JP2011223976A - フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ(fah)欠損性ブタおよびその使用 - Google Patents
フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ(fah)欠損性ブタおよびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】本発明は、インビボにおいてヒト肝細胞を増殖させる方法であって、該方法は、Fah欠損性ブタにヒト肝細胞を移植する工程、および、該ヒト肝細胞を増殖させる工程を包含し、それによって、該ヒト肝細胞を増殖する、方法を提供する。本明細書において、Fah欠損性ブタが記載される。このFah欠損性ブタは、種々の目的のため(他の種(特にヒト)に由来する肝細胞の増殖のため、および肝臓疾患(肝硬変、肝細胞癌、および肝臓感染症が挙げられる)の大型動物モデルとして、が挙げられる)の有用性を有する。
【選択図】なし
Description
本明細書において、Fah欠損性ブタが記載される。このFah欠損性ブタは、種々の目的のため(他の種(特にヒト)に由来する肝細胞の増殖(expansion)のため、および肝臓疾患(肝硬変、肝細胞癌、および肝臓感染症が挙げられる)の大型動物モデルとして、が挙げられる)の有用性を有する。
(項目1) インビボにおいてヒト肝細胞を増殖させる方法であって、該方法は、Fah欠損性ブタにヒト肝細胞を移植する工程、および、該ヒト肝細胞を増殖させる工程を包含し、それによって、該ヒト肝細胞を増殖する、方法。
(項目2) 上記ヒト肝細胞が、少なくとも約2週間、少なくとも約4週間、少なくとも約2ヶ月間、少なくとも約4ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間または少なくとも約8ヶ月間増殖させられる、項目1に記載の方法。
(項目3) 上記Fah欠損性ブタが、ヒト肝細胞移植の前に、肝機能障害を予防するに十分な用量の2−(2−ニトロ−4−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル)−1,3シクロヘキサンジオン(NTBC)を投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目4) 上記Fah欠損性ブタが、肝細胞移植後、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、または少なくとも6日間、NTBCをさらに投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目5) NTBCが、上記Fah欠損性ブタに対して、1日あたり約0.2mg/kg〜約2.0mg/kgの用量で投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目6) NTBCが、上記Fah欠損性ブタに対して、1日あたり約1mg/kgの用量で投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目7) 上記Fah欠損性ブタが免疫抑制状態である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目8) 上記免疫抑制が、1または複数の免疫抑制剤の投与の結果である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目9) 上記1または複数の免疫抑制剤が、FK506、シクロスポリンA、フルダラビン、ミコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシンおよびアザチオプリン、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目10) 上記1または複数の免疫抑制剤が、ヒト肝細胞移植の少なくとも約2日前に、上記Fah欠損性ブタに対して投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目11) 上記ヒト肝細胞が、上記Fah欠損性ブタの肝動脈、脾臓、門脈への注入によって移植される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目12) 上記Fah欠損性ブタが、Fah遺伝子におけるホモ接合性の破壊を含み、該破壊が機能的なFAHタンパク質の発現の欠如をもたらす、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目13) 上記破壊が、上記Fah遺伝子における挿入、欠失、または、1もしくはは複数個の点変異である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目14) 上記破壊が挿入である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目15) 上記挿入が終止コドンを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目16) 上記挿入が選択マーカーを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目17) 上記Fah欠損性ブタに移植される上記ヒト肝細胞が、単離されたヒト肝細胞である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目18) 上記増殖させたヒト肝細胞を、上記Fah欠損性ブタから収集する工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目19) 上記収集したヒト肝細胞を継代移植によって増殖させる工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目20) 上記項目のいずれかに記載の方法によって収集された、単離されたヒト肝細胞。
(項目21) インビボにおいてヒト肝細胞を増殖させる方法であって、該方法は、Fah欠損性ブタの胎仔にヒト肝細胞を移植する工程、および、該Fah欠損性ブタの出生後に該ヒト肝細胞を増殖させる工程を包含し、それによって、該ヒト肝細胞を増殖する、方法。
(項目22) 上記ヒト肝細胞が、少なくとも約2週間、少なくとも約4週間、少なくとも約2ヶ月間、少なくとも約4ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間または少なくとも約8ヶ月間増殖させられる、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目23) 上記Fah欠損性ブタ胎仔が、上記ヒト肝細胞を移植するために外科的に取り出される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目24) 上記ヒト肝細胞が、上記ブタの妊娠から約30日目〜約40日目に移植される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目25) 上記ヒト肝細胞が上記ブタの妊娠から約35日目に移植される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目26) 上記ヒト肝細胞が、上記Fah欠損性ブタ胎仔の臍静脈への注入によって移植される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目27) 約100,000個〜約500,000個のヒト肝細胞が注入される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目28) 約300,000個のヒト肝細胞が注入される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目29) 上記Fah欠損性ブタ胎仔を受胎している雌ブタが、NTBCを投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目30) 上記Fah欠損性ブタが、生後約1日間〜約6日間、NTBCを投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目31) 上記Fah欠損性ブタが、生後約2週間〜約6ヶ月間、NTBCを投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目32) NTBCが、1日あたり約0.2mg/kg〜約2.0mg/kgの用量で投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目33) NTBCが、1日あたり約1mg/kgの用量で投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目34) 上記Fah欠損性ブタ胎仔に移植される上記ヒト肝細胞が、単離されたヒト肝細胞である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目35) 上記ブタの出生後に、上記Fah欠損性ブタに追加のヒト肝細胞を移植する工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目36) 上記増殖させたヒト肝細胞を、上記Fah欠損性ブタから収集する工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目37) 上記収集したヒト肝細胞を継代移植によって増殖させる工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目38) 上記項目のいずれかに記載の方法によって収集された、単離されたヒト肝細胞。
(項目39) 遺伝子改変Fah欠損性ブタであって、該ブタのゲノムがFah遺伝子における破壊についてホモ接合性であり、その結果、該破壊が、機能的なFAHタンパク質の発現の欠如をもたらし、ここで、該ブタは肝機能の低下を示す、遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
(項目40) 上記破壊が、上記Fah遺伝子における挿入、欠失、または、1もしくはは複数個の点変異である、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
(項目41) 上記破壊が挿入である、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
(項目42) 上記挿入が終止コドンを含む、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
(項目43) 上記挿入が選択マーカーを含む、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
(項目44) 上記ブタが移植されたヒト肝細胞を含む、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
(項目45) 上記ブタが免疫抑制状態である、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
(項目46) 上記免疫抑制が、1または複数の免疫抑制剤の投与の結果である、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
(項目47) 上記1または複数の免疫抑制剤が、FK506、シクロスポリンA、フルダラビン、ミコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシンおよびアザチオプリン、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
(項目48) ヒト肝疾患の処置に有効な薬剤を選択するための方法であって、該方法は、以下:
(i)上記項目のいずれかに記載のFah欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程;および
(ii)該肝疾患に対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該肝疾患の1以上の徴候もしくは症状における改善は、該候補薬剤が該肝疾患の処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。
(項目49) 上記ヒト肝疾患がヒト肝臓病原体による感染である上記項目のいずれかに記載の方法であって、該方法は、以下:
(i)ヒト肝細胞を移植されたFah欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該Fah欠損性ブタの該移植されたヒト肝細胞は、該肝臓病原体に感染している、工程;および
(ii)該肝臓感染症に対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該候補薬剤の投与前の該Fah欠損性ブタにおける感染負荷量と比較した、該肝臓病原体の感染負荷量の減少は、該候補薬剤が該肝臓病原体による感染の処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。
(項目50) 上記感染負荷量は、上記ブタから得たサンプル中の上記病原体の力価を測定することによって決定される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目51) 上記感染負荷量は、上記ブタから得たサンプル中の病原体特異的な抗原を測定することによって決定される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目52) 上記感染負荷量は、上記ブタから得たサンプル中の病原特異的な核酸分子を測定することによって決定される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目53) 上記肝臓病原体が肝指向性ウイルスである、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目54) 上記肝指向性ウイルスがHBVまたはHCVである、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目55) 上記ヒト肝疾患が肝硬変である上記項目のいずれかに記載の方法であって、該方法は、以下:
(i)Fah欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該Fah欠損性ブタは、該ブタにおいて肝硬変の発症をもたらす用量でNTBCを投与されている、工程;ならびに
(ii)該Fah欠損性ブタにおける少なくとも1種の肝硬変の診断マーカーに対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該少なくとも1種の肝硬変の診断マーカーは、AST、ALT、ビリルビン、アルカリホスファターゼおよびアルブミンから選択され、そして、該候補薬剤の投与前の該Fah欠損性ブタと比較した、該Fah欠損性ブタにおけるAST、ALT、ビリルビンもしくはアルカリホスファターゼの減少、または、アルブミンの増加は、該候補薬剤が、肝硬変の処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。
(項目56) 上記Fah欠損性ブタにおいて肝硬変が発症した後に、該Fah欠損性ブタに、肝硬変のさらなる進行を予防するために十分な用量のNTBCが投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目57) 上記ヒト肝疾患が肝細胞癌(HCC)である上記項目のいずれかに記載の方法であって、該方法は、以下:
(i)Fah欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該Fah欠損性ブタは、該ブタにおいてHCCの発症をもたらす用量でNTBCが投与されている、工程;および
(ii)該Fah欠損性ブタにおけるHCCに対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該候補薬剤の投与前の該Fah欠損性ブタと比較した、該Fah欠損性ブタにおける腫瘍増殖または腫瘍容積の減少は、該候補薬剤がHCCの処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。
(項目58) インビボにおいてヒト肝細胞に対する外因性因子の効果を評価する方法であって、該方法は、以下:
(i)項目44に記載のFah欠損性ブタに該外因性因子を投与する工程;ならびに
(ii)該Fah欠損性ブタにおいて少なくとも1種の肝機能のマーカーを測定する工程であって、ここで、該少なくとも1種の肝機能のマーカーは、AST、ALT、ビリルビン、アルカリホスファターゼおよびアルブミンから選択され、そして、該外因性因子の投与前の該Fah欠損性ブタと比較した、該Fah欠損性ブタにおけるAST、ALT、ビリルビンもしくはアルカリホスファターゼにおける増加、または、アルブミンにおける減少は、該外因性因子が毒性であることを示す、工程
を包含する、方法。
(項目59) 上記外因性因子が、既知の毒素または疑わしい毒素である、上記項目のいずれかに記載の方法。
(項目60) 遺伝子改変Fah欠損性ブタであって、該ブタのゲノムがFah遺伝子における破壊についてヘテロ接合性である、ブタ。
(項目61) 上記破壊が、Fah遺伝子のエキソン5内にある、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
(項目62) 上記破壊が、Fah遺伝子における挿入、欠失、または、1もしくは複数個の点変異である、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
(項目63) 上記破壊が挿入である、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
(項目64) 上記挿入が終止コドンを含む、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
(項目65) 上記挿入が選択マーカーを含む、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
(項目66) 遺伝子改変Fah欠損性ブタを作製する方法であって、該ブタのゲノムは、Fah遺伝子における破壊についてホモ接合性であり、該方法は、以下:
(i)上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタを、別の遺伝子改変Fah欠損性ブタと交配させる工程;および
(ii)該Fah遺伝子における破壊についてホモ接合性の子孫を選択する工程
を包含する、方法。
相同組換えおよび体細胞核移植によるFah+/−ヘテロ接合性ブタの作製、ならびに、Fah−/−ホモ接合性ブタを産生するための方法が本明細書中に記載される。本開示のFah欠損性ブタは、例えば、ヒト肝細胞の増殖のため、ならびに、遺伝性1型チロシン血症、肝硬変および肝細胞癌の大型動物モデルとして、など、多様な研究および治療の目的に使用され得る。
(I.略語)
AAV アデノ随伴ウイルス
ADSC 脂肪組織由来幹細胞
ALT アラニンアミノトランスフェラーゼ
AST アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
CMV サイトメガロウイルス
DNA デオキシリボ核酸
ES 胚性幹
FACS 蛍光活性化細胞分取
FAH フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ
FSH 卵胞刺激ホルモン
gDNA ゲノムDNA
HBV B型肝炎ウイルス
HCG ヒト絨毛性ゴナドトロピン
HCV C型肝炎ウイルス
hMSC ヒト間葉系幹細胞
HT1 遺伝性1型チロシン血症
iPS 人工多能性幹
IPSC 人工多能性幹細胞
ITR 逆方向末端反復
IVF 体外授精
MOI 感染多重度
mTOR 哺乳動物のラパマイシン標的
NTBC 2−(2−ニトロ−4−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル)−1,3シクロヘキサンジオン
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
SA スクシニルアセトン
SCNT 体細胞核移植。
別途記載のない限り、技術用語は、従来の用法に準拠して使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Pressより出版、1994(ISBN 0−19−854287−9);Kendrewら編,The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.より出版,1994(ISBN 0−632−02182−9);およびRobert A.Meyers編,Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.より出版、1995(ISBN 1−56081−569−8)において見出され得る。
本明細書中には、胎仔ブタ線維芽細胞における相同組換えと、その後の体細胞核移植によるFah+/−ヘテロ接合性ブタの作製が開示される。また、Fah−/−ホモ接合性ブタを産生するための方法も開示される。本開示のFah欠損性ブタは、例えば、他の種(例えば、ヒト)由来の肝細胞の増殖のため、ならびに、遺伝性1型チロシン血症、肝硬変、肝細胞癌および肝臓感染症を含む肝疾患の大型動物モデルとして、など、多様な研究および治療の目的に使用され得る。
ブタの胎仔線維芽細胞においてAAV標的化構築物を用いた相同組換え、その後の体細胞核移植(SCNT)による、Fah欠損性ブタの作製が本明細書中に開示される。SCNTによって胎仔線維芽細胞からFah+/−ブタを産生するために使用される手順は、図5に例示される。Fah−/−ブタを産生するための方法の説明は図1に示される。以下により詳細に考察されるように、Fah欠損性ブタは、多数の研究および治療の目的に有用である。
本開示は、レシピエントブタにおいて増殖させ、そしてレシピエントブタから収集されたヒト肝細胞の、肝臓の再形成(reconstitution)治療を必要とする被験体において肝臓の再形成を行うためのヒト肝細胞の供給源としての使用を企図する。肝細胞の導入による患者における肝臓組織の再形成は、肝臓移植に先行する一時的な処置、または、孤立性代謝不全(isolated metabolic deficiency)を有する患者の決定的な処置のいずれかとして、急性肝不全を有する患者にとって、可能性がある治療の選択肢である(Bumgardner et al.Transplantation 65:53−61,1998)。肝細胞の再形成は、例えば、遺伝子治療のために遺伝子改変された肝細胞を導入するため、あるいは、疾患、物理的もしくは化学的損傷、または悪性疾患の結果としての肝細胞の喪失を補うために使用され得る(米国特許第6,995,299号)。例えば、家族性高コレステロール血症を罹患する患者の遺伝子治療におけるトランスフェクトした肝細胞の使用が報告されている(Grossman et al.Nat.Genet.6:335,1994)。さらに、増殖させたヒト肝細胞は、人工肝臓補助装置に定植させる(populate)ために使用され得る。Fah欠損性ブタにおいてヒト肝細胞を移植および増殖させる特定の方法は、そしてまた増殖させたヒト肝細胞の医療的使用は、以下により詳細に記載される。
Fah欠損性ブタにおいてヒト肝細胞を増殖させるための本明細書中に開示される1つの方法は、Fah欠損性ブタ胎仔にヒト肝細胞を移植する工程を包含する。この方法では、Fah−/−ブタが互いに交配され、ホモ接合性Fahノックアウトの子孫のみを生成する。およそ妊娠35日目に、Fah欠損性ブタ胎仔が外科的に取り出され、そして、臍静脈を介してヒト肝細胞が注入される。一部の実施形態において、ブタ胎仔は、およそ300,000個のヒト肝細胞を注入される。しかしながら、ヒト肝細胞の数は多様であり得、所望される使用に依存する。一部の例では、注入されるヒト肝細胞の数は、約100,000〜約500,000である。胎仔発生段階における免疫系の未熟な性質のおかげで、Fah欠損性ブタ胎仔はヒト肝細胞に対する耐性を生じる。したがって、胎仔発生段階にヒト肝細胞を移植されたFah欠損性ブタを免疫抑制剤で処置する必要はない。
Fah欠損性ブタにおいてヒト肝細胞を増殖させる第二の方法は、Fah欠損性ブタへのヒト肝細胞の生後移植を包含する。一部の実施形態において、生後直ちに(例えば、2日以内、または、1週間以内に)、Fah欠損性仔ブタに移植される。他の実施形態では、より週齢の進んだFah欠損性ブタ(成体Fah欠損性ブタを含む)に移植される。ヒト肝細胞は、一般に、肝動脈、脾臓内注射または門脈によって移植される。Fah欠損性ブタは、肝機能障害を予防するために、NTBCの投与が維持される。ヒト肝細胞の移植前に、Fah欠損性ブタは、ヒト肝細胞の拒絶を予防するために1または複数の免疫抑制剤で処置される。代表的には、1または複数の免疫抑制剤は、ヒト肝細胞移植の約2日前に投与される;しかしながら、免疫抑制剤での処置を開始する時期は、必要に応じて最適な結果を達成するために多様にされ得る。免疫抑制剤の投与は、代表的には、ヒト肝細胞の拒絶を予防するために無限に継続される。
ヒト肝細胞、または、肝細胞前駆体/先祖のあらゆる適切な供給源が、Fah欠損性ブタにおける移植のための本開示の方法において使用され得る。例えば、ヒト肝細胞は、死体のドナーもしくは肝臓の切除物から誘導され得るか、または、市販の供給源から入手され得る。Fah欠損性ブタには、あらゆる年齢のドナーからのヒト肝細胞、または、凍結保存された肝細胞を移植することが可能であるものと期待される。ヒト肝細胞の単離と移植との間にはしばしば遅延(代表的には1〜2日)が存在し、これが、肝細胞の乏しい生存能をもたらし得る。しかしながら、Fah欠損性ブタの系は、肝細胞の数が制限される場合でも、ヒト肝細胞を増殖する手段として機能し得る。
ヒト肝細胞は、当該分野で公知の多数の技術のいずれかを用いてレシピエント動物から収集され得る。例えば、ブタは、麻酔をかけられ、そして、門脈または下大動脈にカテーテルがカニューレを通して挿入され得る。次いで、肝臓が適切な緩衝液(例えば、0.5mM EGTAおよび10mM HEPESが補充されたカルシウムおよびマグネシウムを含まないEBSS)で灌流され、その後、コラゲナーゼ処置(例えば、0.1mg/mlコラゲナーゼXIおよび0.05mg/ml DNase Iを補充したEBSSの溶液を用いる)が行われ得る。肝臓は、穏やかに細かく切られ、そして、ナイロンメッシュを通して濾過され(例えば、逐次的に、70μmおよび40μmのナイロンメッシュを通す)、その後、細胞の遠心分離および洗浄が行われ得る。
Fah欠損性ブタは、肝臓移植の代替として、または、肝臓移植の補助として、ヒトの肝臓を再形成するために使用され得るヒト肝細胞を増殖(propagate)させるためのシステムを提供する。現在、肝疾患を罹患する患者は、移植に適した臓器が利用可能となるまでに、長期間待たなければならないかもしれない。移植後、患者は、ドナー肝臓の拒絶を回避するために、その寿命が続く間、免疫抑制剤で処置される必要がある。患者自身の細胞を増殖(propagate)させるための方法は、生存状態を維持するために免疫抑制を必要としない機能的な肝臓組織の供給源を提供し得る。したがって、本明細書中に開示されるFah欠損性ブタは、その自身の肝細胞(患者の特定の幹細胞から生成されたもの、Fah欠損性ブタにおいて増殖させたものを含む)またはドナーからの肝細胞を用いて、肝疾患および/または肝不全を有する患者の肝臓を再形成するために使用され得る。
遺伝性1型チロシン血症(HT1)は、肝臓および腎臓を冒す重篤な常染色体劣性代謝疾患である。HT1は、ヒトの15番染色体のq23−q25およびマウスの7番染色体に位置するFah遺伝子における欠陥から生じる。HT1患者は、肝硬変に進行する幼児期からの肝臓の損傷;凝固因子の減少;低血糖症;血清血漿における高濃度のメチオニン、フェニルアラニンおよびアミノレブリン酸(aminolevulinic acid);高い肝細胞癌のリスク;ならびに、尿細管および糸球体性の腎機能不全のような多様な臨床症状を呈する。その重篤な形態では、進行性の肝損傷のパターンが幼若乳児期(early infancy)から始まる。その中等度の形態では、高いヘパトームの発生率を伴う慢性肝損傷が特徴的である。
上で考察されたように、動物におけるFah欠損性は、ヒト疾患HT1に類似する疾患の表現型をもたらす。致死性を予防するために、Fah欠損性動物は、肝機能障害を予防するためのNTBC投与が維持されるが、HCC、線維症および肝硬変を含むHT1型表現型の発生を促進するために、NTBCの用量の滴定(titration)が使用され得る。したがって、本明細書中に開示されるFah欠損性ブタは、HCCおよび肝硬変を含む種々の肝疾患の研究に使用され得る。
Fah欠損性ブタにおいて増殖され、収集されたヒト肝細胞はまた、多様な微生物学的研究にも使用され得る。多数の病原体(例えば、細菌、ウイルスおよび寄生虫)は、ヒト宿主または初代ヒト肝細胞において複製するのみである。したがって、初代ヒト肝細胞の十分な供給源が存在することが、これらの病原体の研究にとって重要である。増殖させたヒト肝細胞は、ウイルスの感染および複製の研究のため、または、肝ウイルスの感染を調節する化合物を同定するための研究のために使用され得る。肝ウイルスの研究のために初代ヒト肝細胞を用いる方法は、例えば、欧州特許第1552740号、米国特許第6,509,514号およびPCT公開番号WO 00/17338に記載される。肝ウイルスの例としては、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)およびサイトメガロウイルス(CMV)が挙げられる。肝臓に感染する寄生虫の例としては、例えば、マラリアの原因となる因子(Plasmodium種(Plasmodium falciparum、Plasmodium vivax、Plasmodium ovale、Plasmodium malariaeおよびPlasmodium knowlesiを含む))およびリーシュマニア症の原因となる因子(Leishmania種(L.donovani、L.infantum、L.chagasi、L.mexicana、L.amazonensis、L.venezuelensis、L.tropica;L.major;L.aethiopica、L.(V.)braziliensis、L.(V.)guyanensis、L.(V.)panamensisおよびL.(V.)peruvianaを含む))が挙げられる。
Fah欠損性ブタ、および/または、Fah欠損性ブタにおいて増殖させ、収集されたヒト肝細胞は、あらゆる薬理学的化合物(例えば、低分子、生物学的因子(biologicals)、環境的毒素もしくは生物学的毒素、または遺伝子送達系)による、ヒト肝細胞における遺伝子発現の変化を評価するために使用され得る。
(標的化構築物の作製)
Fah遺伝子ノックアウト構築物を、ブタゲノムDNAから作製したFah遺伝子のエクソン5の2つの1.5kb相同性アームの間にインフレームの終止コドンおよび1.7kbネオマイシン耐性カセット(PGK−neo)を挿入することによって作製した。本明細書中に記載されるように、配列番号1は、ブタにおけるFah遺伝子のエクソン5周辺の20kbの配列のヌクレオチド配列を提供する。この配列は、配列コンティグ番号bE383A3.00171(Genbank ID CU468492)およびbE16F4.00696(Genbank ID CU467891)を用いて、予備ドラフト配列から導いた。
フォワードプライマー−GTAGCGAATTCGCGGCCGCGCAATGTTTTGCTAATTTCTGC(配列番号2)
リバースプライマー−GGATAGAATTCCTGCCGGGAGGAATAGAAGT(配列番号3)
上記標的化ベクターの右アームを増幅するためのプライマーは:
フォワードプライマー−GTAGCAAGCTTCACGCCACAAACGTCGGAGT(配列番号4)
リバースプライマー−GGATAAAGCTTGCGGCCGCACTCTTCCACCAGCAAGCAT(配列番号5)
上記標的化ベクターの中央セグメント(ネオマイシンを含む)を増幅するためのプライマーは:
フォワードプライマー−GTAGCGAATTCTGATCTACCGGGTAGGGGAGGCG(配列番号6)
リバースプライマー−GGATAAAGCTTTAGAACTAGTGGATCTCGAG(配列番号7)。
本研究において使用されたAAVパッケージングヘルパーは、AAV2、AAV5およびAAV8キャプシドタンパク質、ならびにAAV2 repタンパク質を含むハイブリッドキャプシドを発現する(Grimm et al.,J Virol 82:5887,2008)。AAV−DJ標的化ベクターを、標準的なリン酸カルシウムトリプルトランスフェクション法によって作製した。この方法は、HEK293細胞の、等量の以下のプラスミドでの形質導入を含んだ:AAV2repおよびAAV−DJキャップ遺伝子を含むAAVパッケージングヘルパー、アデノウイルスヘルパーpladeno5、ならびにAAV標的化構築物(図3A)。全プロジェクトのために使用され得る多数のウイルス調製物(prep)(1013粒子)を作製するために、293細胞の150mmプレート30枚を調製した。3つ全てのプラスミドの細胞へのトランスフェクション後、粗AAV粒子抽出物を、293細胞を凍結および溶解の複数ラウンドに供することによって調製した。ウイルス調製物の粗抽出物を、胎仔線維芽細胞に感染および標的化するために使用した。
正確に標的化された線維芽細胞クローンの迅速な検出は、頑強かつ迅速なスクリーニング法を必要とする。注意深く最適化されたPCRベースのスクリーニング戦略を作製した。一方のプライマーをPGK−neoカセット内に配置し、他方を1.5kbの標的化相同部位の外側かつFah遺伝子の中に配置する(図3Bを参照のこと)。このスクリーニング法のために使用されたプライマー配列は、以下に提供される。
フォワードプライマー−GAACCCAAATTCTCATGGATACC(配列番号9)
リバースプライマー−CTAAAGCGCATGCTCCAGAC(配列番号10)
3’末端における正確な標的化を判定するためのプライマーは:
フォワードプライマー−ATTGCATCGCATTGTCTGAG(配列番号11)
リバースプライマー−TATGCCTCCTGATCCTAAATCTTCC(配列番号12)。
このプロジェクトのクローニング工程における成功を確実にするためには、複数の独立した標的化雄性胎仔線維芽細胞株および雌性胎仔線維芽細胞株を作製することが必要であった。クローニング効率(核移植によって胚を生成する能力)は細胞株ごとに高度に変動し、予想できないことから、このことが必要であった。また、ブタの群れにおけるFah遺伝子の外側の遺伝的多様性を確立することが重要である。PCRおよびサザンブロットを使用して、本発明者らは、複数の雌性胎仔線維芽細胞株および雄性胎仔線維芽細胞株の正確な標的化を確認した(図4)。
現在、SCNTは、本明細書中に開示されるFAH欠損性ブタのようなトランスジェニックブタの産生のための最も効率的な技術である。図5において、このSCNT手順が図示され、胎仔線維芽細胞から新生児Fah+/−ブタを作製するための概略がまとめられている。簡潔には、まず成熟卵母細胞を雌性ブタから単離した。次いで、これらの卵母細胞を、標的化された胎仔線維芽細胞との融合のすぐ直前の時間までインビトロで培養した。次いで、中期2において除核した卵母細胞を、ドナー線維芽細胞と融合させ、所望のノックアウト胚を作製した。次いで、これらの胚を、活性化された(activated)レシピエントの雌ブタに移した。15日のプロゲステロン治療および2日のFSH−HCG(卵胞刺激ホルモン−ヒト絨毛性ゴナドトロピン)治療の後、レシピエントの雌ブタにおける排卵からおよそ48時間後に、移植を調整した。約115日の妊娠期間後、SCNTから生じた仔ブタが生まれた。全ての仔ブタにPCRおよびサザンブロットスクリーニングを行い、そのFah+/−の状態を確認した。結果は、5匹の仔ブタ中5匹が正確に標的化されたことを実証した。
Fah+/−ヘテロ接合性ブタを交配させて、遺伝性1型チロシン血症(HT1)を効果的に有するFah−/−ホモ接合性ノックアウト動物を作製する。遺伝性1型チロシン血症(HT1)は、FAH(チロシン分解の最後の段階の触媒)欠損から生じる常染色体劣性先天性代謝異常である。遺伝性1型チロシン血症(HT1)は、ヒトにおいて肝硬変および肝細胞癌(HCC)の早期発症によって特徴付けられる(Russoら,Am J Hum Genet 47:317,1990)。Fah−/−ホモ接合性ノックアウトマウスは、以前に作製されている(Grompeら,Genes Dev 7:2298,1993)。これらの動物は、妊娠の間および出生直後にNTBCで処置しない限り、肝不全により死亡する(Grompeら,Nat Genet 10:453,1995)。最適に及ばない(suboptimal)NTBC用量を与えた場合、Fah−/−マウスは、肝細胞癌(HCC)および線維症を発症する(Al−Dhalimyら,Mol Genet Metab 75:38,2002;Vogelら,Hepatology 39:433,2004)。本明細書において開示されるヒト遺伝性1型チロシン血症(HT1)のブタモデルは、顕著な進歩であり、肝硬変および肝細胞癌(HCC)の研究のためのツールであると、予期される。このモデルは、これよりも十分ではない他のモデルにおいては達成し得ない、硬変性肝不全および肝細胞癌(HCC)を処置するために使用される新規治療の開発および試験を可能にする。重要なことには、このモデルにおける肝損傷の程度は、NTBCの用量およびその投与時期を用いて決定(titrate)し得る。このことは、この疾患を有するマウスおよびヒトにおいて示されている。いったん肝硬変または肝細胞癌(HCC)が確立された後、その動物に、完全に治療用量のNTBC(または類似化合物)を与えて、外科手術および他の介入のためにその動物の健康を安定させ得る。
Fah−/−ホモ接合性を作製するために、SCNT手順から得たヘテロ接合性ブタを交配させる。8匹のブタ(6匹の雌および2匹の雄)を使用して、Fah−/−ブタの群れを確立する。まずこの群れを、ヘテロ接合性動物を交配させた後に遺伝的に離れたブタと交配させることによって拡大させ、この群れの遺伝的多様性を増加させかつホモ接合性Fah−/−ブタをNTBC治療において維持するコストを低減させる。この子孫のFah遺伝子の状態を、既に開発済みであるPCRおよびサザンブロットをベースとする遺伝子型決定アッセイによって決定する。ヒトにおける観察事項(observation)およびトランスジェニックFahノックアウトマウスを用いる研究に基づけば、新たに作製されたFah−/−ホモ接合性ブタは、保護薬物であるNTBCを補充しなければ急性肝不全により早期に死亡すると、予期される。肝不全、肝細胞癌および肝硬変の発症を予防するために、用量1mg/kg/日をヒトおよびマウスにおいて使用する。Fah−/−胎仔を受胎した妊娠雌ブタを、妊娠後半期に約55日目から開始してNTBC処置する。新生仔ブタはすべて用量1mg/kg/日のNTBCでその生を始め、遺伝子型決定が完了するまで続ける。いったん遺伝子型決定が完了した後は、ホモ接合性ブタを研究して、その表現型ならびに硬変性肝不全および肝細胞癌(HCC)の発症を特徴づけ得る。
いったん遺伝子型決定が完了した後、ブタにおけるFah−/−ホモ接合性表現型を適切に特徴付け得る。最適に及ばない(suboptimal)NTBC用量である0.2mg/kg/日によって、マウスは生存可能であるが、生存期間の最初の6ヶ月に50%を超える高い浸透率(penetrance rate)で肝細胞癌を発症させる。これらの観察事項に基づけば、Fah−/−ホモ接合性ノックアウトブタの表現型を、0mg/kg/日〜1mg/kg/日の範囲にある用量のNTBCの影響下で評価する。肝硬変、肝細胞癌、または肝不全のエビデンスが1mg/kg/日の用量で生じる場合には、それよりも大きなNTBC用量を検討する。ブタを、0mg/kg/日〜0.1mg/kg/日〜0.2mg/kg/日〜0.5mg/kg/日〜1.0mg/kg/日の範囲にある日用量のNTBCで処置する。適切なNTBC用量は、血漿スクシニルアセトン(SA)または尿スクシニルアセトン(SA)をマーカーとして使用して、用量設定(titrate)し得る。スクシニルアセトン(SA)は、正常な体液においては見出されず、遺伝性1型チロシン血症(HT1)について特有症候である(Grompe,Semin Liver Dis 21:563,2001)。チロシン血症の程度をモニターするために、血漿アミノ酸レベルを決定する。肝損傷のマーカーを追跡するために、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)レベル、アルカリホスファターゼレベル、およびビリルビンレベルを得る。血液凝固を測定して、合成肝不全(synthetic liver failure)の程度を決定する。さらに、α−フェトタンパク質レベルを、腫瘍発生(肝細胞癌)の尺度として得る。ホモ接合性研究用動物を、3ヶ月目、6ヶ月目、および9ヶ月目に屠殺し、その肝臓および他の内部器官を、剖検において原発性腫瘍および転移性腫瘍のエビデンスについて調べる(表1)。このモデルの適切な特徴付けは、肝硬変、肝細胞癌(HCC)、遺伝性1型チロシン血症(HT−1)の研究においてFah−/−ホモ接合性ノックアウトブタを使用することを意図された将来の研究のために有益である。
いったんFah−/−ブタが利用可能になりかつ適切なNTBC用量を決定した後、ヒト肝細胞を用いてそのFah−/−肝臓を再増殖するための実験を行う。2つの一般的なアプローチ((1)免疫前胎仔移植、および(2)免疫抑制を伴う出生後移植)を採用する。
添付の配列表に列挙される核酸配列は、米国特許法施行規則第1.822規則(37 C.F.R. 1.822)において規定されるように、ヌクレオチド塩基に関する標準的な略語文字を使用して示される。各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、提示された鎖に対するあらゆる言及によって相補鎖が含まれると理解される。添付の配列表において、
配列番号1は、ブタFah遺伝子の20kb領域のヌクレオチド配列である。
Claims (66)
- インビボにおいてヒト肝細胞を増殖させる方法であって、該方法は、Fah欠損性ブタにヒト肝細胞を移植する工程、および、該ヒト肝細胞を増殖させる工程を包含し、それによって、該ヒト肝細胞を増殖する、方法。
- 前記ヒト肝細胞が、少なくとも約2週間、少なくとも約4週間、少なくとも約2ヶ月間、少なくとも約4ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間または少なくとも約8ヶ月間増殖させられる、請求項1に記載の方法。
- 前記Fah欠損性ブタが、ヒト肝細胞移植の前に、肝機能障害を予防するに十分な用量の2−(2−ニトロ−4−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル)−1,3シクロヘキサンジオン(NTBC)を投与される、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記Fah欠損性ブタが、肝細胞移植後、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、または少なくとも6日間、NTBCをさらに投与される、請求項3に記載の方法。
- NTBCが、前記Fah欠損性ブタに対して、1日あたり約0.2mg/kg〜約2.0mg/kgの用量で投与される、請求項3または請求項4に記載の方法。
- NTBCが、前記Fah欠損性ブタに対して、1日あたり約1mg/kgの用量で投与される、請求項5に記載の方法。
- 前記Fah欠損性ブタが免疫抑制状態である、請求項1に記載の方法。
- 前記免疫抑制が、1または複数の免疫抑制剤の投与の結果である、請求項7に記載の方法。
- 前記1または複数の免疫抑制剤が、FK506、シクロスポリンA、フルダラビン、ミコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシンおよびアザチオプリン、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記1または複数の免疫抑制剤が、ヒト肝細胞移植の少なくとも約2日前に、前記Fah欠損性ブタに対して投与される、請求項8または請求項9に記載の方法。
- 前記ヒト肝細胞が、前記Fah欠損性ブタの肝動脈、脾臓、門脈への注入によって移植される、請求項1に記載の方法。
- 前記Fah欠損性ブタが、Fah遺伝子におけるホモ接合性の破壊を含み、該破壊が機能的なFAHタンパク質の発現の欠如をもたらす、請求項1に記載の方法。
- 前記破壊が、前記Fah遺伝子における挿入、欠失、または、1もしくはは複数個の点変異である、請求項12に記載の方法。
- 前記破壊が挿入である、請求項13に記載の方法。
- 前記挿入が終止コドンを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記挿入が選択マーカーを含む、請求項14または請求項15に記載の方法。
- 前記Fah欠損性ブタに移植される前記ヒト肝細胞が、単離されたヒト肝細胞である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記増殖させたヒト肝細胞を、前記Fah欠損性ブタから収集する工程をさらに包含する、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記収集したヒト肝細胞を継代移植によって増殖させる工程をさらに包含する、請求項18に記載の方法。
- 請求項18に記載の方法によって収集された、単離されたヒト肝細胞。
- インビボにおいてヒト肝細胞を増殖させる方法であって、該方法は、Fah欠損性ブタの胎仔にヒト肝細胞を移植する工程、および、該Fah欠損性ブタの出生後に該ヒト肝細胞を増殖させる工程を包含し、それによって、該ヒト肝細胞を増殖する、方法。
- 前記ヒト肝細胞が、少なくとも約2週間、少なくとも約4週間、少なくとも約2ヶ月間、少なくとも約4ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間または少なくとも約8ヶ月間増殖させられる、請求項21に記載の方法。
- 前記Fah欠損性ブタ胎仔が、前記ヒト肝細胞を移植するために外科的に取り出される、請求項21または請求項22に記載の方法。
- 前記ヒト肝細胞が、前記ブタの妊娠から約30日目〜約40日目に移植される、請求項21〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒト肝細胞が前記ブタの妊娠から約35日目に移植される、請求項24に記載の方法。
- 前記ヒト肝細胞が、前記Fah欠損性ブタ胎仔の臍静脈への注入によって移植される、請求項21に記載の方法。
- 約100,000個〜約500,000個のヒト肝細胞が注入される、請求項26に記載の方法。
- 約300,000個のヒト肝細胞が注入される、請求項27に記載の方法。
- 前記Fah欠損性ブタ胎仔を受胎している雌ブタが、NTBCを投与される、請求項21に記載の方法。
- 前記Fah欠損性ブタが、生後約1日間〜約6日間、NTBCを投与される、請求項21に記載の方法。
- 前記Fah欠損性ブタが、生後約2週間〜約6ヶ月間、NTBCを投与される、請求項21に記載の方法。
- NTBCが、1日あたり約0.2mg/kg〜約2.0mg/kgの用量で投与される、請求項30または請求項31に記載の方法。
- NTBCが、1日あたり約1mg/kgの用量で投与される、請求項32に記載の方法。
- 前記Fah欠損性ブタ胎仔に移植される前記ヒト肝細胞が、単離されたヒト肝細胞である、請求項21〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ブタの出生後に、前記Fah欠損性ブタに追加のヒト肝細胞を移植する工程をさらに包含する、請求項34に記載の方法。
- 前記増殖させたヒト肝細胞を、前記Fah欠損性ブタから収集する工程をさらに包含する、請求項21〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記収集したヒト肝細胞を継代移植によって増殖させる工程をさらに包含する、請求項36に記載の方法。
- 請求項36に記載の方法によって収集された、単離されたヒト肝細胞。
- 遺伝子改変Fah欠損性ブタであって、該ブタのゲノムがFah遺伝子における破壊についてホモ接合性であり、その結果、該破壊が、機能的なFAHタンパク質の発現の欠如をもたらし、ここで、該ブタは肝機能の低下を示す、遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
- 前記破壊が、前記Fah遺伝子における挿入、欠失、または、1もしくはは複数個の点変異である、請求項39に記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
- 前記破壊が挿入である、請求項40に記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
- 前記挿入が終止コドンを含む、請求項41に記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
- 前記挿入が選択マーカーを含む、請求項41または請求項42に記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
- 前記ブタが移植されたヒト肝細胞を含む、請求項39に記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
- 前記ブタが免疫抑制状態である、請求項39に記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
- 前記免疫抑制が、1または複数の免疫抑制剤の投与の結果である、請求項45に記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
- 前記1または複数の免疫抑制剤が、FK506、シクロスポリンA、フルダラビン、ミコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシンおよびアザチオプリン、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項46に記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
- ヒト肝疾患の処置に有効な薬剤を選択するための方法であって、該方法は、以下:
(i)請求項39に記載のFah欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程;および
(ii)該肝疾患に対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該肝疾患の1以上の徴候もしくは症状における改善は、該候補薬剤が該肝疾患の処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。 - 前記ヒト肝疾患がヒト肝臓病原体による感染である請求項48に記載の方法であって、該方法は、以下:
(i)ヒト肝細胞を移植されたFah欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該Fah欠損性ブタの該移植されたヒト肝細胞は、該肝臓病原体に感染している、工程;および
(ii)該肝臓感染症に対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該候補薬剤の投与前の該Fah欠損性ブタにおける感染負荷量と比較した、該肝臓病原体の感染負荷量の減少は、該候補薬剤が該肝臓病原体による感染の処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。 - 前記感染負荷量は、前記ブタから得たサンプル中の前記病原体の力価を測定することによって決定される、請求項49に記載の方法。
- 前記感染負荷量は、前記ブタから得たサンプル中の病原体特異的な抗原を測定することによって決定される、請求項49に記載の方法。
- 前記感染負荷量は、前記ブタから得たサンプル中の病原特異的な核酸分子を測定することによって決定される、請求項49に記載の方法。
- 前記肝臓病原体が肝指向性ウイルスである、請求項49〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 前記肝指向性ウイルスがHBVまたはHCVである、請求項53に記載の方法。
- 前記ヒト肝疾患が肝硬変である請求項48に記載の方法であって、該方法は、以下:
(i)Fah欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該Fah欠損性ブタは、該ブタにおいて肝硬変の発症をもたらす用量でNTBCを投与されている、工程;ならびに
(ii)該Fah欠損性ブタにおける少なくとも1種の肝硬変の診断マーカーに対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該少なくとも1種の肝硬変の診断マーカーは、AST、ALT、ビリルビン、アルカリホスファターゼおよびアルブミンから選択され、そして、該候補薬剤の投与前の該Fah欠損性ブタと比較した、該Fah欠損性ブタにおけるAST、ALT、ビリルビンもしくはアルカリホスファターゼの減少、または、アルブミンの増加は、該候補薬剤が、肝硬変の処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。 - 前記Fah欠損性ブタにおいて肝硬変が発症した後に、該Fah欠損性ブタに、肝硬変のさらなる進行を予防するために十分な用量のNTBCが投与される、請求項55に記載の方法。
- 前記ヒト肝疾患が肝細胞癌(HCC)である請求項48に記載の方法であって、該方法は、以下:
(i)Fah欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該Fah欠損性ブタは、該ブタにおいてHCCの発症をもたらす用量でNTBCが投与されている、工程;および
(ii)該Fah欠損性ブタにおけるHCCに対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該候補薬剤の投与前の該Fah欠損性ブタと比較した、該Fah欠損性ブタにおける腫瘍増殖または腫瘍容積の減少は、該候補薬剤がHCCの処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。 - インビボにおいてヒト肝細胞に対する外因性因子の効果を評価する方法であって、該方法は、以下:
(i)請求項44に記載のFah欠損性ブタに該外因性因子を投与する工程;ならびに
(ii)該Fah欠損性ブタにおいて少なくとも1種の肝機能のマーカーを測定する工程であって、ここで、該少なくとも1種の肝機能のマーカーは、AST、ALT、ビリルビン、アルカリホスファターゼおよびアルブミンから選択され、そして、該外因性因子の投与前の該Fah欠損性ブタと比較した、該Fah欠損性ブタにおけるAST、ALT、ビリルビンもしくはアルカリホスファターゼにおける増加、または、アルブミンにおける減少は、該外因性因子が毒性であることを示す、工程
を包含する、方法。 - 前記外因性因子が、既知の毒素または疑わしい毒素である、請求項58に記載の方法。
- 遺伝子改変Fah欠損性ブタであって、該ブタのゲノムがFah遺伝子における破壊についてヘテロ接合性である、ブタ。
- 前記破壊が、Fah遺伝子のエキソン5内にある、請求項60に記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
- 前記破壊が、Fah遺伝子における挿入、欠失、または、1もしくは複数個の点変異である、請求項60または請求項61に記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
- 前記破壊が挿入である、請求項60〜62のいずれか1項に記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
- 前記挿入が終止コドンを含む、請求項63に記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
- 前記挿入が選択マーカーを含む、請求項63または請求項64に記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタ。
- 遺伝子改変Fah欠損性ブタを作製する方法であって、該ブタのゲノムは、Fah遺伝子における破壊についてホモ接合性であり、該方法は、以下:
(i)請求項60〜65のいずれか1項に記載の遺伝子改変Fah欠損性ブタを、別の遺伝子改変Fah欠損性ブタと交配させる工程;および
(ii)該Fah遺伝子における破壊についてホモ接合性の子孫を選択する工程
を包含する、方法。
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