JP2011234740A - 細胞外マトリックス成分に結合する修飾タンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】治療遺伝子を損傷、疾患、または移植された血管へターゲティング運搬すること。
【解決手段】壁を有するプロテオリポソームであって、該プロテオリポソームの壁が細胞外マトリックス成分に結合する結合領域を含有するターゲティングポリペプチドを有する、プロテオリポソーム；およびベクター粒子を細胞外マトリックス成分へターゲティングさせる為の修飾ウイルス表面蛋白質を有するベクター粒子であって、該ウイルス表面蛋白質は細胞外マトリックス成分に結合する結合領域を含有するターゲティングポリペプチドを含むように修飾されている、ベクター粒子。
【選択図】なし

Description

Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１，ｐｇｓ５−１４（１９９０） Ｌｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｃｋｒｉｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．４６７−４８５ Ｎａｂｅｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．９１，ｐｇｓ５４１−５４８

本発明により、さらに、以下が提供される。

本発明を以下の図面に関して記載する。
図１Ａは、同種指向性ｇｐ７０蛋白質（配列番号１）の受容体結合領域の模式図であり、アミノ酸残基１８及び１９の間へのコラーゲン結合ドメインを含むポリペプチドの挿入が示されている。 図１Ｂは、リンカーアミノ酸残基が結合したコラーゲン結合ポリペプチドを、同種指向性ｇｐ７０蛋白質のＮ末端領域内のＢｓｔＥＩＩユニーク部位に挿入する為のクローニング戦略及びエンベロープ構造の模式図である。 図２Ａは、表面（ＳＵ）及び膜貫通（ＴＭ）ポリペプチド、並びにシグナルペプチド、追加のコラーゲン結合ドメイン、膜スパニング及びＲペプチド領域が特定されているモロニーマウス白血病ウイルスのエンベロープ蛋白質を示す模式図である。 図２Ｂは、コラーゲン結合ドメインを含むキメラエンベロープ蛋白質の発現、精製、及び再生(renaturation)を表すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 図２Ｃは、コラーゲン被覆マイクロタイターウェルにおける再生した組換えキメラエンベロープ蛋白質の結合を示す。 図３Ａは、ｇｐ７０エンベロープ蛋白質に対して陽性染色を示さない偽(mock)トランスフェクションされた（コントロール）ＧＰＬ細胞を示す。 図３Ｂは、ＣＥＥ＋でトランスフェクションされた、野生型ｇｐ７０を発現するＧＰＬ細胞を示す。 図３Ｃは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋プラスミドＤＮＡでトランスフェクションされたＧＰＬ細胞を示す。 図３Ｄは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋エンベロープ蛋白質と、野生型ＣＥＥ＋エンベロープ蛋白質との共移動(co-migration)、及び３０ｋｄａ領域におけるｇａｇ蛋白質の共移動を示すウエスタンブロットである。 図３Ｅは、マイクロタイターウエル中のコラーゲンマトリックスに対するキメラウイルスの選択的結合を示す。 図４Ａは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋エンベロープ蛋白質を保有するウイルスで形質導入された培養物におけるβ−ガラクトシダーゼに対する陽性染色を示す細胞培養プレート、及び野生型ＣＥＥ＋で形質導入された培養物及び形質導入されなかった培養物における陰性染色を示す細胞培養プレートである。 図４Ｂは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋エンベロープを保有するコラーゲン結合ベクターによる形質導入後にβ−ガラクトシダーゼを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の高倍率での写真である。 図４Ｃは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋蛋白質を保有するウイルスの正常ヒト血清存在下での形質導入効率を示すグラフである。 図５Ａは、カテーテルで傷つけられたマウス大動脈の未処置セグメントを示す。 図５Ｂは、図５Ａに示したカテーテルで傷つけられたマウス大動脈のセグメント部分を高倍率で示したものである。 図５Ｃは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋エンベロープ蛋白質のマウス大動脈の傷つけられたセグメントに対する結合を示したものである。 図５Ｄは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋エンベロープ蛋白質がマウス大動脈の傷つけられていないセグメントに対しては結合しないことを示したものである。 図５Ｅは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋エンベロープ蛋白質の下大静脈の傷つけられたセグメントに対する結合を示したものである。 図５Ｆは、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋ウイルスによる軟骨細胞へのインビボ形質導入を、新生マウス尾内へのベクター上清の注射後の核標的β−ガラクトシダーゼの発現によって示したものである。 図６Ａはバルーンカテーテルによる損傷の９日後で、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋ベクター上清（力価：８×１０^５cfu/ml）点滴２日後の、ラットの左総頚動脈（縦方向に切開）のセグメントの全体像を示す。括弧でくくられた領域が血管損傷及びインビボ形質導入の実際の部位を示す。括弧でくくられた領域の右側の動脈セグメントは傷を受けていないが、同じベクターに暴露された。右頚動脈の短いセグメントが、未損傷、未処置コントロールとして右下に示されている。 図６Ｂは、Ｘ−ガル染色した後にホルマリン固定したラットの損傷総頚動脈の縦方向断面を低倍率（１０×）で示したものである。ブルー染色核を有する多くの細胞（矢印）が中膜の長さに沿って見られる。 図６Ｃは、核標的β−ガラクトシダーゼ導入遺伝子を発現する平滑筋細胞を示す動脈壁セグメント（図６Ｂにおける括弧でくくられた領域）を高倍率で示す（矢印が顕著なブルー核を有する細胞を示している）。 図７は、レトロウイルスベクターＣＥＥ＋、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋、ＣＡＥ、ＥＣＢ−ＣＥＥ．ＣＡＥに感染、又は偽感染（コントロール）した２９３Ｔ細胞の細胞溶解物のウエスタンブロットである。 図８は、レトロウイルスベクターＣＥＥ＋、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋、ＣＡＥ、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋．ＣＡＥに感染、又は偽感染（コントロール）した２９３Ｔ細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）による結果を示す。 図８は、レトロウイルスベクターＣＥＥ＋、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋、ＣＡＥ、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋．ＣＡＥに感染、又は偽感染（コントロール）した２９３Ｔ細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）による結果を示す。 図９は、レトロウイルスベクターＣＥＥ＋、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋、ＣＡＥ、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋ＣＡＥに感染、又は偽感染（コントロール）した２９３Ｔ細胞及びＣＨ０１０細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）による結果を示す。 図９は、レトロウイルスベクターＣＥＥ＋、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋、ＣＡＥ、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋ＣＡＥに感染、又は偽感染（コントロール）した２９３Ｔ細胞及びＣＨ０１０細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）による結果を示す。 図９は、レトロウイルスベクターＣＥＥ＋、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋、ＣＡＥ、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋ＣＡＥに感染、又は偽感染（コントロール）した２９３Ｔ細胞及びＣＨ０１０細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）による結果を示す。 図１０は、ＣＡＥ及びＥＣＢ−ＣＥＥ＋．ＣＡＥベクターのコラーゲン結合アフィニティに関するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。 図１１は、レトロウイルスベクターＣＡＥ又はレトロウイルスベクターＥＣＢ−ＣＥＥ＋．ＣＡＥで処理したマウスの左総頚動脈の断面を示す。 図１１は、レトロウイルスベクターＣＡＥ又はレトロウイルスベクターＥＣＢ−ＣＥＥ＋．ＣＡＥで処理したマウスの左総頚動脈の断面を示す。 図１２は、ＣＡＥ又はＥＣＢ−ＣＥＥ＋．ＣＡＥで処理した損傷ヒト伏在静脈断面を示す。 図１２は、ＣＡＥ又はＥＣＢ−ＣＥＥ＋．ＣＡＥで処理した損傷ヒト伏在静脈断面を示す。 図１３Ａ及びＢは、キメラエンベロープ蛋白質ＳＵ−ＥＣＢ−ＣＥＥ＋又は緩衝液（コントロール）で処理したヒトのアテローム性動脈硬化症プラークを示す。 図１３Ａ及びＢは、キメラエンベロープ蛋白質ＳＵ−ＥＣＢ−ＣＥＥ＋又は緩衝液（コントロール）で処理したヒトのアテローム性動脈硬化症プラークを示す。

Claims (1)

1. 明細書中に記載の発明。