JP2011217665A - Microorganism in which nitrile hydratase gene is replaced - Google Patents

Microorganism in which nitrile hydratase gene is replaced Download PDF

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文昭 渡辺
Yoshinori Wakamatsu
美紀 若松
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不二夫 湯
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a genetically modified microorganism with heterologous nitrile hydratase gene substituted for nitrile hydratase gene more efficiently and more versatilely.SOLUTION: The microorganism with heterologous nitrile hydratase gene substituted for such nitrile hydratase gene as to be found in microorganisms having nitrile hydratase activity is provided; wherein the substitution can be conducted, e.g. by a transformation method including prescribed steps (a) to (d) and utilizing a conjugation transmission from a donor microorganisms to a nitrile hydratase activity-bearing recipient microorganism.

Description

本発明は、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を遺伝的に改変し、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子（例えば、改良型のニトリルヒドラターゼ遺伝子）に置換した微生物に関する。また、当該微生物及びその形質転換体を利用した異種ニトリルヒドラターゼ（例えば、改良型のニトリルヒドラターゼ）、及びアミド化合物の製造方法に関する。   The present invention relates to a microorganism in which a nitrile hydratase gene is genetically modified and replaced with a heterologous nitrile hydratase gene (for example, an improved nitrile hydratase gene). The present invention also relates to a method for producing a heterogeneous nitrile hydratase (for example, improved nitrile hydratase) and an amide compound using the microorganism and its transformant.

近年、ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素または該酵素を含有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が開示されている。この製造方法は、従来の化学合成法と比較し、ニトリル化合物から対応するアミド化合物への転化率及び選択率が高いことが知られている。
ニトリルヒドラターゼを生産する微生物としては、例えば、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレビシエラ(Klebsiella)属、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属、ノカルディア（Nocardia）属等に属する細菌（微生物）を挙げることができる。中でも、ロドコッカス属細菌の一種であるロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株（以下、Ｊ１株と称する）は、アクリルアミドの工業的生産に使用されており、有用性が実証されている。また、その菌株が産生するニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子も明らかとなっている（特許文献１参照）。 In recent years, nitrile hydratase, an enzyme having nitrile hydration activity that hydrates nitrile groups and converts them into amide groups, was discovered, and amides corresponding to nitrile compounds using the enzyme or microbial cells containing the enzyme, etc. A method for producing the compound is disclosed. This production method is known to have a higher conversion rate and selectivity from a nitrile compound to a corresponding amide compound than conventional chemical synthesis methods.
Examples of microorganisms that produce nitrile hydratase include, for example, the genus Corynebacterium, the genus Pseudomonas, the genus Rhodococcus, the genus Rhizobium, the genus Klebsiella, and the pseudonocardia. Examples include bacteria (microorganisms) belonging to the genus, Nocardia genus and the like. Among them, Rhodococcus rhodochrous J1 strain (hereinafter referred to as J1 strain), which is a kind of bacteria belonging to the genus Rhodococcus, has been used for industrial production of acrylamide, and has proved its usefulness. Moreover, the gene which codes the nitrile hydratase which the strain produces is also clear (refer patent document 1).

また、ロドコッカス属細菌を、遺伝子組換えの方法でさらに有用なものに改変する試みがなされている。例えば、宿主−ベクター系を開発するためのプラスミドの探索、ベクターの開発などが行われている（特許文献２〜８）。
酵素を使用した化成品の工業生産においては、単離した酵素を使用するよりも、酵素が生産された微生物を触媒として使用する方がコストの面から好ましい。ロドコッカス属細菌は、一般的に、細胞壁が強固で反応液中へタンパク質などの菌体内容物が漏洩しにくいため、触媒として使用することに適しており、ロドコッカス属細菌の中でも、特にＪ１株は、アクリルアミドの工業生産での実績からアミド化合物を始めとする種々の化合物の生産のための宿主として有用である。 Attempts have also been made to modify Rhodococcus bacteria into more useful ones by genetic recombination methods. For example, search for a plasmid for developing a host-vector system, development of a vector, and the like have been performed (Patent Documents 2 to 8).
In industrial production of a chemical product using an enzyme, it is more preferable from the viewpoint of cost to use a microorganism in which the enzyme is produced as a catalyst than to use an isolated enzyme. Rhodococcus bacteria are generally suitable for use as a catalyst because their cell walls are strong and the contents of cells such as proteins are difficult to leak into the reaction solution. Among the Rhodococcus bacteria, the J1 strain is particularly suitable. From the results of industrial production of acrylamide, it is useful as a host for the production of various compounds including amide compounds.

一方、触媒として作用する酵素は、基質特異性や反応条件により最適な酵素を選抜することが必要であり、本発明者らは、酵素の性能を改変し改良型とした異種ニトリルヒドラターゼを開発している。（特許文献９〜１２参照）。
酵素機能が改変された微生物を作製する方法としては、目的の酵素活性を有する微生物にNTG（N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン）やEMS（エチルメタンスルホン酸）等の変異誘起化合物を用いて変異処理を行い、目的の性能を有する変異株を取得する方法、または、酵素遺伝子を単離してPCRなどの手法で改変酵素遺伝子を作製し、遺伝子組み換え法を用いて組換え菌を作製する方法がある。 On the other hand, it is necessary to select an enzyme that acts as a catalyst according to the substrate specificity and reaction conditions, and the present inventors have developed an improved heterogeneous nitrile hydratase by modifying the performance of the enzyme. is doing. (See Patent Documents 9 to 12).
As a method of producing microorganisms with modified enzyme functions, mutagenesis such as NTG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) and EMS (ethyl methanesulfonic acid) is used for microorganisms with the desired enzyme activity. Mutation treatment using a compound to obtain a mutant strain having the desired performance, or the enzyme gene is isolated and a modified enzyme gene is prepared by a technique such as PCR. There is a method of manufacturing.

さらに、改変酵素を生産する組換え菌の作製には、発現目的とする酵素の酵素活性を有していない宿主菌に発現プラスミドとして導入する方法、又は相同組換えの手法で宿主菌のゲノムにある酵素遺伝子の欠失、あるいはゲノムにある酵素遺伝子を改良酵素遺伝子へ置換する方法がある。しかしながら、変異誘起化合物を使用する方法は、点突然変異であるため変異できるアミノ酸は一部に限定される（平均して3割から4割）、また目的とする酵素遺伝子以外にも複数の変異が挿入される問題があること、発現プラスミドを用いた方法では、組換え菌の培養に高価な抗生物質が必要であり、宿主菌が発現目的と同じ機能を有する酵素遺伝子を有していた場合、プラスミドから発現する酵素と、ゲノムDNAから発現する宿主由来の酵素が菌体内に混在することになり、発現目的とする酵素の性能が十分に発揮できない場合がある（特許文献１３参照）。一方、宿主菌のゲノム遺伝子と置換する方法では相同組換えの技術が必要である。   Furthermore, for the production of a recombinant bacterium that produces a modified enzyme, a method for introducing it into a host bacterium that does not have the enzyme activity of the target enzyme to be expressed as an expression plasmid or a method for homologous recombination into the genome of the host bacterium. There are methods for deleting an enzyme gene or replacing an enzyme gene in the genome with an improved enzyme gene. However, since the method using mutagenic compounds is a point mutation, the number of amino acids that can be mutated is limited to some (on average 30 to 40%), and there are multiple mutations in addition to the target enzyme gene. If the method using expression plasmids requires expensive antibiotics for cultivation of recombinant bacteria, and the host bacteria have an enzyme gene with the same function as the expression purpose The enzyme expressed from the plasmid and the host-derived enzyme expressed from the genomic DNA are mixed in the microbial cells, and the performance of the enzyme intended for expression may not be sufficiently exhibited (see Patent Document 13). On the other hand, homologous recombination techniques are required for the method of replacing the genome gene of the host fungus.

特許第3162091号公報Japanese Patent No.3162091 特開平4-148685号公報Japanese Patent Laid-Open No. 4-148685 特開平4-330287号公報JP-A-4-330287 特開平7-255484号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 7-255484 特開平5-64589号公報Japanese Patent Laid-Open No. 5-64589 特開平8-56669号公報JP-A-8-56669 米国特許第4,920,054号明細書U.S. Pat.No. 4,920,054 特開平8-173169号公報JP-A-8-173169 国際公開第2005/116206号International Publication No. 2005/116206 特開2007-43910号公報JP 2007-43910 A 特開2007-143409号公報JP 2007-143409 A 特開2008-253182号公報JP 2008-253182 A 国際公開第06/062189号International Publication No. 06/062189

アミド化合物の工業生産においては、安定な触媒が求められ、そのためには目的とするニトリルヒドラターゼ遺伝子を工業生産の実績があるロドコッカス属細菌に導入した遺伝子組換え菌を作製することが有効である。
ロドコッカス属細菌をより有効に活用するためには、目的に応じてロドコッカス属細菌のゲノム上の遺伝子を特異的に置換等することにより、改変することが効果的である。 In industrial production of amide compounds, a stable catalyst is required. For this purpose, it is effective to produce a genetically modified bacterium in which the target nitrile hydratase gene is introduced into a bacterium belonging to the genus Rhodococcus. .
In order to utilize Rhodococcus bacteria more effectively, it is effective to modify them by specifically replacing genes on the genome of Rhodococcus bacteria according to the purpose.

ところで、ゲノム上に存在する遺伝子を置換する手法としては、相同組換え（Homologous recombination）を利用する方法が挙げられる。これは、標的遺伝子の塩基配列中に薬剤耐性マーカー遺伝子等を相同組換えにより挿入し、当該遺伝子が機能発現しない状態にする、又は（標的遺伝子を当該遺伝子の一部若しくは全部を含まない配列に置換することにより）標的遺伝子自体を欠失させて、その発現そのものを阻害する方法である。大腸菌や酵母等のいくつかの微生物では、効率的な相同組換え技術が確立しているため（例えば、SOE-PCR法（例えば、SOE-PCR（Gene, vol. 77, p. 61-68（1989））、比較的容易に標的遺伝子の欠失又は不活性化を行うことができる。
ロドコッカス属細菌において相同組換えにより遺伝子欠失又は不活性化を行う場合、エレクトロポレーション法等が知られている。しかしながら、ロドコッカス属細菌及びその類縁属細菌は非相同組換えが起こり易いという特徴を有しているため、目的の相同組換え株が極めて低確率でしか得られないという問題がある。 By the way, as a method for replacing a gene existing on the genome, a method using homologous recombination can be mentioned. This can be achieved by inserting a drug resistance marker gene or the like into the base sequence of the target gene by homologous recombination so that the gene does not function, or (the target gene is in a sequence not including part or all of the gene) It is a method of inhibiting the expression itself by deleting the target gene itself (by substitution). Some microorganisms such as E. coli and yeast have established an efficient homologous recombination technique (for example, SOE-PCR method (for example, SOE-PCR (Gene, vol. 77, p. 61-68 ( 1989)), the target gene can be deleted or inactivated relatively easily.
When performing gene deletion or inactivation by homologous recombination in Rhodococcus bacteria, an electroporation method or the like is known. However, Rhodococcus bacteria and their related bacteria have the characteristic that non-homologous recombination is likely to occur, so that there is a problem that the desired homologous recombination strain can be obtained with a very low probability.

従って、ロドコッカス属細菌などのニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物について、当該微生物由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子が異種のニトリルヒドラターゼ遺伝子（例えば、改良型のニトリルヒドラターゼ遺伝子）に置換されたものは、十分に得られていないのが現状である。
このような状況下において、より効率的かつ汎用的にニトリルヒドラターゼ遺伝子を置換させた、遺伝的に改変された微生物の取得及び開発が望まれていた。具体的には、本発明はロドコッカス属細菌等の微生物における相同組換え技術を開発及び確立し、当該微生物（宿主）由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換させた改変微生物をより効率的かつ汎用的に得ることが望まれていた。さらには、当該改変微生物を用いて異種ニトリルヒドラターゼを効率的に産生し、これを用いて低コストかつ高効率でアミド化合物を製造することが望まれていた。 Therefore, for microorganisms having nitrile hydratase activity such as Rhodococcus bacteria, those in which the nitrile hydratase gene derived from the microorganism is replaced with a heterogeneous nitrile hydratase gene (for example, an improved nitrile hydratase gene) The current situation is not obtained.
Under such circumstances, it has been desired to obtain and develop a genetically modified microorganism in which the nitrile hydratase gene is more efficiently and universally replaced. Specifically, the present invention develops and establishes homologous recombination technology in microorganisms such as Rhodococcus bacteria, and moreover provides modified microorganisms in which a nitrile hydratase gene derived from the microorganism (host) is replaced with a heterologous nitrile hydratase gene. It has been desired to obtain it efficiently and universally. Furthermore, it has been desired to efficiently produce a heterogeneous nitrile hydratase using the modified microorganism and to produce an amide compound at low cost and high efficiency using this.

本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換した微生物、ニトリルヒドラターゼ（異種ニトリルヒドラターゼ）の製造方法、及びアミド化合物の製造方法等を提供するものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。 The present invention has been made in consideration of the above situation, and the following microorganisms in which a nitrile hydratase gene is replaced with a heterogeneous nitrile hydratase gene, a method for producing a nitrile hydratase (heterologous nitrile hydratase), and an amide compound The manufacturing method etc. of this are provided.
That is, the present invention is as follows.

（１）ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換された微生物。
本発明の微生物において、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物は、例えば、ロドコッカス属細菌又はノカルディア属細菌が挙げられる。ここで、ロドコッカス属細菌は、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株又はその変異株が挙げられる。
本発明の微生物において、置換されるニトリルヒドラターゼ遺伝子は、例えば、高分子量型ニトリルヒドラターゼ遺伝子及び／又は低分子量ニトリルヒドラターゼ遺伝子が挙げられる。 (1) A microorganism in which a nitrile hydratase gene in a microorganism having nitrile hydratase activity is replaced with a heterogeneous nitrile hydratase gene.
In the microorganism of the present invention, examples of the microorganism having nitrile hydratase activity include Rhodococcus bacteria and Nocardia bacteria. Here, examples of the genus Rhodococcus include Rhodococcus rhodochrous J1 strain or mutants thereof.
Examples of the nitrile hydratase gene to be substituted in the microorganism of the present invention include a high molecular weight nitrile hydratase gene and / or a low molecular weight nitrile hydratase gene.

本発明の微生物は、例えば、前記置換が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われるものが挙げられる。
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、(i)レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換させた配列、(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、(iv)レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）前記（ｂ）で作製されたドナー微生物から前記（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）前記（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。 In the microorganism of the present invention, for example, the substitution is performed by a transformation method using conjugative transmission from a donor microorganism to a recipient microorganism having nitrile hydratase activity, including the following steps (a) to (d). Things.
(A) a step of producing a microorganism having enhanced resistance to a drug to which a donor microorganism to be used for conjugation transmission is sensitive as a recipient microorganism;
(B) as a donor microorganism, (i) a sequence obtained by substituting the nitrile hydratase gene with a heterogeneous nitrile hydratase gene in a base sequence including the nitrile hydratase gene in the recipient microorganism and the surrounding base sequence, (ii) ) A conjugation initiation region that functions in the donor microorganism; (iii) a replication initiation region that functions in the donor microorganism; (iv) a resistance gene for a drug to which the recipient microorganism is sensitive; and (v) a conditionally lethal to the recipient microorganism. Producing a microorganism transformed with a gene modifying plasmid containing a gene;
(C) producing a transformant of the recipient microorganism by performing conjugation transfer from the donor microorganism produced in (b) to the recipient microorganism produced in (a); and (d ) A step of culturing the transformant prepared in (c) under a culture condition in which the conditionally lethal gene can function.

ここで、上記接合伝達を利用した形質転換方法において、ドナー微生物は、例えば、大腸菌が挙げられる。また、ドナー微生物が感受性を示す薬剤は、例えば、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、カルベニシン及びナルジクス酸からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。さらに、レシピエント微生物が感受性を示す薬剤は、例えば、カナマイシンが挙げられる。   Here, in the transformation method using the conjugation transfer, examples of the donor microorganism include Escherichia coli. Examples of the drug to which the donor microorganism is sensitive include at least one selected from the group consisting of chloramphenicol, ampicillin, gentamicin, tetracycline, carbenicin and naldic acid. Furthermore, examples of the drug to which the recipient microorganism is sensitive include kanamycin.

（２）上記(1)に記載の微生物及を培養し、得られる培養物から前記異種ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
（３）上記(1)に記載の微生物を培養して得られる培養物又は当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させ、当該接触により生成されるアミド化合物を採取することを特徴とする、アミド化合物の製造方法。 (2) A method for producing a nitrile hydratase, comprising culturing the microorganism according to (1) above and collecting the heterogeneous nitrile hydratase from the resulting culture.
(3) A culture obtained by culturing the microorganism according to (1) above or a treated product of the culture is contacted with a nitrile compound, and an amide compound produced by the contact is collected. A method for producing an amide compound.

本発明によれば、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物、特にロドコッカス属細菌等の微生物について、当該微生物ゲノム上のニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子（例えば、改良型ニトリルヒトラターゼ遺伝子）に置換させた微生物を、より一層効率的かつ汎用的に提供することができる。
具体的には、本発明によれば、ロドコッカス属細菌等の微生物における相同組換え技術を確立し、上記のような遺伝的に改変した微生物を効率的かつ汎用的に得ることができる。さらには、当該改変微生物を用いて異種ニトリルヒドラターゼ（例えば、改良型のニトリルヒトラターゼ）を効率的に産生すること、及び当該微生物を微生物触媒として用いて様々なニトリル化合物から低コストかつ高効率でアミド化合物を製造することができる。 According to the present invention, for a microorganism having nitrile hydratase activity, particularly a microorganism such as Rhodococcus, the nitrile hydratase gene on the genome of the microorganism is replaced with a heterologous nitrile hydratase gene (for example, an improved nitrile human latase gene). The made microorganisms can be provided more efficiently and universally.
Specifically, according to the present invention, homologous recombination techniques in microorganisms such as Rhodococcus bacteria can be established, and the genetically modified microorganisms as described above can be obtained efficiently and universally. Furthermore, the modified microorganism is used to efficiently produce a heterogeneous nitrile hydratase (for example, an improved nitrile human lactase), and the microorganism is used as a microbial catalyst from various nitrile compounds at low cost and high efficiency. The amide compound can be produced with

本実施例における、プラスミドpK19mobsacB1の構造を示す模式図である。FIG. 2 is a schematic diagram showing the structure of plasmid pK19mobsacB1 in this example. 本実施例における、プラスミドpBKHN10の構造を示す模式図である。FIG. 2 is a schematic diagram showing the structure of plasmid pBKHN10 in this example. 相同組換えの概念図である。It is a conceptual diagram of homologous recombination.

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. The scope of the present invention is not limited to these descriptions, and other than the following examples, the scope of the present invention can be appropriately changed and implemented without departing from the spirit of the present invention.
It should be noted that all publications cited in the present specification, for example, prior art documents, publications, patent publications and other patent documents are incorporated herein by reference.


１．ニトリルヒドラターゼ遺伝子が改変された微生物
本発明に係るニトリルヒドラターゼ遺伝子が置換された微生物（以下、「本発明の微生物」ということがある）は、前述した通り、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換された微生物である。
本発明の微生物が得られる前の、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物（対象微生物）としては、ニトリルヒドラターゼを産生し、その活性を示すものであればよく、特に限定はされないが、例えば、ロドコッカス属細菌、バチルス属細菌、シュードノカルディア属細菌、ジオバチルス属細菌、シュードモナス属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌等が好ましく挙げられる。中でもロドコッカス属細菌は、細胞壁が強固で反応液中へタンパク質などの菌体内容物が漏れないため、産業的に微生物触媒としての使用等に適している点でより好ましい。
1. Microorganisms in which the nitrile hydratase gene has been modified Microorganisms in which the nitrile hydratase gene according to the present invention has been replaced (hereinafter sometimes referred to as “microorganisms of the present invention”) are microorganisms having nitrile hydratase activity as described above. A microorganism in which the nitrile hydratase gene is replaced with a heterologous nitrile hydratase gene.
The microorganism having the nitrile hydratase activity (target microorganism) before the microorganism of the present invention is obtained is not particularly limited as long as it produces nitrile hydratase and exhibits the activity. For example, Rhodococcus Preferred examples include genus bacteria, Bacillus bacteria, Pseudonocardia bacteria, Geobacillus bacteria, Pseudomonas bacteria, Nocardia bacteria, Corynebacterium bacteria and the like. Among them, Rhodococcus bacteria are more preferable because they have a strong cell wall and the contents of cells such as proteins do not leak into the reaction solution, and thus are industrially suitable for use as microbial catalysts.

ロドコッカス・ロドクロウスとしては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス J1、ロドコッカス・ロドクロウス M8(SU1731814)、ロドコッカス・ロドクロウス M33（VKM Ac-1515D）及びロドコッカス・ロドクロウス ATCC39484（特開平2001-292772号）等が好ましく挙げられる。ロドコッカス・ピリジノボランスとしては、例えば、ロドコッカス・ピリジノボランス S85-2（国際公開第03/066800号）、ロドコッカス・ピリジノボランス MS-38（特願2004-151508号）等が好ましく挙げられる。
また、バチルス属細菌としては、例えば、バチルス・スミシ（Bacillus smithii）(特開平09-248188号)等が好ましく挙げられる。シュードノカルディア属細菌としては、例えば、シュードノカルディア・サーモフィラ JCM3095(特開平09-275978号)、等が好ましく挙げられる。ジオバチルス属細菌としては、例えば、ジオバチルス・サーモグルコシダシアス（国際公開第04/108942号）、ジオバチルス・カルドキシロシチリカス M16（特開2006-158323号）等が好ましく挙げられる。シュードモナス属細菌としては、例えば、シュードモナス・クロロラフィス B23（特開昭58- 86093）シュードモナス・プチダ DSM16276（国際公開第05/2689号）、シュードモナス・マルギナリス DSM16275（国際公開第05/2689号）、ノカルディア属細菌としては、例えばノカルディア YS-2002株（CN1584024）、ノカルディア sp.JBRs（GenBankアクセッション番号:AY141130）が好ましく挙げられる。 Preferred examples of Rhodococcus rhodochrous include Rhodococcus rhodochrous J1, Rhodococcus rhodochrous M8 (SU1731814), Rhodococcus rhodochrous M33 (VKM Ac-1515D) and Rhodococcus rhodochrous ATCC39484 (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-292772). Preferred examples of Rhodococcus pyridinoborans include Rhodococcus pyridinoborans S85-2 (International Publication No. 03/066800) and Rhodococcus pyridinoborans MS-38 (Japanese Patent Application No. 2004-151508).
Further, preferable examples of Bacillus bacteria include Bacillus smithii (Japanese Patent Laid-Open No. 09-248188). Preferred examples of Pseudocardia bacteria include Pseudocardia thermophila JCM3095 (Japanese Patent Laid-Open No. 09-275978). Preferred examples of the Geobacillus bacterium include Geobacillus thermoglucosidasias (International Publication No. 04/108942), Geobacillus cardoxylosilicus M16 (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-158323), and the like. Examples of the genus Pseudomonas include Pseudomonas chlorolafis B23 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-86093) Pseudomonas putida DSM16276 (International Publication No. 05/2689), Pseudomonas marginalis DSM16275 (International Publication No. 05/2689), Preferred examples of the genus Cardia include Nocardia strain YS-2002 (CN1584024) and Nocardia sp. JBRs (GenBank accession number: AY141130).

ニトリルヒドラターゼは、以下の反応式に示すように、ニトリル化合物のニトリル基に作用し、対応するアミド化合物に変換する水和反応を触媒する酵素である。
R-CN + H2O → R-CONH2
(式中、Rは、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のシクロアルキル基、置換又は無置換のアリール基、あるいは置換又は無置換の飽和又は不飽和複素環基を表す。) Nitrile hydratase is an enzyme that acts on a nitrile group of a nitrile compound to catalyze a hydration reaction for conversion to a corresponding amide compound, as shown in the following reaction formula.
R-CN + H 2 O → R-CONH 2
(Wherein R is a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted alkenyl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted saturated or unsaturated group) Represents a heterocyclic group.)

ここで、「ニトリルヒドラターゼ活性」とは、ニトリル化合物のニトリル基に作用して対応するアミド化合物に変換させる活性を意味する。ニトリルヒドラターゼ活性の測定方法としては、例えば、ニトリル化合物の１種であるアクリロニトリルを用いる方法が挙げられる。この方法では、ニトリルヒドラターゼ活性の結果としてアクリロニトリルに対応するアミド化合物、すなわちアクリルアミドが得られる。従って、本発明の微生物等のニトリルヒドラターゼ活性（異種ニトリルヒドラターゼ活性）を測定する場合は、当該微生物等をアクリロニトリルに接触させ、生成するアクリルアミドの量の増加を定量することで、ニトリルヒドラターゼ活性を測定することができる。あるいは、アクリロニトリルの消費量を定量することによってもニトリルヒドラターゼ活性を測定することができる。   Here, “nitrile hydratase activity” means an activity of acting on a nitrile group of a nitrile compound to convert it into a corresponding amide compound. Examples of the method for measuring the nitrile hydratase activity include a method using acrylonitrile, which is one kind of nitrile compound. In this way, an amide compound corresponding to acrylonitrile, ie acrylamide, is obtained as a result of the nitrile hydratase activity. Therefore, when measuring the nitrile hydratase activity (heterogeneous nitrile hydratase activity) of the microorganism of the present invention, the microorganism is brought into contact with acrylonitrile, and the increase in the amount of acrylamide produced is quantified to determine the nitrile hydratase. Activity can be measured. Alternatively, the nitrile hydratase activity can also be measured by quantifying the consumption of acrylonitrile.

本発明の微生物は、本来有する（当該微生物由来の）ニトリルヒドラターゼ遺伝子が置換されたものであるが、この置換される遺伝子（標的遺伝子）としては、対象微生物のゲノムDNAにコードされるニトリルヒドラターゼ遺伝子の全部又は一部の領域であってもよく、限定はされず、例えば、当該遺伝子のプロモーター配列の全部又は一部の領域であってもよいし、発現調節に関連する遺伝子の全部又は一部の領域であってもよいし、これらの領域を複数組み合わせたものであってもよい。
なお、本発明においては、例えば、上記対象微生物がロドコッカス・ロドクロウス J1株の場合は、本来有するニトリルヒドラターゼ遺伝子として、高分子量型ニトリルヒドラターゼの遺伝子（配列番号1）と低分子量型ニトリルヒドラターゼの遺伝子（配列番号5）との２種のニトリルヒドラターゼ遺伝子を有しているため、標的遺伝子としては、これらのいずれか一方でもよいし、両方でもよく、限定はされない。なお、上記高分子量型ニトリルヒドラターゼのαサブユニット、βサブユニット及びβホモログ（nhhG）をコードする遺伝子を、それぞれ順に、配列番号2〜4に示した。同様に、上記低分子量型ニトリルヒドラターゼの遺伝子のαサブユニット、βサブユニット及びβホモログ（nhlE）をコードする遺伝子を、それぞれ順に、配列番号6〜8に示した。 The microorganism of the present invention has an originally substituted nitrile hydratase gene (derived from the microorganism), and the substituted gene (target gene) is a nitrile hydra encoded by the genomic DNA of the target microorganism. The region may be all or part of the tase gene, and is not limited. For example, it may be all or part of the promoter sequence of the gene, or all or part of the gene related to expression regulation. It may be a partial area or a combination of a plurality of these areas.
In the present invention, for example, when the target microorganism is Rhodococcus rhodochrous J1, the high molecular weight nitrile hydratase gene (SEQ ID NO: 1) and the low molecular weight nitrile hydratase are used as the original nitrile hydratase gene. Since there are two types of nitrile hydratase genes with the above gene (SEQ ID NO: 5), either one or both of these may be used as target genes, and there is no limitation. The genes encoding the α subunit, β subunit and β homolog (nhhG) of the high molecular weight nitrile hydratase are shown in SEQ ID NOs: 2 to 4, respectively. Similarly, the genes encoding the α subunit, β subunit and β homolog (nhlE) of the low molecular weight nitrile hydratase gene are shown in SEQ ID NOs: 6 to 8, respectively.

本発明における、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子とは、前記対象微生物が有するニトリルヒドラターゼ遺伝子と翻訳後のアミノ酸配列が異なるニトリルヒドラーゼ遺伝子を意味する。すなわち、異種ニトリルヒドラターゼとは、前記対象微生物のゲノムDNAにコードされたニトリルヒドラターゼと比較して、そのアミノ酸配列中、１残基以上のアミノ酸が異なる（置換、挿入(付加)又は欠失等）ものが含まれ、アミノ酸配列ホモロジーで80％を超えるニトリルヒドラターゼは使用することができる。具体的には、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス J1株を対象微生物とした場合は、国際公開第2005/116206号、特開2007-43910号、特開2007-143409号及び特開2008-253182号等に記載の改良型のニトリルヒドラターゼや、前記ニトリルヒドラターゼとDNA配列ホモロジー、あるいはアミノ酸配列ホモロジーの高いノカルデァ YS-2002株、ノカルディア sp.JBRs、ロドコッカス・ピリジノボランス S85-2、ロドコッカス・ピリジノボランス MW3株、ロドコッカス・ピリジノボランス MS-38株、ロドコッカス・ロドクロウス M8株などが異種ニトリルヒドラターゼ（改変ニトリルヒドラターゼ）として好ましく挙げられる。これらの異なる菌種由来の異種ニトリルヒドラターゼの遺伝子は、例えば、それらを産生し得る微生物を培養し、培養した菌からゲノムDNAを調製してPCR増幅することによって得ることができる。   In the present invention, the heterologous nitrile hydratase gene means a nitrile hydrase gene having a different amino acid sequence after translation from the nitrile hydratase gene of the target microorganism. That is, the heterologous nitrile hydratase differs from the nitrile hydratase encoded in the genomic DNA of the target microorganism by one or more amino acids in the amino acid sequence (substitution, insertion (addition) or deletion). Nitrile hydratase with amino acid sequence homology exceeding 80% can be used. Specifically, for example, when Rhodococcus rhodochrous J1 strain is the target microorganism, International Publication Nos. 2005/116206, JP 2007-43910, JP 2007-143409, JP 2008-253182, etc. The improved nitrile hydratase described above, Nocardia YS-2002 strain, Nocardia sp.JBRs, Rhodococcus pyridinovorans S85-2, Rhodococcus pyridinoborans MW3 strain, which has high DNA sequence homology or amino acid sequence homology with the nitrile hydratase, Rhodococcus pyridinoborans MS-38 strain, Rhodococcus rhodochrous M8 strain and the like are preferably mentioned as heterogeneous nitrile hydratase (modified nitrile hydratase). The genes for heterogeneous nitrile hydratases derived from these different bacterial species can be obtained, for example, by culturing microorganisms that can produce them, preparing genomic DNA from the cultured bacteria, and PCR amplification.

なお、上記挿入(付加)されるアミノ酸（アミノ酸配列）の例としては、リンカー配列及びタグ配列等が挙げられる。タグ配列の例としては、His-tag（6〜10残基のヒスチジン）、GST-tag（Glutathione S-Transferase）、MBP-tag：Maltose Binding Protein（マルトース結合タンパク質）、Strep-tag（8残基のアミノ酸Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys）、HQ-tag（ヒスチジンとグルタミンが交互に連続したペプチドタグ）、HN-tag（ヒスチジンとアスパラギンが交互に連続したペプチドタグ）、HAT-tag（ニワトリの乳酸脱水素酵素由来のペプチドタグ）などが挙げられる。タグ配列を付加する場所はN末端とC末端の両方が使用できる。また、上記欠失されるアミノ酸（アミノ酸配列）としては、酵素活性に影響のない数個から10個程度のアミノ酸残基（アミノ酸配列）が挙げられ、欠失の場所としてはN末端とC末端が好ましい。
さらに、本発明の微生物（ニトリルヒドラターゼ遺伝子が異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換された微生物）は宿主微生物としても用いることができ、この場合、本発明の微生物にさらに他の異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子（前記置換により導入された異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子と同種であっても異種であってもよい）を発現ベクター等により導入した形質転換体（形質転換微生物）を作製し使用することができる。 Examples of amino acids (amino acid sequences) to be inserted (added) include linker sequences and tag sequences. Examples of tag sequences are His-tag (6-10 residue histidine), GST-tag (Glutathione S-Transferase), MBP-tag: Maltose Binding Protein, Strep-tag (8 residues) Amino acid Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys), HQ-tag (peptide tag with alternating histidine and glutamine), HN-tag (peptide tag with alternating histidine and asparagine) HAT-tag (a peptide tag derived from chicken lactate dehydrogenase). Both N-terminal and C-terminal can be used as the place to add the tag sequence. In addition, the deleted amino acids (amino acid sequences) include several to about 10 amino acid residues (amino acid sequences) that do not affect the enzyme activity. Is preferred.
Furthermore, the microorganism of the present invention (microorganism in which the nitrile hydratase gene is replaced with a heterologous nitrile hydratase gene) can also be used as a host microorganism. A transformant (transformed microorganism) into which a heterologous nitrile hydratase gene introduced by the substitution may be the same or different from the nitrile hydratase gene by an expression vector or the like can be prepared and used.

また、本発明の微生物等が産生するニトリルヒドラターゼ（異種ニトリルヒドラターゼ）は、さらにアミド化合物耐性としての性質を有することが好ましい。ここで、「アミド化合物耐性」とは、他の微生物由来のニトリルヒドラターゼと比較して、アミド化合物存在下でニトリルヒドラターゼ活性をより高活性で維持し得ることを意味する。本発明の微生物等が産生するニトリルヒドラターゼが耐性を示すアミド化合物としては、限定はされないが、例えば、以下の化学式で表されるアミド化合物が好ましく挙げられる。
R-CONH2
(式中、Rは、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のシクロアルキル基、置換又は無置換のアリール基、あるいは、置換又は無置換の飽和又は不飽和複素環基を表す)
上記式で表されるアミド化合物としては、例えば、式中のRがCH2=CHであるアクリルアミドが好ましい。 Moreover, it is preferable that the nitrile hydratase (heterogeneous nitrile hydratase) produced by the microorganism of the present invention further has a property as amide compound resistance. Here, “amide compound resistance” means that nitrile hydratase activity can be maintained at a higher activity in the presence of an amide compound as compared with nitrile hydratase derived from other microorganisms. The amide compound to which the nitrile hydratase produced by the microorganism of the present invention is resistant is not limited, but preferred examples include amide compounds represented by the following chemical formula.
R-CONH 2
(In the formula, R represents a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted alkenyl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted saturated or unsubstituted group; (Represents a saturated heterocyclic group)
As the amide compound represented by the above formula, for example, acrylamide in which R is CH 2 ═CH is preferable.


２．ニトリルヒドラターゼ遺伝子が改変された微生物の製造
本発明において、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換する方法としては、限定はされず、如何なる方法を適用してもよいが、例えば、以下の方法が好ましく挙げられる。
すなわち、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法（詳しくは、当該形質転換方法を用いることを含むニトリルヒドラターゼ遺伝子の置換方法）方法により、本発明の微生物が得られることが好ましい。なお、図３に当該置換方法の概略を示す。
2. Production of microorganisms with modified nitrile hydratase gene In the present invention, the method for replacing the nitrile hydratase gene with a heterogeneous nitrile hydratase gene is not limited, and any method may be applied. The method is preferably mentioned.
That is, a transformation method using conjugation transfer from a donor microorganism to a recipient microorganism having a nitrile hydratase activity, including the following steps (a) to (d) (specifically, including using the transformation method) It is preferable that the microorganism of the present invention is obtained by the method of replacing the nitrile hydratase gene. FIG. 3 shows an outline of the replacement method.

（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、下記(i)〜(v)：
(i)レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子（標的遺伝子）とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換させた塩基配列領域、
(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、
(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、
(iv)レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び
(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子
を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）工程（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。 (A) a step of producing a microorganism having enhanced resistance to a drug to which a donor microorganism to be used for conjugation transmission is sensitive as a recipient microorganism;
(B) As a donor microorganism, the following (i) to (v):
(i) a base sequence region obtained by substituting the nitrile hydratase gene with a heterogeneous nitrile hydratase gene in a base sequence including a nitrile hydratase gene (target gene) in the recipient microorganism and a base sequence in the vicinity thereof,
(ii) a junction transmission initiation region that functions in the donor microorganism;
(iii) a replication initiation region that functions in the donor microorganism,
(iv) a resistance gene to a drug to which the recipient microorganism is sensitive; and
(v) producing a microorganism transformed with a plasmid for genetic modification containing a conditionally lethal gene for the recipient microorganism;
(C) producing a transformant of the recipient microorganism by performing conjugative transfer from the donor microorganism produced in step (b) to the recipient microorganism produced in step (a); and (d ) A step of culturing the transformant prepared in the step (c) under a culture condition in which the conditionally lethal gene can function.

上記置換方法において用いるレシピエント微生物としては、限定はされないが、前述したニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物が例示できる。中でもロドコッカス属細菌が、前述と同様の理由でより好ましい。ロドコッカス属細菌等の具体例についても、前述と同様のものが挙げられる。
一方、ドナー微生物としては、上記レシピエント微生物と接合伝達可能な微生物であればよく、限定はされないが、例えば、大腸菌が好ましい。 Although it does not limit as a recipient microorganism used in the said substitution method, The microorganisms which have the nitrile hydratase activity mentioned above can be illustrated. Among these, Rhodococcus bacteria are more preferable for the same reason as described above. Specific examples of Rhodococcus bacteria and the like include those described above.
On the other hand, the donor microorganism is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of conjugating and transmitting to the recipient microorganism, and for example, Escherichia coli is preferable.

2.1. 工程（ａ）
工程（ａ）では、接合伝達に供するレシピエント微生物として、接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性を強化した微生物を作製する。「薬剤への耐性を強化する」とは、レシピエント微生物が薬剤耐性を有していない場合には、薬剤耐性を付与することをいい、レシピエント微生物が薬剤耐性の乏しい場合には、当該耐性をより強化することをいう。
接合伝達法を使用する場合、レシピエントとなる微生物には薬剤耐性マーカーが必要である。よって、薬剤耐性を有していない微生物、又は薬剤耐性の乏しい微生物を使用する場合、薬剤選択可能な程度の十分な薬剤耐性を有する株（レシピエント）の作製が必要となる。ここで、薬剤としては、接合伝達法を使用することを考慮し、接合伝達に供するドナー微生物（接合伝達時のドナー微生物）が感受性を示す薬剤が好ましい。当該薬剤としては、具体的には、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、トリメトプリム、ゲンタマイシン、ナルジクス酸、カルベニシン、チオストレプトン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が好ましく、クロラムフェニコール及びアンピシリン等がより好ましい。 2.1. Process (a)
In the step (a), a microorganism having enhanced resistance to a drug to which a donor microorganism used for conjugation transmission is sensitive is prepared as a recipient microorganism used for conjugation transmission. “Strengthening resistance to drugs” refers to imparting drug resistance if the recipient microorganism does not have drug resistance, and if the recipient microorganism has poor drug resistance, the resistance It means to strengthen more.
When using the conjugation transfer method, the recipient microorganism needs a drug resistance marker. Therefore, when using a microorganism that does not have drug resistance or a microorganism that has poor drug resistance, it is necessary to produce a strain (recipient) having sufficient drug resistance that allows drug selection. Here, considering the use of the junction transfer method, the agent is preferably an agent that is sensitive to the donor microorganism used for the junction transfer (the donor microorganism at the time of the junction transfer). Specific examples of the drug include chloramphenicol, ampicillin, kanamycin, trimethoprim, gentamicin, nardicic acid, carbenicin, thiostrepton, tetracycline, streptomycin, and the like, and chloramphenicol and ampicillin are more preferable.

上述のように薬剤耐性を強化したレシピエント微生物を作製する方法としては、特に限定はされない。例えば、自然変異誘発法、紫外線照射や変異誘発剤を用いる突然変異誘発法、EZ-Tn5（Epicentre社製）のようなランダム変異導入ツール等を用いることにより、本来レシピエント微生物が持たない薬剤耐性遺伝子を人為的に当該微生物ゲノム上に導入する方法、あらかじめ遺伝子改変用プラスミドとは別の、抗生物質耐性獲得用のプラスミドを導入する方法等が好ましい。これらの中でも自然変異誘発法がより好ましい。   The method for producing a recipient microorganism with enhanced drug resistance as described above is not particularly limited. For example, by using a mutagenesis method such as natural mutagenesis, UV irradiation or mutagenesis using a mutagen, or random mutagenesis tools such as EZ-Tn5 (Epicentre), drug resistance that the recipient microorganism originally does not have A method of artificially introducing a gene into the microorganism genome, a method of introducing a plasmid for acquiring antibiotic resistance separately from a plasmid for genetic modification in advance, and the like are preferable. Among these, the natural mutagenesis method is more preferable.

自然変異誘発法は、所望の薬剤を含有する培地中で対象とする微生物を継代培養等することにより、もともとは当該培地中で生育不可又は困難な微生物に自然変異を誘発させて、より高濃度の薬剤を含有する当該培地中でも生育し得る株を取得する方法である。レシピエント微生物の薬剤耐性をどの程度まで強化するかについては、使用するレシピエント微生物、ドナー微生物及び選択する薬剤により異なるため適宜調整することができるが、レシピエント微生物の生育が抑制されず、且つ、ドナー微生物の生育が阻害される薬剤濃度を基準に強化することが好ましい。例えば、レシピエント微生物としてロドコッカス属細菌を、ドナー微生物として大腸菌を、選択用薬剤としてクロラムフェニコールを用いる場合、自然突然変異によりクロラムフェニコール1〜200 mg/L、好ましくは10〜100 mg/Lを含有する培地において生育可能なレシピエント微生物（クロラムフェニコール耐性強化株）を得ることが望ましい。   The natural mutagenesis method is a method in which a target microorganism is originally subcultured in a medium containing a desired drug to induce spontaneous mutation in a microorganism that is originally impossible or difficult to grow in the medium. This is a method for obtaining a strain that can grow even in the medium containing a drug of a concentration. The extent to which the drug resistance of the recipient microorganism is enhanced can be adjusted as appropriate depending on the recipient microorganism used, the donor microorganism and the selected drug, but the growth of the recipient microorganism is not suppressed, and It is preferable to strengthen based on the drug concentration at which the growth of the donor microorganism is inhibited. For example, when Rhodococcus bacteria are used as the recipient microorganism, Escherichia coli is used as the donor microorganism, and chloramphenicol is used as the selective agent, chloramphenicol is 1 to 200 mg / L, preferably 10 to 100 mg by spontaneous mutation. It is desirable to obtain a recipient microorganism (chloramphenicol resistant strain) capable of growing in a medium containing / L.

2.2. 工程（ｂ）
工程（ｂ）では、接合伝達に供するドナー微生物として、所定の遺伝子改変用プラスミド（接合用プラスミド）を用いて形質転換された微生物を作製する。遺伝子改変用プラスミド、すなわちレシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子を改変するためのプラスミドDNAとしては、前述の(i)〜(v)の構成（遺伝子・塩基配列）を含むものを用いる。
ここで、前記(i)の配列は、改変の対象とするレシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換させた塩基配列領域である。当該塩基配列領域の作製は、レシピエント微生物のゲノムから、ニトリルヒドラターゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列の単離（クローニング）、遺伝子ライブラリー作製やPCR等の公知技術を用いて行うことができる。なお、ニトリルヒドラターゼ遺伝子の周辺の塩基配列としては、限定はされないが、例えば、当該遺伝子に加え、発現調節に関連する遺伝子の上流及び下流の相同領域が両端からそれぞれ100〜3000 bpの塩基配列を含む配列であることが好ましく、より好ましくは500〜2000 bpの塩基配列を含む配列である。単離した塩基配列を用いて、前記(i)の塩基配列を作製する方法は特に限定されず、PCR法や制限酵素を用いた標的遺伝子部分の切除又は置換等の公知技術を用いて行うことができる。 2.2. Process (b)
In the step (b), a microorganism transformed with a predetermined gene modifying plasmid (a plasmid for conjugation) is prepared as a donor microorganism to be used for conjugation transmission. As a plasmid for gene modification, that is, a plasmid DNA for modifying a nitrile hydratase gene in a recipient microorganism, a plasmid containing the above-described configurations (i) to (v) (gene / base sequence) is used.
Here, the sequence of (i) is a base sequence including a nitrile hydratase gene in a recipient microorganism to be modified and a base sequence around the gene, and the nitrile hydratase gene is a heterologous nitrile hydratase gene. This is a base sequence region substituted with. The base sequence region is prepared by isolating (cloning) the base sequence including the nitrile hydratase gene and the base sequence around the gene from the genome of the recipient microorganism, using a known technique such as gene library preparation or PCR. Can be used. The base sequence around the nitrile hydratase gene is not limited. For example, in addition to the gene, the upstream and downstream homologous regions of the gene related to expression regulation are 100 to 3000 bp each from both ends. It is preferable that it is a sequence including a base sequence of 500 to 2000 bp. The method for preparing the base sequence (i) using the isolated base sequence is not particularly limited, and it may be performed using a known technique such as PCR method or excision or replacement of a target gene portion using a restriction enzyme. Can do.

単離したニトリルヒドラターゼ遺伝子を置換する方法としては、限定はされず、如何なる方法を適用してもよい。例えば、SOE-PCR法や、ゲノムDNAの相同領域を有するプラスミドを形質転換する方法を用いることができる。さらに、形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法や接合伝達法が使用できる。
前記(ii)の接合伝達開始領域は、使用するドナー微生物中において接合伝達の開始点となる塩基配列を含む領域であればよく、特に限定はされず、例えば、Fプラスミド由来の接合伝達開始領域を含む配列、プラスミドR6K由来のoriT、プラスミドRP4由来のoriTが好ましい。
前記(iii)の複製開始領域は、使用するドナー微生物中において前記遺伝子改変用プラスミドの自己複製起点として機能し得る塩基配列を含む領域であればよく、特に限定はされず、例えば、oriVや、プラスミドpMB1及び広宿主域プラスミドRK2由来の複製開始点並びにその派生物等を含む領域の使用が好ましい。 The method for replacing the isolated nitrile hydratase gene is not limited, and any method may be applied. For example, an SOE-PCR method or a method for transforming a plasmid having a homologous region of genomic DNA can be used. Further, as a transformation method, an electroporation method or a junction transfer method can be used.
The junction transfer initiation region of (ii) is not particularly limited as long as it includes a base sequence that serves as a start point of junction transfer in the donor microorganism to be used. For example, the junction transfer initiation region derived from F plasmid A sequence comprising, oriT derived from plasmid R6K, oriT derived from plasmid RP4 is preferred.
The replication initiation region of (iii) is not particularly limited as long as it contains a base sequence that can function as a self-replication origin of the gene-modifying plasmid in the donor microorganism used, for example, oriV, It is preferable to use a region containing the replication origin derived from the plasmid pMB1 and the broad host range plasmid RK2, and derivatives thereof.

前記(iv)の薬剤耐性遺伝子は、接合伝達に供するレシピエント微生物（例えばロドコッカス属細菌等）が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子であれば、特に限定はされず、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、トリメトプリム耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ナルジクス酸耐性遺伝子、カルベニシン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子等が好ましく挙げられる。レシピエント微生物がこれらの薬剤耐性を有していない場合、所望の薬剤耐性を有する変異株を作製し、使用することができる。
前記(v)の条件致死遺伝子は、レシピエント微生物のゲノム上に導入された場合に、当該微生物を死に至らしめる作用を有し得る遺伝子であれば、特に限定はされず、例えば、sacB遺伝子が好ましい。sacB遺伝子は、当該遺伝子を保有し発現する微生物（例えばロドコッカス属細菌等）をスクロース含有培地で培養した場合に、スクロースを基質とし当該微生物に対して致死作用を有する有害物質を産生する酵素をコードする遺伝子である。 The drug resistance gene (iv) is not particularly limited as long as it is a resistance gene to a drug to which a recipient microorganism (for example, Rhodococcus genus bacteria) subjected to conjugation transmission is sensitive. For example, an ampicillin resistance gene, kanamycin resistance Preferred examples include genes, chloramphenicol resistance genes, trimethoprim resistance genes, gentamicin resistance genes, naldic acid resistance genes, carbenicin resistance genes, thiostrepton resistance genes, and the like. When the recipient microorganism does not have these drug resistances, mutants having the desired drug resistance can be produced and used.
The conditional lethal gene of (v) is not particularly limited as long as it is a gene that can have the effect of causing the microorganism to die when introduced into the genome of the recipient microorganism. For example, the sacB gene is preferable. The sacB gene encodes an enzyme that produces a harmful substance having a lethal effect on a microorganism using sucrose as a substrate when a microorganism (for example, Rhodococcus genus bacteria) possessing and expressing the gene is cultured in a sucrose-containing medium. It is a gene to do.

接合伝達に用いる前記遺伝子改変用プラスミドは、如何なるベクターをベースとして構築されたものであってもよく、限定はされないが、例えば、レシピエント微生物がロドコッカス属細菌の場合は、pK19mobベクター（Schaefer et al, Gene1, vol. 45, p. 69-73(1994)）等を用いることが好ましい。
前記遺伝子改変用プラスミドにおける(i)〜(v)の構成は、例えば、上流から順に、前記(i)の配列、前記(iv)の耐性遺伝子、前記(v)の条件致死遺伝子、前記(ii)の接合伝達開始領域、前記(iii)の複製開始領域の順で配されていることが好ましい。前記(i)〜(v)の構成を含む遺伝子改変用プラスミドの構築は、公知の遺伝子組換え技術を用いて実施することができる。
工程（ｂ）では、上述したような各構成を有する遺伝子改変用プラスミドをドナー微生物内に導入して形質転換された微生物、すなわち接合伝達に供するドナー微生物を作製する。その際、形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法や塩化カルシウム法等の、微生物の形質転換方法として公知の方法を用いることができる。 The plasmid for gene modification used for conjugation transfer may be constructed based on any vector, and is not limited. For example, when the recipient microorganism is a Rhodococcus bacterium, the pK19mob vector (Schaefer et al. Gene1, vol. 45, p. 69-73 (1994)).
(I) to (v) in the plasmid for genetic modification are, for example, in order from upstream, the sequence (i), the resistance gene (iv), the conditionally lethal gene (v), the (ii) ) And (iii) replication start region are arranged in this order. The construction of the plasmid for gene modification including the structures (i) to (v) can be performed using a known gene recombination technique.
In the step (b), a genetically modified plasmid having each of the above-described structures is introduced into a donor microorganism to produce a transformed microorganism, that is, a donor microorganism used for conjugation transmission. At this time, as a transformation method, a method known as a transformation method for microorganisms, such as an electroporation method or a calcium chloride method, can be used.

2.3. 工程（ｃ）
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行う。通常は、ドナー微生物及びレシピエント微生物のそれぞれの菌体懸濁液を混合し、適当なプレート培地（LB培地等）上に均一に広げて、両微生物の接合を行わせる。
当該接合においては、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドがレシピエント微生物内に移動し、レシピエント微生物のゲノムと上記プラスミドとの相同配列で相同組換が起こり、遺伝子改変用プラスミドの一部又は大部分が当該レシピエント微生物のゲノム上に導入される。この接合により、レシピエント微生物の形質転換体が、すなわち相同組換え株が作製される。
本工程（ｃ）における所望の相同組換え株は、1重交差により標的遺伝子の上流又は下流に当該遺伝子改変用プラスミドが導入されたものである。
所望の形質転換体であるかどうかの確認は、レシピエント微生物自体の薬剤耐性、及び前記遺伝子改変用プラスミド由来の薬剤耐性を利用して行うことができる。具体的には、両薬剤を含む培地（例えば、カナマイシン及びクロラムフェニコール含有培地等）において上記接合後の微生物を培養することにより、所望の形質転換体を選択することができる。 2.3. Process (c)
In the step (c), the junction transfer from the donor microorganism produced in the step (b) to the recipient microorganism produced in the step (a) is performed. Usually, the cell suspensions of the donor microorganism and the recipient microorganism are mixed and spread uniformly on an appropriate plate medium (LB medium or the like) to allow the two microorganisms to be joined.
In this conjugation, the gene modification plasmid in the donor microorganism moves into the recipient microorganism, homologous recombination occurs in the homologous sequence of the recipient microorganism's genome and the above plasmid, and a part or large part of the gene modification plasmid is generated. A portion is introduced onto the genome of the recipient microorganism. By this conjugation, a transformant of the recipient microorganism, that is, a homologous recombinant strain is produced.
The desired homologous recombination strain in this step (c) is one in which the gene-modifying plasmid is introduced upstream or downstream of the target gene by single crossover.
Whether or not the desired transformant is desired can be confirmed using the drug resistance of the recipient microorganism itself and the drug resistance derived from the gene modification plasmid. Specifically, a desired transformant can be selected by culturing the microorganism after conjugation in a medium containing both drugs (for example, a medium containing kanamycin and chloramphenicol).

2.4. 工程（ｄ）
工程（ｄ）では、工程（ｃ）で作製されたレシピエント微生物の形質転換体（形質転換微生物）を、前記遺伝子改変用プラスミド由来の条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養（継代培養）する。条件致死遺伝子が機能し得る培養条件としては、限定はされないが、例えば条件致死遺伝子がsacB遺伝子の場合は、スクロース含有培地を用いた培養が好ましく挙げられる。
当該培養においては、上記条件致死遺伝子を有する形質転換微生物は生育困難であるため、継代培養により、自然誘発的に、当該微生物のゲノム上から相同組換えにより上記条件致死遺伝子を含む塩基配列領域が除かれた（脱落した）形質転換微生物を得る（選抜する）ことができる。ただし、当該得られた微生物の中には、レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子が、当初の目的の通り置換されているものと、そうでないもの（上記脱落の際の相同組換えにより元の（異種でない）ニトリルヒドラターゼ遺伝子に復活したもの）とが含まれ得る。よって、通常は、ゲノム上のニトリルヒドラターゼ遺伝子のDNA配列確認や、さらに別の培養条件で培養したり、培養物を用いてニトリルヒドラターゼ活性測定や各種タンパク質分析法を適用して分析することにより、所望の形質転換微生物を選択することがより好ましい。 2.4. Process (d)
In the step (d), the recipient microorganism transformant (transformed microorganism) produced in the step (c) is cultured (subcultured) under a culture condition in which the conditional lethal gene derived from the gene modifying plasmid can function. ) The culture conditions under which the conditionally lethal gene can function are not limited. For example, when the conditionally lethal gene is the sacB gene, culture using a sucrose-containing medium is preferable.
In this culture, since the transformed microorganism having the conditionally lethal gene is difficult to grow, the base sequence region containing the conditionally lethal gene by homologous recombination from the genome of the microorganism naturally induced by subculture. It is possible to obtain (select) transformed microorganisms from which is removed (dropped). However, in the obtained microorganism, the nitrile hydratase gene in the recipient microorganism has been replaced as originally intended, and the microorganism that has not been replaced (the original by homologous recombination at the time of dropping). (Non-heterologous) nitrile hydratase gene resurrected). Therefore, usually, the DNA sequence of the nitrile hydratase gene on the genome should be confirmed, cultured under different culture conditions, or analyzed using nitrile hydratase activity measurement or various protein analysis methods using the culture. More preferably, a desired transformed microorganism is selected.


３．ニトリルヒドラターゼの製造方法
本発明のニトリルヒドラターゼの製造方法、詳しくは、異種ニトリルヒドラターゼの製造方法は、前述した本発明の微生物を培養し、得られる培養物から前記異種ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする方法である。
ここで、当該製造方法に用いる本発明の微生物としては、具体的には、ニトリルヒドラターゼ遺伝子が異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換された微生物、すなわちゲノム上の異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子の発現により異種ニトリルヒドラターゼを産生し得る微生物が挙げられる。
また、当該微生物は、後述する形質転換微生物の宿主としても用いることができる。
当該形質転換微生物としては、従来公知の遺伝子組換え技術等により、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子（前記置換により導入されている異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子と同種であっても異種であってもよい）が発現し得るように導入されたものであればよく、限定はされないが、例えば、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む組換えベクター（発現ベクター）等を導入することによりなされたものが好ましい。
3. Method for producing nitrile hydratase The method for producing nitrile hydratase of the present invention, specifically, the method for producing heterogeneous nitrile hydratase, cultivates the microorganism of the present invention described above, and collects said heterogeneous nitrile hydratase from the resulting culture. It is the method characterized by doing.
Here, as the microorganism of the present invention used in the production method, specifically, a microorganism in which a nitrile hydratase gene is replaced with a heterogeneous nitrile hydratase gene, that is, a heterologous nitrile by expression of a heterologous nitrile hydratase gene on the genome. Examples include microorganisms capable of producing hydratase.
The microorganism can also be used as a host for a transformed microorganism described later.
As the transformed microorganism, a heterologous nitrile hydratase gene (which may be the same or different from the heterologous nitrile hydratase gene introduced by the above substitution) is expressed by a conventionally known genetic recombination technique or the like. It is not particularly limited as long as it has been introduced so as to be able to do so, but for example, those introduced by introducing a recombinant vector (expression vector) containing a heterologous nitrile hydratase gene and the like are preferable.

組換えベクターを用いる場合は、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子が、形質転換される本発明の微生物において発現可能なように、ベクターに組み込まれることが必要である。例えば、異種ニトリルヒドラターゼを産生し得る微生物のゲノム等から異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むPCR断片を得て、得られた断片を発現ベクターに連結することで、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む発現ベクターを得ることができる。発現ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどが挙げられ、中でもプラスミドDNAが好ましい。異種ニトリルヒドラターゼを発現させるためのベクター（プラスミドDNA）としては、限定されないが、例えば、ロドコッカス属細菌を宿主とする場合は、pSJ034、pSJ041、pSJ042、pSJ043等が好ましい。pSJ034は、ロドコッカス属細菌においてニトリルヒドラターゼを発現するベクターであり、特開平10-337185号公報に示す方法でpSJ023より作製することができる。このpSJ023は、形質転換体 ATCC16274/pSJ023（FERM BP-6232）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成９年３月４日付けで国際寄託されている。   When a recombinant vector is used, it is necessary that the heterologous nitrile hydratase gene be incorporated into the vector so that it can be expressed in the transformed microorganism of the present invention. For example, an expression vector containing a heterologous nitrile hydratase gene is obtained by obtaining a PCR fragment containing a heterologous nitrile hydratase gene from the genome of a microorganism capable of producing a heterologous nitrile hydratase and linking the obtained fragment to an expression vector. Can be obtained. Examples of expression vectors include plasmid DNA, bacteriophage DNA, retrotransposon DNA, artificial chromosomal DNA, and plasmid DNA is preferred. The vector (plasmid DNA) for expressing the heterologous nitrile hydratase is not limited, but for example, when a Rhodococcus bacterium is used as a host, pSJ034, pSJ041, pSJ042, pSJ043 and the like are preferable. pSJ034 is a vector that expresses nitrile hydratase in Rhodococcus bacteria, and can be prepared from pSJ023 by the method described in JP-A-10-337185. This pSJ023 was transformed into ATCC16274 / pSJ023 (FERM BP-6232) in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (1st, 1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) in March 1997. It has been deposited internationally on the 4th.

当該発現ベクターには、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
本発明において、「培養物」とは、培養上清、培養菌体又は菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換微生物を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。目的の異種ニトリルヒドラターゼは、上記培養物中に蓄積される。 In addition to the heterologous nitrile hydratase gene, a promoter, terminator, enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, ribosome binding sequence (SD sequence) and the like can be linked to the expression vector. Examples of selectable markers include ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, dihydrofolate reductase gene, neomycin resistance gene, and the like.
In the present invention, “culture” means any of culture supernatant, cultured cells, or disrupted cells. The method for culturing the transformed microorganism is carried out according to the usual method used for culturing a host. The desired heterogeneous nitrile hydratase accumulates in the culture.

形質転換微生物を培養する培地は、宿主菌となる本発明の微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅若しくは炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。さらに、培地にはニトリルヒドラターゼの補欠分子であるコバルトイオンや鉄イオンを添加し、酵素の誘導剤となるニトリル類やアミド類を添加してもよい。   The medium for cultivating the transformed microorganism contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism of the present invention as a host fungus, and can be used to efficiently culture microorganisms. Either a natural medium or a synthetic medium may be used. Examples of the carbon source include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol. Examples of the nitrogen source include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium phosphate or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor, and the like. Examples of the inorganic substance include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate. Moreover, you may add an antifoamer in order to prevent foaming during culture | cultivation as needed. Further, cobalt ions and iron ions, which are nitrile hydratase prosthetic molecules, may be added to the medium, and nitriles and amides serving as enzyme inducers may be added.

培養中、発現ベクターや目的遺伝子（置換によりゲノム上に導入した異種ニトリルヒドラターゼも含む）の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。すなわち、発現ベクター等における選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合に相当する薬剤を培地に添加したり、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合に相当する栄養因子を培地から除いたりしてもよい。また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合は、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した微生物を培養する場合、培養中、必要に応じてアンピシリンを添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養するときには、IPTG等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸(IAA)で誘導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養するときには、IAA等を培地に添加することができる。 During culturing, the cells may be cultured under selective pressure in order to prevent the expression vector and the target gene (including heterologous nitrile hydratase introduced into the genome by substitution) from dropping off. That is, a drug corresponding to when the selection marker in an expression vector or the like is a drug resistance gene may be added to the medium, or a nutrient factor corresponding to when the selection marker is an auxotrophic complementary gene may be removed from the medium. Good. When the selectable marker is an assimilation gene, a corresponding assimilation factor can be added as a sole factor as necessary. For example, when culturing a microorganism transformed with a vector containing an ampicillin resistance gene, ampicillin may be added as needed during the culture.
When cultivating a transformed microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when cultivating a transformed microorganism transformed with an expression vector having a promoter inducible with isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), IPTG or the like can be added to the medium. In addition, when cultivating a transformed microorganism transformed with an expression vector using a trp promoter inducible with indoleacetic acid (IAA), IAA or the like can be added to the medium.

形質転換微生物の培養条件は、発現目的の異種ニトリルヒドラターゼの生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば、特段限定されるものではない。通常、10℃〜45℃、好ましくは10℃〜40℃の温度下で、5〜120時間、好ましくは5〜100時間程度行うことができる。pHの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて、適時調整を行うことが好ましい。培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられるが、振盪培養又は通気攪拌培養（ジャーファーメンター）により好気的条件下で培養することが好ましい。また、場合により、本培養に先立ち、少量の前培養を行うこともできる。例えば、ロドコッカス属細菌の形質転換微生物を培養する場合は、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、30〜40℃の温度下で行うことが好ましい。
上記培養条件で培養すると、高収率で異種ニトリルヒドラターゼを上記培養物中、すなわち培養上清、培養菌体又は菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積することができる。これら異種ニトリルヒドラターゼを含有する「培養物」は、後述するアミド化合物の製造方法に使用することができる。 The culture conditions for the transformed microorganism are not particularly limited as long as the productivity of the heterogeneous nitrile hydratase for expression and the growth of the host are not hindered. Usually, it can be carried out at a temperature of 10 ° C to 45 ° C, preferably 10 ° C to 40 ° C for 5 to 120 hours, preferably about 5 to 100 hours. It is preferable to adjust the pH in a timely manner using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, or the like. Examples of the culture method include solid culture, stationary culture, shaking culture, and aeration and agitation culture, but culture under aerobic conditions by shaking culture or aeration and agitation culture (jar fermenter) is preferable. In some cases, a small amount of pre-culture can be performed prior to the main culture. For example, when cultivating a transformed microorganism of the genus Rhodococcus, it is preferably carried out at a temperature of 30 to 40 ° C. under aerobic conditions such as shaking culture or aeration stirring culture.
When cultured under the above-described culture conditions, the heterogeneous nitrile hydratase can be accumulated in the culture, that is, in at least one of the culture supernatant, the cultured cells, or the disrupted cells of the cells in a high yield. The “culture” containing these different nitrile hydratases can be used in the method for producing an amide compound described later.

培養後、異種ニトリルヒドラターゼが菌体内に生産される場合には、菌体を破砕することにより、目的の異種ニトリルヒドラターゼを採取することができる。菌体の破砕方法としては、フレンチプレス又はホモジナイザーによる高圧処理、超音波処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。破砕後、必要に応じて菌体の破砕残渣（菌体抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、菌体抽出液可溶性画分であり、粗精製した異種ニトリルヒドラターゼ溶液とすることができる。
また、異種ニトリルヒドラターゼが菌体内に生産される場合、菌体そのものを遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま使用することも可能である。 When heterogeneous nitrile hydratase is produced in the microbial cells after culturing, the desired heterogeneous nitrile hydratase can be collected by disrupting the microbial cells. As a method for disrupting cells, high-pressure treatment using a French press or homogenizer, ultrasonic treatment, grinding treatment using glass beads, enzyme treatment using lysozyme, cellulase or pectinase, freeze-thawing treatment, hypotonic solution treatment, phage treatment A lysis induction process or the like can be used. After crushing, if necessary, crushing residues of the microbial cells (including the insoluble fraction of the microbial cell extract) can be removed. Examples of the method for removing the residue include centrifugation and filtration. If necessary, the residue removal efficiency can be increased by using a flocculant or a filter aid. The supernatant obtained after removing the residue is a soluble fraction of the bacterial cell extract and can be a crudely purified heterogeneous nitrile hydratase solution.
In addition, when heterogeneous nitrile hydratase is produced in the microbial cells, the microbial cells themselves can be recovered by centrifugation, membrane separation, etc., and used without being crushed.

異種ニトリルヒドラターゼが菌体外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により菌体を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により前記培養物中から異種ニトリルヒドラターゼを採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することもできる。
形質転換微生物を培養して得られた異種ニトリルヒドラターゼの生産収率は、例えば、培養液あたり、菌体湿重量又は乾燥重量あたり、粗酵素液タンパク質あたりなどの単位で、SDS-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）やニトリルヒドラターゼ活性測定などにより確認することができるが、特段限定されるものではない。SDS-PAGEは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。また、異種ニトリルヒドラターゼ活性は、上述した活性の値を適用することができる。 When heterogeneous nitrile hydratase is produced outside the cells, the culture solution is used as it is, or the cells are removed by centrifugation or filtration. Thereafter, if necessary, a different nitrile hydratase is collected from the culture by extraction with ammonium sulfate precipitation or the like, and further subjected to dialysis and various chromatography (gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.) as necessary. It can also be used for isolation and purification.
The production yield of the heterogeneous nitrile hydratase obtained by culturing the transformed microorganism is, for example, in units such as per culture liquid, wet or dry weight of the bacterial cell, or per protein of the crude enzyme liquid. Acrylamide gel electrophoresis) or nitrile hydratase activity measurement can be used, but it is not particularly limited. SDS-PAGE can be performed by those skilled in the art using a known method. Moreover, the value of the activity mentioned above can be applied to the heterogeneous nitrile hydratase activity.


４．アミド化合物の製造方法
上述のように製造された異種ニトリルヒドラターゼ（前述した培養物を含む）は、酵素触媒（菌体のまま利用する微生物触媒等を含む）として物質生産に利用することができる。例えば、ニトリル化合物に、異種ニトリルヒドラターゼを接触させ、当該接触によりニトリル化合物が変換されて生成されるアミド化合物を採取することにより、アミド化合物を製造することができる。
酵素触媒としては、前述のように適当な宿主内で異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子が発現するように遺伝子導入を行い、宿主を培養した後の培養物、又は当該培養物の処理物を利用することができる。処理物としては、例えば、培養後の菌体をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、グルタルアルデヒドで処理したもの、アルミナ、シリカ、ゼオライト及び珪藻土等の無機担体に担持したもの等が挙げられる。
基質として使用されるニトリル化合物は、酵素の基質特異性、酵素の基質に対する安定性等を考慮して選択される。ニトリル化合物としては、アクリロニトリルが好ましい。
4). Method for Producing Amide Compound The heterogeneous nitrile hydratase (including the culture described above) produced as described above can be used for substance production as an enzyme catalyst (including a microbial catalyst used as it is). . For example, an amide compound can be produced by bringing a nitrile compound into contact with a different nitrile hydratase and collecting the amide compound produced by the conversion of the nitrile compound by the contact.
As the enzyme catalyst, as described above, it is possible to use a culture after culturing the host or a processed product of the culture after introducing the gene so that the heterologous nitrile hydratase gene is expressed in an appropriate host. it can. Examples of the treated product include those in which the cultured cells are included in a gel such as acrylamide, those treated with glutaraldehyde, and those supported on an inorganic carrier such as alumina, silica, zeolite, and diatomaceous earth.
The nitrile compound used as the substrate is selected in consideration of the substrate specificity of the enzyme, the stability of the enzyme to the substrate, and the like. As the nitrile compound, acrylonitrile is preferable.

反応方法、及び反応終了後のアミド化合物の採取方法は、特に限定はされず、基質及び酵素触媒の特性により適宜選択することができる。例えば、当該反応において、基質となるニトリル化合物の濃度は、0.1〜10% (W/V)が好ましく、5％ (W/V)程度が特に好ましい。また、当該反応は、pH 5〜10の緩衝液又は水中で行うことが好ましく、例えば、50 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）中で行うことができる。反応後の酵素触媒は、その活性が失活しない限り、リサイクル使用することが好ましい。失活の防止やリサイクルを容易にすることに鑑み、酵素触媒は処理物の形態で使用されることが好ましい。
上記反応により生成したアクリルアミドは、ガスクロマトグラフィーなどの公知の方法を用いて定量することができる。また、アクリルアミドの産生量から前記酵素触媒のニトリルヒドラターゼ活性を換算することができる。 The reaction method and the method for collecting the amide compound after completion of the reaction are not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the characteristics of the substrate and the enzyme catalyst. For example, in the reaction, the concentration of the nitrile compound serving as a substrate is preferably 0.1 to 10% (W / V), particularly preferably about 5% (W / V). Moreover, it is preferable to perform the said reaction in the buffer solution of pH 5-10 or water, for example, can be performed in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0). The enzyme catalyst after the reaction is preferably recycled as long as its activity is not deactivated. In view of preventing deactivation and facilitating recycling, the enzyme catalyst is preferably used in the form of a treated product.
Acrylamide produced by the above reaction can be quantified using a known method such as gas chromatography. The nitrile hydratase activity of the enzyme catalyst can be converted from the amount of acrylamide produced.


以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.

異種（改変）ニトリルヒドラターゼ置換用プラスミドの作製
（１）接合伝達プラスミド（pK19mobsacB1）の作製
pDNR-1r（clontech社製）中のsacB遺伝子を、NspV切断サイトを付加したプライマーSAC-01（配列番号9）及びSAC-02（配列番号10）を使用したPCRにより増幅し、約1.9 kbのsacB遺伝子断片を得た。PCRは以下の反応条件で行った。 Preparation of heterogeneous (modified) nitrile hydratase replacement plasmid (1) Preparation of conjugation transfer plasmid (pK19mobsacB1)
The sacB gene in pDNR-1r (manufactured by clontech) was amplified by PCR using primers SAC-01 (SEQ ID NO: 9) and SAC-02 (SEQ ID NO: 10) to which an NspV cleavage site was added. A sacB gene fragment was obtained. PCR was performed under the following reaction conditions.

プライマー：
SAC-01： 5'-GGTTCGAATACCTGCCGTTCACTATTATTTAGTG-3'（配列番号９）
SAC-02： 5'-GGTTCGAATCGGCATTTTCTTTTGCGTTTTTATTTG-3'（配列番号１０） Primer:
SAC-01: 5'-GGTTCGAATACCTGCCGTTCACTATTATTTAGTG-3 '(SEQ ID NO: 9)
SAC-02: 5'-GGTTCGAATCGGCATTTTCTTTTGCGTTTTTATTTG-3 '(SEQ ID NO: 10)

反応液組成：
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR（タカラバイオ社製） 25 μl
プライマーSAC-01（配列番号９） 1 μl
プライマーSAC-02（配列番号１０） 1 μl
pDNR-1r（clontech社製）（100倍希釈） 1 μl
総量 50 μl Reaction solution composition:
Sterile water 22 μl
2 x PrimeSTAR (Takara Bio) 25 μl
Primer SAC-01 (SEQ ID NO: 9) 1 μl
Primer SAC-02 (SEQ ID NO: 10) 1 μl
pDNR-1r (manufactured by clontech) (100-fold dilution) 1 μl
Total volume 50 μl

温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 150秒の反応を30サイクル、72℃ 300秒の反応を1サイクル Temperature cycle:
30 cycles of reaction at 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 150 seconds, 1 cycle for reaction at 72 ° C for 300 seconds

sacB遺伝子断片を制限酵素NspV（タカラバイオ社製）で消化後、pK19mobのNsp Vサイトに接続し、sacB遺伝子が正方向に導入されたプラスミドpK19mobsacB1を構築した。pK19mob Nsp V切断断片とsacB遺伝子断片及びsacB遺伝子Nsp V切断断片の精製にはGFX PCR DNA band and Gel Band Purification kit（GE Healthcare社製）を、両断片の接続にはDNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞を、プラスミドの抽出にはQIAprep miniprep kit（QIAGEN社製）を用いた。   The sacB gene fragment was digested with the restriction enzyme NspV (manufactured by Takara Bio Inc.) and then connected to the Nsp V site of pK19mob to construct plasmid pK19mobsacB1 into which the sacB gene was introduced in the forward direction. For purification of pK19mob Nsp V-cleaved fragment, sacB gene fragment and sacB gene Nsp V-cleaved fragment, GFX PCR DNA band and Gel Band Purification kit (manufactured by GE Healthcare) and DNA Ligation Kit <Mighty Mix> The QIAprep miniprep kit (manufactured by QIAGEN) was used for plasmid extraction.

（２）J1株ゲノムDNAの調製
ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J1株(以下、J1株と称する)を100mlのMYK培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、１％ グルコース、0.2％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4、pH7.0）中、30℃にて72時間振盪培養した。
培養後、集菌し、集菌された菌体をSaline-EDTA溶液（0.1M EDTA、0.15M NaCl(pH8.0)）4mlに懸濁した。懸濁液にリゾチーム40 mgを加えて、37℃で1〜2時間振盪した後、-20℃で凍結した。
次に、10mlのTris-SDS液（1％SDS、0.1M NaCl、0.1M Tris-HCl(pH9.0)）を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼK（メルク社）を10μl（終濃度10mg/ｍｌ）加えて37℃で1時間振盪した。
次に、等量のTE (10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0)) 飽和フェノールを加え、撹拌した後遠心した。遠心後、上層をとり2倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でDNAを巻きとり、90％、80％、70％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。 (2) Preparation of J1 strain genomic DNA Rhodococcus rhodochrous J1 strain (hereinafter referred to as J1 strain) in 100 ml of MYK medium (0.5% polypeptone, 0.3% bactoeast extract, 0.3% bactomalt extract, 1% Glucose, 0.2% K2HPO4, 0.2% KH2PO4, pH 7.0) was cultured with shaking at 30 ° C. for 72 hours.
After culturing, the cells were collected, and the collected cells were suspended in 4 ml of Saline-EDTA solution (0.1 M EDTA, 0.15 M NaCl (pH 8.0)). 40 mg of lysozyme was added to the suspension, shaken at 37 ° C for 1-2 hours, and then frozen at -20 ° C.
Next, 10 ml of Tris-SDS solution (1% SDS, 0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-HCl (pH 9.0)) was added with gentle shaking, and 10 μl of proteinase K (Merck) was added (final concentration 10 mg). / ml) and shaken at 37 ° C. for 1 hour.
Next, an equal amount of TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)) saturated phenol was added, stirred and centrifuged. After centrifugation, the upper layer was taken, and twice the amount of ethanol was added. Then, the DNA was wound with a glass rod, and phenol was sequentially removed with 90%, 80%, and 70% ethanol.

次に、DNAを3mlのTE緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼA溶液(100℃、15分間の加熱処理済)を10μg/mlになるよう加え、37℃で30分間振盪した。さらに、プロテイナーゼKを加え37℃で30分間振盪した後、等量のTE飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量のクロロホルム（4％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に2倍量のエタノールを加え、ガラス棒でDNAを巻きとり回収し、Ｊ１株ゲノムのDNAを得た。このゲノムDNAは、配列番号１に示すニトリルヒドラターゼ遺伝子を有している。 Next, DNA was dissolved in 3 ml of TE buffer, ribonuclease A solution (100 ° C., heat-treated for 15 minutes) was added to 10 μg / ml, and shaken at 37 ° C. for 30 minutes. Furthermore, after adding proteinase K and shaking at 37 ° C. for 30 minutes, an equal amount of TE-saturated phenol was added and centrifuged to separate into an upper layer and a lower layer.
After repeating this operation twice for the upper layer, the same amount of chloroform (containing 4% isoamyl alcohol) was added, and the same extraction operation was repeated. Then, twice the amount of ethanol was added to the upper layer, and the DNA was wound up and collected with a glass rod to obtain DNA of the J1 strain genome. This genomic DNA has the nitrile hydratase gene shown in SEQ ID NO: 1.

（３）異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子の作製と発現プラスミドの構築
ニトリルヒドラターゼ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下の反応条件でPCRを行った。 (3) Preparation of heterologous nitrile hydratase gene and construction of expression plasmid In order to obtain a sequence including the upstream region and the downstream region of the nitrile hydratase gene, PCR was performed under the following reaction conditions.

プライマー：
NH-Sub01: 5'-GGCCTGCAGGggtgagggctctgatgacagttgc-3'（配列番号１１）
NH-Sub02: 5'-CCTCTAGAatgaccggcgtgtcgtaaccggacg-3'（配列番号１２） Primer:
NH-Sub01: 5'-GGCCTGCAGGggtgagggctctgatgacagttgc-3 '(SEQ ID NO: 11)
NH-Sub02: 5'-CCTCTAGAatgaccggcgtgtcgtaaccggacg-3 '(SEQ ID NO: 12)

反応液組成：
鋳型DNA（Ｊ１株ゲノムDNA） 1μl
プライマーNH-Sub01（配列番号１１） 0.5μl
プライマーNH-Sub02（配列番号１２） 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl Reaction solution composition:
Template DNA (J1 strain genomic DNA) 1μl
Primer NH-Sub01 (SEQ ID NO: 11) 0.5 μl
Primer NH-Sub02 (SEQ ID NO: 12) 0.5 μl
Sterile water 8μl
PrimeSTAR (Takara Bio) 10μl
Total volume 20μl

温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 60秒の反応を30サイクル Temperature cycle:
30 cycles of reaction at 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 60 seconds

PCR終了後、反応液2μlを0.7％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約4.5kbのPCR産物の検出を行った。PCR産物を確認した後、反応液をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製し、Mighty Cloning Kit(Blunt End)（タカラバイオ）でpUC118にクローニングし、DNA配列を確認し、pUC-JN01と命名した。   After completion of PCR, 2 μl of the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 0.7% agarose gel, and a PCR product of about 4.5 kb was detected. After confirming the PCR product, the reaction solution was purified with GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit (Amersham Biosciences), cloned into pUC118 with Mighty Cloning Kit (Blunt End) (Takara Bio), and the DNA sequence was confirmed. And named pUC-JN01.

次に、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を作製した。異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子は、特開2007-43910号公報（特願2005-228736）に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ（「Nα↑60D，Dβ←209G，Iα↓95T」のアミノ酸置換）をコードする遺伝子として作製した。
ここで、上記アミノ酸置換の態様（すなわち「Nα↑60D，Dβ←209G，Iα↓95T」）は、具体的には、Ｊ１菌由来の野生型ニトリルヒドラターゼのαサブユニット（配列番号２）の塩基配列のうち、ＣＴＬＣＳＣ領域（補欠分子結合領域を構成するアミノ酸配列領域）の最も上流側のＣ残基より６０残基上流のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換され（この置換は「Nα↑60D」と表記される）、上記ＣＴＬＣＳＣ領域の最も下流側のＣ残基より９５残基下流のイソロイシン（Ｉ）がスレオニン（Ｔ）に置換され（この置換は「Iα↓95T」と表記される）、さらに、Ｊ１菌由来の野生型ニトリルヒドラターゼのβサブユニット（配列番号１）の塩基配列のうちＣ末端のアミノ酸残基から（当該アミノ酸残基を含めて数えて）２０９番目のアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に置換された（この置換は「Dβ←209G」と表記される）アミノ酸残基の置換態様を意味するものである。 Next, a heterologous nitrile hydratase gene was prepared. The heterologous nitrile hydratase gene encodes the improved nitrile hydratase (amino acid substitution of “Nα ↑ 60D, Dβ ← 209G, Iα ↓ 95T”) described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-43910 (Japanese Patent Application No. 2005-228736). Prepared as a gene.
Here, the above-described amino acid substitution mode (ie, “Nα ↑ 60D, Dβ ← 209G, Iα ↓ 95T”) is specifically the wild-type nitrile hydratase α-subunit (SEQ ID NO: 2) derived from J1 bacteria. Of the base sequence, asparagine (N) 60 residues upstream from the most upstream C residue in the CTLCSC region (amino acid sequence region constituting the prosthetic molecule binding region) is substituted with aspartic acid (D) (this substitution is “Nα ↑ 60D”), isoleucine (I), which is 95 residues downstream from the most downstream C residue in the CTLCSC region, is replaced with threonine (T) (this substitution is expressed as “Iα ↓ 95T”). In addition, from the amino acid residue at the C-terminal of the β-subunit (SEQ ID NO: 1) of the wild-type nitrile hydratase derived from J1 bacterium (counted including the amino acid residue), position 209 The ass Ragin acid (D) has been substituted with glycine (G) (This replacement inscribed as a "D.beta ← 209G") is intended to mean the substitution aspect of the amino acid residues.

まず、下記の反応条件でPCRを行うことにより、「α↑60D」のアミノ酸置換を導入した。   First, amino acid substitution of “α ↑ 60D” was introduced by performing PCR under the following reaction conditions.

プライマー（「α↑60D」アミノ酸置換用）：
Forward-プライマー（α↑60D-F）：
gtcgtttcgtactacgaggacgagatcggcccgatgg（配列番号１３）
Reverse-プライマー（α↑60D-R）：
ccatcgggccgatctcgtcctcgtagtacgaaacgac（配列番号１４） Primer (for “α ↑ 60D” amino acid substitution):
Forward-primer (α ↑ 60D-F):
gtcgtttcgtactacgaggacgagatcggcccgatgg (SEQ ID NO: 13)
Reverse-primer (α ↑ 60D-R):
ccatcgggccgatctcgtcctcgtagtacgaaacgac (SEQ ID NO: 14)

反応液組成：
pUC-JN01 1μl
10μM Forward-プライマー 1μl
10μM Reverse-プライマー 1μl
滅菌水 7μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl Reaction solution composition:
pUC-JN01 1μl
10 μM Forward-Primer 1 μl
10 μM Reverse-Primer 1 μl
Sterile water 7μl
PrimeSTAR (Takara Bio) 10μl
Total volume 20μl

温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 60秒の反応を30サイクル Temperature cycle:
30 cycles of reaction at 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 60 seconds

各反応液にDpnIを1μl添加し、37℃で１時間インキュベートし、DpnI処理液を用いて大腸菌JM109に形質転換を行った。得られた形質転換体のDNA配列を確認し、pUC-JN02と命名した。
さらに下記のプライマーを使用し、上記と同様の方法で、「Dβ←209G」及び「Iα↓95T」の変異をそれぞれ順に追加導入した。得られたプラスミドをpUC-JN04と命名した。 1 μl of DpnI was added to each reaction solution, incubated at 37 ° C. for 1 hour, and E. coli JM109 was transformed with the DpnI treatment solution. The DNA sequence of the obtained transformant was confirmed and named pUC-JN02.
Further, using the following primers, mutations of “Dβ ← 209G” and “Iα ↓ 95T” were sequentially introduced in the same manner as described above. The obtained plasmid was designated as pUC-JN04.

プライマー（「β←209G」アミノ酸置換用）：
Forward-プライマー（β←209G-F）：
gtcccctatcagaaggGcgagcccttcttccac（配列番号１５）
Reverse-プライマー（β←209G-R）：
gtggaagaagggctcgCccttctgataggggac（配列番号１６） Primer (for “β ← 209G” amino acid substitution):
Forward-primer (β ← 209G-F):
gtcccctatcagaaggGcgagcccttcttccac (SEQ ID NO: 15)
Reverse-primer (β ← 209G-R):
gtggaagaagggctcgCccttctgataggggac (SEQ ID NO: 16)

プライマー（「α↓17G」アミノ酸置換用）：
Forward-プライマー（α↓17G-F）：
acaccgcaggaagtgaCcgtatgagtgaagac（配列番号１７）
Reverse-プライマー（α↓17G-R）：
gtcttcactcatacgGtcacttcctgcggtgt（配列番号１８） Primer (for “α ↓ 17G” amino acid substitution):
Forward-primer (α ↓ 17G-F):
acaccgcaggaagtgaCcgtatgagtgaagac (SEQ ID NO: 17)
Reverse-primer (α ↓ 17G-R):
gtcttcactcatacgGtcacttcctgcggtgt (SEQ ID NO: 18)

次に、上記でクローニングした断片を制限酵素XbaI、Sse8387Iで切断し、約6Kbの断片を回収し、接合伝達用のプラスミド（pK19mobsacB1）のXbaI-Sse8387I部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドは異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子置換プラスミド：pBKNH10と名付けた。図１に、プラスミドpK19mobsacB1の構造を示す模式図を、図２に、プラスミドpBKNH10の構造を示す模式図を示した。
Next, the fragment cloned above was cleaved with restriction enzymes XbaI and Sse8387I, and a fragment of about 6 Kb was recovered and ligated to the XbaI-Sse8387I site of the plasmid for junction transfer (pK19mobsacB1) to prepare a plasmid. The resulting plasmid was named heterologous nitrile hydratase gene replacement plasmid: pBKNH10. FIG. 1 shows a schematic diagram showing the structure of plasmid pK19mobsacB1, and FIG. 2 shows a schematic diagram showing the structure of plasmid pBKNH10.

薬剤耐性を有するＪ１株の作製
接合伝達に使用するドナーは、遺伝子置換株のセレクションに薬剤耐性が必要である。そこで、種々の薬剤耐性株の取得を試み、アンピシリン耐性を有するＪ１株の変異株を下記の方法で取得した。
2μg／mlのアンピシリンを含んだMYKプレート（0.5% ポリペプトン、0.3% バクトイーストエキス、0.3% マルツエキス、0.2% KH2PO4、0.2% K2HPO4、1.5% 寒天）にＪ１株をストリークし、コロニーが生育するまで30℃で保温した。約２週間後、アンピシリン耐性株が生育してきたので、再度2μg／mlのアンピシリンプレートにストリークして、30℃で保温した。 Creation of J1 strains having drug resistance Donors used for conjugation transfer require drug resistance for selection of gene replacement strains. Then, acquisition of various drug resistant strains was attempted, and mutant strains of J1 strain having ampicillin resistance were obtained by the following method.
Streak J1 strain on MYK plate (0.5% polypeptone, 0.3% bact yeast extract, 0.3% malt extract, 0.2% KH 2 PO 4 , 0.2% K 2 HPO 4 , 1.5% agar) containing 2 μg / ml ampicillin, It was kept at 30 ° C. until colonies grew. About 2 weeks later, since an ampicillin resistant strain had grown, it was again streaked on a 2 μg / ml ampicillin plate and kept at 30 ° C.

次に、2μg／mlのアンピシリンプレートから生育したコロニーを、５μg／mlのアンピシリンプレートにストリークし、耐性株が出現するまで30℃で保温した。以下、同様の操作を、アンピシリン濃度を10μg／ml→15μg／ml→50μg／ml→100μg／mlの順に高めながら繰り返し、100μg／mlのアンピシリン濃度で生育するアンピシリン耐性株（J1-Amp株）を得た。
Next, colonies grown from 2 μg / ml ampicillin plates were streaked onto 5 μg / ml ampicillin plates and incubated at 30 ° C. until resistant strains appeared. Thereafter, the same operation is repeated while increasing the concentration of ampicillin in the order of 10 μg / ml → 15 μg / ml → 50 μg / ml → 100 μg / ml to obtain an ampicillin resistant strain (J1-Amp strain) that grows at an ampicillin concentration of 100 μg / ml. Obtained.

接合伝達による遺伝子置換
（１）ドナーの調製
乾熱滅菌した試験管に大腸菌S17-1λpirのコンピテントセル20μlにプラスミドpBKHN01 １μlを加え、氷上で30分静置した。42℃で30秒ヒートショック後、SOC培地を180μl添加し、37℃で1時間振とう培養を行った。その後、50μg/mlカナマイシンを含んだLBプレートに塗布し、37℃で一晩静置した。
翌日、プレートに生育したコロニーをLB培地1ｍｌで回収し、遠心分離により菌体を回収し、遠心上清を除去した。同様の操作をもう一度繰り返し、最後に0.5mlのLB培地を添加し、菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液をドナー溶液とした。 Gene replacement by conjugation transfer (1) Preparation of donor In a test tube sterilized by dry heat, 1 μl of plasmid pBKHN01 was added to 20 μl of competent cells of Escherichia coli S17-1λpir and allowed to stand on ice for 30 minutes. After heat shock at 42 ° C. for 30 seconds, 180 μl of SOC medium was added, and shaking culture was performed at 37 ° C. for 1 hour. Then, it apply | coated to LB plate containing 50 microgram / ml kanamycin, and left still at 37 degreeC overnight.
On the next day, colonies grown on the plate were collected with 1 ml of LB medium, and the cells were collected by centrifugation, and the centrifuged supernatant was removed. The same operation was repeated once again, and finally 0.5 ml of LB medium was added to prepare a cell suspension. This bacterial cell suspension was used as a donor solution.

（２）レシピエントの調整
J1−Amp株をMYKプレートにストリークし、30℃で2日生育させた。生育したコロニーは実施例３（１）と同様の方法で回収及び洗浄し、レシピエントとなる菌体懸濁液を調製した。 (2) Recipient adjustment
The J1-Amp strain was streaked on a MYK plate and grown at 30 ° C. for 2 days. The grown colonies were collected and washed in the same manner as in Example 3 (1) to prepare a bacterial cell suspension serving as a recipient.

（３）接合伝達
実施例３（１）で調製したドナー溶液と、実施例３（２）で調製したレシピエント溶液を100μlずつ混合し、抗生物質を含まないMYKプレートに塗布し、30℃で一晩静置した。
翌日、生育したコロニーは１ｍｌのLB培地で回収し、100μlずつカナマイシン濃度を10、30、50μg/mｌとした選抜プレート（すべて100μg/mlアンピシリンを含む）に塗布した。塗布したプレートは組み換え菌コロニーが出現するまで30℃で1週間保温した。
その結果、100μg/ｍｌアンピシリン、10μg/ｍｌカナマイシンを含んだプレートに複数のコロニーが出現し、得られたコロニーを＃77〜80と命名し、以後の実験に使用した。 (3) Junction transfer 100 μl of the donor solution prepared in Example 3 (1) and the recipient solution prepared in Example 3 (2) were mixed and applied to a MYK plate containing no antibiotics at 30 ° C. Let stand overnight.
On the next day, the grown colonies were collected in 1 ml of LB medium, and applied to selection plates (each containing 100 μg / ml ampicillin) with 100 μl each with kanamycin concentrations of 10, 30, and 50 μg / ml. The applied plate was kept at 30 ° C. for 1 week until a recombinant bacterial colony appeared.
As a result, a plurality of colonies appeared on the plate containing 100 μg / ml ampicillin and 10 μg / ml kanamycin, and the obtained colonies were named # 77-80 and used for the subsequent experiments.

（４）異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子への置換
接合伝達により得られた組み換え菌＃77〜80は、ゲノム中に野生型ニトリルヒドラターゼ遺伝子と改良型としての異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子とが存在している。野生型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失するためには2段階の相同組換えが必要であるため、sacB遺伝子を利用した選抜を実施した。
10％ショ糖を含んだMYKプレートを作製し、＃77〜80のコロニーを滅菌水に懸濁した液を適度に希釈して塗布し、30℃で静置した。生育したコロニーについて各２個のコロニーからゲノムDNAを調製し、ニトリルヒドラターゼ遺伝子のDNA配列を確認した。
その結果、ゲノム中のニトリルヒドラターゼ遺伝子は、上記改良型としての異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子であることを確認した。 (4) Substitution with heterologous nitrile hydratase gene Recombinant bacteria # 77-80 obtained by conjugation transfer have a wild-type nitrile hydratase gene and an improved heterologous nitrile hydratase gene in the genome. . Since deletion of the wild-type nitrile hydratase gene requires two-step homologous recombination, selection using the sacB gene was performed.
A MYK plate containing 10% sucrose was prepared, and a solution in which # 77 to 80 colonies were suspended in sterilized water was appropriately diluted and applied, and allowed to stand at 30 ° C. Genomic DNA was prepared from each of the two colonies that grew, and the DNA sequence of the nitrile hydratase gene was confirmed.
As a result, it was confirmed that the nitrile hydratase gene in the genome was a heterogeneous nitrile hydratase gene as the improved type.

配列番号９〜１８：合成DNA SEQ ID NOs: 9 to 18: synthetic DNA

Claims (10)

ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換された微生物。   A microorganism in which a nitrile hydratase gene in a microorganism having nitrile hydratase activity is replaced with a heterologous nitrile hydratase gene. 前記微生物が、ロドコッカス属細菌又はノカルディア属細菌である、請求項１記載の微生物。   The microorganism according to claim 1, wherein the microorganism is a genus Rhodococcus or a genus Nocardia. ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株又はその変異株である、請求項２記載の微生物。   The microorganism according to claim 2, wherein the Rhodococcus bacterium is Rhodococcus rhodochrous J1 strain or a mutant thereof. 置換されるニトリルヒドラターゼ遺伝子が、高分子量型ニトリルヒドラターゼ遺伝子及び／又は低分子量ニトリルヒドラターゼ遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。   The microorganism according to any one of claims 1 to 3, wherein the nitrile hydratase gene to be replaced is a high molecular weight nitrile hydratase gene and / or a low molecular weight nitrile hydratase gene. 前記置換が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、(i)レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換させた配列、(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、(iv)レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）前記（ｂ）で作製されたドナー微生物から前記（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）前記（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。 The substitution is performed by a transformation method using conjugative transfer from a donor microorganism to a recipient microorganism having nitrile hydratase activity, comprising the following steps (a) to (d): 5. The microorganism according to any one of 4 above.
(A) a step of producing a microorganism having enhanced resistance to a drug to which a donor microorganism to be used for conjugation transmission is sensitive as a recipient microorganism;
(B) as a donor microorganism, (i) a sequence obtained by substituting the nitrile hydratase gene with a heterogeneous nitrile hydratase gene in a base sequence including the nitrile hydratase gene in the recipient microorganism and the surrounding base sequence, (ii) ) A conjugation initiation region that functions in the donor microorganism; (iii) a replication initiation region that functions in the donor microorganism; (iv) a resistance gene for a drug to which the recipient microorganism is sensitive; and (v) a conditionally lethal to the recipient microorganism. Producing a microorganism transformed with a gene modifying plasmid containing a gene;
(C) producing a transformant of the recipient microorganism by performing conjugation transfer from the donor microorganism produced in (b) to the recipient microorganism produced in (a); and (d ) A step of culturing the transformant prepared in (c) under a culture condition in which the conditionally lethal gene can function. ドナー微生物が大腸菌である、請求項５に記載の微生物。   The microorganism according to claim 5, wherein the donor microorganism is Escherichia coli. ドナー微生物が感受性を示す薬剤が、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、カルベニシン及びナルジクス酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５〜６のいずれか１項に記載の微生物。   The microorganism according to any one of claims 5 to 6, wherein the agent to which the donor microorganism is sensitive is at least one selected from the group consisting of chloramphenicol, ampicillin, gentamicin, tetracycline, carbenicin and naldic acid. . レシピエント微生物が感受性を示す薬剤が、カナマイシンである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物。   The microorganism according to any one of claims 5 to 7, wherein the drug to which the recipient microorganism is sensitive is kanamycin. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物及を培養し、得られる培養物から前記異種ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。   A method for producing a nitrile hydratase, comprising culturing the microorganism according to any one of claims 1 to 8, and collecting the heterogeneous nitrile hydratase from the obtained culture. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物を培養して得られる培養物又は当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させ、当該接触により生成されるアミド化合物を採取することを特徴とする、アミド化合物の製造方法。   A culture obtained by culturing the microorganism according to any one of claims 1 to 8 or a treated product of the culture is brought into contact with a nitrile compound, and an amide compound produced by the contact is collected. A process for producing an amide compound.
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