JP2011202964A - バイオマーカーとしてのプロパノイルリジン、プロパノイルリジンの使用、及び検査用試薬キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】プロパノイルリジンをアルツハイマー病の診断のためのバイオマーカーとして使用する。患者からの試料は、例えば患者の脳組織、髄液、血清、及び尿等から取得する。プロパノイルリジンの発現量は、例えば、液体クロマトグラフィー/タンデム型質量分析計、又は解析対象とするタンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的方法によって測定される。
【選択図】図1
Description
老化モデル動物として、24ヵ月齢のF344/Nラットを用い、そのラット脳における抗PRL抗体を用いた免疫組織化学的解析を行った。
次に、PRL及びAβ42間の局在性の検証を、蛍光標識2次抗体を用いた多重染色によって検証した。抗PRL抗体として、Anti-PRLmonoclonal antibody(mouse monoclonal antibody)を使用した。抗Aβ42抗体として、Anti-Amyloidβ[1-42]rabbitIgG Affinity Purify(IBL)、抗Aβ40抗体として、Anti-Amyloidβ[1-40]rabbit IgG AffinityPurify(IBL)、抗Aβ[1-14]抗体として、Anti-Amyloidβ[1-14]rabbit IgG Affinity Purify(Rockland)を使用した。
次に、ヒト髄液中からのPRLの検出解析を試みた。抗PRL抗体を用いたELISAによる定量評価を試みたところ、データは示さないが、ELISAでの検出限界である1μM以下であることが明らかとなった。この結果を踏まえ、まずはPRLが髄液中に存在するかどうかをタンパク質レベルで検証するため、ウェスタンブロット解析により、抗PRL抗体陽性のタンパク質の存在を検証した。
免疫組織化学的解析及び生化学的解析の結果、アルツハイマー病患者の脳及び髄液中においてPRLの生成が、非アルツハイマー病患者における脳及び髄液との比較によって顕著に増加することが認められた。これら結果を踏まえ、より定量的な解析を行うため高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析器(LC/MS/MS)を用いた化学的な解析を行った。
次に、ヒト尿中におけるPRLの免疫学的解析を行った。PRL-BSA(1mg/ml)を1μg/mlにPBSにて希釈し、50μl/wellの量でイムノプレートに添加し、4℃で一晩静置してコーティングを行った。コーティングしたプレートを、TPBS200μl/wellで3回洗浄した。1% Block ace (in water) 200μl/wellにより、ブロッキングを37℃で1時間行った。PRLantibody-Biotin(0.2mg/ml)をTPBSにて1500倍希釈し、一方でPRLのstandardを600μMから3段階の希釈溶液(TPBSにて)を7種類、調製した。競争物質なし及びblank(TPBSのみ)も調製した。ヒト尿サンプルは、原液、5倍、10倍と各種PBSにて希釈して調製した。ブロッキングが終了したプレートを、ELISA洗浄ステップ処理を行い、PRLのstandard及び希釈サンプルをそれぞれ50μl分、プレートの各wellに添加し、更に50μlのPRLantibody-Biotin希釈液を添加し、1晩4℃で静置して競争反応を行った(Final concentration:PRLantibody-Biotin:3000倍希釈、各STD:300μMより3段階希釈の濃度)。ELISA洗浄ステップ後、2次抗体としてTPBSにて5000倍に希釈したstreptavidin-HRP溶液を100μl/wellずつ添加し、37℃で1時間反応させた。ELISA洗浄ステップ後、TMB発色(100μl/well)を15分間行い、1Nリン酸100μl/wellにより発色を停止させ、プレートリーダーにて450nmの吸光度を測定し、検量線を作製して各定量値を算出した。
Claims (5)
- アルツハイマー病の診断のためのバイオマーカーとして使用されるプロパノイルリジン。
- アルツハイマー病の診断のためのバイオマーカーとしてのプロパノイルリジンの使用。
- アルツハイマー病を診断するための検査用試薬キットであって、患者から得られた試料におけるプロパノイルリジンの発現量を検出又は定量する手段を含む検査用試薬キット。
- 前記試料は、患者の脳組織、髄液、血清、及び尿のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする請求項3に記載の検査用試薬キット。
- 前記発現量が、質量分析、又は解析対象とするタンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的方法によって測定されることを特徴とする請求項3又は4に記載の検査用試薬キット。
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