JP2011172596A - ペプチドが結合された、イノシン置換アンチセンスオリゴマー化合物および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】治療的なオリゴマー−ペプチド結合体およびこの結合体を使用する方法の提供。
【解決手段】本願発明の治療的なオリゴマー−ペプチド結合体は、（ａ）実質的に荷電していないオリゴヌクレオチドアナログ化合物であって、化合物が結合することが意図される標的核酸領域において、４以上連続したシトシン塩基と相補的である塩基の列を含む塩基配列を有する、化合物、および（ｂ）標的細胞への該化合物の取り込みを高めるのに効果的な、この化合物に結合されたアルギニンリッチペプチドを含む。この化合物中の塩基の列は、この塩基の列における連続したグアニン塩基の数を３個以下に制限するように列中に配置された少なくとも１個のイノシン塩基を含む。この結合体は、アルギニンリッチペプチドによって、化合物単独よりも大きな細胞取り込みを有し、そしてイノシンによるグアニン置換がない結合体よりも活性が実質的により大きいアンチセンス活性を有する。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、アンチセンスオリゴマー化合物およびこのような化合物の使用方法に関し、このアンチセンスオリゴマー化合物は、（ｉ）細胞へのこのオリゴマーの取り込みを高めるのに効果的なアルギニンリッチペプチドに結合されており、そして（ｉｉ）Ｇ塩基の列が、１個より以上のイノシン塩基によって壊れている。

（参考文献）

（発明の背景）
アンチセンスオリゴマーは、現在臨床研究中のアンチセンス薬物の数により証明され、そしてアンチセンスオリゴマーの多くの潜在的制限が過去数年にわたって首尾よく対処されたという事実（非特許文献１、非特許文献２）によって補助されるたように、製薬として大きな可能性を提供する。新規な荷電していないオリゴマーバックボーンは、細胞への取り込みを改善して、ヌクレアーゼ分解への抵抗性を高めるために開発された（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。いくつかのオリゴマー構造（例えば、モルホリノベースの構造）に関しては、修飾されたバックボーンは、その標的核酸への高められた結合親和性を与えるとわかった（非特許文献４、非特許文献５）。

より近年では、種々のアルギニンリッチペプチドが、荷電していないオリゴヌクレオチドの細胞（哺乳動物細胞を含む）への取り込みレベルを劇的に上昇させることができるということが見出された（例えば、２００３年４月２９日に出願された、共有に係る米国特許出願第６０／４６６，７０３号および２００４年４月２９日に出願した、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｔｏ Ｃｅｌｌｓ」に関する対応する米国特許出願（これらの両方はそれらの全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。この知見には、選択されたタンパク質の発現を妨害することが意図されるもの、プレプロセシングされたｍＲＮＡにおける特定のドナースプライス部位またはアクセプタースプライス部位を妨害することを目的とするもの、およびウイルス遺伝子の発現妨害または一本鎖ウイルスゲノムの複製妨害によってウイルス感染を処置するように設計されたものを含め、種々のアンチセンスオリゴマーの治療的な可能性をかなり増やす可能性がある。

いくつかのアンチセンス適用において、オリゴマーアンチセンスが指向される最適標的化配列は、一続きの４個以上のシトシン塩基を含み得る。その場合には、このオリゴマーは、４個以上の相補的なグアニン塩基の対応する列を含む。重要な例として、ｃ−ｍｙｃタンパク質に関する最適標的配列は、一続きの４個のシトシン塩基を含むｃ−ｍｙｃ ＲＮＡのＡＵＧ開始部位を含んでいる領域である。ｃ−ｍｙｃの開始コドン領域に指向されたアンチセンスオリゴマーは、癌の処置、多嚢胞腎病の処置（例えば、その全体が本明細書中に参考として援用される、共有に係る米国特許第６，８７５，７４７号（特許文献１）を参照のこと）、冠状動脈血管再狭窄の処置（例えば、その全体が本明細書中に参考として援用される、共有に係るＰＣＴ特許出願ＷＯ００／４４８９７（２０００年８月３日公開；特許文献２）を参照のこと）および癌治療（例えば、その全体が本明細書中に参考として援用される、共有に係る米国特許出願ＵＳ−２００３−００８７８６１−Ａ１（２００３年５月８日公開；特許文献３）を参照のこと）を含め、多くの重要な治療適用を有する。

米国特許第６，８７５，７４７号明細書 国際公開第００／４４８９７号パンフレット 米国特許出願公開第２００３／００８７８６１号明細書

Ｄｅｖｉ，Ｇ．Ｒ．（２００２）．"Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ：ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．"Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ４（２）：１３８−４８ Ｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ａ．，Ｄ．Ｅ．Ｓｋｉｌｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００１）．"Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｓｉｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ．" Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １１（５）：３１７−２５． Ｈｕｄｚｉａｋ，Ｒ．Ｍ．，Ｅ．Ｂａｒｏｆｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）．"Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｔｏ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．" Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ６（４）２６７−７２． Ｉｖｅｒｓｅｎ，Ｐ．Ｌ．（２００１）．Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ． Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ａｎｄ Ｄ．Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）．"Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：ｄｅｓｉｇｎ，ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．"Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ７（３）：１８７− ９５．

驚くべきことに、現在、オリゴマーの細胞取り込みを高める試みにおいて、一続きの４個以上のシトシン塩基を有するアンチセンス化合物にアルギニンリッチペプチドを結合させることにより、この化合物のアンチセンス活性ならびにこの化合物を精製する能力がひどく損なわれることが分かった。この課題の基礎は理解されていないにもかかわらず、これは、オリゴマー中のＧカルテットの形成を促進し、従って、この化合物の溶解性および／またはその標的核酸との結合能力を低下させる様式での、正に荷電したペプチドとオリゴマー化合物との間の相互作用に関連するようである。それゆえ、その細胞内標的に関するこの化合物のアンチセンス活性を損なわずこの化合物をアルギニンリッチペプチドと結合させることによって、このようなアンチセンスオリゴマー化合物の細胞取り込みを高めることは有用である。

特に、癌、多嚢胞腎病または冠状動脈血管（ｃｏｒｏｎａｒｙ−ｖｅｓｓｅｌ）再狭窄の処置において化合物の治療的な活性を高めることを目的として、アンチセンス活性の損失なしに上記のｃ−ｍｙｃアンチセンス化合物の細胞取り込みを高めることは有用である。

（発明の要旨）
本発明の方法は、１つの局面において、実質的に荷電していないオリゴヌクレオチドアナログ化合物と該化合物の標的細胞への取り込みを高めるのに効果的なアルギニンリッチペプチドとの結合体を形成することによって該化合物の細胞取り込みを高めるための方法において改善を含み、該化合物は、該化合物が結合することが意図される標的核酸領域において、４以上連続したシトシン塩基と相補的である塩基の列を含む。この改善は、該塩基の列における連続したグアニン塩基の数を３以下に（好ましくは２以下に）制限するためにイノシン塩基で、前記化合物における該塩基の列において少なくとも１個のグアニン塩基を置換することを含む。

この改善は、置換が、陽イオン性イオン交換樹脂への結合体の結合および該陽イオン性イオン交換樹脂からの結合体の遊離を含む精製工程中の前記結合体の水溶性を、該イノシン置換がない同じ結合体と比較して高めるのに効果的であり得る。前記標的核酸領域が、開始コドンをｍＲＮＡに含む場合、この改善は、該ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の翻訳を妨害する前記結合体の能力を、前記イノシン置換のない同じ結合体と比較して高めるに効果的であり得る。前記標的核酸領域が、プレプロセシングされたｍＲＮＡ中にドナースプライス部位またはアクセプタースプライス部位を含む場合、前記改善は、該標的領域でｍＲＮＡスプライシングをマスキングする前記結合体の能力を、前記イノシン置換がない同じ結合体と比較して高めるのに効果的であり得る。

前記標的核酸領域が、ウイルス複製に関与する、ウイルスにコードされるシス作用性エレメントを含む場合、前記改善は、ウイルス複製をブロックする前記結合体の能力を、前記イノシン置換がない同じ結合体と比較して高めるのに効果的であり得る。

例示的な実施形態では、前記アルギニンリッチペプチドは、少なくとも６個のＸサブユニット、少なくとも２個のＹサブユニットおよび多くても３個のＺサブユニットを含め、Ｘサブユニット、Ｙサブユニットおよび必要に応じたＺサブユニットから選択される８〜１６個のサブユニットを含み、ここで、該サブユニットの５０％より多くがＸサブユニットであり、そしてここで
（ａ）各々のＸサブユニットは、アルギニンまたはアルギニンアナログを独立して表し、該アナログは、構造Ｒ^１Ｎ＝Ｃ（ＮＨ_２）Ｒ^２の側鎖を含む陽イオン性αアミノ酸であり、ここで、Ｒ^１は、ＨまたはＲであり；Ｒ^２はＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲまたはＮＲ^２であり、ここで、Ｒは低級アルキルまたは低級アルケニルであって、酸素または窒素をさらに含むことができ；Ｒ^１とＲ^２とは、一緒に環を形成し得；そして、側鎖は、Ｒ^１またはＲ^２により該アミノ酸に連結され；
（ｂ）各々のＹサブユニットは、中性アミノ酸−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨＲ）_ｎ−ＮＨ−を独立して表し、ここで（ｉ）ｎが２〜７であり、そして各々のＲが独立してＨまたはメチルであるか、または（ｉｉ）ｎは１であり、そして、Ｒは、置換されたかまたは非置換の、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルから選択される中性の側鎖であり、ここで、該中性の側鎖は、置換されたアルキル、アルケニルおよびアルキニルから選択される場合、４個全ての炭素原子について多くとも１個のヘテロ原子を含み；そして
（ｃ）各々のＺサブユニットは、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリジン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、セリンおよびトレオニンから選択されるアミノ酸を独立して表す。

また、例示的な実施形態では、前記オリゴヌクレオチドアナログ化合物は、１個のサブユニットのモルホリノ窒素と隣接したサブユニットのモルホリノ３位の環外炭素との間のリン含有結合により連結されるモルホリノサブユニットから構成されるモルホリノオリゴマーである。前記モルホリノサブユニットは、構造：

に従う、荷電していないホスホロジアミデート結合で結合されてもよく、ここで、Ｙ_１＝Ｏであり、Ｚ＝Ｏであり、Ｐｊは、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基と結合するのに効果的なプリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分であり、そして、Ｘは、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシまたはアルキルアミノである。

別の局面では、本発明は、治療的なオリゴマー−ペプチド結合体を含み、この結合体は、（ａ）化合物が結合することが意図される標的核酸領域において、４個以上連続したシトシン塩基と相補的である塩基の列を含む塩基配列を有する実質的に荷電していないオリゴヌクレオチドアナログ化合物、および（ｂ）標的細胞への該化合物の取り込みを高めるのに効果的な、該化合物に結合されたアルギニンリッチペプチドから構成される。該化合物における該塩基の列は、該塩基の列における連続したグアニン塩基の数を３個以下に（好ましくは２個以下に）制限するように該列中に配置される少なくとも１個のイノシン塩基を含む。結合体の例示的実施形態は、上記の通りである。

特に、ヒトのｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡのＡＵＧ開始部位を含む領域への結合によるｃ−ｍｙｃタンパク質の翻訳の妨害において使用するために、該化合物の標的配列は、配列番号２〜配列番号１０と同定される配列のうちの１つを含み得る。前記化合物に結合されたアルギニンリッチペプチドは、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８と同定される配列を含み得る。

また開示されるのは、被験体の標的細胞中のｃ−ｍｙｃ発現の阻害に応答性の病理学的状態を有する被験体を処置する方法である。該方法を実施する際に、ちょうど記載した種類の結合体は、治療有効量で該被験体に投与される。該結合体は、アルギニンリッチペプチドがないアンチセンス化合物単独よりも大きな細胞取り込みを有し、かつ、ｃ−ｍｙｃ翻訳の妨害において、１個以上のイノシン塩基がない同じ結合体よりも活性が高い。該方法で使用する結合体の例示的実施形態は、上記の通りである。

膀胱癌を処置する際に使用するためには、前記結合体は、経尿道送達により投与されてよく、そして、該方法は、シスプラチン抗癌化合物を前記患者に投与することをさらに含み得る。

血管形成術手順後の血管損傷部位での冠状動脈再狭窄の危険度を減らす際に使用するためには、前記結合体は、例えば、薬物放出ステントを介して、または薬物を運ぶ微小泡の静脈内注射によって、脈管内送達により投与されてもよい。

冠状動脈バイパス形成手術の間に配置される伏在静脈を保護する際に使用するためには、前記結合体は、該静脈を外科的に配置する前に該静脈を前記結合体にさらすことにより投与されてもよい。

多嚢胞腎病を処置するためには、前記結合体は、経口投与または非経口投与によって前記被験体に投与されてもよい。

以下の発明の詳細な説明が添付図面とともに読まれれば、発明のこれらおよび他の目的および特徴は、より完全に明らかになる。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
実質的に荷電していないオリゴヌクレオチドアナログ化合物と該化合物の標的細胞への取り込みを高めるのに効果的なアルギニンリッチペプチドとの結合体を形成することによって該化合物の細胞取り込みを高めるための方法であって、該化合物は、該化合物が結合することが意図される標的核酸領域において、４個以上連続したシトシン塩基と相補的である塩基の列を含む方法において、改善が、該塩基の列における連続したグアニン塩基の数を３個以下に制限するために、前記化合物における該塩基の列において少なくとも１個のグアニン塩基をイノシン塩基に置換することを含む、改善。
（項目２）
前記イノシン置換が、前記列における連続したグアニン塩基の数を２個以下に制限するのに効果的である、項目１に記載の改善。
（項目３）
少なくとも２個のイノシン塩基が前記塩基の列において置換される、項目１に記載の改善。
（項目４）
前記置換が、陽イオン性イオン交換樹脂への結合体の結合および該陽イオン性イオン交換樹脂からの結合体の遊離を含む精製工程中の前記結合体の水溶性を、該イノシン置換がない以外は同じ結合体と比較して高めるのに効果的である、項目１に記載の改善。
（項目５）
前記標的核酸領域が、開始コドンをｍＲＮＡに含み、そして前記置換は、該ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の翻訳を妨害する前記結合体の能力を、前記イノシン置換がない以外は同じ結合体と比較して高めるのに効果的である、項目１に記載の改善。
（項目６）
前記標的核酸領域が、プレプロセシングされたｍＲＮＡ中にドナースプライス部位またはアクセプタースプライス部位を含み、そして前記置換は、該標的領域でｍＲＮＡスプライシングをマスキングする前記結合体の能力を、前記イノシン置換がない以外は同じ結合体と比較して高めるのに効果的である、項目１に記載の改善。
（項目７）
前記標的核酸領域が、ウイルス複製に関与する、ウイルスにコードされるシス作用性エレメントを含み、そして前記置換は、ウイルス複製をブロックする前記結合体の能力を、前記イノシン置換がない以外は同じ結合体と比較して高めるのに効果的である、項目１に記載の改善。
（項目８）
項目１に記載の改善であって、前記アルギニンリッチペプチドが、少なくとも６個のＸサブユニット、少なくとも２個のＹサブユニットおよび多くても３個のＺサブユニットを含め、Ｘサブユニット、Ｙサブユニットおよび必要に応じたＺサブユニットから選択される８〜１６個のサブユニットを含み、ここで、該サブユニットの５０％より多くがＸサブユニットであり、そしてここで
（ａ）各々のＸサブユニットが、アルギニンまたはアルギニンアナログを独立して表し、該アナログは、構造Ｒ ^１ Ｎ＝Ｃ（ＮＨ _２ ）Ｒ ^２ の側鎖を含む陽イオン性αアミノ酸であり、ここで、Ｒ ^１ は、ＨまたはＲであり；Ｒ ^２ はＲ、ＮＨ _２ 、ＮＨＲまたはＮＲ ^２ であり、ここで、Ｒは低級アルキルまたは低級アルケニルであって、酸素または窒素をさらに含むことができ；Ｒ ^１ とＲ ^２ とは、一緒に環を形成し得；そして、側鎖は、Ｒ ^１ またはＲ ^２ により該アミノ酸に連結され；
（ｂ）各々のＹサブユニットが、中性アミノ酸−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨＲ） _ｎ −ＮＨ−を独立して表し、ここで（ｉ）ｎが２〜７であり、そして各々のＲが独立してＨまたはメチルであるか、または（ｉｉ）ｎは１であり、そして、Ｒは、置換されたかまたは非置換の、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルから選択される中性の側鎖であり、ここで、該中性の側鎖は、置換されたアルキル、アルケニルおよびアルキニルから選択される場合、４個全ての炭素原子について多くとも１個のヘテロ原子を含み；そして
（ｃ）各々のＺサブユニットが、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリジン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、セリンおよびトレオニンから選択されるアミノ酸を独立して表す、改善。
（項目９）
前記オリゴヌクレオチドアナログ化合物が、１個のサブユニットのモルホリノ窒素と隣接したサブユニットのモルホリノ３位の環外炭素との間のリン含有結合により連結されるモルホリノサブユニットから構成されるモルホリノオリゴマーである、項目８に記載の改善。
（項目１０）
前記モルホリノサブユニットが、構造：
（化１）

に従う、荷電していないホスホロジアミデート結合で結合され、ここで、Ｙ _１ ＝Ｏであり、Ｚ＝Ｏであり、Ｐｊは、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基と結合するのに効果的なプリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分であり、そして、Ｘは、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシまたはアルキルアミノである、項目９に記載の改善。
（項目１１）
治療的なオリゴマー−ペプチド結合体であって、
（ａ）化合物が結合することが意図される標的核酸領域において、４個以上連続したシトシン塩基と相補的である塩基の列を含む塩基配列を有する、実質的に荷電していないオリゴヌクレオチドアナログ化合物、および
（ｂ）標的細胞への該化合物の取り込みを高めるのに効果的な、該化合物に結合されたアルギニンリッチペプチドであって、ここで該化合物における該塩基の列は、該塩基の列における連続したグアニン塩基の数を３個以下に制限するように該列中に配置される少なくとも１個のイノシン塩基を含む、アルギニンリッチペプチド
を含む、治療的なオリゴマー−ペプチド結合体。
（項目１２）
前記化合物中の１個以上のイノシン塩基の位置が、前記列中の連続したグアニン塩基の数を２個以下に制限するようなものである、項目１１に記載の結合体。
（項目１３）
前記化合物が、前記塩基の列中に少なくとも２個のイノシン塩基を含む、項目１２に記載の結合体。
（項目１４）
項目１１に記載の結合体であって、前記アルギニンリッチペプチドが、少なくとも６個のＸサブユニット、少なくとも２個のＹサブユニットおよび多くても３個のＺサブユニットを含め、Ｘサブユニット、Ｙサブユニットおよび必要に応じたＺサブユニットから選択される８〜１６個のサブユニットを含み、ここで、該サブユニットの５０％より多くがＸサブユニットであり、そしてここで
（ａ）各々のＸサブユニットが、アルギニンまたはアルギニンアナログを独立して表し、該アナログは、構造Ｒ ^１ Ｎ＝Ｃ（ＮＨ _２ ）Ｒ ^２ の側鎖を含む陽イオン性αアミノ酸であり、ここで、Ｒ ^１ は、ＨまたはＲであり；Ｒ ^２ はＲ、ＮＨ _２ 、ＮＨＲまたはＮＲ ^２ であり、ここで、Ｒは低級アルキルまたは低級アルケニルであって、酸素または窒素をさらに含むことができ；Ｒ ^１ とＲ ^２ とは、一緒に環を形成し得；そして、側鎖は、Ｒ ^１ またはＲ ^２ により該アミノ酸に連結され；
（ｂ）各々のＹサブユニットが、中性アミノ酸−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨＲ） _ｎ −ＮＨ−を独立して表し、ここで（ｉ）ｎが２〜７であり、そして各々のＲが独立してＨまたはメチルであるか、または（ｉｉ）ｎは１であり、そして、Ｒは、置換されたかまたは非置換の、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルから選択される中性の側鎖であり、ここで、該中性の側鎖は、置換されたアルキル、アルケニルおよびアルキニルから選択される場合、４個全ての炭素原子について多くとも１個のヘテロ原子を含み；そして
（ｃ）各々のＺサブユニットが、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリジン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、セリンおよびトレオニンから選択されるアミノ酸を独立して表す、結合体。
（項目１５）
前記オリゴヌクレオチドアナログ化合物が、１個のサブユニットのモルホリノ窒素と隣接したサブユニットのモルホリノ３位の環外炭素との間のリン含有結合により連結されるモルホリノサブユニットから構成されるモルホリノオリゴマーである、項目１４に記載の結合体。
（項目１６）
前記モルホリノサブユニットが、構造：
（化２）

に従う、荷電していないホスホロジアミデート結合で結合され、ここで、Ｙ _１ ＝Ｏであり、Ｚ＝Ｏであり、Ｐｊは、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基と結合するのに効果的なプリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分であり、そして、Ｘは、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシまたはアルキルアミノである、項目１５に記載の結合体。
（項目１７）
陽イオン性イオン交換樹脂への結合体の結合および陽イオン性イオン交換樹脂からの結合体の遊離を含む精製工程中に、前記１個以上のイノシン塩基を含まないこと以外は同じ結合体よりも大きな水溶性を有する、項目１１に記載の結合体。
（項目１８）
プレプロセシングされたｍＲＮＡの前記標的核酸領域中の選択されたドナースプライス部位またはアクセプタースプライス部位での、該プレプロセシングされたｍＲＮＡのプロセシングを妨害するのに使用するための、項目１１に記載の結合体であって、このようなｍＲＮＡのスプライス部位プロセシングを妨害する際に、前記１個以上のイノシン塩基がないこと以外は同じ結合体よりも活性である、結合体。
（項目１９）
標的核酸領域がウイルス複製にとって必須のシス作用性エレメントを含むウイルスに感染した細胞におけるウイルス複製の妨害において使用するための、項目１１に記載の結合体であって、このようなウイルス複製を妨害する際に、前記１個以上のイノシン塩基がないこと以外は同じ結合体よりも活性である、結合体。
（項目２０）
標的核酸領域が開始コドンを含むｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の翻訳の妨害において使用するための、項目１１に記載の結合体であって、このような翻訳を妨害する際に、前記１個以上のイノシン塩基がないこと以外は同じ結合体よりも活性である、結合体。
（項目２１）
前記化合物が、（ｉ）ヒトのｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡのＡＵＧ開始部位を含む領域を標的としており、そして該化合物が、（ｉｉ）が配列番号２〜１０からなる群から選択される標的化配列を含む、項目２０に記載の結合体。
（項目２２）
前記ペプチドが、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群から選択される配列を含む、項目２１に記載の結合体。
（項目２３）
前記ペプチドが、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群から選択される配列を含む、項目１１に記載の結合体。
（項目２４）
被験体の標的細胞中のｃ−ｍｙｃ発現の阻害に応答性の病理学的状態を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、治療有効量のオリゴマー−ペプチド結合体を該被験体に投与する工程を包含し、
該オリゴマー−ペプチド結合体は、
（ａ）ｍＲＮＡ開始コドンを含む標的ｍＲＮＡ領域において、４個以上連続したシトシン塩基と相補的である塩基の列を含む塩基配列を有する実質的に荷電していないオリゴヌクレオチドアナログ化合物、および
（ｂ）該標的細胞への該化合物の取り込みを高めるのに効果的な、該化合物に結合されたアルギニンリッチペプチド
から構成され、ここで
（ｉ）該化合物の塩基配列は、該塩基の列において、該塩基の列における連続したグアニン塩基の数を３個以下に制限するように該列中に配置される少なくとも１個のイノシン塩基を含み、そして
（ｉｉ）該結合体は、このような翻訳を妨害する際に、前記１個以上のイノシン塩基がないこと以外は同じ結合体よりも活性である、方法。
（項目２５）
項目２４に記載の方法であって、前記アルギニンリッチペプチドが、少なくとも６個のＸサブユニット、少なくとも２個のＹサブユニットおよび多くても３個のＺサブユニットを含め、Ｘサブユニット、Ｙサブユニットおよび必要に応じたＺサブユニットから選択される８〜１６個のサブユニットを含み、ここで、該サブユニットの５０％より多くがＸサブユニットであり、そしてここで
（ａ）各々のＸサブユニットが、アルギニンまたはアルギニンアナログを独立して表し、該アナログは、構造Ｒ ^１ Ｎ＝Ｃ（ＮＨ _２ ）Ｒ ^２ の側鎖を含む陽イオン性αアミノ酸であり、ここで、Ｒ ^１ は、ＨまたはＲであり；Ｒ ^２ はＲ、ＮＨ _２ 、ＮＨＲまたはＮＲ ^２ であり、ここで、Ｒは低級アルキルまたは低級アルケニルであって、酸素または窒素をさらに含むことができ；Ｒ ^１ とＲ ^２ とは、一緒に環を形成し得；そして、側鎖は、Ｒ ^１ またはＲ ^２ により該アミノ酸に連結され；
（ｂ）各々のＹサブユニットが、中性アミノ酸−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨＲ） _ｎ −ＮＨ−を独立して表し、ここで（ｉ）ｎが２〜７であり、そして各々のＲが独立してＨまたはメチルであるか、または（ｉｉ）ｎは１であり、そして、Ｒは、置換されたかまたは非置換の、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルから選択される中性の側鎖であり、ここで、該中性の側鎖は、置換されたアルキル、アルケニルおよびアルキニルから選択される場合、４個全ての炭素原子について多くとも１個のヘテロ原子を含み；そして
（ｃ）各々のＺサブユニットが、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリジン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、セリンおよびトレオニンから選択されるアミノ酸を独立して表す、方法。
（項目２６）
前記オリゴヌクレオチドアナログ化合物が、１個のサブユニットのモルホリノ窒素と隣接したサブユニットのモルホリノ３位の環外炭素との間のリン含有結合により連結されるモルホリノサブユニットから構成されるモルホリノオリゴマーである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記モルホリノサブユニットが、構造：
（化３）

に従う、荷電していないホスホロジアミデート結合で結合され、ここで、Ｙ _１ ＝Ｏであり、Ｚ＝Ｏであり、Ｐｊは、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基と結合するのに効果的なプリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分であり、そして、Ｘは、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシまたはアルキルアミノである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記化合物が、配列番号２〜配列番号１０からなる群から選択される標的化配列を含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記ペプチドが、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群から選択される配列を含む、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記化合物が、配列番号２〜配列番号１０からなる群から選択される標的化配列を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
膀胱癌を処置する際に使用するための、項目２４に記載の方法であって、前記結合体が経尿道送達により投与され、そして、該方法が、シスプラチン抗癌化合物を前記患者に投与することをさらに含む、方法。
（項目３２）
血管形成術手順後の血管損傷部位での冠状動脈再狭窄の危険度を減らす際に使用するための、項目２４に記載の方法であって、前記結合体が、脈管内送達により投与される、方法。
（項目３３）
前記血管形成術手順が、血管損傷部位でのステントの配置を含み、そして前記結合体が、該ステントからの放出により投与される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
冠状動脈バイパス形成手術の間に配置される伏在静脈を保護する際に使用するための、項目２４に記載の方法であって、前記結合体が、該静脈を外科的に配置する前に該静脈を該結合体にさらすことにより投与される、方法。
（項目３５）
多嚢胞腎病を処置するための、項目２４に記載の方法であって、前記結合体が、経口投与または非経口投与によって前記被験体に投与される、方法。

図１Ａ〜図１Ｄは、ポリマー形成に適した５原子連結基（Ａ）、６原子連結基（Ｂ）および７原子連結基（Ｃ〜Ｄ）を有する、いくつかの好ましいモルホリノ型サブユニットを示す。 図１Ａ〜図１Ｄは、ポリマー形成に適した５原子連結基（Ａ）、６原子連結基（Ｂ）および７原子連結基（Ｃ〜Ｄ）を有する、いくつかの好ましいモルホリノ型サブユニットを示す。 図１Ａ〜図１Ｄは、ポリマー形成に適した５原子連結基（Ａ）、６原子連結基（Ｂ）および７原子連結基（Ｃ〜Ｄ）を有する、いくつかの好ましいモルホリノ型サブユニットを示す。 図１Ａ〜図１Ｄは、ポリマー形成に適した５原子連結基（Ａ）、６原子連結基（Ｂ）および７原子連結基（Ｃ〜Ｄ）を有する、いくつかの好ましいモルホリノ型サブユニットを示す。 図２Ａ〜図２Ｄは、それぞれ、図１のサブユニットＡ〜Ｄを使用して構築される例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復するサブユニット部分を示す。 図２Ａ〜図２Ｄは、それぞれ、図１のサブユニットＡ〜Ｄを使用して構築される例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復するサブユニット部分を示す。 図２Ａ〜図２Ｄは、それぞれ、図１のサブユニットＡ〜Ｄを使用して構築される例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復するサブユニット部分を示す。 図２Ａ〜図２Ｄは、それぞれ、図１のサブユニットＡ〜Ｄを使用して構築される例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復するサブユニット部分を示す。 図３Ａ〜図３Ｇは、本発明で使用されるアルギニンリッチペプチドの各種実施形態において使用するための例示的なＸ側鎖構造を示す。 図３Ａ〜図３Ｇは、本発明で使用されるアルギニンリッチペプチドの各種実施形態において使用するための例示的なＸ側鎖構造を示す。 図３Ａ〜図３Ｇは、本発明で使用されるアルギニンリッチペプチドの各種実施形態において使用するための例示的なＸ側鎖構造を示す。 図３Ａ〜図３Ｇは、本発明で使用されるアルギニンリッチペプチドの各種実施形態において使用するための例示的なＸ側鎖構造を示す。 図３Ａ〜図３Ｇは、本発明で使用されるアルギニンリッチペプチドの各種実施形態において使用するための例示的なＸ側鎖構造を示す。 図３Ａ〜図３Ｇは、本発明で使用されるアルギニンリッチペプチドの各種実施形態において使用するための例示的なＸ側鎖構造を示す。 図３Ａ〜図３Ｇは、本発明で使用されるアルギニンリッチペプチドの各種実施形態において使用するための例示的なＸ側鎖構造を示す。 図４Ａ〜図４Ｄは、オリゴマー−ペプチド結合体およびそれらの調製方法を示し、ここで、図４Ｃは、インビボで切断可能な結合体の調製を示し、そして図４Ｄは、６−アミノヘキサン酸／β−アラニンリンカーを有する結合体の調製を示す。 図４Ａ〜図４Ｄは、オリゴマー−ペプチド結合体およびそれらの調製方法を示し、ここで、図４Ｃは、インビボで切断可能な結合体の調製を示し、そして図４Ｄは、６−アミノヘキサン酸／β−アラニンリンカーを有する結合体の調製を示す。 図４Ａ〜図４Ｄは、オリゴマー−ペプチド結合体およびそれらの調製方法を示し、ここで、図４Ｃは、インビボで切断可能な結合体の調製を示し、そして図４Ｄは、６−アミノヘキサン酸／β−アラニンリンカーを有する結合体の調製を示す。 図４Ａ〜図４Ｄは、オリゴマー−ペプチド結合体およびそれらの調製方法を示し、ここで、図４Ｃは、インビボで切断可能な結合体の調製を示し、そして図４Ｄは、６−アミノヘキサン酸／β−アラニンリンカーを有する結合体の調製を示す。 図５は、ＰＭＯがオリゴマーバックボーンの分子間モルホリン残基または分子内モルホリン残基を表すＧカルテット塩基対の模式図である。 図６は、様々な、結合していないイノシン置換したｃ−ｍｙｃオリゴマーおよびイノシン置換したｃ−ｍｙｃオリゴマーを用いた無細胞ウサギ網状赤血球溶解産物翻訳阻害の結果をグラフで示す。 図７は、イノシン置換があるかまたはない、アルギニンリッチペプチドに結合したｃ−ｍｙｃ ＰＭＯを使用した無細胞翻訳の阻害を表す。

（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
「アルキル」とは、分岐状であっても、直鎖状であっても、または環状（シクロアルキル）であってもよい、炭素および水素を含む完全に飽和した一価性のラジカルをいう。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチル、イソプロピル、シクロプロピル、シクロペンチル、エチルシクロペンチルおよびシクロヘキシルである。一般に好ましいのは、１〜６個の炭素原子を有しているアルキル基（「低級アルキル」と称され、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、イソアミル、ｎ−ペンチルおよびイソペンチルにより例示される）である。一実施形態において、低級アルキルとは、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルをいう。

「アルケニル」とは、分岐状であっても、直鎖状であっても、または環状であってもよい、炭素および水素を含む不飽和の一価性のラジカルをいう。アルケニル基は、一不飽和でもよく、または多価不飽和でもよい。一般に好ましいのは、「低級アルケニル」と称される、１〜６個の炭素原子を有するアルケニル基である。

「アリール」とは、一般に、単一の環（例えば、ベンゼン）または２個の縮合環（例えば、ナフチル）を有する、置換されたか非置換の一価性の芳香族ラジカルをいう。この用語は、ヘテロアリール基を含み、ヘテロアリール基は、環において１個以上の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有する芳香族環基（例えば、フリル、ピロール、ピリジルおよびインドール）である。「置換された」とは、アリール基中の１個以上の環水素がハロゲン化物（例えば、フッ素、塩素または臭素）によって；１個または２個の炭素原子を含んでいる低級アルキル基によって；ニトロ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、メトキシ、ハロメトキシ、ハロメチルまたはハロエチルによって置換されていることを意味する。好ましい置換基としては、ハロゲン、メチル、エチルおよびメトキシが挙げられる。一般に好ましいのは単一環を有するアリール基である。

「アラルキル」とは、アリール基によってさらに置換された、アルキル（好ましくは低級（Ｃ_１−Ｃ_４、好ましくは、Ｃ_１−Ｃ_２）アルキル置換基をいう；例は、ベンジル（−ＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_５）およびフェネチル（−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_５）である。

「複素環」とは、環原子が炭素、窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される、非芳香族環（好ましくは５員〜７員の環）をいう。好ましくは、環原子は、３〜６個の炭素原子を含む。このような複素環としては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジンおよびモルホリンが挙げられる。

用語「置換される」とは、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基またはアルカリール基に関して、ヘテロ原子含有置換基（例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、イミノ、オキソ（ケト）、ニトロ、シアノなど）またはさまざまな酸もしくはエステル（例えば、カルボン酸、スルホン酸もしくはリン酸またはカルボン酸エステル、スルホン酸エステルもしくはリン酸エステル）による、水素原子の置換をいう。

「アンチセンスオリゴマー化合物」または「アンチセンスオリゴマーアナログ」または「アンチセンス化合物」または「オリゴマーアナログ化合物」とは全て、実質的に荷電しておらず、代表的には、８塩基と４０塩基との間の長さを有し、かつ一本鎖標的核酸（例えば、プロセシングもしくはプレプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物、または一本鎖ウイルスゲノムＲＮＡもしくはＤＮＡ）と相補的であるかまたは実質的に相補的である塩基配列を有する、核酸アナログをいう。この化合物は、結合されていない形態であってもよく、または結合された形態（例えば、アルギニンリッチペプチドに結合される）であってもよい。

「モルホリノオリゴマー」とは、図１に示される形態のモルホリノサブユニット構造から構成されるオリゴヌクレオチドアナログであり、ここで、（ｉ）これらの構造は、リン含有結合によって一緒に連結されており（１〜３原子長、好ましくは２原子長）、そして好ましくは荷電しておらず、１個のサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接したサブユニットの５’環外炭素に連結している、そして（ｉｉ）Ｐ_ｉおよびＰ_ｊは、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基と結合するのに効果的なプリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分である。このプリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分は、代表的には、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミンである。モルホリノオリゴマーの合成、構造および結合の特徴は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号および同第５，５０６，３３７号において、詳述される。これらの全ては本明細書中に参考として援用される。

２原子結合を有する、図１Ｂに示されるサブユニットは、図２Ｂに示されるように、６原子反復単位バックボーンのために使用される。これらの構造において、５’モルホリノ炭素をリン基に連結している原子Ｙ_１は、硫黄、窒素、炭素または、好ましくは酸素であり得る。リンからペンダントするＸ部分は、塩基に特異的な水素結合を妨害しない任意の安定な基である。好ましい基としては、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、およびアルキルアミノ（環状アミンを含む）が挙げられ、塩基に特異的な結合が崩壊しない限り、これらの全てはさまざまに置換され得る。アルキル、アルコキシおよびチオアルコキシは好ましくは、１〜６個の炭素原子を含む。アルキルアミノとは好ましくは、低級アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）置換をいい、そして環状アミンは好ましくは、必要に応じて、酸素、窒素および硫黄から選択される１〜２個のさらなるヘテロ原子を含んでいる、５員〜７員の窒素複素環である。Ｚは、硫黄または酸素であって、好ましくは酸素である。

好ましいモルホリノオリゴマーは、ホスホロジアミデートに連結されたモルホリノオリゴマーであり、本明細書において、ＰＭＯと称される。このようなオリゴマーは、図２Ｂに示される形態のモルホリノサブユニット構造から構成され、ここで、この構造は、ホスホロジアミデート結合によって一緒に連結され、ここで、Ｘ＝ＮＨ_２、ＮＨＲまたはＮＲ_２（ここで、Ｒは、低級アルキル、好ましくはメチルである）であり、Ｙ＝Ｏであり、そしておよびＺ＝Ｏであり、ホスホロジアミデート結合は、１個のサブユニットのモルホリノ窒素を隣接したサブユニットの５’環外炭素に結合し、Ｐ_ｉおよびＰ_ｊは、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに効果的なプリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分である。また好ましいのは、交互のホスホロジアミデート結合を有する構造であり、ここで、図２Ｂにおいて、Ｘ＝低級アルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）であり、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲであり、ここでＲは低級アルキルであり、そしてＺ＝Ｏである。

モルホリノベースのオリゴマーの望ましい化学的特性としては、相補的塩基標的核酸（標的ＲＮＡが挙げられる）と、（８〜１４塩基程度の短いオリゴマーとさえ）高いＴｍを有して、選択的にハイブリダイズする能力、、哺乳動物細胞に能動輸送される能力、およびオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖がＲＮＡｓｅ分解に耐える能力が挙げられる。

「実質的に荷電していない」モルホリノオリゴマーは、４個全ての（好ましくは１０個全ての、より好ましくは２０個全ての）荷電していないサブユニット間結合について、多くても１個の荷電したサブユニット間結合を含む。任意の荷電した結合は、好ましくは、荷電したホスホルアミデート（またはチオホスホルアミデート）結合である（例えば、図２Ｂに示される結合であって、ここで、ＸはＯ⁻またはＳ⁻である）。好ましくは、モルホリノオリゴマーは、完全に荷電していない。

「アミノ酸サブユニット」は、好ましくは１個のα−アミノ酸残基（すなわち、−ＣＯ−ＣＨＲ−ＮＨ−）である；これはまた、βアミノ酸または他のアミノ酸残基（例えば、−ＣＯ−ＣＨ_２ＣＨＲ−ＮＨ−）であってもよく、ここで、Ｒは側鎖である。

「Ｇカルテット」は、Ｇカルテットの存在によって安定化される分子間四重鎖構造および分子内四重鎖構造をグアニンリッチ核酸に採らせ得る積み重なった平面水素結合グアニンテトラマーからなる。

用語「非天然アミノ酸」とは、β−アラニン（β−Ａｌａ）または６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）のような、天然で見つかるタンパク質に存在しないアミノ酸をいう
（ＩＩ．化合物−輸送体結合体）
本発明は、一つの局面では、実質的に荷電していないオリゴヌクレオチドアナログ化合物と、それに対して結合された、標的細胞へのこの化合物の取り込みを高めるのに効果的なアルギニンリッチペプチドとから構成される、治療的なオリゴマー−ペプチド結合体を含む。この化合物は、この化合物が結合することが意図される標的核酸領域において、４個以上連続したシトシン塩基と相補的である塩基の列を含む方法において、この列は、この列における連続したグアニン塩基の数を３個以下に制限するようにこの列中に配置される少なくとも１個のイノシン塩基を含む。好ましくは、塩基の列は、少なくとも２個のイノシン塩基を含み、そしてこの列における連続したグアニンの数は２以下である。

以下から分かるように、イノシン塩基は、標的シトシン塩基と相補的であるが、通常のＧ−Ｃ塩基対よりも安定性が低いＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成し、陽イオン性イオン交換樹脂への結合体の結合および陽イオン性イオン交換樹脂からの結合体の遊離を含む精製工程中の結合体の溶解性を、このイノシン置換がない同じ結合体と比較して高めるのに有用である。この溶解性を高めることは、実用的な精製法によって精製された結合体を得る際に重要である。本発明の別の特徴によれば、イノシン塩基置換はまた、以下によって証明されるように、その標的核酸に関して化合物の活性を高めるのに効果的である：
（ｉ）標的核酸領域が開始コドンをｍＲＮＡに含む場合、置換は、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の翻訳を妨害する結合体の能力を高めるのに効果的である；
（ｉｉ）標的核酸領域が、プレプロセシングされたｍＲＮＡ中にドナースプライス部位またはアクセプタースプライス部位を含む場合、置換は、前記標的領域でｍＲＮＡスプライシングをマスキングする結合体の能力を高めるのに効果的である；および
（ｉｉｉ）標的核酸領域が、ウイルス複製に関与する、ウイルスにコードされるシス作用性エレメントを含む場合、置換は、ウイルス複製をブロックする結合体の能力を、イノシン置換がない同じ結合体と比較して高めるのに効果的である。

イノシン塩基で置換されたオリゴマー−ペプチド結合体の高められたアンチセンス活性を実証するための方法は、代表的には、ｍＲＮＡ翻訳、プレプロセシングされたｍＲＮＡのスプライスの精度またはウイルス複製の阻害を測定するように設計された無細胞翻訳アッセイおよび組織培養に基づくアッセイである。

無細胞翻訳アッセイは、翻訳能力のある細胞溶解産物（例えば、ウサギ網状赤血球溶解産物）および（例えば、アンチセンスオリゴマー標的配列がすぐ上流に配置されたホタルルシフェラーゼ）を含む投入ｍＲＮＡからなる。種々のプラスミド構造物は、レポーターｍＲＮＡを生成するために用いられ得る。アンチセンスオリゴマーは無細胞翻訳反応物に加えられ、そしてレポーター遺伝子シグナルの相対的な阻害はアンチセンス活性の尺度である。本発明を記載するために使用する無細胞翻訳アッセイのより詳細な説明は、実施例４および５に示される。

ｍＲＮＡの翻訳阻害を示すように設計された組織培養に基づくアッセイは、翻訳産物（例えば、タンパク質）が量的に測定され得るネイティブな細胞遺伝子または細胞株に安定してトランスフェクションされたレポーター遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴマーを使用する。標的ｍＲＮＡの翻訳阻害の程度の測定は、免疫学的な方法を使用したタンパク質発現のレポーター遺伝子シグナル出力または定量を含めた種々の分析法を使用して実行され得る。

プレプロセシングされたｍＲＮＡスプライシングの阻害は、スプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位を標的としたアンチセンスオリゴマーで処理された細胞におけるサザンブロットまたは定量的ポリメラーゼ連鎖反応により、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡのレベルを測定することにより示され得る。代替のアプローチ（例えば、Ｋａｎｇ，Ｃｈｏら，１９９８を参照のこと）は、誤ったスプライシングを引き起こす変異したヒトβ−グロビンイントロンにより中断されるルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドによって安定してトランスフェクションされた細胞株を利用する。このイントロン中の変異を標的としたアンチセンスオリゴマーは、機能的なルシフェラーゼレポータータンパク質のスプライシングの修正およびアップレギュレーションに結果としてなる。

ウイルス複製に関係するシス作用性エレメントを標的とするアンチセンスオリゴマーの高められた活性は、標準的な組織培養に基づくウイルス複製アッセイまたはウイルスレプリコンを使用して示され得る。アンチセンスオリゴマーの存在下でのウイルス複製の阻害は、アンチセンスオリゴマーの存在下で複製されたウイルスの力価を決定することにより測定される。ウイルスレプリコン系は、全長の感染性ウイルスクローンの誘導体を利用し、ここで、ウイルスの構造遺伝子は、部分的または完全のいずれかで、レポーター遺伝子により置換されている。レプリコンは、通常、トランスフェクションによって、複製能力のあるウイルスに感染している細胞に導入される。このレプリコンは、レポーター遺伝子の増幅およびレポーターシグナル（例えば、ルシフェラーゼ活性）の増加に結果となる、ウイルスの複製機構によって認識される必須のシス作用性複製エレメントをコードする。

（Ａ．アルギニンリッチポリペプチド部分）
実質的に荷電していないアンチセンスオリゴマー化合物の生体膜を通した取り込みを高めるために本発明で使用されるアルギニンリッチペプチドは、一般に、８〜１３個のＸサブユニット、２〜４個の連続したＹサブユニット、Ｘサブユニットの中に単独で散在するＹサブユニットを含め、ＸおよびＹから選択される１０〜１５個のサブユニットからなる部分を含み、そして薬剤が連結される必要に応じたリンカーサブユニットを含む。Ｘは、構造Ｒ^１Ｎ＝Ｃ（ＮＨ_２）Ｒ^２の側鎖部分を含むアミノ酸サブユニットを表し（図３Ａを参照のこと）、ここで、Ｒ^１は、ＨまたはＲであり；Ｒ^２はＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲまたはＮＲ^２であり、ここで、Ｒは低級アルキルまたは低級アルケニルであって、酸素または窒素をさらに含むことができ；Ｒ^１とＲ^２とは、一緒に環を形成し得；そして、側鎖部分は、Ｒ^１またはＲ^２によりこのアミノ酸サブユニットに連結される。

選択された実施形態では、各々のＸについては、側鎖部分は、グアニジル（ＨＮ＝Ｃ（ＮＨ_２）ＮＨ−）、アミジニル（ＨＮ＝Ｃ（ＮＨ_２）Ｃ＜）、２−アミノジヒドロピリミジル、２−アミノテトラヒドロピリミジル、２−アミノピリジニルおよび２−アミノピリミドニル（２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｍｉｄｏｎｙｌ）（それぞれ、可能な結合部位を示す、図３Ｂ〜図３Ｇ）からなる群から独立して選択される。構造３Ｄ、構造３Ｅおよび構造３Ｇにおいて、アミノ酸サブユニットに対する側鎖の連結が、環の−ＮＨ−基のいずれかによって、および示される炭素原子のいずれかによって起こり得ることに注意されたい。１つの実施形態では、アミノ酸サブユニットアルギニン（Ａｒｇ）においてのように、側鎖部分はグアニジルである。

Ｙは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキルおよびアルカリールからなる群から選択される側鎖を有する疎水性アミノ酸サブユニットを表し、これらのいずれもが、置換されても置換されなくてもよい；置換されたアルキル、置換されたアルケニルおよび置換されたアルキニルから側鎖が選択される場合、Ｙは、６つ全ての炭素原子について多くても１個のヘテロ原子を含む。選択された実施形態では、Ｙは、置換されたかまたは非置換の、アリール、アラルキルおよびアルカリールからなる群から選択される、側鎖を有する疎水性アミノ酸サブユニットを表す。他の実施態様において、各々のＹは、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンからなる群から選択される。１つの好ましい実施形態では、各々のＹは、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）サブユニットである。他の好ましい実施形態では、Ｙサブユニットは、非天然のアミノ酸６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）である。ＸサブユニットおよびＹサブユニットは、本明細書において、「陽イオン性サブユニット」および「疎水性サブユニット」と称されてもよい。

上記の如く、ＸサブユニットがＹサブユニットの間を中断していないという点で、Ｙサブユニットは連続しているか、または、Ｘサブユニットの間で単独で散在するかのいずれかである。しかしながら、連結サブユニットは、Ｙサブユニットの間にあってもよい。１つの実施形態では、Ｙサブユニットは、輸送体の末端にある；他の実施形態では、それらは、Ｘサブユニットが隣接している。

好ましくは、輸送体はペプチドであり、ここで、アミノ酸はペプチド結合で連結される。アミノ酸は、ｄ−アミノ酸、ｌ−アミノ酸、非天然アミノ酸またはそれらの組合せであり得る。送達されるべき化合物は、検出のために使用される化合物（例えば、蛍光化合物）であってもよいが、しかし、それは、好ましくは生物活性物質（例えば、治療用薬剤または診断薬剤）である。この種の薬剤としては、核酸または核酸アナログ（特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド）が挙げられる。

本願明細書において示されるように、上記の通りの輸送体部分は、結合した荷電していないオリゴマー化合物の細胞への侵入を、結合した輸送体部分がないこの化合物の取り込みと比較して、そして疎水性サブユニットＹを欠いている結合した輸送体部分による取り込みと比較して、大いに高める。このような高められた取り込みは、好ましくは、疎水性サブユニットＹを欠いている結合した輸送体部分によるこの薬剤の取り込みと比較した、哺乳動物細胞への化合物の取り込みにおける少なくとも２倍の増加、好ましくは４倍の増加によって証明される。取り込みは、結合していない化合物と比較して、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも４０倍高められる。

輸送体部分の更なる利点は、おそらく、正に荷電した輸送体部分と負に荷電した核酸との間での静電的相互作用による、アンチセンスオリゴマーとその標的核酸配列との間で二重鎖を安定させるその予想される能力である。輸送体中の荷電したサブユニットの数は、上記のように、１４個未満であり、好ましくは８個および１１個との間である。なぜなら、荷電したサブユニット数があまりに多いと、配列特異性の低減に至るかもしれないからである。

組織培養および無細胞系の両方で測定したところ、輸送体部分もまた、アンチセンスオリゴマーの有効濃度を低下させて、アンチセンス活性を達成する。無細胞翻訳系は、その標的と結合して立体的妨害により下流配列の翻訳を阻害するアンチセンスオリゴマーの能力に対する、輸送体部分の高められた効果を評価する独立した手段を提供する。アルギニンリッチペプチド−ＰＭＯ結合体のアンチセンス活性を試験するように設計された無細胞翻訳アッセイは、結合していないＰＭＯと比較して、アンチセンス活性における１０倍と５００倍との間の改善を実証する（実施例５、ならびに図６および図７を参照のこと）。

（Ｂ．オリゴマーアンチセンス化合物）
上記の如く、１つの実施形態では、アンチセンスオリゴマー化合物は、ポリヌクレオチドの標的配列に対して塩基特異的に結合し得る合成オリゴマー（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドアナログ）である。バックボーン構造か、環構造か、またはより低い頻度では、天然のポリヌクレオチドの塩基構造が修飾されているこの種のアナログは周知であり、そしてこれには、荷電したアナログ（例えばホスホロチオネートに結合したオリゴヌクレオチド）および荷電していないアナログ（例えば、メチルホスホネートおよびペプチド核酸）を含む。連結部分における置換に依存して、いくつかのアナログ（例えば、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート）は、荷電していても荷電してなくてもよい。

好ましい実施形態では、上記で定義した通り、このポリマーは、長さが約８〜４０サブユニットのモルホリノオリゴマーである。より代表的には、このオリゴマーは、長さが約１０〜３０サブユニットまたは約１２〜２５サブユニットである。いくつかの適用に関しては、例えば、（例えば、長さが約８〜１２サブユニットの）抗細菌性の短いオリゴマーは、特に本願明細書において開示されるようなペプチド輸送体に結合させた場合、特に有利であり得る。好ましくは、オリゴマーは、上記でも規定した、荷電していないホスホロジアミデートに結合したモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。このＰＭＯは、任意の配列のものであり得、ここで、この支持される塩基対合基としては、標準的または改変されたＡ塩基、Ｔ塩基、Ｃ塩基、Ｇ塩基、Ｉ塩基およびＵ塩基が挙げられる。

本発明の一局面によれば、オリゴマー化合物が指向される標的核酸配列としては、４以上連続したシトシン塩基の領域が挙げられる。この標的領域はｍＲＮＡ中のＡＵＧ開始部位の一部であってもよく、ここで、ｍＲＮＡによってコードされる選択されたタンパク質の発現を阻害または妨害することが望ましい。あるいは、これは、プレプロセシングされたｍＲＮＡ中にドナースプライス部位もしくはアクセプタースプライス部位を含んでもよく、またはこれらに隣接していてもよく、ここで、スプライシング変異ポリペチドを作製する目的、または不完全もしくは不活性なペプチドを作製する目的のいずれかで、その部位での正しいスプライシングを妨害することが望ましい。さらに別の実施形態では、この標的は、ウイルスゲノム中のシス作用性エレメントであってもよく、ここで、オリゴマー（これは、＋ウイルスゲノム鎖または−ウイルスゲノム鎖のいずれかを標的とし得る）の結合は、ウイルス感染細胞中でのウイルス複製を妨害するのに効果的である。

これらの３個の標的タイプの各々において４個以上のグアニン塩基の列を含んでいる例示的な標的配列は、当業者に周知の公の配列データベースにおいて見出され得る。下記の１つの例示的な標的配列は、ＡＵＧ開始部位をヒトｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡに含む。しかしながら、この配列および標的化オリゴマー化合物において作製されるイノシンによるさまざまなグアニン置換は、本発明の利点を達成するために、４個以上のシトシン塩基の列で任意の標的配列を標的とする場合にオリゴマー化合物がどのようにして改変され得るかの例示であることが理解される。

輸送体は、従来技術において、当業者が利用可能な種々の方法により、送達されるべき化合物に連結され得る。例示的な方法は、下記の実施例１において提供され、そして図４Ａ〜図４Ｄにおいて図示される。これらの例のうちの１つにおいて、輸送体は、側鎖チオールが連結のために使われる単一のシステイン残基を含んでいるペプチドである。結合位置は、輸送体に沿ってさまざまな場所に存在し得る。選択された実施形態において、それは、輸送体の末端にある。代表的には、それは、輸送体の疎水性残基と隣接している。複数の輸送体は、所望により、単一化合物に結合され得る。

このリンカーはまた、ＰＭＯの５’末端およびペプチド輸送体のＣ末端に結合した、２個のβ−Ａｌａ残基および／またはＡｈｘ残基のうちの任意の組合せであり得る。好ましい実施形態は、図４Ｄで示すように、Ａｈｘ残基をペプチド輸送体のＣ末端に結合し、そしてβ−Ａｌａ残基をＰＭＯの５’末端に結合することである。

化合物がＰＭＯである場合、輸送体は、実施例３にて説明したように、そして図４Ａに示すように、例えば、５’−ヒドロキシル基により、またはアミンキャッピング部分により、ＰＭＯの５’末端に結合され得る。あるいは、輸送体は、図４Ｂに示すように、例えば、モルホリノ環窒素により、または末端結合もしくは内部結合のいずれかのサブユニット間結合の側鎖により、３’末端に結合され得る。リンカーはまた、例えば、カルボジイミドによって促進される縮合により形成される、輸送体ペプチドのカルボキシ末端とＰＭＯのアミン基またはヒドロキシ基との間の直接結合を含み得る。

リンカーは、通常の使用条件下で切断可能でないリンカー（例えば、チオエーテル結合またはカルバメート結合を含む）から選択され得る。いくつかの実施形態では、輸送体部分とインビボで切断可能である化合物との連結を含むことが所望され得る。インビボで切断可能である結合は当該分野において公知であり、例えば、カルボン酸エステル（これは、酵素によって加水分解される）およびジスルフィド（これはグルタチオンの存在下で切断される）を含む。適切な波長の照射の適用によって、インビボで、光分解的に切断可能な結合（例えば、オルト−ニトロフェニルエーテル）を切断することもまた可能であり得る。

例えば、試薬Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはスクシンイミジルオキシカルボニルα−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）を使用したジスルフィドリンカーを有する結合体の調製は、図４Ｃにおいて例示される。切断可能なジスルフィド基をさらに含む例示的なヘテロ二官能性連結剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル３−［（４−アジドフェニル）ジチオ］プロピオネートおよび（ＶａｎｉｎおよびＪｉ １９８１）に記載される他のものを含む。

以下のセクションで考察されるＰＭＯ、ペプチド結合ＰＭＯおよび例示的な輸送体ペプチドの配列の表を、表１として以下で提供する。一般に、ペプチドは、Ｎ末端アミノ基およびＣ末端のアミンを含む（例えば、ＮＨ_２−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＦＦＣ−ＣＯＮＨ_２ 配列番号１６）。イノシンで置換されたグアニン残基を、太字で示す。

（Ｃ．オリゴマー化合物におけるイノシン置換）
本発明を支持して実施され、以下に報告する研究では、化合物の細胞取り込みを高めることを目的として、４個以上のグアニン塩基の列を有する（すなわち、一続きの４個以上のシトシン塩基を有する配列を標的とする）オリゴマー化合物にアルギニンリッチペプチドを連結することが、２つの重大な課題を生じることが観察された。これらの課題はいずれも予想外であった。第一に、アルギニンリッチポリペチドの存在によって、陽イオン性イオン交換樹脂での精製プロセス中に結合体の凝集が生じた。第二に、標的に対するこの化合物のアンチセンス活性は、かなり低下していた。

実施例２および実施例３にて説明したように、結合体の凝集は、ｃ−ｍｙｃ ＰＭＯ（ＡＶＩ−４１２６、配列番号１）のようなＧリッチＰＭＯに結合したアルギニンリッチペプチドの合成において、克服するには大きなハードルである。ペプチド結合ｃ−ｍｙｃ ＰＭＯの最初の調製物は、その後の分析において矛盾を生じた。結合体の質量スペクトルは予想通りだったが、分析用の強陽イオン交換（ＳＣＸ）ＨＰＬＣは、全く異なる保持時間を有するいくつかの異なるピークを与えた。複数のピークは、結合体の異なる凝集形態に対応した。実施例４および実施例５に記載されている結果は、グアニンリッチなＰＭＯ配列がｃ−ｍｙｃ ＰＭＯの強陽イオン交換（ＳＣＸ）ＨＰＬＣにおいて観察される凝集に関係していること、および連続したグアニン塩基のうちの１個以上をイノシン塩基で置換することにより、この凝集が低減したかまたはなくなったことを実証する。表１に列挙するように、ＡＶＩ−５１２６（配列番号１２）についての１つの例示的な構造は、３個のイノシン残基を含んでおり、凝集に非常に有利な条件下でさえ、凝集したものを形成しない。

アルギニンリッチな輸送体ペプチドがＰＭＯに結合されるときに観察される凝集現象は、この種類の核酸アナログに限定されない。アルギニンリッチポリペチドに結合される場合、他のモルホリノバックボーン、メチルホスホネート、ホスホロチオエートおよびホスホジエステル（すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）およびＰＮＡを含め、他の荷電していない核酸または核酸アナログには全て、凝集の同じ可能性があり、それゆえ、本発明のイノシンによるグアニン塩基置換によって改善される可能性がある。

（Ｄ．イノシンで置換されたアルギニンリッチペプチドの改善された立体妨害特性）
ｃ−ｍｙｃ遺伝子を標的とする、イノシンで置換されたＰＭＯを、実施例４に記載される無細胞ウサギ網状赤血球溶解産物（ＲＲＬ）アッセイにおいて試験した。この実施例で記載されており、図６に示されるように、イノシンによるグアニン置換の数の増加は、翻訳阻害の減少と相関した。４個のイノシンによるグアニン置換を有するＰＭＯ（配列番号１０）は、翻訳の阻害が最も効果なく、一方、イノシンによるグアニン置換を１個だけ有するＰＭＯ（配列番号２および配列番号３）は、全てのイノシン含有ＰＭＯのうちで最も効果的であった。イノシン置換なしのコントロールのｃ−ｍｙｃ ＰＭＯ（配列番号１）は、このアッセイにおいて最も高い阻害レベルを有した。イノシン含有ＰＭＯについて観察された翻訳阻害の減少は、３個の水素結合を有するＧ：Ｃ塩基対合と比較した、Ｉ：Ｃ塩基対合の間での１個の水素結合の喪失と一貫している。標的化ＰＭＯとその標的との間でのより低いＴｍは、ＲＲＬアッセイが測定する立体的妨害の相対的な損失で役割を果たし得る。

上で記載されているイノシンによるグアニン置換を有するｃ−ｍｙｃ ＰＭＯｓのうちの３個は、（ＲＡｈｘＲ）_４送達ペプチドに連結され、そして実施例４に記載されているのと同じｐＣＮｍｙｃｌｕｃプラスミドおよびＲＲＬ系を使用して、無細胞翻訳を阻害する能力について試験された。図７に示され、そして実施例５に記載されているように、最少の阻害のＰＭＯは、イノシン置換のないコントロールペプチドに結合されたｃ−ｍｙｃ ＰＭＯ配列（配列番号１４）であることが観察された。対照的に、イノシン置換を有する化合物は、かなり大きな翻訳阻害を示した。図７において示すのは、２個または３個のイノシン置換を有する（ＲａｈｘＲ）_４ペプチドＰＭＯ結合体（配列番号１１〜配列番号１３）である。ペプチド結合された、イノシンで置換されたＰＭＯの改善された翻訳阻害は、実施例４に記載され、図６に示されるような、結合していないＰＭＯを用いて観察される阻害の低減と著しく異なっている。

アルギニンリッチペプチドがアンチセンスＰＭＯに与える高められた立体的妨害の阻害は、結合されていない、イノシンで置換されたＰＭＯを用いて観察される減少した立体的妨害の特性を完全に克服する。実施例５に記載された結果および図７に示される結果の両方に基づいて、イノシン置換を有するＰＭＯは、イノシンで置換されていないＰＭＯと比較して立体的妨害の特性を有意に高めた。

（ＩＩＩ．適用）
本発明の結合体は、脈管増殖の障害（例えば、再狭窄）の処置に有用である。脈管損傷の領域は、例えば、ステント挿入の有無にかかわらず、脈管介入（例えば、冠状動脈バルーン血管形成術）後の脈管内腔の再狭窄または再度の狭まりを含む。再狭窄は、血管形成術によって処置される病変のうちの約３０％〜６０％、およびこの手順後３〜６ヵ月以内にステントを用いて処置される病変のうちの約２０％に起こると考えられている（例えば、Ｄｅｖｉ，Ｎ．Ｂ．ら，Ｃａｔｈｅｔ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｉａｇｎ ４５（３）：３３７−４５，１９９８を参照のこと。狭窄症はまた、冠状動脈バイパス手術後に起こることができ、ここで、心臓手術は、血液が、詰まった動脈周辺をコース変更、すなわち「バイパス」して、心臓への血液および酸素の供給を改善するために行われる。そのような場合、狭窄症は、移植された血管セグメントで、特に交換された血管の接合部に起こり得る。狭窄症は、また、透析のために作製される吻合の接合部で起こり得る。

この局面において、ＰＭＯ結合体（好ましくは、ｃ−ｍｙｃを標的とするもの）は、コーティングしたステントにおいて用いられるか、または伏在静脈の処置のためにエキソビボで浸漬することによって用いられるか、さもなくば、脈管損傷部位に送達される。微小な泡状の組成物は、血栓症または脈管損傷の領域（例えば、損傷を受けた内皮）（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ ２０００／０２５８８号を参照のこと）ならびに選択された器官（例えば、肝臓および腎臓）への結合された分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の送達において特に有用であることが見出されている。好ましい抗再狭窄組成物は、Ａｈｘ−βＡｌａリンカー（例えば、配列番号１２）によって（ＲＡｈｘＲ）_４輸送体ペプチドに結合された、イノシン置換された抗ｃ−ｍｙｃ ＰＭＯである。

本願明細書において記載されているｃ−ｍｙｃ遺伝子を標的としているＰＭＯ結合体はまた、癌一般、特に膀胱癌の処置に有用である。化学療法と併用した、ＰＭＯ結合体（好ましくはｃ−ｍｙｃを標的とするもの）の経尿道投与は、（Ｋｎａｐｐ，Ｍａｔａら ２００３）に記載され、そして共有に係る同時係属中の米国出願１０／１５１，００８（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、高められた抗癌活性を提供する。好ましい抗癌組成物は、Ａｈｘ−βＡｌａリンカー（例えば、配列番号１２）により（ＲＡｈｘＲ）_４輸送体ペプチドに結合した、イノシンで置換された抗ｃ−ｍｙｃ ＰＭＯである。

以下の実施例は、限定をせずに、本発明の各種実施形態を例示する。

（実施例１：ＰＭＯへのペプチド合成および結合）
ペプチドを、本明細書中でＳＰＰＳと称される、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成（Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって合成した。ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂を、Ｃ末端に酸を有するペプチドの合成のために用い、その一方で、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂を、ペプチドアミドのために用いた。両方の樹脂は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能である。代表的合成サイクルを、２０％のピペリジンによるＮ末端脱保護から始めた。それから、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の存在下で２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を用いた活性化によって、成長中のペプチド鎖に連結した。アルギニン側鎖を、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）保護基、トリチルを有するシステインおよびｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）を有するリジン側鎖を用いて保護した。所望の配列においてカルボキシからアミノの方向でアミノ酸の全てが付加されるまで、サイクルを繰り返した。ペプチジル樹脂を２．５％ Ｈ_２Ｏ、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）および９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液で処理することによって、合成樹脂からの切断および側鎖の脱保護を同時に実行した。システイン残基を含んでいるペプチドに関しては、２．５％の１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）を切断カクテルに添加した。粗製ペプチドを、１０倍過剰のジエチルエーテルを使用した沈殿により単離した。Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｓ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を利用している強陽イオン交換ＨＰＬＣを精製のために使用し、続いてＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ３００Ｍ樹脂（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を使用した逆相脱塩を行った。脱塩されたペプチドを凍結乾燥し、そしてマトリックス支援レーザ脱離電離飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）、強い陽イオン交換高速液体クロマトグラフ（ＳＣＸ ＨＰＬＣ）およびキャピラリー電気泳動法（ＣＥ）によって正体および純度を分析した。

様々なＣ末端疎水性結合を含んでいるペプチドを以下の通りに調製した。ペプチドを、ＳＰＰＳ中にペプチドのＣ末端に天然および／または非天然のアミノ酸の組合せを含めることによって、ＰＭＯのアミン基またはヒドロキシ基との直接縮合のために調製した。具体的には、結合は、１または２の残基の異なる組合せにおいて使用される、アミノ酸グリジン、β−アラニンおよび／または６−アミノヘキサン酸から構成された。ペプチド合成は、他の点では他のペプチド酸の合成と同一であった。

ＰＭＯのアミン基またはヒドロキシ基との直接的縮合のためにアミン基がマスクされたペプチドを、以下の通りに調製した。遊離のペプチドアミノ基は、ＰＭＯのアミンまたはヒドロキシ基とペプチドのカルボキシ末端との直接的縮合を妨害するので、マスキングされなければならない。１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘクス−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）アミン側鎖保護基を用いることにより、アミン側鎖を含むペプチド配列（例えば、ｒＴａｔおよびｐＴａｔ（表１））を調製した。ペプチド合成は、他の点では他のペプチド酸の合成と同一であった。リジンＤｄｅ基は、樹脂切断および他のアミノ酸側鎖保護基の脱保護に耐えた。側鎖アミンは、結合を通してＤｄｅによってマスキングされるままであり、その後、ＤＭＦ中の２％ヒドラジンを用いた処理によって脱保護される。

ＰＭＯの５’末端での輸送体ペプチドの結合を、以下の通りにアミド結合によって実行した。ペプチド−酸（１５μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１４．２５μｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（１５μｍｏｌ）を２００μｌのＮＭＰに溶かし、そしてＤＩＥＡ（２２．５μｍｏｌ）を加えることにより、Ｃ末端反応性のペプチド−ベンゾトリアゾリルエステルを調製した。ＤＩＥＡの添加の直後に、ペプチド溶液を、ＤＭＳＯ中の５’−ピペラジン官能基化した３’−アセチル−ＰＭＯの１２ｍＭ溶液１ｍｌに加えた。３０℃にて１８０分後に、反応物を４倍過剰の水で希釈した。粗製結合体を最初にＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ弱陽イオン交換カラム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に通して、結合していないＰＭＯを取り除き、次いで、逆相カラム（ＨＬＢカラム，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に通して、精製した。結合体を凍結乾燥し、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＳＣＸ
ＨＰＬＣおよびＣＥにより分析した。

（実施例２：アルギニンリッチペプチドに結合した場合にＧリッチオリゴマーはＧ四重鎖凝集物を形成する）
本実施例は、冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）の臨床応用のための、ｃ−ｍｙｃ遺伝子を標的とするアルギニンリッチペプチド−ＰＭＯ結合体の開発を詳述する。本実施例で記載されているプロジェクトの目的は、受け入れられる収率および純度を有する、結合体の合成および精製のためのプロセスを開発することであった。さらに、結合体の分析のための方法は、結合体を特徴づけなければならず、そして合成プロセス全体にわたって、そしてクリニックにおいて使用されるいかなる製剤においても不純物を識別しなければならない。製品中に残存する遊離ペプチドの量の定量は、おそらく最も重要分析能力である。なぜなら、遊離ペプチドは、結合体または遊離ＰＭＯよりも毒性が高い可能性があるからである。

以下に示されるように、分子内Ｇカルテットの形成による凝集は、ｃ−ｍｙｃ ＰＭＯ（ＡＶＩ−４１２６、配列番号１）のようなＧリッチＰＭＯに結合したアルギニンリッチペプチドの合成において克服しようとする大きなハードルであることが明らかである。これを考慮すると、この化合物の更なる開発の前に、いくつかの課題を解決する必要がある。第一に、凝集していない形態の結合体を生じることは可能であるか。第二に、所定のサンプルの形態の正確な評価を与える、凝集もせず、脱凝集もしない分析法を開発することは可能であるか。最後に、注射緩衝液（例えば、ＰＢＳ）において処方された場合に、結合体は、あるとすればどのような凝集形態をとるのか。

ｃｍｙｃ ＰＭＯに結合されたペプチドの最初の調製物は、その後の分析において、明白な矛盾を生じた。質量スペクトルは予想通りだった。しかし、分析用の強陽イオン交換（ＳＣＸ）ＨＰＬＣは、全く異なる保持時間を有するいくつかの異なるピークを与えた。複数のピークは、異なる凝集形態の結合体に対応した。

凝集の証拠は、分取用ＳＣＸ ＨＰＬＣによってそれを精製する際の最初の試みから得られる。１１８ ＯＤ_２６０のＲ_９Ｆ_２Ａｈｘ−ｃｍｙｃ（配列番号１５）を２０ｍｌのＳｏｕｒｃｅ １５Ｓ ＨＰＬＣカラムにローディングし、そしてｐＨ４．７５のＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液中で流し、１．５Ｍ ＫＣｌで溶出させた。緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂは両方とも、２５％のアセトニトリル（ＡＣＮ）を含んでいた。結合体は、カラムから１個の主なピークとして溶出し、遊離ペプチドの直後に溶出したが、その後の画分分析により、後で溶出するピークが豊富になったことが分かった。後で溶出するピークは、マルチマー凝集形態の結合体に対応する。後で溶出するピークが、荷電の増加に起因した、より長い保持時間を有するマルチマー凝集形態の結合体であるという証拠は、塩気のある条件のＳＣＸ精製が凝集体形態に有利であり、低塩条件が遊離形態に有利であるという観察により提供された。塩がＧカルテットにより四重鎖ＧＲＯの形成を高めることは公知である。１．５ＭのＫＣｌ中のＳＣＸ ＨＰＬＣカラムに結合体をローディングすることにより、２個の後で溶出するピークのうちの２個目のピークが富化され、そして早期の凝集していないピークの量が減少した。２Ｍ塩化グアニジニウムまたは６Ｍ尿素のいずれかにおけるローディングにより、後で溶出するピークの量が大いに低減し、早期に溶出するピークは影響を受けないままであった。従って、分子の集合状態は、ローディング環境を変えることにより操作され得る。これにより、後で溶出するピークが凝集した形態の結合体に対応し、伝統的な脱凝集剤である尿素およびグアニジニウムは、樹脂にローディングされるので、この結合体を脱凝集する際に明らかに効果的であるというさらなる証拠が提供された。

分析用ＳＣＸ ＨＰＬＣに対する熱の影響は、凝集に関するさらなる証拠を提供した。このクロマトグラフィーを、カラムオーブンに入れたＳｏｕｒｃｅ １５Ｓ ｔｒｉｃｏｒｎ ＳＣＸカラムを使用して実行した。金属陽イオンがクロマトグラフィーから完全に排除され、そしてグアニジニウムで置き換えられる場合、カラムに熱をかけることにより、後で溶出するピークが消える。凝集した結合体のパーセンテージは、カラムの温度が室温から６５℃まで上昇するにつれて減少する。ナトリウムをクロマトグラフィー全体にわたって陽イオンとして用いた場合、「融解」現象は観察されない。このことは、凝集したものを金属陽イオンが安定させることを示唆する。カリウムが偏在し、凝集体形態が優勢であった上記のＳＣＸ精製の試みの文脈を考慮すれば、このことは、つじつまがあう。

しかしながら、結合体の凝集形態がずっと長い保持時間を有するという事実は、分子が相互作用しており、アルギニン側鎖上の電荷がイオン交換樹脂との相互作用にまだ利用され得ることを示唆した。ペプチド部分が相互作用に関係していない場合に結合体分子のＰＭＯ部分が互いに相互作用してマルチマー凝集体を形成するならば、これはまさにその通りであろう。

凝集体の問題は、ｃ−ｍｙｃ ＰＭＯ配列に、または少なくともグアニンリッチオリゴマー（ＧＲＯ）に特有のようである。低いＧ含有量を有する配列に対して類似したペプチドを結合することは、凝集の問題を提示しない。連続した一続きのＧと他のＰＭＯとの結合体は、ＳＣＸ ＨＰＬＣ上に同じタイプの凝集体を示す。ＰＭＯとペプチドとの間のリンカーは、凝集にいかなる影響をも及ぼすようではない。Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）チオエーテル結合は、Ｇｌｙ２−Ａｈｘ、Ａｈｘ２またはＡｈｘアミド連鎖に非常に類似したＳＣＸ溶出パターンを与える。最後に、本発明者らのｃ−ｍｙｃ結合体において使用される、より最近のペプチドである（ＲＡｈｘＲ）_４−は、以前のＲ_９Ｆ_２−よりも５８％長いが、より短いペプチドと同じ凝集体ＳＣＸ溶出パターンを与える。従って、凝集は、いかなるアルギニンリッチペプチドを用いても起こり、そして現在まで使用される結合の全てについて起こる。様々な結合を有する同じペプチドが「低Ｇ」ＰＭＯ配列に結合された場合には凝集が観察されないので、本発明者らは、この現象を、ｃ−ｍｙｃ ＰＭＯ配列のＧリッチな性質によるものであると考える。

結合されたＧＲＯを用いて観察される観察された凝集は、連続的な一続きのグアニンを有するＤＮＡおよびＲＮＡにみられるＧ四重鎖構造を形成するＰＭＯ−ＰＭＯ相互作用と一貫している。上記のｃｍｙｃ ２０マーＰＭＯのＰＭＯ配列（配列番号１）は、５’−ＡＣＧ ＴＴＧ ＡＧＧ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＣ−３’であり、その一続きの４個のＧは、８位〜１１位にわたる。凝集程度に対する異なる陽イオンの効果がＳＣＸ ＨＰＬＣによって測定される場合、Ｇ四重鎖構造の形成についての証拠が提供される。陽イオン性相互作用がＤＮＡおよびＲＮＡの四重鎖を協調させることにとって重要であることは、周知である。

（実施例３：イノシンによるグアニン置換は、アルギニンリッチペプチドに結合したＧリッチなオリゴマーの凝集を防止する）
グアニンリッチ核酸配列が、Ｇカルテットの存在下で安定化される分子間四重鎖構造または分子内四重鎖構造を採り得ることが長く認識されてきた（図５を参照のこと）。Ｇカルテットは、積み重ねられた平面状の水素結合したグアニンテトラマーであり、グアニンリッチ核酸に四重鎖構造を形成させる。いくつかの生物学的に重要なＧリッチ配列はインビトロにおいて生理学的条件下でＧカルテットを形成し得るので、インビボでの四重鎖形成の潜在的役割が調査されている。さらに、特異的Ｇカルテット結合タンパク質を記載している報告の数は、現在、かなりのものである（ＳｈａｆｅｒおよびＳｍｉｒｎｏｖ，２０００）。

熱力学的考慮事項および反応速度的考慮事項の両方に依存して、Ｇリッチオリゴマー（ＧＲＯ）は、種々の可能な四重鎖構造を形成し得る。形成される構造は、オリゴヌクレオチドの塩基配列および濃度、ならびにアニーリングに使用する条件（温度および緩衝液）、特にＫ^＋およびＮａ^＋のような一価の陽イオンの存在により影響され得る。四重鎖は、１分子、２分子または４分子のオリゴヌクレオチドにより形成され得、これらは、それぞれ、モノマー構造、ダイマー構造およびテトラマー構造と称される。モノマー四重鎖およびダイマー四重鎖は、いす形（横方向のループ）またはバスケット形（斜めのループ）になるそれらのループ領域の配置に基づいて、さらに分類されている。四重鎖の４個の鎖の相対的な鎖配向（５’から３’への極性）は、平行、逆平行または混合型であり得る（Ｄａｐｉｃ，Ａｂｄｏｍｅｒｏｖｉｃら，２００３）。

Ｇ四重鎖構造を促進する水素結合相互作用を破壊するために、ｃ−ｍｙｃ ＰＭＯ（配列番号１）の４個のＧ内の異なる位置でイノシンによりグアニンを置換した９つのＰＭＯを合成した。イノシンを含んでいるＰＭＯを、配列番号２〜配列番号１０として表１に列挙する。ペプチドとの結合後、非常に凝集性のＳＣＸ ＨＰＬＣ条件下で分析を行った。条件は最大限に凝集性であるので、これらは、各々の分子の相対的な凝集傾向の厳密な試験であるはずである。

トリフルオロ酢酸塩としてのＡｃ−（Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ）_４−Ａｈｘ−βＡｌａ−ＯＨペプチドを、表１に列挙した未改変のｃｍｙｃ ＰＭＯ ２０マー配列およびイノシンで改変した９つのｃｍｙｃ ＰＭＯ ２０マー配列（配列番号１〜１０）に結合させた。結合を、ＮＭＰ／ＤＭＳＯ中でのＨＢＴＵカップリングを使用して、通常の様式で実施した。反応は、３５℃にて１８０分間進行した。反応混合物を３ｍｌのＨ_２Ｏで希釈し、２ｍｌのＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにローディングし、２ｍｌのＡＣＮおよび１ｍｌのＨ_２Ｏによって洗浄した。結合体を、４ｍｌの２Ｍの塩化グアニジニウムによって溶出させた。イオン交換カラムから溶出した塩分のある結合体溶液を、２ｍｌのＷａｔｅｒｓ ＨＬＢ逆転相カラムにローディングすることにより脱塩し、４ｍｌのＨ_２Ｏによって洗浄し、そして４ｍｌの５０％ ＡＣＮによって溶出させた。最後に、この溶液を凍結乾燥した。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる結合体の分析によって、Ｎ−１が切断されたＰＭＯ配列に起因する主な不純物であるきれいな生成物が示唆された。ＨＰＬＣを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＢｉｏＬｏｇｉｃ ＨＲ ＨＰＬＣシステムを使用して実施した。全ての実施のために使用したカラムは、Ｔｒｉｃｏｒｎ Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｓ ４．６／１００ ＰＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；製品１７−５１８２−０１）であった。使用した緩衝系は、ｐＨ７．５の２５％ ＡＣＮ中の１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４であり、１．５Ｍ ＮａＣｌによって溶出させた。サンプルを全て、緩衝液Ａ中でローディングした。２０〜７５％ Ｂ／１４カラム体積勾配にて１ｍｌ／分の流量を、全ての実施に用いた。クロマトグラフィーの結果を、積分したピーク値として下記の表２に示す。化学的不純物および約７％の積分合計を表している小さいピークが全てのクロマトグラムに存在した点に留意するべきである。

イノシンによるグアニン置換は、凝集の相対量に明らかな影響を及ぼした。９位または１０位におけるたった１個のグアニンの置換については、凝集形態における結合体のパーセントは、７９％から平均５６％まで低下した。２個の置換を有する配列のうちの３個（Ｉ８、Ｉ１０）、（Ｉ８、Ｉ１１）および（Ｉ９、Ｉ１１）は、凝集した結合体が平均２０％であるクロマトグラムを有した。一続きの４個のＧのうちの２個の中心グアニンを置換することは、より大きな効果を有し、凝集物は２．７％のみであった。グアニン（Ｉ９、Ｉ１０）のうちの３個以上が置換される場合、凝集は全く除去された。

（実施例４：イノシンによるグアニン置換を有するＰＭＯを用いた無細胞翻訳の阻害）
ホタルルシフェラーゼ（ｆＬＵＣ）についてのコード配列を、Ｓａｌ Ｉ部位Ｎｏｔ Ｉ部位において、プラスミドｐＣｉ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイトにサブクローン化し、得られたプラスミドをｐＣＮｌｕｃｒと名づけた。ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子のＡＴＧ開始コドンを取り囲んでいる３０塩基対合領域（５’−ＡＧＣＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＡＴＧＣＣＣＣＴＣＡＡＣＧＴＴＡ−３’（配列番号２９）、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｖ００５６８）をｐＣＮｌｕｃｒのＮｈｅ Ｉ部位およびＳａｌ Ｉ部位にサブクローン化し、そしてｐＣＮｍｙｃｌｕｃと名づけた。これにより、ｃ−ｍｙｃコード配列は、ｆＬＵＣ遺伝子のアミノ酸コード配列とフレームがあって配置された（ｃ−ｍｙｃ：ｆＬＵＣ）。ｃ−ｍｙｃのこの領域を標的とするＰＭＯ（ＡＶＩ−４１２６）を、配列番号１として列挙する。イノシンで置換されたグアニン残基の数および位置が様々であって、ｃ−ｍｙｃ開始コドン領域を標的とする、イノシンで置換されたＰＭＯを、配列番号２〜配列番号１０として列挙する。

上で記載されている全てのプラスミドは、ｃ−ｍｙｃ：ｆＬＵＣの上流にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する。そして、Ｔ７ポリメラーゼに基づくＭｅｇａｓｃｒｉｐｔキットおよびプロトコル（Ａｍｂｉｏｎ）を使用し、Ｎｏｔｌを用いた線状化後にこのプラスミドからＲＮＡが生成されることを許容した。ＰＭＯ、（ＲＡｈｘＲ）_４−ＰＭＯまたは水に加えて１２μｌのヌクレアーゼ処理済みウサギ網状赤血球溶解産物（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに、各々の反応中、１ｎＭの最終濃度で転写されたＲＮＡを使用してインビトロ翻訳を実施した。１０μｌの翻訳反応物を、製造業者の指示に従って、５０μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、そして発光をＦＬｘ８００マイクロプレートルミノメーター（ＢＩＯ−ＴＥＣ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に読み取った。反応物を、発光機能および１２５の感度設定を使用したＫＣ Ｊｕｎｉｏｒプログラム（ＢＩＯ−ＴＥＣ）を用いて相対光単位についてアッセイした。各々の列の最初のウェルおよび最後のウェルに水のコントロール反応物を含めて、１２個の反応物を一度にアッセイした。ＰＭＯまたは（ＲＡｈｘＲ）_４−ＰＭＯの濃度の関数として各々の反応（ｎ＝３）によって得られた相対光単位（ＲＬＵ）は、図６および図７に示すように表された。

ｃ−ｍｙｃ遺伝子を標的とする、イノシンで置換された様々なＰＭＯを、上記の無細胞ウサギ網状赤血球溶解産物（ＲＲＬ）アッセイにおいて試験した。図６に示すように、イノシンによるグアニン置換の数を増やすことは、翻訳の減少した阻害と相関した。イノシンによるグアニン置換を４個有するＰＭＯ（配列番号１０）は、翻訳を阻害することに最も効果がなかった。ＩによるＧ置換を１個だけ有するＰＭＯ（配列番号２および配列番号３）は、全てのイノシン含有ＰＭＯの中で最も効果的であった。最も効果的なＰＭＯは、イノシン置換のないコントロールのｃ−ｍｙｃ ＰＭＯ（配列番号１）であった。イノシン含有ＰＭＯを用いて観察される翻訳阻害の減少は、３個の水素結合を有するＧ：Ｃ塩基対合と比較した、Ｉ：Ｃ塩基対合の間での１個の水素結合の損失に起因することが提唱される。

（実施例５：イノシン置換ペプチド−ＰＭＯ結合体を用いた無細胞翻訳の阻害向上）
イノシンによる様々なグアニン置換を有する３個の異なるｃ−ｍｙｃ ＰＭＯを（ＲａｈｘＲ）_４送達ペプチドに結合させ、そして実施例４に記載の同じｐＣＮｍｙｃｌｕｃプラスミドおよびＲＲＬ系を用いて、それらが無細胞翻訳を阻害する能力を試験した。図７に示すように、最少阻害性のＰＭＯは、イノシン置換のないコントロールペプチドが結合されたｃ−ｍｙｃ ＰＭＯ配列（配列番号１４）であることが観察されたイノシン置換を有する化合物は、かなり有意に大きな翻訳阻害を示した。図７に示すのは、２個または３個のイノシン置換を有するＲａｈｘＲペプチドＰＭＯ結合体（配列番号１１〜配列番号１３）である。ペプチドに結合されイノシンで置換されたＰＭＯの改善された翻訳阻害は、実施例３に記載されていて、図６に示される、結合していないＰＭＯを用いて観察される阻害低下とは極めて対照的である。アルギニンリッチペプチドがアンチセンスＰＭＯに与える高められた立体妨害阻害は、結合していないイノシン置換されたＰＭＯについて観察される立体妨害特性の低下を完全に克服する。図７に示される結果に基づいて、イノシン置換を有するＰＭＯは、イノシン置換がされていないＰＭＯよりも大きな程度まで予想外に高められる。アルギニンリッチペプチドがイノシン置換されたＰＭＯに与える立体妨害特性を高める機構は、現在わかっていない。しかしながら、これらの改善されたアンチセンスＰＭＯの合成および治療可能性の両方における有用性は大いにある。

Claims (1)

1. 本願明細書に記載された発明。

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