JP2011225472A

JP2011225472A - がん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進剤

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Publication number: JP2011225472A
Application number: JP2010095318A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Matsui; 裕史松井; Kazuhiro Hiyama; 和寛檜山
Original assignee: University of Tsukuba NUC
Current assignee: University of Tsukuba NUC
Priority date: 2010-04-16
Filing date: 2010-04-16
Publication date: 2011-11-10

Abstract

【課題】がん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進剤を提供すること。
【解決手段】本発明のがん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進剤は、エリスロポエチンを有効成分としてなることを特徴とするものである。本発明によれば、がんに対する効果的なＰＤＴやＰＤＤを行うことが可能となる他、副作用のない治療効果に優れた化学療法が可能となる。
【選択図】図１

Description

本発明は、がん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進剤に関する。

ポルフィリンががん細胞に特異的に取り込まれる現象が２０世紀初頭に報告されて以来、ポルフィリンを光増感剤として利用したがんに対する光線力学的療法（ＰＤＴ）は一定の成果をあげてきたが、ポルフィリンはそれ自体が蛍光性を有するため、副作用として光毒性が発現する問題がある。そこで近年では、ヘム合成系におけるポルフィリンの前駆体である５−アミノレブリン酸がポルフィリンにかわる光増感剤として利用されている。化学式：ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_２−ＣＯ−ＣＨ_２−ＮＨ_２で表される５−アミノレブリン酸は、δ−アミノレブリン酸とも呼ばれ、がん細胞においてポルフィリンに変換されてその蓄積を生ぜしめ、蛍光を発する（例えば非特許文献１を参照）。５−アミノレブリン酸はポルフィリンと異なってそれ自体が蛍光性を有さないため、副作用としての光毒性の問題がない。従って、５−アミノレブリン酸は、がんに対するＰＤＴに加え、光線力学的診断法（ＰＤＤ）においても光増感剤として利用されている。しかしながら、５−アミノレブリン酸を光増感剤として利用したＰＤＴやＰＤＤががんに対する万能の治療法や診断法であるわけではない。その効果には改善の余地があり、例えば、がん細胞において５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換をいかに促進し、がん細胞におけるポルフィリン量をいかに増加させるかといった技術課題が存在する。

Ｄｉｖａｒｉｓ，ＤＸ，Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｊ．Ｃ．ｅｔａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１３６，８９１−８９７，１９９０

そこで本発明は、がん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進剤を提供することを目的とする。

本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、赤芽球系前駆細胞から赤血球への分化を促す造血ホルモンであるエリスロポエチンが、がん細胞において５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換を促進し、がん細胞におけるポルフィリン量を増加させる作用を有することを知見した。

上記の知見に基づいてなされた本発明のがん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進剤は、請求項１記載の通り、エリスロポエチンを有効成分としてなることを特徴とする。
また、請求項２記載のがん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進剤は、請求項１記載のがん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進剤において、５−アミノレブリン酸を投与する前に投与されることを特徴とする。

本発明によれば、がん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進剤を提供することができる。

実施例１におけるエリスロポエチンのがん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進作用を示すグラフである。参考例１におけるドキソルビシンの正常細胞とがん細胞に対する細胞毒性に対して５−アミノレブリン酸が及ぼす作用を示すグラフである。

本発明のがん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進剤は、エリスロポエチンを有効成分としてなることを特徴とするものである。本発明によれば、がんに対するＰＤＴやＰＤＤを行うための５−アミノレブリン酸を投与する前にエリスロポエチンを投与しておくことで、がん細胞において投与された５−アミノレブリン酸が早期にポルフィリンに変換され、がん細胞におけるポルフィリン量が増加するので、がんに対する効果的なＰＤＴやＰＤＤを行うことが可能となる。また、本発明者らは、５−アミノレブリン酸が、抗癌剤のがん細胞に対する細胞毒性を増強する一方で、正常細胞に対してはこのような作用を示さず、がん細胞に対して選択的に機能する抗癌剤の効果増強剤の有効成分となることを見出している。従って、本発明によれば、副作用のない治療効果に優れた化学療法を行うことも可能となる。

本発明において用いるエリスロポエチンは、１６５個のアミノ酸から構成され、主に腎臓で産生、分泌される糖蛋白質であって、赤芽球系前駆細胞から赤血球への分化を促す造血ホルモンであるが、当業者にエリスロポエチンとして認識されうるものであれば、既知のアミノ酸配列を持つヒト由来の天然体に限らず、その遺伝子工学的手法による産生体であってもよい。また、天然体のアミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸が置換・欠失・付加・挿入され、かつ、天然体が本来有する生物活性を保持乃至増強させた誘導体であってもよい。

本発明においてエリスロポエチンによってポルフィリンへの変換が促進される、ＰＤＴやＰＤＤにおいて利用される５−アミノレブリン酸は、自体公知の化学合成法によって製造されたものであってもよいし発酵法によって製造されたものであってもよい。５−アミノレブリン酸はエステルの形態で投与されてもよいし、塩の形態で投与されてもよい。５−アミノレブリン酸のエステルとしては、例えば、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｎ−ヘキシルエステルなどの炭素数が１〜６のアルキルエステルが挙げられる。５−アミノレブリン酸の塩としては、例えば、塩酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩などの酸付加塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などの金属塩が挙げられる。

エリスロポエチンは、例えば、ＰＤＴやＰＤＤを行う患者に対し、５−アミノレブリン酸投与の前日〜半日前に投与すればよい。エリスロポエチンの投与経路は特段制限されるものではなく、自体公知の静脈内投与や皮下投与の他、筋肉内投与などであってよい。また、その製剤形態は自体公知のアンプル製剤やシリンジ製剤であってよい。投与量は、患者の性別、年齢、体重、症状の程度などに応じて適宜決定されるべきものであるが、例えば成人では１日あたり５００〜１０００００ｕｎｉｔを１日１回〜少なくとも２週間に１回投与すればよい。

なお、前述したように、本発明者らは、５−アミノレブリン酸ががん細胞に対して選択的に機能する抗癌剤の効果増強剤の有効成分となることを見出している。５−アミノレブリン酸が抗癌剤のがん細胞に対する細胞毒性を選択的に増強する理由の全容は現段階においては必ずしも明らかではない。しかしながら、がん細胞が抗癌剤耐性を獲得する機序の一つとして、がん細胞におけるＡＢＣトランスポーターファミリーの一つであるＡＢＣＧ２の発現の亢進と、ＡＢＣＧ２を介した抗癌剤の排出が知られており（例えば、ＤｏｙｌｅＬＡｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，９５，１５６６５−７０，１９９９などを参照）、また、がん細胞においては５−アミノレブリン酸から生成したポルフィリンはＡＢＣＧ２を介して排出されることが知られている（例えば、田村藍ら，日薬理誌（ＦｏｌｉａＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．），１３０，２７０−２７４，２００７などを参照）ことからすれば、５−アミノレブリン酸が抗癌剤のがん細胞に対する細胞毒性を選択的に増強する理由としては、がん細胞における抗癌剤のＡＢＣＧ２を介した排出と５−アミノレブリン酸に由来するポルフィリンのＡＢＣＧ２を介した排出が競合することによってがん細胞からの抗癌剤の排出が阻害される結果、抗癌剤の濃度ががん細胞においてのみ高濃度に維持されることが推測される（正常細胞においては５−アミノレブリン酸に由来するポルフィリンは最終的にヘムとなりＡＢＣＧ２以外のトランスポーターを介して排出されるのでＡＢＣＧ２を介した抗癌剤の排出は阻害されない）。従って、５−アミノレブリン酸と併用することによってがん細胞に対する細胞毒性が増強される抗癌剤としては、例えば、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、ドキシフルリジン、テガフール、シタラビン、ゲムシタビンに例示される代謝拮抗剤、シクロホスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、ニムスチンに例示されるアルキル化剤、マイトマイシン、ドキソルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、ペプロマイシンに例示される抗癌性抗生物質、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンに例示される微小管作用薬、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチンに例示される白金製剤、イリノテカン、ノギテカンに例示されるトポイソメラーゼ阻害剤、エトポシドに例示されるアルカロイド系抗癌剤、ゲフィチニブ、トラスツズマブに例示される分子標的薬などが挙げられるが、中でも、ドキソルビシン、イリノテカン、ゲフィチニブ、トラスツズマブ、シスプラチン、メトトレキサートなどのＡＢＣＧ２を介して排出されることが知られている抗癌剤（例えば、ＲｏｓｓＤＤｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５９６，２５１−９０，２０１０などを参照）が適している。なお、治療対象となるがんは特段制限されるものではなく、化学療法の対象となるがんであればどのようながんであってもよいが、具体的には、頭頚部癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌などの固形癌や、悪性リンパ腫、白血病などの血液癌が挙げられる。

５−アミノレブリン酸は、例えば、標準化学療法を行う患者に対し、化学療法開始の前日〜半日前から投与を開始し、化学療法期間中は投与を継続し、化学療法を終了する時点で投与を中止する（５−アミノレブリン酸は６時間ほどでがん細胞に特異的にポルフィリンの蓄積を生ぜしめる）。この場合、エリスロポエチンは、例えば、５−アミノレブリン酸投与の前日〜半日前に投与すればよい。エリスロポエチンの投与経路や製剤形態や投与量は前述のとおりであってよい。５−アミノレブリン酸の投与経路は特段制限されるものではなく、経口投与であってもよいし非経口投与であってもよく、その製剤形態は投与経路に応じた公知の形態でよい。例えば５−アミノレブリン酸塩酸塩は水に易溶の白色粉末であるので、そのまま粉末製剤として服用することもできるし、蒸留水や生理食塩水に溶解して液状製剤として飲用したり注射剤として静脈内投与したりすることもできる。投与量は、患者の性別、年齢、体重、症状の程度などに応じて適宜決定されるべきものであるが、例えば成人では１日あたり０．０１〜１０００ｍｇを１〜数回で投与すればよい。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。

実施例１：エリスロポエチンのがん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進作用
ラット癌様変異細胞であるＲＧＫ１細胞（ＷＯ２００７／０１８１８２）とヒト胃癌細胞であるＭＫＮ４５細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換に対してエリスロポエチンがどのような作用を及ぼすか、以下の方法で調べた。
１０％ＦＢＳを混和したＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁したそれぞれの細胞を９６ウェルプレートに２×１０^４個播種し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で１晩培養した後、１０ｕｎｉｔ／ｍＬの組換えヒトエリスロポエチン（Ｓｉｇｍａ）を含有させた１０％ＦＢＳ混和ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地に培地を交換し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で４時間培養した。次に、１ｍＭの５−アミノレブリン酸塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）を含有させた１０％ＦＢＳ混和ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地（５−アミノレブリン酸塩酸塩は培地にそのまま溶解することで添加）に培地を交換し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で４時間培養した後、４１５ｎｍの励起光を照射してポルフィリンに基づく６３０ｎｍの蛍光を観察することで、それぞれの細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換の程度を評価した。評価は５−アミノレブリン酸存在下での培養１時間後における蛍光量を１とした場合の相対値で行った。なお、５−アミノレブリン酸存在下での１時間培養と４時間培養は異なるプレートを用いて行ったが、個々の培養においてはインタクトな細胞を播種したレーンを設定し、ポルフィリンに基づく蛍光量は、当該レーンの蛍光量を基準にした補正を行って数値化した。結果を図１に示す（ＥＰＯ）。なお、図１には、エリスロポエチンを添加しないこと以外は上記と同じ実験を行った場合の結果をあわせて示す（ｍｏｃｋ）。
図１から明らかなように、５−アミノレブリン酸の添加に先立ってエリスロポエチンを添加しておくことで、がん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換が促進され、細胞内においてプロトポルフィリンＩＸ量が増加したことによる蛍光量の大幅な増加が認められた。以上の結果から、エリスロポエチンは５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進剤の有効成分となることがわかった。

参考例１：ドキソルビシンが有する細胞毒性に対する５−アミノレブリン酸の作用
ラット正常胃粘膜細胞であるＲＧＭ１細胞とヒト胃癌細胞であるＡＧＳ細胞に対するドキソルビシンの細胞毒性に対して５−アミノレブリン酸がどのような作用を及ぼすか、以下の方法で調べた。
１０％ＦＢＳを混和したＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁したそれぞれの細胞を９６ウェルプレートに２×１０^４個播種し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で１晩培養した後、１０ｍＭの５−アミノレブリン酸塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）を含有させた１０％ＦＢＳ混和ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地に培地を交換し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で４時間培養した。次に、１０ｎＭのドキソルビシン塩酸塩（Ｗａｋｏ）を含有させた１０％ＦＢＳ混和ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地（ドキソルビシン塩酸塩はＤＭＳＯに溶解して培地に添加）に培地を交換し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した後、ＭＴＴアッセイを行い、それぞれの細胞に対する細胞毒性を評価した。評価はドキソルビシンを添加しないこと以外は上記と同じ実験を行った場合の細胞生存率を１とした場合の相対値で行った。結果を図２に示す（ＡＬＡ：１０ｍＭ）。なお、図２には、５−アミノレブリン酸を添加しないこと以外は上記と同じ実験を行った場合の結果をあわせて示す（ＡＬＡ：０ｍＭ）。
図２から明らかなように、ドキソルビシンの添加に先立って５−アミノレブリン酸を添加しておくことで、ＡＧＳ細胞に対する細胞毒性が増強される一方、ＲＧＭ１細胞に対する細胞毒性の発現が回避された。以上の結果から、５−アミノレブリン酸は、ドキソルビシンのがん細胞に対する細胞毒性を増強する一方で、正常細胞に対してはこのような作用を示さず、がん細胞に対して選択的に機能する抗癌剤の効果増強剤の有効成分となり、エリスロポエチンは、予め投与しておくことで、その抗癌剤の効果増強作用の早期発現に寄与することがわかった。

製剤例１：アンプル製剤
組換えヒトエリスロポエチン８μｇ、ヒト血清アルブミン５ｍｇ、注射用蒸留水にて全量を２ｍＬとした溶液を無菌的に調製し、アンプルに分注して密封し、アンプル製剤とした。

本発明は、がん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

Claims

エリスロポエチンを有効成分としてなることを特徴とするがん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進剤。
５−アミノレブリン酸を投与する前に投与されることを特徴とする請求項１記載のがん細胞における５−アミノレブリン酸からポルフィリンへの変換促進剤。