JP2003520825A - 抗ドナー免疫へ抵抗する、移植前に順応された臓器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明には、移植に先立って順応され、従って前形成抗体による拒絶に抵抗する臓器移植片の組成物が含まれる。順応は、ドナーに対して感作される動物から得られる順応誘導因子の亜致死レベルの投与により、ドナー動物の内部で達成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本明細書に記載の研究は、本発明に一定の権利を有する米国政府からの研究奨
学金第Ｒ４３ ＤＫ５０７３７号により一部資金提供された。

【０００２】 発明の分野 本発明の分野は、臓器及び組織の移植に、そして特に、移植片レシピエントでの
拒絶抗体に抵抗するために、まだドナー中にある間に異種移植臓器を条件づける
こと（順応）に関する。本発明は、ドナー動物の内部で順応を評価する方法にも
関する。

【０００３】 背景技術 ある哺乳動物種から別の種への臓器の移植に対する主要な障壁は、異種移植片の
拒絶である。この拒絶のほとんどは組織特異抗原に関するのではなく、レシピエ
ントがドナー動物へ感作されることから生じる。例えば、ヒトと旧世界サルは、
ブタを含む他の動物中の組織で発現されるα−ガラクトシルオリゴ糖に対する循
環抗体を有する。この抗体は、移植されたブタ異種移植片へ結合し、補体を結合
させ、この移植片を１時間以内に破壊する。この迅速な反応は、超急性拒絶（Ｈ
ＡＲ）と言われる。移植片は、前形成された自然抗体の内皮細胞への結合と補体
の結合により速やかに破壊される。ヒト及び旧世界サルの前形性抗体のほとんど
（＞８０％）は、Ｇａｌ（α）１−３Ｇａｌエピトープ（αＧａｌ）に抗する。

【０００４】 急性血管性異種移植拒絶は、移植後３〜８日で生じる。誘導された回帰性の抗
ドナー抗体が内皮へ結合し、内皮活性化、小血管血栓、及び、マクロファージ及
びＮＫ細胞の動員をもたらす。急性異種移植拒絶は、細胞拒絶によっても媒介さ
れる。細胞性同種移植拒絶とは対照的に、移植片の損傷にはＣＤ４＋細胞障害性
リンパ球が貢献する。

【０００５】 現行のＨＡＲの予防法は、抗体の結合又は補体の結合を標的にする。抗ドナー
抗体若しくは補体を、レシピエントの血液から枯渇させ得る。ヒヒで実施された
ＡＢＯ不適合心臓同種移植では、抗体を中和するＡ及びＢ抗原の可溶性三糖の注
入により超急性拒絶が予防された。このオリゴ糖を中断した後で循環抗体が残存
したが、いくつかの移植片は長期の生存を示した。Cooper D. K., et al., Tran
splantation 56: 769-77 (1993)。ヒト補体の阻害剤を発現するか、又はαＧａ
ｌの発現が低下したトランスジェニックブタも創製されている。

【０００６】 上記の技術は短期間のベースでは有用である。しかしながら、それらは完全に
有効であるわけではない。抗体がその除去後すぐに復帰するので、この方法を頻
繁に繰り返さねばならない。トランスジェニックブタでは、トランス遺伝子の発
現レベルがまちまちである。いずれの方法でも、ＨＡＲ及び急性血管性拒絶のエ
ピソードは一般的である。慣用の化学療法を使用して急性異種移植拒絶を抑制し
ようとする努力は、部分的にしか成功していない。特に、ブタ異種移植片ヘの抗
体応答は、抑制へ抵抗することが証明された。

【０００７】 異種移植片の長期生存を信頼できるほどに達成するには、免疫寛容又は移植片
順応が必要であろう。免疫寛容には、ある移植片に対して特異的に反応しないよ
うにレシピエントの免疫系をプログラムすることが伴う。順応は、既存の免疫応
答へ抵抗するように移植片を適応させることを意味する。

【０００８】 ブタ異種移植片への部分免疫寛容は、レシピエントの免疫系を一部除去し、ブ
タ造血細胞の存在下でそれを再構成することによって誘導された。ブタの造血細
胞は１年後に検出可能である。このアプローチには３つの基本的な限界がある。
第一に、寛容では、既存の自然抗体により引き起こされる問題を解決し得ないこ
と。免疫吸着による既存抗体の除去のような追加の努力が必要とされるだろう。
第二に、レシピエントが長期間の免疫不全状態に置かれ、日和見感染症や人畜共
通感染症のリスクを負うこと。第三に、寛容が造血細胞上で発現される抗原だけ
に対すること。寛容は、組織関連抗原に対しては誘導されない。このプロトコー
ルを使用すると、ブタの心臓及び腎臓異種移植片は、ヒヒにおいて劇症的に拒絶
された。

【０００９】 免疫が一部除去されたレシピエントへブタ脾臓を移植すると、レシピエントの
前胸腺細胞がブタの環境で成熟するので、寛容が増強される。このアプローチを
使用すると、ブタの皮膚移植片の生存がマウスでは顕著に長期化し、霊長動物で
は適度に長期化される。混在するキメラ性に関わる上記の基本的な限界は、依然
として問題となろう。

【００１０】 特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５８４４は、リンパ球を免疫不全ドナー動
物へ注入することによる、レシピエントリンパ球の異種移植片への免疫寛容の誘
導を教示する。この寛容細胞を後に採取し、レシピエントへ戻して移入すると、
レシピエントへ寛容をもたらす。しかしながら、既存の免疫応答により、このア
プローチの有用性も制限されるだろう。

【００１１】 順応の機序は不明である。それは抗体の枯渇によるのでも、移植片内でドナー
内皮が宿主内皮ヘ置換されることによるものでもない。長期の心臓異種移植（ハ
ムスターからラットへ）の免疫組織化学は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｃ３及びＣ６が内
皮上に沈積するが、フィブリン形成はわずかであることを示している。

【００１２】 順応された内皮細胞が抗原の発現を低下させたという可能性が探究された。α
ｇａｌのような抗原のいくらかの低下が順応について観察されたが、移植片を保
護するのに十分であるとは考えられなかった。Parker W et al., Am. J. Pathol
. 152: 829-39 (1998)。

【００１３】 順応された移植片は、第二のレシピエントへ養子移植され得ることが知られて
いる。順応の原因となる因子は移植片の内部に存在していて、循環する調節細胞
若しくは因子を必要としない。Miyatake は、ハムスター心臓移植片の拒絶がラ
ットレシピエントにおいて予防し得るならば、この移植片はまた、第一のレシピ
エントと同一の第二のレシピエントへ再移植されるとき、やはり拒絶に抵抗する
ものであることを示した。T. Miyatake, N. Koyamada, W. W. Hancock, M. P. S
oares, と F. H. Bach.「順応された心臓異種移植片の、シクロスポリン処置レ
シピエントへの再移植時の生存」Transplantation 65: 1563-1569, (1998)。こ
の観察事実は科学的に価値があるものの、臨床的には有用でない。この観察事実
を応用するには、ヒトレシピエントのような２つの同一の被検者を必要とし、そ
の１つは順応が達成されるまで、ドナー臓器を収容することになるだろう。次い
でその臓器が獲得され、第二の被検者へ移植されることになる。潜在的なレシピ
エントの数が一卵性の双子で非常に限られていることと、第一のレシピエントへ
の倫理的に許容されない合併症のために、このアプローチは実現し得ない。

【００１４】 培養内皮細胞における順応を達成することにやや成功したことが報告されてい
る。Dorling A., et al., Xenotransplantation, 5: 84-92 (1998); 及び Dorli
ng A., et al., Transplantation, 62: 1127-1136 (1996)。Dorling et al. は
、ブタ内皮細胞の培養で、正常ヒト免疫グロブリンへの長期曝露により、順応を
示唆する内皮細胞の諸変化が生じることを示した。

【００１５】 上記の研究結果のみかけの追認が、Shah et al., 第５回国際異種移植学会総
会、抄録（Fifth Congress of the International Xenotransplantation Associ
ation, Abstract）199 (1999) により提供された。培養の７２時間で補体介在性
細胞毒性へのわずかな抵抗が達成された。１２０〜１４４時間のインキュベーシ
ョン時点でよりよい抵抗が観察された。一方、初代内皮細胞培養物を使用して、
上記の研究結果を追認し得なかったものもいる。McKane W. et al., 第５回国際
異種移植学会総会、抄録 200 (1999)。彼らは、他者により報告された見かけの
抵抗が、抗アポトーシス遺伝子を構成的に発現する不死化内皮細胞の使用に関連
した人為的な事実であり得ると示唆した。

【００１６】 in vitro 培養が有意義な臨床有用性を有する可能性は少ない。順応された内
皮細胞には、それだけでは有意義な有用性がないだろう。さらに、培養されて形
質転換される内皮細胞の順応には最も少なくても７２時間、好ましくは１２０時
間の培養が必要とされた。Dorling et al. (1996), 同上、を参照のこと。この
観察事実を、培養で維持される臓器全体の ex vivo 培養へ拡張するとすれば、
臓器はこの間に著しく悪化するだろう。

【００１７】 レシピエントの内部で順応を達成することは非常に困難で、コストがかかり、
そして移植片の拒絶で、失敗に終わることが多い。 それ故、高コスト、合併症、及び、移植後のレシピエント内部での異種移植臓
器の順応に関連した失敗の高リスクを回避する異種移植片移植の方法へのニーズ
が存在する。

【００１８】 発明の要約 本発明の目的は、組織若しくは移植片の移植に先立って順応される組織若しくは
移植片を提供することである。

【００１９】 本発明の第二の目的は、ドナー移植片の移植に先立つ順応についての方法を提
供することである。 本発明のもう１つの目的は、改善されるドナー内順応技術の開発についての方
法を提供することである。

【００２０】 本発明の１つの態様によれば、レシピエント哺乳動物における拒絶に抵抗する
ために、ドナー哺乳動物において順応される組織若しくは臓器を提供する方法が
提供される、この方法は： 亜致死レベルの少なくとも１種の順応誘導因子を少なくとも１回ドナー哺乳動物
に注入し、前記順応誘導因子へ長期の曝露を与える工程；及び 順応された前記組織若しくは臓器の１つ又はそれ以上を採取する工程を含む。

【００２１】 好ましい態様によれば、順応誘導因子は、免疫不全状態にある前記ドナー哺乳
動物に注入される。もう１つの好ましい態様によれば、順応誘導因子は、ブタ内
皮のようなドナー内皮と反応性の抗体、形質細胞、Ｂリンパ球、ヒトＢリンパ球
、条件不死化Ｂリンパ球、抗αＧａｌ抗体、抗体のような順応誘導因子を発現す
る細胞、順応誘導因子を発現する細胞を含んでなるハイブリドーマ、移植片の組
織若しくは臓器の細胞と反応性のＴ細胞、パーフォリン、又は Bandeiraea simp
licifolia レクチンである。もう１つの好ましい態様によれば、この方法は、前
記臓器若しくは組織の移植に先立って、組織若しくは臓器の順応が達成されたこ
とを決定する工程をさらに含む。

【００２２】 もう１つの態様によれば、異種移植臓器若しくは組織が提供される。異種移植
臓器若しくは組織は、順応誘導因子で処置されたドナー哺乳動物において育てら
れる。好ましい態様によれば、異種移植臓器には、限定しないが、心臓、腎臓、
肝臓、肺、膵臓、心−肺、腸、脾臓、又は胸腺が含まれる。異種移植組織には、
限定しないが、骨、皮膚、髪、眼、神経組織、平滑筋、骨格筋、心筋、筋細胞、
膵島、肝細胞、胚性幹細胞、前駆細胞、又は造血細胞が含まれる。もう１つの好
ましい態様によれば、順応誘導因子での処置は、ドナー哺乳動物が免疫不全状態
にある間に生じた。もう１つの好ましい態様によれば、順応誘導因子は、ドナー
内皮と反応性の抗体、ブタ内皮と反応性の抗体、形質細胞、Ｂリンパ球、ヒトＢ
リンパ球、条件不死化Ｂリンパ球、抗αＧａｌ抗体、順応誘導因子を発現する細
胞、順応誘導因子を発現する細胞を含んでなるハイブリドーマ、移植片組織若し
くは臓器中の細胞と反応性のＴ細胞、パーフォリン、又は Bandeiraea simplici
folia レクチンである。

【００２３】 さらにもう１つの態様によれば、順応因子を発現させる方法が提供され、これ
は、亜致死レベルの少なくとも１種の順応誘導因子を少なくとも１回ドナー哺乳
動物に注入する工程；このドナー以外の哺乳動物由来の組織若しくは細胞をこの
ドナーへ投与する工程；順応誘導因子へ長期の曝露を与える工程；及び順応され
た組織又は細胞を採取する工程を含む。好ましい態様によれば、順応誘導因子は
、前記採取される組織若しくは臓器の予定レシピエントである個体に由来する。
もう１つの好ましい態様によれば、順応誘導因子は免疫不全状態にあるドナー哺
乳動物に注入される。さらにもう１つの好ましい態様によれば、順応誘導因子は
、ドナー内皮と反応性の抗体、前記ドナーへ投与された、前記ドナー以外の哺乳
動物由来の細胞若しくは組織と反応性の抗体、前記ドナーへ投与された、前記ド
ナー以外の哺乳動物由来の細胞若しくは組織と反応性の抗体を発現する細胞、ブ
タ内皮と反応性の抗体、形質細胞、Ｂリンパ球、ヒトＢリンパ球、条件不死化Ｂ
リンパ球、抗αＧａｌ抗体、順応誘導因子を発現する細胞、順応誘導因子を発現
する細胞を含んでなるハイブリドーマ、前記組織若しくは臓器と反応性のＴ細胞
、パーフォリン、又は Bandeiraea simplicifolia レクチンである。なおもう１
つの好ましい態様によれば、この方法は、組織若しくは細胞の採取に先立って、
前記組織若しくは細胞の順応が達成されたことを決定する追加の工程を含む。

【００２４】 もう１つの態様によれば、異種移植組織若しくは細胞は、造骨細胞、破骨細胞
、皮膚、皮膚上皮細胞、毛包細胞、眼細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞
、心筋細胞、膵島、肝細胞、幹細胞、前駆細胞、又は造血細胞である。

【００２５】 発明の詳細な説明 Ｉ．概観 本発明は、移植に適する順応された臓器若しくは組織の産生法と順応された臓器
を提供する。順応とは、被感作レシピエントにおける損傷に抵抗するように臓器
を条件づける方法である。それはまた適応とも言われる。適応は、移植片におい
て、細胞死若しくはアポトーシス、凝血促進変化、及び白血球の癒着に対する抵
抗をもたらす。本発明によれば、順応は、順応誘導因子のドナーへの注入、移植
片を順応誘導因子へ曝露させること、レシピエントにおける拒絶へ抵抗するよう
にドナー中に存在する間に順応された移植片を採取することによって達成される
。

【００２６】 順応誘導因子は異種移植臓器若しくは組織のドナー内部における順応を引き起
こす任意の因子である。この因子は、ドナー以外の哺乳動物種に由来する血漿の
アリコートであり得る。他のやり方では、この因子は、血漿から精製されるか又
は in vitro 系で発現されるリガンドであり得る。好ましくは、この因子は、免
疫系の成分、例えばＢリンパ球又は抗体である。

【００２７】 順応された臓器若しくは組織とは、被感作レシピエントによる拒絶に抵抗し得
る臓器若しくは組織である。被感作レシピエントとは、移植前の移植片−レシピ
エントに存在する、ドナー抗原と反応性の前形成抗体若しくは記憶Ｔ細胞を有す
る生物である。被感作生物の例は、ブタ抗原に感受性がある、ヒト及び旧世界サ
ルである。典型的に、被感作レシピエントは、ドナー組織に対して超急性及び／
又は急性の血管性異種移植免疫応答を産生する。この応答は、異種移植片の導入
前にレシピエント生物に存在する、前形成抗体及びＴ細胞により媒介される。臓
器若しくは組織の移植片は、キメラ動物から採取される。

【００２８】 本発明によれば、キメラ哺乳動物若しくは動物は、注入されたトランスジェニ
ック順応誘導因子が存在する任意の哺乳動物である。例えば、他の哺乳動物に由
来する細胞の注入物を受けた子ブタは、キメラ動物である。好ましい態様では、
キメラ動物は、免疫不全状態の間に、別の哺乳動物種、例えばヒト由来の細胞の
注入物を受けたブタである。注入は、好ましくは、ドナーが免疫前の胎児のよう
な免疫不全状態にあるときに生じる。

【００２９】 順応を誘導する因子には、限定しないが、ドナー組織と反応性の抗体、ドナー
内皮と反応性の抗体、（ドナーがブタであるか又はブタ科の一員である場合）ブ
タの組織若しくは内皮と反応性の抗体、形質細胞、Ｂリンパ球、ヒトＢリンパ球
、条件不死化Ｂリンパ球、抗αＧａｌ抗体、順応誘導因子を発現するように操作
された細胞、及び Bandeiraea simplicifolia レクチンが含まれる。この因子は
、天然の単離因子であるか、又はそれはリガンドを発現するように操作された細
胞、又は精製された操作リガンドであり得る。

【００３０】 順応因子は、異種移植レシピエント（例えば、ヒト又は他の哺乳動物）となる
種の一員から得られる場合がある。好ましい態様では、順応誘導因子は、後にレ
シピエントとなる個体から単離される。順応誘導因子のそれぞれを決定、単離、
そして操作する方法は、当業者によく知られている。

【００３１】 本発明はまた、前形成され、発生している免疫要素、特に、αＧａｌへの自然
抗体のような抗体による拒絶への感受性が低い臓器異種移植片を提供する。上記
の抗体はほとんどのヒト及び旧世界サルに存在している。αＧａｌ抗原は、ブタ
を含む他のほとんどの種に由来の内皮細胞及び他の細胞若しくは組織で発現され
ている。移植臓器の順応は、臓器ドナーの内部で、少なくとも１種の順応誘導因
子へ移植片を長期に曝露することで達成され得る。抗体順応の機序は、十分には
理解されていない。この現象についての特定の機械論的な説明に拘泥せずに言え
ば、ドナーにおいて順応因子へ曝露された内皮及び他の細胞がレシピエントの抗
体に対する保護を提供する作用因子を発現し、抵抗をもたらすと考えられている
。

【００３２】 本発明はまた、レシピエントにおいて移植組織に抗する、前形成抗体又は発生
抗体へ抵抗する、ドナー以外の種由来の移植組織を提供する。例えば、亜致死濃
度の順応因子へ曝露させる条件の下で、ブタ胎児の中へヒト造血細胞を入れる。
上記の因子はブタ胎児へ注入される細胞により産生されるか、又はそのブタ若し
くは若雌ブタ／雌ブタにより産生され得る。顆粒球のような造血細胞は、顆粒球
に対する抗体を有するヒト宿主での破壊に抵抗するはずである。

【００３３】 本発明はまた、潜在的なドナー動物の内部で順応のレベルを分析及び検出する
方法及びキットを提供する。このアッセイは、ドナー臓器の移植前に予定のドナ
ー動物から得られる血液及び組織に対して実施される。分析には、レシピエント
順応誘導因子、例えば、ドナー動物中の免疫グロブリン、Ｂ細胞、及びＴ細胞の
検出が含まれる。他の分析には、予定ドナーから取られた循環する細胞及び組織
の、レシピエントの反応性抗体及び補体、又は反応性の細胞障害性Ｔ細胞による
溶解への抵抗性の in vitro 試験が含まれる。他の代わりの分析には、予定ドナ
ー由来の血液及び組織を、ヘムオキシゲナーゼ−１、Ａ−２０、及びｂｃｌ２の
ような、順応された臓器の内部で通常発現される保護遺伝子の過剰発現について
評価することが含まれる。Bach, F. H. et al., Nature Medicine 3 (2): 196-2
04 (1997)。

【００３４】 本発明はまた、順応の方法及び因子を評価し、本発明による順応の方法を改善
するための方法を提供する。 Ａ．移植臓器若しくは組織は、移植に先立って順応される。 本発明は、移植臓器若しくは組織がまだドナー動物内にある間に、移植に先立っ
てその移植臓器若しくは組織の順応を誘導する。移植に先立つ誘導は重要な利点
を提供する。臓器移植片の拒絶のリスクが有意に低下する。拒絶を予防する努力
に関連した、潜在コストと患者への合併症が有意に低下する。望まれるならば、
多数のドナー動物における順応を達成することへ多数の試行をすることが可能で
あり、最良の移植結果のしるしを示すドナーが異種移植片の供与のために選択さ
れ得る。

【００３５】 ドナー動物は哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、限定しないが、非ヒト霊
長動物、偶蹄目、食肉目、げっ歯目又はウサギ目であり得る。ブタ胎児が順応因
子の好ましいレシピエントである。

【００３６】 順応因子は、典型的には、抗体又は抗体産生細胞であるが、順応を誘導する他
の因子が含まれ、それには限定しないが、ドナー組織と反応性の抗体、ドナー内
皮と反応性の抗体、（ドナーがブタであるか又はブタ科の一員である場合）ブタ
組織若しくは内皮と反応性の抗体、形質細胞、Ｂリンパ球、ヒトＢリンパ球、条
件不死化Ｂリンパ球、抗αＧａｌ抗体、順応誘導因子を発現するように操作され
た細胞、順応誘導因子を発現する細胞を含んでなるハイブリドーマ、移植片組織
若しくは臓器の細胞と反応性のＴ細胞、パーフォリン、及び Bandeiraea simpli
cifolia レクチンが含まれる。この因子は、天然の単離因子であるか、又はそれ
はリガンドを発現するように操作された細胞、又は精製された操作リガンドであ
り得る。

【００３７】 順応因子は、異種移植レシピエント（例えば、ヒト又は他の哺乳動物）となる
種の一員から得られる場合がある。好ましい態様では、順応誘導因子は、後にレ
シピエントとなる個体から単離される。順応誘導因子のそれぞれを決定、単離、
そして操作する方法は、当業者によく知られている。

【００３８】 順応の方法は、少なくとも１６時間から１５０日までの、順応誘導因子への長
期の曝露を必要とする。この時点で、臓器の採取が実行される。 好ましい態様では、ブタの胎児が、成長の初期段階、好ましくは約４５日目で
注入される。しかしながら、成体の哺乳動物における順応も可能である。ドナー
は免疫不全状態であるに及ばないが、循環する順応誘導因子が、臓器及び組織の
順応を可能にするのに十分な時間の間ドナー中に存続することを可能にしなけれ
ばならない。しかしながら、免疫不全哺乳動物への注入が好ましい。

【００３９】 順応された異種移植臓器を達成する第一の工程は、順応誘導因子のドナー動物
への注入である。好ましくは、この免疫成分は、免疫前の成長段階でドナーへ導
入される。例えば、ドナー動物の細胞へ結合する亜致死レベルのリガンドを産生
する細胞をドナー動物へ注入する。このリガンドが順応を誘導する。細胞は、安
定なキメラ形成、即ち、異種移植片ドナー生物におけるレシピエント免疫系成分
の安定的な存在を許容する条件の下で注入される。後に、移植用の順応された臓
器を採取し、レシピエント動物への移植に適した条件下で、輸送培地へ入れる。

【００４０】 １例として、ブタ内皮と反応性の抗体を産生するようにプログラムされたＢ細
胞を免疫前ブタ胎児へ注入する。産生される低レベルの抗体がブタの内皮細胞へ
結合し、補体依存性の細胞毒性に対する順応若しくは抵抗を誘導する。次いで、
修飾されたドナーのブタから入手される心臓のような臓器を、例えば、ウィスコ
ンシン大学溶液のような輸送培地に入れ、ヒトレシピエントへ移植する。ヒトレ
シピエントには、抗αＧａｌ抗体を含む、ブタへ反応性の抗体があるにもかかわ
らず、この臓器は超急性拒絶へ抵抗する。

【００４１】 他の態様は、形質細胞や条件不死化Ｂリンパ球のような、１種又はそれ以上の
抗体の供給源を活用する。in vitro で無限に増殖するが、移植前には可死化（m
ortalized）される細胞を産生する。例えば、易熱性のＳＶ４０形質転換遺伝子
が挿入され得る。すると、この細胞は、３３℃で増殖するが、３７℃では増殖し
ない。形質転換遺伝子をｌｏｘＰ部位で囲むことによるような他の手段により、
さらなる安全手段が提供され得る。次いで、この形質転換遺伝子は、Ｃｒｅリコ
ンビナーゼを用いて除去され得る。Nakamura, J., et al., Transplantation 63
(11): 1541-1547 (1997)。抗体を発現する細胞は最終の異種移植片レシピエン
トからのものであり得るが、必ずしもそのレシピエントからでなくてもよい。順
応はレシピエント内の寛容の誘導には依存しない。むしろ、ドナーの臓器細胞に
おける抗アポトーシス遺伝子の長期発現に依存し得る。

【００４２】 追加の代替的な実施は、ドナー動物と反応するＴ細胞を活用する。細胞障害性
Ｔ細胞により産生され、標的細胞の細胞溶解の原因となるタンパク複合体である
、パーフォリンは、膜攻撃複合体と構造的に酷似している。細胞障害性の細胞ヘ
の抵抗性の増加が、パーフォリンヘの曝露により発現される。

【００４３】 本発明のもう１つの実施には、ドナー哺乳動物とは異なる種の組織若しくは細
胞の産生が含まれる。例えば、ヒト患者への注入に先立って順応されるヒト顆粒
球が産生される。すると、それらは、レシピエントに存在する前形成抗体若しく
は発生抗体による拒絶及び破壊に抵抗する。ヒト造血細胞（好ましくは、１０⁷
個／ブタ、ブタ１頭につき１０¹〜１０¹⁰の範囲）を、妊娠４５日目（妊娠１２
日目〜出生後７日の範囲）の免疫前ブタ胎児へ注入する。順応因子を産生する、
形質細胞、Ｂリンパ球、又はハイブリドーマ細胞のような細胞が、このブタ胎児
へ注入され得る。このヒト細胞は、後に、例えば、このブタの出生後に採取され
、レシピエントへの輸注若しくは移植に適正なやり方で調製される。この細胞又
はブタは、ヒト細胞内での順応を予測するアッセイで試験され得る。例えば、ヒ
ト細胞は、抗体による細胞毒性へのその抵抗性、又はプログラムされた死から細
胞を保護することが知られている遺伝子の発現について試験され得る。ブタは、
ヒト細胞と反応性の抗体の存在について試験され得る。

【００４４】 Ｂ．ドナー動物について順応を評価するアッセイ 本発明は、臓器の移植に先立ってドナー動物の順応を評価する方法を提供する。
このアッセイは、移植に先立つ順応の確認を可能にする。それはまた、臓器を順
応するために因子を注入される多数のドナー動物の比較と、最良の候補動物の選
択を提供する。このアッセイは、移植の試みの諸結果を向上させ、前形成された
免疫成分による異種移植片の拒絶のリスクを最小化する。

【００４５】 有効であるためには、このアッセイは、順応を予測することが必要であり、臓
器組織を移植のために保存することが必要である。ex vivo 灌流アッセイは、超
急性拒絶と拒絶への抵抗性を前決定するための最高標準法と考えられる。ex viv
o 灌流アッセイによれば、心臓のような臓器がランゲンドルフ装置において血清
若しくは血液とともに灌流される。順応されていない臓器は、数分後に機能を止
めてしまう。順応された臓器は数時間機能する。しかしながら、順応された臓器
は、この方法の後では移植に適さなくなる。

【００４６】 本発明によれば、順応についてのアッセイには、移植臓器以外の組織の短期 e
x vivo 灌流が含まれる。他のやり方では、推定されるドナー動物から得られる
血液細胞若しくは内皮細胞を補体依存性細胞毒性への抵抗性について試験するこ
とによって、順応を評価する。補体依存性細胞毒性アッセイでは、反応性で新鮮
な補体であることが知られている抗体とともに試験細胞をインキュベートする。
ある時間の後で、細胞の生存能力を決定する。同様の対照細胞を用いると、この
抗体及び補体はほとんどの細胞を殺傷するが、順応された細胞はより高い比率で
生き延びる。さらにもう１つの方法は、ドナー動物について注入された細胞の存
続を試験するか、又はドナー動物についてドナー動物組織と反応性の抗体若しく
は細胞を試験する。関連した方法は当技術分野でよく知られている。

【００４７】 Ｃ．ドナー動物内で順応を増強する方法 本発明は、種々の改良とさらなる順応刺激剤の同定を試験する系を提供する。こ
の系は、様々な因子及び細胞を試験動物へ注入し、後に、修飾された動物を順応
について評価することからなる。この系の例として、ブタ反応性抗体の多数の供
給源／分画を、順応を引き起こすその潜在可能性について比較する。各実験群に
は、特定の細胞の分画が注入されたブタ胎児が含まれる。後に、ドナー及び／又
は臓器を順応について評価する。順応についての試験の例には、心臓又は腎臓の
ような臓器の ex vivo 灌流と、異種移植片の非ヒト霊長動物への異所性移植が
含まれる。最適と考えられるのは、心臓の最も長期の機能をもたらす細胞分画で
あろう。本発明の追加の目的には、様々な系統のドナー動物及びトランスジェニ
ック動物を試験することが含まれる。

【００４８】 ＩＩ．順応された臓器若しくは組織をドナー動物において産生する方法 本発明は、レシピエントによる移植片の拒絶へ抵抗するように順応された移植臓
器若しくは組織を提供する。それはまた、そのような順応された臓器の産生法を
提供する。この方法によれば、臓器は、採取前に、ドナー動物の組織へ結合する
がその動物若しくは臓器へ修復不能な損傷は引き起こさない順応因子へ、反復的
又は慢性的なベースで曝露される。長期の曝露の後で、順応された臓器を採取し
、ヒトのようなレシピエントへの移植用に調製する。

【００４９】 好ましくは、リガンドは、反復ベースでドナーへ注入されるか、又はドナー動
物内で安定である細胞により産生される必要がある。同一若しくは代替の、又は
追加のリガンドが注入工程の繰り返しで注入される。好ましくは、ドナー動物は
、リガンドを受け入れるには、即ち、免疫学的にそれを拒絶しないためには、免
疫活性が低下した（免疫不全）状態にあるべきである。

【００５０】 リガンド注入の例として、免疫前ブタ胎児へヒト免疫グロブリンを注入する。
この免疫グロブリンは、超音波誘導を使用して、経皮注射により個々のブタへ注
射される。亜致死レベルの順応因子が注入される。

【００５１】 注入されるべき因子のレベルは、経験的な方法で前決定される。例えば、血清
分画を使用して、類似の成長段階にある少なくとも１匹以上の胎児へ増加する濃
度のものを投与する。ＬＣＤ₅₀を決定し、好ましくは、順応処置として使用する
。ｎが致死量の９０％以下である、任意のＬＣＤ_nが順応因子の用量として有用
である。

【００５２】 免疫グロブリンには、ブタ内皮細胞ヘ特異的に結合する、ＩｇＧ及びＩｇＭを
包含する抗体が含まれる。そのような抗体の例には、ヒト及び旧世界霊長動物に
存在する抗αＧａｌが含まれる。Galili, U., et al., Blood, 82 (8): 2485-24
93 (1993)。αＧａｌはこれらの動物では発現していないが、ブタを含む、他の
ほとんどの種で発現している。免疫グロブリンには、他の異種抗原に対する抗体
が含まれる場合がある。

【００５３】 そのような抗体の調製、又はそのような抗体が豊富な分画の単離の方法は、当
業者によく知られている。例えば、αＧａｌを含有する免疫吸着カラムに血清を
通すことが可能である。カラムを洗浄すると、付着した抗αＧａｌ抗体が溶出さ
れる。活性抗体フラグメント若しくは活性単一ドナー抗体も利用され得る。

【００５４】 リガンドのもう１つの例は、Bandeiraea simplicifolia レクチンであろう。
これは、ブタ内皮細胞上で発現されるαＧａｌを含む、αＧａｌへ結合する。Gr
ehan, J. F., et al., Transplant. Proc. 32 (5): 975 (2000)。このレクチン
は、低レベル（１００μｇ／ｍＬ未満）で推定ドナーのブタへ注入される。それ
は、３〜３０日の間、連日ベースで注入される。

【００５５】 抗体の産生へ方向づけられたＢ細胞、又はドナー組織と反応性の抗体を産生す
る形質細胞を、安定な生着を可能にし、亜致死量の抗体を提供する条件の下で注
入する。１例として、ヒトＢリンパ球（２ｘ１０⁸個／ｋｇ，１ｘ１０⁶／ｋｇ〜
４ｘ１０⁹／ｋｇの範囲）が、超音波誘導により、無菌条件下で妊娠４５日目（
３０〜８０日の範囲）のブタ胎児へ注入される。約１％のヒトＢ細胞がαＧａｌ
への抗体の産生へ方向づけられると推定される。このＢ細胞が免疫前ブタ胎児へ
注入されるので、ブタ胎児はこのＢ細胞を受入れ、そのような細胞に対して寛容
になるだろう。

【００５６】 順応誘導因子は、リガンドであれ、免疫細胞を含有する懸濁液であれ、レシピ
エントには無関係な個体に由来し得る。従って、細胞には、無関係のヒト又は他
の種由来のＢ細胞が含まれ得る。例えば、Ｏ型個体由来のヒトＢ細胞をＡ若しく
はＢ型のヒヒ胎児へ注入し得る。低レベルの抗Ａ−若しくは抗−Ｂにより順応が
誘導される。次いで、このヒヒの出生後に、移植臓器を移植用に採取し得る。注
入される細胞には、ハイブリドーマ細胞のような不死化細胞が含まれ得る。１つ
の態様によれば、順応誘導細胞、好ましくは、Ｂリンパ球は、チミジンキナーゼ
又はアデノシンデアミナーゼのような、自殺遺伝子を含有するものである。Cohe
n, J. L. et al., Hum. Gene Ther. 11 (18): 2473-2481 (2000)。次いで、この
細胞は、移植に先立って、適切なプロドラッグで除去され得る。

【００５７】 好ましい態様では、順応誘導因子は、レシピエントと同じ種に由来する。もう
１つの好ましい態様によれば、順応誘導因子は、最終レシピエントとなる個体に
由来する。順応は移植臓器の特性であるので、リンパ球をレシピエントへ戻して
養子移入することは不可欠ではない。

【００５８】 長期曝露（好ましくは２０日以上、１６時間〜１５０日の範囲）の後で、移植
に適したドナー臓器の入手を可能にする条件の下で、ドナー動物を安楽死させる
。例えば、移植用の臓器がブタ心臓であれば、順応された組織を有するドナーの
ブタを、イソフルランで鎮静化させ、麻酔をかける。無菌条件の下で開胸し、（
マンニトール、塩化カリウム、重炭酸ナトリウムを含有するスタンフォード溶液
のような）冷 Cardioplegia 溶液をブタ大動脈へ注入し、心臓を氷冷生理食塩水
に詰める。心臓を除去し、Eurocollins 溶液（Steffen, R., et al., Transpl.
Int. 3(3): 133-136 (1990)）又はウィスコンシン大学溶液（Belzer, F. O. 及
び Southard, J. H. Transplantation 45 (4): 673-676 (1988)）のような輸送
培地で灌流する。臓器保存溶液は、レシピエントへの移植の間に臓器若しくは組
織の生存能力を維持する、必須アミノ酸、炭水化物、及び電解質を含有する。

【００５９】 移植に先立って移植のために順応され得る臓器には、例えば、限定しないが、
心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、心−肺、腸、脾臓、又は胸腺が含まれる。順応さ
れ得る組織には、限定しないが、骨、皮膚、髪、眼、退化した色素細胞、神経組
織、骨格筋、筋細胞、膵島、肝細胞、胚性若しくは成体幹細胞、及び造血細胞が
含まれる。

【００６０】 本発明のもう１つの実施は、ドナー哺乳動物とは異なる種の順応された組織若
しくは細胞の産生に関する。そのような組織若しくは細胞には、限定しないが、
造骨細胞、破骨細胞、皮膚、皮膚上皮細胞、毛包細胞、眼、神経細胞、骨格筋、
平滑筋細胞、心筋細胞、膵島、肝細胞、幹細胞、前駆細胞、又は造血細胞が含ま
れる。そのような細胞は、ドナー以外の種の動物から得られる場合がある。好ま
しくは、それらは、最終レシピエントと同一の種からであるか、又はレシピエン
ト自身からのものであろう。ドナー動物は、本発明のドナーのいずれでも可能で
ある。

【００６１】 本発明による順応因子は、順応用の細胞の投与に（１時間〜２日間）先立つか
、順応用の細胞と同時にか、又は順応用の細胞が投与された直後に投与され得る
。好ましい態様では、順応用の細胞と順応誘導因子が同時に、一緒に混合されて
投与されるか、又は互いに数分以内に投与される。順応誘導因子は本発明による
因子であるが、順応されるべき細胞が得られる種由来の細胞を認識する抗体、抗
体産生細胞、又はＴ細胞をさらに包含する場合がある。

【００６２】 本発明による長期曝露の後で、ドナー哺乳動物と異なる種の細胞の順応状態を
、本発明の方法により、例えば、順応用に導入される細胞に特異的な抗体をドナ
ー中で探すことによって、評価し得る。最後に、順応された細胞若しくは組織を
採取する。

【００６３】 順応用に導入された細胞又はその子孫は、ポジティブ法かネガティブ法により
、ドナー細胞から分離され得る。例えば、ドナーは、条件致死遺伝子、例えば、
チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子で操作された種に由来し得る。この遺
伝子を収容する細胞は、ガンシクロビルに対して感受性である。Moolten と Wel
ls, Cancer Res. 46: 5276-5281 (1986); Reardon, J. Biol. Chem. 264: 19039
-44 (1989), 及び Patil et al., Breast Can. Res. Treat. 62: 109-115。採取
するのと同時に、ガンシクロビルへの曝露により、ドナー細胞を殺傷し得る。他
のやり方では、順応される細胞を、ドナーへ投与する前に、ポジティブ選択で形
質転換する。それらは、薬剤耐性のような選択マーカーか、又は発現時に細胞膜
上に位置する抗原を発現するように操作され得る。そうすると、この抗原に特異
的な抗体が、この抗原を発現する細胞を探り出す可能性がある。上記と、同様の
アプローチは、当技術分野の当業者によく知られている。

【００６４】 例えば、ヒト患者への注入に先立って順応される、ヒト顆粒球を産生し得る。
すると、それらは、レシピエント中に存在する前形成抗体若しくは発生抗体によ
る拒絶及び破壊に抵抗する。ヒト造血細胞（好ましくは、１０⁷個／ブタ、ブタ
１頭につき１０¹〜１０¹⁰の範囲）を、妊娠４５日目（妊娠１２日目〜出生後７
日の範囲）の免疫前ブタ胎児へ注入する。順応因子を産生する、形質細胞、Ｂリ
ンパ球、又はハイブリドーマ細胞のような順応誘導因子が、このブタ胎児へ注入
され得る。このヒト細胞は、後に、例えば、このブタの出生後に採取され、レシ
ピエントへの輸注若しくは移植に適正なやり方で調製される。この細胞又はブタ
は、ヒト細胞内での順応を予測するアッセイで試験され得る。例えば、ヒト細胞
は、抗体による細胞毒性への抵抗性、又はプログラムされた死から細胞を保護す
ることが知られている遺伝子の発現について試験され得る。このブタは、ヒト細
胞と反応性の抗体の存在について試験され得る。

【００６５】 ブタは順応に理想的な種のドナー哺乳動物であるが、本発明は、多くの動物の
いずれを用いても容易に実施され得る。代用物、即ちドナーとして潜在的に使用
し得る動物には、限定しないが、以下に列挙されるものが含まれる。ある動物は
選択使用への利点を提供することが知られている。

【００６６】 好ましいドナーは哺乳動物である。哺乳類綱の３９の主要な目の中で、ヒト臓
器レシピエントの代用動物として特に適していると思われるのは、霊長目、偶蹄
目、食肉目、げっ歯目、及びウサギ目の５目である。

【００６７】 ヒト以外の霊長動物は、臓器機能の視点から適している。タンパク質のアミノ
酸配列を決定すると、典型的には、ヒトと９０〜９８％の相同性を示す。肝臓及
び心臓のような臓器は、ヒトへ移植されたときに良好に機能する。霊長動物はヒ
トと調和する、即ち、ヒトレシピエントは、典型的には、霊長動物の組織への前
形成抗体を有さないのである。

【００６８】 下等霊長動物の中には、キツネザルのように、短い妊娠期間（１３２〜１３４
日）を有するものがあるが、高等霊長動物（チンパンジー、ゴリラ）は、ヒトの
それに近い妊娠期間（２６７日）を有する。

【００６９】 偶蹄目、偶数の蹄をもつ有蹄動物には、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシのようない
くつかの家畜動物が含まれる。数種の成員由来の臓器若しくはタンパク質は、ヒ
トにおいて機能して有用であることが証明され、移植を提唱されてきた。例えば
、ブタ及びウシのインスリン、豚皮、ヒツジの心臓などは、治療使用に使用され
ているか又は提唱されてきた。

【００７０】 妊娠期間はこの目の成員間で異なる。ブタは、１１４日の期間を有する。ヒツ
ジは１４５日の期間を有する。ウシは２８２日の妊娠期間を有する。ウシは、代
用寛容導入に潜在的に有用である特徴を提供する。すべての同腹子で胎盤血液が
共有されている。従って、１匹の子牛へ注入されたヒト細胞は、同腹子のすべて
へ寛容をもたらすことになる。

【００７１】 イヌ、ネコ、等を含む食肉目は、代用寛容導入に潜在的に有利であるいくつか
の特徴を有する。多くは短い妊娠期間（ネコは約６５日間、イヌは６３日間）を
有し、新生児は比較的良好に発達する。イヌ及びネコの免疫系はヒトの免疫系に
酷似している。ネコのネコ免疫不全ウイルスモデルは、ＡＩＤＳの研究に利用し
得る数少ない動物モデルの１つである。

【００７２】 ネコ及びイヌは、骨髄、肺、腸、及び骨の移植を含む、移植の大動物モデルと
して一般に使用されてきた。Ladiges et al., Lab. Anim. Sci. 40: 11-15 (199
0); 及び Henry, et al., Am. J. Vet. Res., 46: 1714-20 (1985)。

【００７３】 ラット、マウス、等を含むげっ歯目は、その短い妊娠期間と成熟への急成長の
ために、代用寛容導入に潜在的に有用である。例えば、ラットはわずか２１日の
妊娠期間を有し、たった６週で成熟する。げっ歯目の免疫系は出生時には非常に
未熟であるので、子宮内注射よりも、出生後２４時間以内に細胞を注射すること
によって寛容を誘導し得る。

【００７４】 家ウサギと野ウサギを含むウサギ目は、かつてはげっ歯目の一部とみなされて
いたが、最近では分けられている。それらは、ごく短い妊娠期間短い成熟期間を
げっ歯目と共有する。従って、これらも、機能的な臓器若しくは組織提供する好
ましいトランスジェニック系統を含む、新規ドナー系統の開発に有用であろう。
これらの動物は、げっ歯目よりサイズが大きいので、より良好な代用候補である
。

【００７５】 理想的な代用種は、好ましくは、予定の臓器移植片レシピエントに系統学的に
近くあるべきである。また、予定移植片の生理学は、移植片により置換され得る
、臓器移植片レシピエントの臓器若しくは組織の生理学に似ているべきである。

【００７６】 追加の考察が代用寛容導入の種の選択に影響する。移植される移植片は、臓器
移植片レシピエント内の対応する移植片とほぼ同一のサイズでなければならない
。

【００７７】 従って、上記に記載の追加の考察では、ブタは霊長動物より好ましい代用物に
なる。なぜなら、ブタはほんの１１４日の妊娠期間を有し、典型的には、４月齢
までに５９ｋｇを超えて成長するからである。

【００７８】 免疫前の胎児動物は、Ｂ細胞若しくは形質細胞の注入に理想的な環境を提供す
る。順応誘導因子を注入され得る最も早期の胎児は、循環系と拍動する心臓を有
する第１期であろう。胎児の成長は、様々な種で様々な速度で進行する。しかし
ながら、この期は、カーネギー期１０（４〜１２体節）として当技術分野で知ら
れている。この期でのヒト胎児は２〜３．５ｍｍの長さである。William J. Lar
sen,「ヒト胎生学の本質（ESSENTIALS OF HUMAN EMBRYOLOGY）」チャーチル・リ
ビングストン、P. xi (1998)。

【００７９】 ドナーが胎児であるときは、母性因子が順応へ貢献し得る。多くの因子が母体
の循環系から胎児の循環系へ輸送される。例えば、ＩｇＧの４種のサブクラスが
すべて胎盤膜を通って輸送される。Coulam et al.,編「免疫産科学（IMMUNOLOGI
CAL OBSTETRICS）」p. 295, ＷＷ ノートン＆Ｃｏ．（1992）。胎盤輸送は第一
期の中間点（ブタでは約１７日間）で始まり、第二期全体（ブタでは約７６日）
で低レベルで継続する。in vitro では、低レベルのＩｇＧがブタ内皮細胞を順
応することが示された。Dorling et al., (1998), 同上。従って、注入により導
入されるか又は母体で産生される母体の循環ＩｇＧ又は他の因子が胎盤を越えて
胎児へ輸送され、胎児の順応をもたらすのだろう。

【００８０】 順応誘導因子、例えば、Ｂ細胞若しくは形質細胞が安定な生着を達成して抗ド
ナー抗体を産生し得る、別の方法がある。例えば、化学療法若しくは放射線によ
り免疫不全になっているか、又は重症複合免疫不全症のような先天性障害により
免疫不全になっている動物へ、Ｂ細胞を注入し得る。哺乳動物は、ヒト骨髄移植
に使用される方法に類似して、骨髄若しくは肝細胞移植物を受け取る場合がある
。Armitage, J. O., Blood 73 (7): 1749-1758 (1989)。重症複合免疫不全症の
ような先天性免疫不全状態を有する哺乳動物へ、ヒト造血細胞のような異種細胞
を注入し得る。McCune, J. M., et al., Immunol. Rev. 124: 45-62 (1991)。

【００８１】 安定な生着はまた、ドナー動物により抗原としては認識されない細胞をドナー
動物へ注入することによっても達成され得る。１例として、ブタ内皮細胞と反応
性の抗体を産生する遺伝子で、ブタＢ細胞をトランスフェクトし得る。次いで、
上記の細胞を、ドナー動物として使用され得るブタへ注入し得る。

【００８２】 特定の状況下では、当該因子は、当業者に既知の経路、例えば、経口、静脈内
、筋肉内、動脈内、脊髄内、鞘内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、舌下、又は直
腸により投与され得る。順応誘導因子の好ましい投与方法は、注入による。

【００８３】 当該因子は、製剤的に許容される製剤でデリバリーされる。それらは、好まし
くは、生理学的に適合した緩衝液の水溶液、例えばハンクス溶液、リンゲル液、
又は緩衝化生理食塩水である。他のやり方では、散剤、ゲル、エマルジョンが投
与され得る。製剤はデリバリーの経路に依存し、当技術分野の当業者によく知ら
れている。製剤と投与法に関する考察については、「レミントン製薬学」（マッ
ク・パブリッシング社、イーストン、ＰＡ）を参照のこと。 ＩＩＩ．移植に先立って移植臓器の順応を評価する方法 上記の方法が達成された後で、ドナーのブタ、又はドナーのブタ由来の組織を
分析し、順応が達成されたかどうかを決定し、その順応を定量すれば、最適の有
用性が達成されるだろう。一般に、この試験は比較的速やかで、費用効果が優れ
ているべきである。それは移植片の生存性を予測すべきである。それは移植され
る臓器に干渉してはならない。

【００８４】 ドナー動物について順応の予測証拠を分析すれば、３つの基本目標が達成され
るだろう。第一に、この分析は、順応の品質保証及び確認を提供する。試験され
るドナー動物において順応が達成されていなければ、移植を延期するか、又は別
の動物を使用し得る。第二に、順応の試験は、移植片が特定の患者に特異的に順
応されるかどうかを確認し得る。第三に、この分析は、多数の潜在的なドナー動
物の比較と移植に最も適した動物の選択を可能にする。

【００８５】 順応の分析は、４つの基本的なアプローチ：拒絶の in vitro アッセイ、拒絶
に抗する保護をもたらす遺伝子を組織内に検出すること、臓器採取に先立って、
注入された細胞若しくは免疫グロブリンをドナー動物内に検出すること、及びド
ナー動物と反応性の抗体を試験動物内に検出すること、のいずれでも達成され得
る。

【００８６】 第一のアプローチでは、ドナー動物由来の組織を in vitro で評価する。レシ
ピエント、又はレシピエントと同様の被感作動物由来の血漿若しくは血清を、試
験動物由来の組織全体に注入する。順応が達成されていなければ、この組織は灌
流後すぐに機能を停止するだろう。しかしながら、順応が達成されていれば、組
織は機能し続ける。１例として、ランゲンドルフ・アッセイでは、細胞障害性抗
体を含有する血漿、血清、又は血液とともに灌流された心臓移植片は、約２０分
で拍動を停止する。しかしながら、順応が達成されていれば、この移植片は２〜
４時間拍動するものである。それ故、移植のために得られる心臓移植片を、被感
作血漿とともに灌流し得る。４５〜６０分経ってもそれが依然として拍動してい
れば、順応が証明される。そうなれば、心臓麻痺を用いてこの心臓移植片を中断
し、移植されるまで輸送培地で灌流する。実施例２及び４を参照のこと。

【００８７】 もう１つの好ましい態様では、ドナー動物由来のもう１つの臓器を試験する。
例えば、移植臓器が腎臓であれば、心臓又は対側性の腎臓について、ランゲンド
ルフ・アッセイを用いて機能を試験し得る。試験臓器が、順応誘導工程を受けた
同等の臓器が生存可能と考えられる典型的な時間より、少なくとも５０％長い時
間の間、好ましくは少なくとも１００％長い時間の間生存可能であるとみなされ
続ければ、順応が達成されているとみなされるだろう。

【００８８】 拒絶 in vitro 試験のもう１つの実施では、キメラのドナー哺乳動物由来の末
梢血白血球若しくは内皮細胞が、ドナー哺乳動物の組織及び補体へ特異的に結合
する抗体を含有する血清とともにインキュベートされる。ドナー由来の細胞の補
体介在性溶解を判定する。順応が達成されていれば、同様の非修飾動物の溶解に
比較して、溶解が有意に低下する。実施例３も参照のこと。

【００８９】 生存能力は別の色素を用いても判定され得る。例えば、死細胞はヨウ化プロピ
ジウム（propidium iodide）を蓄積するので、フローサイトメトリーにより検出
され得る。細胞は放射活性クロム−５１で標識し得る。殺傷されると、この放射
活性が放出される。細胞及び膜を除去した後で、遊離の放射活性を測定する。Sh
imizu, Y. et al., J. Immunol. Methods 164: 69-77 (1993)。実施例５を参照
のこと。

【００９０】 順応について分析する第二の基本アプローチは、修飾された動物由来の組織に
ついて、超急性拒絶から組織を保護する遺伝子の発現を試験する。これらの遺伝
子産物は、アポトーシスによる細胞死に対して細胞を抵抗性にし、サイトカイン
、凝血原、及び接着分子を含む炎症促進遺伝子の発現を妨げる。これらの遺伝子
の例には、ヘムオキシゲナーゼ、Ａ−２０、及びＢｃｌ−２が含まれる。それら
は、被感作レシピエントにおける長期移植の後で順応した移植片において観察さ
れている。

【００９１】 本発明によれば、１つの態様において、前形成された抗ブタ抗体への順応を誘
導するように上記のように修飾されたブタのような、試験ドナー動物から生検を
採取する。生検は、心臓左心室の穿刺生検のように、移植臓器に由来し得る。移
植臓器が心臓であれば、腎臓、皮膚、又は血液のサンプルからの生検であり得る
。上記遺伝子の存在について、免疫組織化学、ウェスタンブロット、及びＥＬＩ
ＳＡアッセイのような標準的な抗体ベースのアッセイ、並びにＲＮＡを使用する
ノーザンブロット及びポリメラーゼ連鎖反応アッセイを使用して、上記遺伝子の
存在についてこの組織を試験する。結果を陽性及び陰性対照と比べる。Ｂｃｌ−
２のモノクローナル抗体は、トランスダクション・ラボラトリーズ（レキシント
ン、ＫＹ）から、ヘムオキシゲナーゼのモノクローナル抗体は、ＳｔｒｅｓｓＧ
ｅｎ（ビクトリア、ＢＣ、カナダ）から入手し得る。Ａ−２０に対するモノクロ
ーナル抗体は、Ｖ．Ｄｉｘｉｔ博士（アン・アーバー、ＭＩ）により調製された
。プローブは設計し得るか、又はプライマーは設計及び購入し得るか、又は当技
術分野で周知の方法によりＤＮＡ合成機で合成し得る。ある臓器をまだドナー中
にある間に順応した例がないので、上記遺伝子の発現亢進について移植前にドナ
ー臓器を試験する理由がなかった。また、順応の証拠について、ドナー動物に由
来する移植臓器以外の組織を試験する理由もなかった。

【００９２】 順応の検出及び定量への第三のアプローチは、細胞が注入されたか、又は順応
誘導因子の免疫グロブリンで処理されたドナー動物の内部でキメラ形成の証拠を
評価する。これらのパラメーターは、容易にアッセイされ、順応の間接証拠を提
供し得る。ドナー動物が注入細胞を拒絶し、免疫グロブリンが検出されなければ
、臓器若しくは組織の順応が達成された可能性は低い。同様に、それらの存続は
順応の予兆となる。

【００９３】 胎児のときにＢ細胞を注入されたブタのような修飾ドナー動物から、抗凝固処
理された血液若しくは血清のサンプルを得る。末梢血のリンパ球をキメラリンパ
球について染色し、細胞数を分析フローサイトメトリーで定量する。１例として
、ブタにヒトＢ細胞を注入すれば、この修飾されたブタ由来のリンパ球を、ヒト
Ｂリンパ球について、ＣＤ２０への特異抗体で染色し得る。ＣＤ２０は、順応因
子を提供する種に特異的である。キメラ形成の量を、適正な陽性及び陰性対照で
比較する。他のやり方では、注入された細胞にのみ存在するＤＮＡについてリン
パ球をアッセイする。ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応によるか、又は制限断片
長多型により検出される。

【００９４】 もう１つの態様によれば、ドナー動物へ注入された細胞は、容易に検出される
マーカーで標識される。例えば、注入された細胞は、グリーン蛍光タンパク質（
ＧＦＰ）を含有するトランス遺伝子を含有し得る。修飾ドナー動物由来の血液を
、蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリーにより、ＧＦＰについて直接試験する。

【００９５】 もう１つの態様では、注入された細胞により産生される免疫グロブリンについ
て血清をアッセイする。例えば、ヒト免疫グロブリンは、ＥＬＩＳＡアッセイの
ような標準アッセイを使用して定量され得る。実施例６を参照のこと。

【００９６】 修飾ドナー動物を順応について分析する第四のアプローチは、ドナー組織へ特
異的に結合する抗体を産生するドナー組織若しくは細胞に特異的な抗体の検出に
よる。ブタ内皮細胞と反応性のヒトＢ細胞を注入したブタのような、順応誘導因
子で前処置したドナー動物から、血清又は抗凝固処理血液を入手する。この血清
をブタ内皮細胞とともに培養する。この細胞を洗浄し、ペルオキシダーゼ共役抗
ヒトＩｇＧ及びＩｇＭに次いで、適正な基質で標識する。低レベルの抗ブタ抗体
の存在が陽性の結果である。この値を適正な陰性及び陽性対照と比較する。他の
やり方では、修飾ドナー動物から入手されるリンパ球を培養で維持する。消費さ
れた上澄液を、抗ドナー抗体の産生についてアッセイする。他のやり方では、修
飾ドナー動物由来の１種又はそれ以上の組織から免疫グロブリンを単離する。例
えば、移植臓器が心臓であれば、修飾動物から腎臓を除去し、グリシン緩衝液の
ような酸性緩衝液（ｐＨ２〜ｐＨ４）で灌流する。溶出液において回収される抗
体を抗ドナー抗体についてアッセイする。

【００９７】 ＩＶ．順応法を改善する方法 本発明は、ドナー臓器の順応への改善を試験すること、特に、順応因子を試験す
るための実験系を提供する。特に、本発明は、順応の定量化を考慮する。

【００９８】 この系の実施の１例として、抗ブタ抗体の多数の供給源をアッセイし、ブタ異
種移植片の最適順応を創出する。抗体の潜在的な供給源には、非感作ヒトから単
離されるＢ細胞、被感作ヒトから単離されるＢ細胞、ヒツジから単離されるＢ細
胞、αＧａｌへの抗体を産生することが知られているＢ細胞系、Bandeiraea sim
plicifolia を含有するリポソーム、等が含まれる。免疫前ブタ胎児の同腹仔へ
、超音波誘導を使用して、毒性によりブタ胎児が流産されるまで、増加用量の抗
体若しくは抗体発現細胞を注入する。致死量の５０％のような亜致死量の試験物
質（source）を使用して、ブタ胎児にこの試験物質を注入する。ブタの出産、又
は雌ブタの帝王切開の後で、上記の試験のいずれかを使用して、この試験ブタを
順応についてアッセイする。様々な年齢で適正なブタから心臓移植片を採取し、
ヒト血液のような被感作血漿若しくは血液でその移植片を灌流するランゲンドル
フ・アッセイにより試験する。ランゲンドルフ・アッセイで最も長期の機能を提
供し、出産後の順応の存続を提供するのが、最適な抗体若しくは抗体産生細胞で
ある。試験した順応誘導物質のごく一部を、ヒヒのような被感作レシピエントへ
の異種移植でさらに試験する。

【００９９】 この系はまた、様々な系統のブタ、トランスジェニックブタ、又は他の哺乳動
物を含む、順応用の動物の供給源を試験するためにも使用され得る。 以上のように一般的に記載された本発明は、以下の実施例を参照にすればさら
に容易に理解されるだろう。実施例は、説明のために提供され、本発明を限定す
るものではない、

【０１００】

【実施例】

実施例１．キメラブタを使用する、被感作ヒツジにおけるＨＡＲの予防 方法。妊娠４５日目の免疫前ブタ胎児へ、ヒツジ（レシピエントヒツジか、無関
係なヒツジのいずれか）から得られるリンパ球の懸濁液を注入することによって
、３匹のドナーブタでキメラ形成を誘導した。この懸濁液には、ブタ細胞と反応
性の抗体を産生するようにプログラムされたＢ細胞が含まれる。後にブタの心臓
をドナーから入手し、異所性ブタ心臓移植を実施した。

【０１０１】 結果。結果を表１に示す。被感作レシピエントにおいて、非キメラ対照が０．
５〜２日間で血管性拒絶されたのに比較して、キメラ移植片は、３＋、９＋及び
２５日目に拒絶された。

【０１０２】 移植片の長期生存は寛容によるのではなかった。実際、第二の被感作ヒツジは
、移植後７日までにブタへの細胞障害性抗体の１：２０００より高い力価を示し
たが、それでも適正に機能し続けたのである。

【０１０３】 第三の実験移植は、キメラ形成に使用したヒツジとは無関係のヒツジであった
。移植に先立って、それをブタリンパ球で３回意図的に感作した。 結論。キメラ形成は、被感作ヒツジにおける超急性拒絶に対する保護を提供す
るようだ。第三のレシピエントは、この順応が個々のヒツジの機能ではないこと
を示唆する。観察された移植片生存の長期化が寛容の誘導のためであった可能性
はきわめて低い。実際、レシピエントの１つは、典型的な二次セット感作を示し
た。二次セット感作とは、抗原への反復曝露に後続する免疫反応を意味する。そ
れは、典型的には、より速やかで、より高力価で、記憶細胞とＩｇＧが関与する
。

【０１０４】

【表１】

【０１０５】 実施例２．被感作ヒツジ血漿を用いたランゲンドルフでの、ブタ心臓に対する
キメラヒツジの機能 この試験では、キメラブタ心臓についてランゲンドルフ装置における機能を評価
し、非キメラ心臓と比較した。これまでの試験は、このアッセイが in vivo 機
能を予兆することが示した。

【０１０６】 ヒツジ骨髄を調製し、妊娠４５日目のブタ胎児へ注入した。所定の期間で、こ
のブタを帝王切開により摘出した。クラスＩ組織適合性抗原に特異的なプライマ
ーを利用するポリメラーゼ連鎖反応とフローサイトメトリーにより、キメラ形成
について血液を分析した。キメラ若しくは非キメラのブタから心臓移植片を単離
し、ランゲンドルフ装置に懸濁した。移植片の冠動脈をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｉｎｓ
ｌｅｉｔ溶液で灌流した。３０分の拍動後、非感作のヒツジ、又はブタリンパ球
で３〜５回感作したヒツジからの血漿を加えた。ヒツジも感作に使用したブタの
リンパ球も、キメラ心臓のヒツジ若しくはブタとは無関係であった。補体依存性
リンパ球毒性アッセイは、被感作ヒツジの血漿が３２〜１２８の力価を有するこ
とを示した。移植片について、移植片が拍動を停止する（１分あたり３０拍動未
満）までの心拍数、灌流圧、及び、冠流量を分析した。

【０１０７】 結果：非感作ヒツジ由来の血漿で灌流した正常な対照心臓は４時間もの間機能
した。高度に感作されたヒツジ由来の血漿で灌流された正常な対照心臓は、１９
＋／−１２分（７〜４０分、ｎ＝６）で拍動を停止した。これには、キメラ形成
が低い（１％未満）ブタ２頭とキメラ形成が検出されない注射された雌ブタ由来
のブタ１頭が含まれた。キメラ（フローサイトメトリーによると、３〜１１％）
ブタ由来の心臓は１８３＋／−４６分（１３７〜２２９分、ｎ＝３）の間拍動す
る。この差は有意であった（Ｐ＜０．０００１）。免疫蛍光染色は、キメラ心臓
の血管にＩｇＧ及びＩｇＭの沈積がより少ないことを示した。

【０１０８】 結論：高力価の細胞障害性抗ブタ抗体の存在下で、正常のブタ心臓が２０分未
満で拍動を停止したのに対し、キメラ心臓は、３時間拍動を続けた。拒絶への抵
抗は、循環する因子若しくは細胞よりは、心臓移植片の内部にある因子に依存し
た。この保護効果は、特定のヒツジ又は特定のブタに特異的なものではなかった
。灌流用の血漿のために使用したヒツジは、心臓の供給源となったブタとは無関
係なブタのリンパ球で感作された。このヒツジもブタ胎児へ注入した細胞を有す
るヒツジとは無関係であった。

【０１０９】 最小のキメラ形成を有する１頭のブタと、注射された雌ブタ由来のキメラ形成
が検出されない２頭のブタは、順応の証拠を示さず、その心臓移植片は、被感作
ヒツジ由来の血漿を加えるとすぐに拍動を停止した。上記の観察事実は、臓器入
手に先立ってブタを分析することの価値を証明している。

【０１１０】 実施例３．キメラブタにおける白血球の順応 方法：正常なブタと免疫前胎児期でヒツジ骨髄を注射されたキメラブタから末梢
血リンパ球を得た。このリンパ球を、被感作ヒツジ由来の力価検定した血清と、
αＧａｌへの細胞障害性抗体を含有するヒト血清とともにインキュベートした。
新鮮な家兎補体を加えた。トリパンブルーで細胞毒性を判定した。２０％又はそ
れより高い細胞毒性を有する最大希釈で力価を決定した。

【０１１１】 結果：３頭の試験ブタの末梢血液は、２．７％（７２−３）〜４．６％（７２
−５）へ変化する、ヒツジ細胞とのキメラ形成を示した。 この３頭のキメラブタ由来の末梢血リンパ球は、被感作血清による溶解に対し
て少なくとも部分的な抵抗性を有する。対照ブタリンパ球の１００％溶解を引き
起こす血清の希釈度で、それはキメラブタ由来リンパ球の１１％、３１％及び４
７％しか溶解を引き起こさなかった。図１を参照のこと。

【０１１２】 ブタ７２−５の順応を、二次感作ヒツジ由来の血清を用いたリンパ球の溶解に
より確認した。正常ブタリンパ球の９０％溶解を引き起こす希釈度で、この血清
は、キメラブタ由来のリンパ球の約１５％しか溶解を引き起こさなかった。図２
を参照のこと。

【０１１３】 結論：キメラブタ由来の末梢血リンパ球は、補体介在性細胞毒性へ抵抗を示し
た。この保護は、ヒツジリンパ球の存在では説明し得ない。なぜなら、キメラ形
成が５％未満だったからである。リンパ球の最大の順応を示す、子ブタ７２−５
由来の心臓について、ヒト血液を用いる ex vivo 灌流試験において順応を試験
した。

【０１１４】 実施例４．ヒツジ因子により順応されたブタ心臓の、ヒト血液で灌流される場
合の長期機能 方法：実施例３に記載のように、免疫前ブタ胎児にヒツジ骨髄を注入した。出生
後、ＰＣＲ及びフローサイトメトリーにより、その血液をヒツジ細胞とのキメラ
形成について分析する。実施例３に示すように、補体依存性抗体細胞障害性への
抵抗を測定することによって順応を評価した。最良のキメラブタ（７２−５）と
対照ブタ由来の心臓外植片を、ランゲンドルフ装置を使用して、ヒトボランティ
ア（Ｂ型）由来の血液と ex vivo で灌流した。J. J. Dunning, et al., Eur. J
. Cardiothorac Surg. 8: 204-206 (1994)。心機能の時間を判定した。心臓の切
片をホルマリンで固定し、定常のヘマトキシリン及びエオジン切片を用いて評価
した。

【０１１５】 結果：Dunning, 同上、による試験結果に一致して、対照のブタ心臓は、ヒト
全血での灌流の２０分以内に徐脈になった。心室はその時点で停止した。同じボ
ランティア由来のヒト血液を（ヒツジ骨髄を注射した）キメラブタ由来の心臓移
植片に灌流させると、それははじめやや減速を示した（１３２／分から７０／分
へ）。しかしながら、２０分までには、その速度は初速度の８０％にまで回復し
た。８０分までには、その速度は初速度の１００％へ回復した。この心臓は４時
間の間強く拍動し続け、その時点でアッセイをやめた。図３を参照のこと。

【０１１６】 対照移植片の組織学は、血小板の血栓とフィブリン、好中球の辺縁化、及び間
質の出血を含む、超急性拒絶の証拠を示した。筋繊維には、超好酸性の細胞質、
濃縮した核、及び空胞化を伴う、虚血の証拠があった。対照的に、実験心臓の切
片は、血栓も、好中球辺縁化も、虚血も示さなかった。ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｃ
３、及びＣ９について免疫蛍光染色を実施した。キメラブタ由来の心臓は、対照
心臓よりＩｇＭ、Ｃ３及びＣ９の沈積が少なかった。ＩｇＧ沈積でははっきりと
した差がなかった。

【０１１７】 結論：この試験は、ヒト血液へ曝露されたときに、ヒツジ因子キメラ心臓が長
期に機能することを示す。ヒツジは構成的にαＧａｌを産生するので、ヒトとは
対照的に、αＧａｌへの自然抗体を創出しない。従って、抗αＧａｌへの順応に
よる移植片の保護は、αＧａｌ以外のブタ関連抗原への抗体により産生されたも
のである。

【０１１８】 実施例５．キメラブタにおける順応の存続 序：この試験では、１２及び１５週齢のブタで順応を評価した。 方法：順応及び対照のブタから末梢血リンパ球を単離した。このリンパ球を、
被感作ヒツジ由来の血清（力価１：１２８）と新鮮な家兎補体とともにインキュ
ベートした。被感作血清は１：４の希釈で使用した。殺傷されたリンパ球をヨウ
化プロピジウムとフローサイトメトリーで定量した。被感作血清及び補体は、８
頭の対照ブタ由来ブタリンパ球を上記の条件で９６〜１００％殺傷した。それ故
、対照リンパ球の生存能力は４％以下であった。対照的に、順応されたブタ由来
のリンパ球の７３％以上は生存していた。表２を参照のこと。

【０１１９】

【表２】

【０１２０】 考察：２週齢ブタで観察されたリンパ球の順応は、１２若しくは１５週齢で試
験されるまで存続した。この齢及び体重でのブタが、大人のヒトレシピエントに
適正なドナーとなるだろう。内皮細胞も同様のレベルの保護を有すると仮定すれ
ば、順応された臓器は、超急性拒絶と急性血管性拒絶に抗する保護を提供するだ
ろう。

【０１２１】 実施例６：順応キメラブタにおけるヒツジＩｇＧの存在と移植の結果 序：順応は、免疫グロブリンが結合した細胞における保護タンパク質の誘導から
生じると考えられている。従って、キメラブタにおける順応のあり得る機序は、
注入された異種細胞により亜致死レベルの抗体が産生されることであろう。この
試験では、ドナーブタ由来の血清サンプルを、ヒツジＩｇＧについてのＥＬＩＳ
Ａにより分析した。

【０１２２】 方法：ヒツジＩｇＧのためにサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを開発した。マ
イクロタイタープレートをロバの抗ヒツジＩｇＧでコートし、Ｔｗｅｅｎ２０で
ブロックし、洗浄した。多数の希釈で試験血清を加え、３０分インキュベートし
た。洗浄後、ビオチニル化したロバ抗ヒツジＩｇＧをこのプレートへ加えた。洗
浄後、ストレプタビジンペルオキシダーゼに次いで基質を用いてプレートを発色
させた。この反応を硫酸で止め、マイクロプレートリーダーでプレートを読み取
った。このアッセイは、４頭の対照ヒツジ、１４頭の対照ブタ、及びヒツジ骨髄
細胞を注射されたブタを孕む雌ブタに由来する１２頭のブタ（１０〜１４日）の
血清を用いて実施した。心臓を採取して、レシピエントのヒツジへ移植した。移
植後、ヒツジにシクロスポリン（３００〜８００ｎｇ／ｍｌ、谷レベル）と少量
のステロイドを投与した。この心臓を毎週生検した。表３を参照のこと。

【０１２３】 考察：特定ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、キメラブタにおいてキメラＩｇＧ
の存在を検出した。この知見は３つの理由で重要である。第一に、ＩｇＧの存在
により、低レベルの抗体がブタ細胞へ結合して順応を誘導することが示唆される
こと。第二に、このアッセイにより、Ｂ細胞のキメラ形成及び機能を亢進するこ
とによって順応を改善することの努力をモニターする手段が提供されること。第
三に、このアッセイが、移植用の臓器を入手するに先立って潜在的なドナーブタ
を評価する、品質保証に有用であること。

【０１２４】 この試験は、移植片のアウトカムを予測するのにキメラＩｇＧが特異的である
ことを明確にするものではない。しかしながら、検出可能なＩｇＧを有するブタ
由来の異種移植片の中で、試験の経過の間に明らかな拒絶を発症したものは１つ
もなかった。もっとも、２頭のヒツジは５日目と１７日目に技術上の理由で安楽
死させた。２頭のヒツジをプロトコールに従って３０日目で安楽死させた。１つ
の移植片は、１０６日後も拒絶を受けなかった。

【０１２５】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】 リンパ球溶解アッセイによるキメラブタでの順応を示す。７２−５、７２−１、
及び７２−３は、免疫前の胎児期で骨髄を注入したキメラブタである。対照サン
プルは、非注入ブタ由来のリンパ球である。被感作ヒツジ血清の濃度との相関と
して、トリパンブルーによりこの溶解を評価した−詳細な方法については実施例
３を参照のこと。

【図２】 キメラブタ（７２−５）のリンパ球アッセイによる順応を示す。対照サンプルは
、非注入ブタ由来のリンパ球である。被感作ヒツジ血清の濃度との相関として、
トリパンブルーによりこの溶解を評価した−詳細な方法については実施例３を参
照のこと。被感作ヒツジ血清は、図１のヒツジとは異なる被感作ヒツジから単離
した。

【図３】 キメラブタ心臓の、ヒト血液による超急性拒絶からの保護を示す。対照ブタ及び
キメラブタ（７２−５）の心臓を被感作ヒト血液で灌流し、心拍をモニターした
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/06 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C084 AA17 MA65 NA14 ZB081 4C085 AA33 BB31 CC22 4C087 BB34 BB63 BB65 CA04 DA26 MA65 NA14 ZB08

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 レシピエント哺乳動物における拒絶に抵抗するために、ドナ
   ー哺乳動物において順応される組織若しくは臓器を提供する方法であって： 亜致死レベルの少なくとも１種の順応誘導因子を少なくとも１回ドナー哺乳動
   物に注入する工程； 前記順応誘導因子へ長期の曝露を与える工程；及び 順応された前記組織若しくは臓器の１つ又はそれ以上を採取する工程を含んで
   なる、前記方法。
2. 【請求項２】 前記順応誘導因子が、前記順応される組織若しくは臓器のレ
   シピエントと同じ種である哺乳動物に由来する、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記レシピエントがヒトである、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記順応誘導因子が、前記採取される組織若しくは臓器の予
   定レシピエントである個体に由来する、請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記順応誘導因子が、免疫不全状態にある前記ドナー哺乳動
   物に注入される、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記順応誘導因子が、抗体であるか又は抗体を発現する細胞
   である、請求項２に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記順応誘導因子が、ドナー内皮と反応性の抗体、ブタ内皮
   と反応性の抗体、形質細胞、Ｂリンパ球、ヒトＢリンパ球、条件不死化Ｂリンパ
   球、抗αＧａｌ抗体、順応誘導因子を発現する細胞、順応誘導因子を発現する細
   胞を含んでなるハイブリドーマ、前記組織若しくは臓器と反応性のＴ細胞、パー
   フォリン、又は Bandeiraea simplicifolia レクチンである、請求項２に記載の
   方法。
8. 【請求項８】 前記順応誘導因子が、抗αＧａｌ抗体であるか又はαＧａｌ
   への抗体を産生する細胞である、請求項２に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記免疫不全状態が、免疫前の胎児成長期、化学療法処置誘
   導状態、放射線処置誘導状態、又は先天性免疫不全状態である、請求項５に記載
   の方法。
10. 【請求項１０】 前記免疫不全状態が免疫前の胎児成長期である、請求項９
    に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記採取される臓器が、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、心
    −肺、腸、脾臓、又は胸腺である、請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記採取される臓器が、骨、皮膚、髪、眼、神経組織、骨
    格筋、平滑筋、心筋、骨格筋の筋細胞、平滑筋の筋細胞、心筋の筋細胞、膵島、
    肝細胞、幹細胞、前駆細胞、又は造血細胞である、請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記臓器若しくは組織の移植に先立って、前記組織若しく
    は臓器の順応が達成されたことを決定する工程をさらに含んでなる、請求項１に
    記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記組織若しくは臓器の順応が達成されたことを決定する
    前記工程が、前記臓器若しくは組織の採取に先立って生じる、請求項１３に記載
    の方法。
15. 【請求項１５】 前記組織若しくは臓器の順応が達成されたことを決定する
    前記工程が： 前記レシピエント哺乳動物由来の血漿、血清、又は血液とともに臓器が灌流さ
    れ、ここで灌流される前記臓器は、前記レシピエントにおける移植に先立って試
    験される臓器であるか、又は同じドナー由来の代用臓器である、ランゲンドルフ
    型アッセイ、又は ドナー白血球若しくは内皮細胞の、レシピエント由来の血清へ曝露されたとき
    の溶解に対する感受性を決定するアッセイである、請求項１３に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記組織若しくは臓器の順応が達成されたことを決定する
    前記工程が、ヘムオキシゲナーゼ遺伝子、Ａ−２０遺伝子、ｂｃｌ−２遺伝子の
    増加した発現レベルの検出、順応誘導細胞若しくは抗体のドナー哺乳動物におけ
    る検出、又は、ドナー白血球若しくは内皮細胞の、レシピエント由来の血清へ曝
    露されたときの溶解に対する感受性の決定である、請求項１４に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記組織若しくは臓器の順応が達成されたことを決定する
    前記工程が、ドナー白血球若しくは内皮細胞の、レシピエント由来の血清へ曝露
    されたときの溶解に対する感受性の決定である、請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 順応誘導因子で処置されたドナー哺乳動物において育てら
    れる異種移植臓器若しくは組織。
19. 【請求項１９】 心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、心−肺、腸、脾臓、及び胸
    腺からなる群から選択される、請求項１８に記載の異種移植臓器。
20. 【請求項２０】 骨、皮膚、髪、眼、神経組織、骨格筋、平滑筋、心筋、骨
    格筋の筋細胞、平滑筋の筋細胞、心筋の筋細胞、膵島、肝細胞、胚性幹細胞、前
    駆細胞、及び造血細胞からなる群から選択される、請求項１８に記載の異種移植
    組織。
21. 【請求項２１】 前記ドナー哺乳動物が免疫不全状態にある間に誘導因子で
    の前記処置が生じた、請求項１８に記載の異種移植臓器若しくは組織。
22. 【請求項２２】 前記誘導因子が、ドナー内皮と反応性の抗体、ブタ内皮と
    反応性の抗体、形質細胞、Ｂリンパ球、ヒトＢリンパ球、条件不死化Ｂリンパ球
    、抗αＧａｌ抗体、順応誘導因子を発現する細胞、順応誘導因子を発現する細胞
    を含んでなるハイブリドーマ、前記組織若しくは臓器と反応性のＴ細胞、パーフ
    ォリン、又は Bandeiraea simplicifolia レクチンである、請求項１８に記載の
    異種移植臓器若しくは組織。
23. 【請求項２３】 順応因子を発生させる方法であって： 順応を誘導することについて試験される因子の亜致死レベルを少なくとも１回
    試験ドナー哺乳動物に注入する工程；及び 前記試験哺乳動物について誘導された順応のレベルを試験する工程を含んでな
    る、前記方法。
24. 【請求項２４】 ドナー哺乳動物において順応される、ドナー哺乳動物以外
    の種由来の組織若しくは細胞を提供する方法であって： 亜致死レベルの少なくとも１種の順応誘導因子を少なくとも１回ドナー哺乳動
    物に注入する工程； 前記ドナー以外の哺乳動物由来の組織若しくは細胞を前記ドナーへ投与する工
    程； 前記順応誘導因子へ長期の曝露を与える工程；及び 順応された前記組織又は前記細胞の少なくとも１つを採取する工程を含んでな
    る、前記方法。
25. 【請求項２５】 前記順応誘導因子が、前記採取される組織若しくは細胞の
    予定レシピエントである個体に由来する、請求項２４に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記順応誘導因子が、免疫不全状態にある前記ドナー哺乳
    動物に注入される、請求項２４に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記順応誘導因子が、抗体であるか又は抗体を発現する細
    胞である、請求項２４に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記順応誘導因子が、ドナー内皮と反応性の抗体、前記ド
    ナーへ投与された、前記ドナー以外の哺乳動物由来の細胞若しくは組織と反応性
    の抗体、前記ドナーへ投与された、前記ドナー以外の哺乳動物由来の細胞若しく
    は組織と反応性の抗体を発現する細胞、ブタ内皮と反応性の抗体、形質細胞、Ｂ
    リンパ球、ヒトＢリンパ球、条件不死化Ｂリンパ球、抗αＧａｌ抗体、順応誘導
    因子を発現する細胞、順応誘導因子を発現する細胞を含んでなるハイブリドーマ
    、前記組織若しくは臓器と反応性のＴ細胞、パーフォリン、又は Bandeiraea si
    mplicifolia レクチンである、請求項２４に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記免疫不全状態が、免疫前の胎児成長期、化学療法処置
    誘導状態、放射線処置誘導状態、又は先天性免疫不全状態である、請求項２４に
    記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記免疫不全状態が免疫前の胎児成長期である、請求項２
    ９に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記組織若しくは細胞の採取に先立って、前記組織若しく
    は臓器の順応が達成されたことを決定する工程をさらに含んでなる、請求項２４
    に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記採取される細胞若しくは組織が、造骨細胞、破骨細胞
    、皮膚、皮膚上皮細胞、毛包細胞、眼細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞
    、心筋細胞、膵島、肝細胞、幹細胞、前駆細胞、又は造血細胞である、請求項２
    ４に記載の方法。
33. 【請求項３３】 順応誘導因子で処置されたドナー哺乳動物において育てら
    れる、ドナー哺乳動物以外の種由来の異種移植組織若しくは細胞。
34. 【請求項３４】 破骨細胞、皮膚、皮膚上皮細胞、毛包細胞、眼細胞、神経
    細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、膵島、肝細胞、幹細胞、前駆細胞、
    及び造血細胞からなる群から選択される、請求項３３に記載の異種移植組織若し
    くは細胞。
35. 【請求項３５】 前記ドナー哺乳動物が免疫不全状態にある間に誘導因子で
    の前記処置が生じた、請求項３３に記載の異種移植臓器若しくは組織。
36. 【請求項３６】 前記順応誘導因子が、ドナー内皮と反応性の抗体、前記ド ナーへ投与された、前記ドナー以外の哺乳動物由来の細胞若しくは組織と反応
    性の抗体、前記ドナーへ投与された、前記ドナー以外の哺乳動物由来の細胞若し
    くは組織と反応性の抗体を発現する細胞、ブタ内皮と反応性の抗体、形質細胞、
    Ｂリンパ球、ヒトＢリンパ球、条件不死化Ｂリンパ球、抗αＧａｌ抗体、順応誘
    導因子を発現する細胞、順応誘導因子を発現する細胞を含んでなるハイブリドー
    マ、前記組織若しくは臓器と反応性のＴ細胞、パーフォリン、又は Bandeiraea
    simplicifolia レクチンである、請求項３３に記載の異種移植臓器若しくは組織
    。