭素の雰囲気中に３７℃で２４時間培養した。

得られた細胞培養物中の液体成分を実施例１で得られた試料と交換し、５体積％二酸化炭素の雰囲気中に３７℃で２４時間培養した。

得られた細胞培養物から、線維芽細胞によって産生され、当該線維芽細胞外に分泌されるヒアルロン酸を含む培養上清を得た。その後、前記培養上清を凍結乾燥させた。得られた乾燥物１５μｇをリン酸緩衝化生理的食塩水２００μＬに溶解させ、測定用試料を得た。

得られた測定用試料およびヒアルロン酸のサイズマーカーを、それぞれ、０．７５質量％アガロースゲルのウェルに供し、電圧５０Ｖで２．５時間電気泳動した。なお、電気泳動用緩衝液として、１０倍希釈ＴＡＥバッファー（ｐＨ７．９）を用いた。また、ヒアルロン酸のサイズマーカーとして、分子量が既知である市販のヒアルロン酸を用いた。

電気泳動後のアガロースゲルに、ビオチン標識ヒアルロン酸結合タンパク質〔生化学工業（株）製、商品名：ヒアルロン酸結合性タンパク質−ビオチン〕と西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン〔カルビオケム（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）製、商品名：ストレプトアビジン、ペルオキシダーゼコンジュゲート〕とを接触させた。さらに、前記アガロースゲルに、過酸化水素およびジアミノベンジジンを接触させ、ゲル上のヒアルロン酸を染色した。その後、デンシトメーターを用い、アガロースゲルのウェルからのヒアルロン酸の泳動距離および前記ヒアルロン酸に対応するアガロースゲル上のバンドのピクセル強度を測定した。

つぎに、ヒアルロン酸に対応するバンド毎に、ヒアルロン酸の泳動距離と、ピクセル強度とを、ｘ軸が泳動距離であり、ｙ軸がピクセル強度である２次元座標上にプロットして、ヒアルロン酸の泳動距離の分布曲線を作成した。得られた分布曲線を用い、実施例１で得られた試料を接触させた線維芽細胞によって産生されたヒアルロン酸の泳動距離とピクセル強度との関係を調べた。

また、実施例１で得られた試料の代わりに、比較例１の試料を用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、試料を接触させた線維芽細胞によって産生されたヒアルロン酸の泳動距離とピクセル強度との関係を調べた。

試験例１において、実施例１で得られた試料を接触させた線維芽細胞によって産生されたヒアルロン酸の泳動距離とピクセル強度との関係を示す図１（ａ）に、試験例１において、比較例１の試料を接触させた線維芽細胞によって産生されたヒアルロン酸の泳動距離とピクセル強度との関係を図１（ｂ）に示す。

つぎに、図１（ａ）および（ｂ）それぞれに示されるグラフを用い、泳動距離が１〜２００ピクセル〔ヒアルロン酸の粘度平均分子量：約３００００００（泳動距離２００ピクセル）以上、約４００００００（泳動距離１ピクセル）以下〕の範囲および泳動距離が２００ピクセルを超え、８５０ピクセル以下〔ヒアルロン酸の粘度平均分子量：約１００００００以上（泳動距離８５０ピクセル）、約３００００００（泳動距離２００ピクセル）未満〕の範囲それぞれについて、前記分布曲線と座標軸とにより囲まれる部分の面積（分布曲線の曲線下面積）を算出した。得られた分布曲線の曲線下面積をヒアルロン酸の量の指標として用い、線維芽細胞に接触させた試料の種類と、泳動距離が１〜２００ピクセルのヒアルロン酸の量および泳動距離が２００ピクセルを超え、８５０ピクセル以下のヒアルロン酸の量との関係を調べた。

試験例１において、試料の種類と分布曲線の曲線下面積との関係を図２に示す。図中、白棒は泳動距離が１〜２００ピクセルのヒアルロン酸の量の指標、黒棒は泳動距離が２００ピクセルを超え、８５０ピクセル以下のヒアルロン酸の量の指標を示す。

図２に示された結果から、実施例１で得られた試料を線維芽細胞に接触させたときの泳動距離が１〜２００ピクセルのヒアルロン酸の量に対応する曲線下面積は、比較例１の試料を線維芽細胞に接触させたときの泳動距離が１〜２００ピクセルのヒアルロン酸の量に対応する曲線下面積と比べ、多いことがわかる。一方、実施例１で得られた試料を線維芽細胞に接触させたときの泳動距離が２００ピクセルを超え、８５０ピクセル以下のヒアルロン酸の量に対応する曲線下面積は、比較例１の試料を線維芽細胞に接触させたときの泳動距離が２００ピクセルを超え、８５０ピクセル以下のヒアルロン酸の量に対応する曲線下面積とほぼ同程度であることがわかる。

これらの結果から、実施例１で得られた試料を線維芽細胞に接触させたときに産生されるヒアルロン酸のうち、低分子量のヒアルロン酸の量は、対照試料を線維芽細胞に接触させた場合の低分子量のヒアルロン酸の量と同程度に保たれているにもかかわらず、高分子量のヒアルロン酸の量は、対照試料を線維芽細胞に接触させた場合の高分子量のヒアルロン酸の量よりも多くなっていることがわかる。したがって、実施例１で得られた試料によって生体中のヒアルロン酸を高分子量化させることができることがわかる。

（実施例２）
実施例１において、製造例１で得られた化合物の代わりに、製造例１で得られた化合物と同じ繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基であり、粘度平均分子量が２００００である化合物を用いることを除き、実施例１と同様に操作を行ない、試料を得る。

（実施例３）
実施例１において、製造例１で得られた化合物の代わりに、製造例１で得られた化合物と同じ繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基であり、粘度平均分子量が７５０である化合物を用いることを除き、前記実施例１と同様に操作を行ない、試料を得る。

（試験例２）
試験例１において、実施例１で得られた試料の代わりに、実施例２で得られた試料または実施例３で得られた試料を用いることを除き、試験例１と同様の操作を行ない、線維芽細胞に接触させた試料の種類と、泳動距離が１〜２００ピクセルのヒアルロン酸の量および泳動距離が２００ピクセルを超え、８５０ピクセル以下のヒアルロン酸の量との関係を調べる。

その結果、実施例２で得られた試料または実施例３で得られた試料を用いた場合、実施例１で得られた試料を用いた場合と同様の結果が示される。

なお、実施例１において、製造例１で得られた化合物の代わりに、式（Ｉ）におけるＲ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴のいずれかがメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基であり、Ｒ⁵がナトリウム原子、カリウム原子、メチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基である繰返し単位を有する化合物を用いて得られた試料を用いた場合にも、実施例１で得られた試料を用いた場合と同様の結果が示される。

これらの結果から、式（Ｉ）で表される繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基であり、粘度平均分子量が５００〜２００００である化合物は、線維芽細胞によって産生され、当該線維芽細胞外に分泌されるヒアルロン酸のうち、高分子量のヒアルロン酸の量を増大させることができることがわかる。このことから、前記化合物Ａは、生体中のヒアルロン酸を高分子量化させるヒアルロン酸高分子量化剤として有用であることが示唆される。

（実施例４）
製造例１で得られた化合物を、当該化合物の濃度が１質量％となるように精製水に溶解させ、試料を得た。

（比較例２）
実施例４において、製造例１で得られた化合物の代わりに、式（Ｉ）において、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵それぞれが水素原子である繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基であり、粘度平均分子量が１２０００００である化合物〔（株）資生堂製、商品名：バイオヒアルロン酸ＮＡ１２〕（以下、「化合物Ｂ」という）を用いたことを除き、実施例４と同様に操作を行ない、試料を得た。

（試験例３）
健常な成人男性１３名の被験者を、２２℃、相対湿度５０％の試験室内で２０分間馴化させた。前記被験者の左前腕腕内側部および右前腕腕内側部のそれぞれ１．５ｃｍ×１０ｃｍ四方の部分（以下、「テープストリッピング部位」という）の長手方向両端部より２ｃｍ内側の部分（測定部位）における経表皮水分蒸散量を測定した。得られた経表皮水分蒸散量の値を「ＴＥＷＬ値Ａ」という。

つぎに、前記測定部位における経表皮水分蒸散量の値が２０〜３０ｇ／ｍ²・ｈになるまで、前記テープストリッピング部位へのセロハンテープ〔ニチバン（株）製〕の小片（１．５ｃｍ×１０ｃｍ）の貼付および剥離を繰り返してテープストリッピングを行ない、モデル損傷皮膚を得た。テープストリッピング直後のモデル損傷皮膚の前記測定部位における経表皮水分蒸散量を測定した。得られた経表皮水分蒸散量の値を「ＴＥＷＬ値Ｂ」という。

つぎに、前記テープストリッピング部位に、実施例４で得られた試料１００μＬを１日あたり２回３日間塗布した。最初の塗布から１日間または３日間経過後に、前記測定部位における経表皮水分蒸散量を測定した。最初の塗布から１日間または３日間経過後の前記測定部位における経表皮水分蒸散量の値を「ＴＥＷＬ値Ｃ」という。

つぎに、ＴＥＷＬ値Ａを１００％、ＴＥＷＬ値Ｂを０％として、モデル損傷皮膚形成時から測定時までの間の経表皮水分蒸散量の回復率を、式（Ｖ）：

（ＴＥＷＬ値Ａ−ＴＥＷＬ値Ｃ）／（ＴＥＷＬ値Ａ―ＴＥＷＬ値Ｂ）×１００ （Ｖ）

に基づいて算出した。

また、実施例４で得られた試料の代わりに、比較例２で得られた試料または精製水（比較例３）を用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、経表皮水分蒸散量の回復率を算出した。

試験例３において、経過日数と経表皮水分蒸散量の回復率との関係を図３に示す。図３中、黒丸は実施例４で得られた試料を用いたときの経表皮水分蒸散量の回復率、黒三角は比較例２で得られた試料を用いたときの経表皮水分蒸散量の回復率、黒四角は比較例３の試料（精製水）を用いたときの経表皮水分蒸散量の回復率を示す。

図３に示された結果から、モデル損傷皮膚形成から１日間および３日間経過後のいずれにおいても、実施例４で得られた試料をモデル損傷皮膚に塗布したときの経表皮水分蒸散量の回復率は、比較例２で得られた試料または比較例３の試料（精製水）をモデル損傷皮膚に塗布したときの経表皮水分蒸散量の回復率と比べて多くなっていることがわかる。このことから、実施例４で得られた試料によれば、損傷皮膚の回復を促進させることができることがわかる。

（実施例５）
実施例４において、製造例１で得られた化合物の代わりに、製造例１で得られた化合物と同じ繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基であり、粘度平均分子量が２００００である化合物を用いることを除き、実施例４と同様に操作を行ない、試料を得る。

（実施例６）
実施例４において、製造例１で得られた化合物の代わりに、製造例１で得られた化合物と同じ繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基であり、粘度平均分子量が５００である化合物を用いることを除き、実施例４と同様に操作を行ない、試料を得る。

（比較例４）
実施例４において、製造例１で得られた化合物の代わりに、化合物Ｂと同じ繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基であり、粘度平均分子量が５００００である化合物を用いたことを除き、実施例４と同様に操作を行ない、試料を得る。

（試験例４）
試験例３において、実施例４で得られた試料の代わりに、実施例５で得られた試料、実施例６で得られた試料または比較例４で得られた試料を用いることを除き、試験例３と同様に操作を行ない、経表皮水分蒸散量の回復率を算出する。

その結果、実施例５で得られた試料または実施例６で得られた試料を用いた場合、実施例４で得られた試料を用いた場合と同様の結果が示される。

なお、実施例４において、製造例１で得られた化合物の代わりに、式（Ｉ）におけるＲ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴のいずれかがメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基であり、Ｒ⁵がナトリウム原子、カリウム原子、メチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基である繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基、メチルオキシ基、エチルオキシ基、プロピルオキシ基またはブチルオキシ基である化合物を用いて得られた試料を用いた場合にも、実施例４で得られた試料を用いた場合と同様の結果が示される。

一方、比較例４で得られた試料を用いた場合、比較例２で得られた試料を用いた場合と同様の結果が示される。

以上の結果から、式（Ｉ）で表される繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基または炭素数１〜４のアルキルオキシ基であり、粘度平均分子量が５００〜２００００である化合物は、損傷皮膚の回復を促進させることができることがわかる。

（実施例７）
蛍光標識剤〔１，２，３，４−テトラヒドロ−６，７−ジメトキシ−１−メチル−２−オキソキノキサリン−３−プロピオン酸ヒドラジド（以下、「ＤＭＥＱ−ヒドラジド」という）〕を用い、得られた化合物を標識した。蛍光標識された化合物を、濃度が１質量％となるように、１０体積％エタノール水溶液に溶解させ、試料を得た。

（比較例５）
実施例７において、製造例１で得られた化合物の代わりに、前記化合物Ｂを用いたことを除き、実施例７と同様の操作を行ない、試料を得た。

（試験例５）
（１）モデル損傷皮膚の作製
予め皮下脂肪を除去したユカタンミニブタ全層皮膚モデル〔日本チャールズ・リバー（株）社製、約１０ｃｍ四方〕を直径２４ｍｍの円形にくりぬき、フランツ型拡散セル〔レセプター相１２ｍＬ〕に装着させた。セルの有効塗布部分である直径１５ｍｍの円形のエリアをテープストリッピング部位として用い、前記テープストリッピング部位に対して十分に大きいセロハンテープ〔ニチバン（株）製〕の小片（約１７ｃｍ×約３０ｍｍ）の貼付および剥離を行なった。ＴＥＷＬの値が２０〜３０ｇ／ｍ²・ｈになるまで、前記全層皮膚モデルの表面へのセロハンテープの貼付および剥離を繰り返して、モデル損傷皮膚を形成させた。その後、前記テープストリッピング部位におけるＴＥＷＬの値が定常状態になるまで、前記モデル損傷皮膚を約１時間放置した。

（２）皮膚透過性試験（用量有限試験）
前記（１）で得られたモデル損傷皮膚のテープストリッピング部位に、実施例７で得られた試料１０μｇを１時間ごとに４回塗布した。つぎに、精製水でモデル損傷皮膚を洗浄し、キムワイプで清拭した。その後、モデル損傷皮膚の表面の残存物を除去した。残存物除去後のモデル損傷皮膚から凍結切片を作製した。得られた凍結切片の蛍光染色像を蛍光顕微鏡で観察した。さらに、前記凍結切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。得られた核染色像を光学顕微鏡で観察した。

また、実施例７で得られた試料１０μｇの代わりに、比較例５で得られた試料１０μｇを用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、凍結切片の蛍光染色像および核染色像を観察した。

試験例５において、実施例７で得られた試料を塗布したモデル損傷皮膚の凍結切片の核染色像の光学顕微鏡による観察結果を示す図面代用写真を図４（ａ）に、試験例５において、前記モデル損傷皮膚の凍結切片の蛍光染色像の蛍光顕微鏡による観察結果を示す図面代用写真を図４（ｂ）に示す。図中、スケールバーは、１００μｍを示す。また、試験例５において、比較例５で得られた試料を塗布したモデル損傷皮膚の凍結切片の核染色像の光学顕微鏡による観察結果を示す図面代用写真を図５（ａ）に、試験例６において、前記モデル損傷皮膚の凍結切片の蛍光染色像の蛍光顕微鏡による観察結果を示す図面代用写真を図５（ｂ）に示す。図中、スケールバーは、１００μｍを示す。

図４（ａ）および（ｂ）に示された結果から、実施例７で得られた試料中の蛍光標識された化合物に含まれる蛍光標識剤に基づく蛍光は、角層および角層直下の部位に検出され、局所的に、表皮深層に検出されることがわかる。この結果から、実施例７で得られた試料に含まれる製造例１で得られた化合物は、皮膚の表面から表皮深層まで浸透することがわかる。これに対して、図５（ａ）および（ｂ）に示された結果から、比較例５で得られた試料中の蛍光標識された化合物に含まれる蛍光標識剤に基づく蛍光は、皮膚の外において検出されるが、皮膚中では検出されないことがわかる。この結果から、比較例５で得られた試料に含まれる化合物は、皮膚中に浸透しないことがわかる。

（３）皮膚透過性試験（用量無限試験）
前記（１）で得られたモデル損傷皮膚と実施例７で得られた試料０．５ｍＬとを、３２℃で２４時間接触させた。

その後、前記モデル損傷皮膚から表皮層を摘出し、精製水５ｍＬ中で破砕し、抽出物を得た。得られた抽出物を、蛍光分光光度計〔（株）日立ハイテクノロジーズ製、商品名：Ｆ−７０００〕に供して、実施例７で得られた試料または比較例５で得られた試料中の蛍光標識された化合物に含まれる蛍光標識剤に基づく蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度の値と、予め作成した検量線とを用い、表皮層中における蛍光標識剤の濃度を算出した。前記と同様の操作を行ない、さらに４種類のモデル損傷皮膚の表皮層それぞれにおける蛍光標識剤の濃度を算出した。

また、前記モデル損傷皮膚から表皮層を摘出する代わりに、真皮層を摘出したことを除き、前記と同様の操作を行ない、５種類のモデル損傷皮膚の真皮層中における蛍光標識剤の濃度それぞれを算出した。

試験例５において、試料の種類と、蛍光標識剤の濃度との関係を図６（ａ）に、試験例５において、試料の種類と、蛍光標識剤の濃度との関係を図６（ｂ）に示す。図６（ａ）中、試料番号１〜５は、いずれもモデル損傷皮膚の表皮層である。また、図６（ｂ）中、試料番号１〜５は、いずれもモデル損傷皮膚の真皮層である。

図６（ａ）に示された結果から、表皮層中における蛍光標識剤の濃度は、約５０〜１００μｇ／ｃｍ³であることがわかる。また、図６（ｂ）に示された結果から、真皮層中における蛍光標識剤の濃度は、約０．０３〜０．０７μｇ／ｃｍ³であることがわかる。したがって、これらの結果から、実施例７で得られた試料中に含まれる製造例１で得られた化合物は、皮膚の表面から真皮層まで浸透することがわかる。

なお、実施例７で得られた試料の代わりに、比較例５で得られた試料を用いた場合、表皮層および真皮層への比較例５で得られた試料中に含まれる化合物の浸透はみられなかった。

（実施例８）
実施例７において、製造例１で得られた化合物の代わりに、製造例１で得られた化合物と同じ繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基であり、粘度平均分子量が２００００である化合物を用いることを除き、実施例７と同様に操作を行ない、試料を得る。

（実施例９）
実施例７において、製造例１で得られた化合物の代わりに、製造例１で得られた化合物と同じ繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基であり、粘度平均分子量が５００である化合物を用いることを除き、実施例７と同様に操作を行ない、試料を得る。

（比較例６）
実施例７において、製造例１で得られた化合物の代わりに、前記化合物Ｂと同じ繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基であり、粘度平均分子量が５００００である化合物を用いたことを除き、実施例７と同様に操作を行ない、試料を得る。

（試験例６）
（１）皮膚透過性試験（用量有限試験）
試験例５（２）において、実施例７で得られた試料の代わりに、実施例８で得られた試料、実施例９で得られた試料または比較例６で得られた試料を用いることを除き、試験例５（２）と同様に操作を行ない、凍結切片の蛍光染色像および核染色像を観察する。

その結果、実施例８で得られた試料および実施例９で得られた試料を用いた場合、実施例７で得られた試料を用いた場合と同様の結果が示される。

なお、実施例７において、製造例１で得られた化合物の代わりに、式（Ｉ）におけるＲ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴のいずれかがメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基であり、Ｒ⁵がナトリウム原子、カリウム原子、メチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基である繰返し単位を有する化合物を用いて得られた試料を用いた場合にも、実施例７で得られた試料を用いた場合と同様の結果が示される。

一方、比較例６で得られた試料を用いた場合、比較例５で得られた試料を用いた場合と同様の結果が示される。

（２）皮膚透過性試験（用量無限試験）
試験例５（３）において、実施例７で得られた試料の代わりに、実施例８で得られた試料、実施例９で得られた試料または比較例６で得られた試料を用いることを除き、試験例５（３）と同様に操作を行ない、モデル損傷皮膚の表皮層中における蛍光標識剤の濃度およびモデル損傷皮膚の真皮層中における蛍光標識剤の濃度それぞれを算出する。

その結果、実施例８で得られた試料および実施例９で得られた試料を用いた場合、実施例７で得られた試料を用いた場合と同様の結果が示される。

なお、実施例７において、製造例１で得られた化合物の代わりに、式（Ｉ）におけるＲ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴のいずれかがメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基であり、Ｒ⁵がナトリウム原子、カリウム原子、メチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基である繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基、メチルオキシ基、エチルオキシ基、プロピルオキシ基またはブチルオキシ基である化合物を用いて得られた試料を用いた場合にも、実施例７で得られた試料を用いた場合と同様の結果が示される。

一方、比較例６で得られた試料を用いた場合、比較例５で得られた試料を用いた場合と同様の結果が示される。

以上の結果から、式（Ｉ）で表される繰返し単位を有し、両末端がそれぞれ水酸基または炭素数１〜４のアルキルオキシ基であり、粘度平均分子量が５００〜２００００である化合物は、皮膚中に良好に浸透して、皮膚中におけるヒアルロン酸を高分子量化させることができ、損傷皮膚の回復を促進することが示唆される。したがって、前記化合物Ａは、皮膚中に良好に浸透し、かつ損傷皮膚の回復を促進することから、皮膚損傷回復促進剤として有用であることがわかる。

Claims (3)

1. 生体中のヒアルロン酸を高分子量化させるヒアルロン酸高分子量化剤であって、式（Ｉ）：
   （式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴はそれぞれ独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ⁵は水素原子、アルカリ金属原子または炭素数１〜４のアルキル基を示す）
   で表される繰返し単位を有し、粘度平均分子量が５００〜２００００である化合物を含有してなるヒアルロン酸高分子量化剤。
2. 前記式（Ｉ）において、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵がそれぞれ水素原子である請求項１に記載のヒアルロン酸高分子量化剤。
3. 損傷皮膚の回復を促進させるための皮膚損傷回復促進剤であって、請求項１または２に記載のヒアルロン酸高分子量化剤を含有してなる皮膚損傷回復促進剤。