JP2003500418A

JP2003500418A - 多発性嚢胞腎疾患の処置のためのｃ−ｍｙｃに対するアンチセンス

Info

Publication number: JP2003500418A
Application number: JP2000620083A
Authority: JP
Inventors: パトリックエル．イバーセン，
Original assignee: エイブイアイバイオファーマ，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-05-24
Filing date: 2000-05-24
Publication date: 2003-01-07
Also published as: AU781094B2; KR20020033628A; AU5284300A; WO2000071706A1; EP1185637B1; CA2374499A1; ATE402257T1; DE60039601D1; KR100708573B1; EP1185637A1

Abstract

(57)【要約】ｃ−ｍｙｃに対するオリゴヌクレオチドアンチセンスを投与することによって、多発性嚢胞腎疾患の処置するための方法が記載されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、モルホリノオリゴヌクレオチドである。このオリゴマーは、長さが８〜４０ヌクレオチドでかつ、非荷電のリン含有サブユニット間結合を有する。そのアンチセンスオリゴマーは、注射、経皮送達、吸収、または経口投与によって投与され得、そして、好ましくは、後者で投与され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、ｃ−ｍｙｃに対するアンチセンスであるオリゴマーの投与による、
多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）の処置のための方法およびアンチセンス結合体に関
する。

【０００２】（参考文献）

【０００３】

【数１】（発明の背景）多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）は、約５００分の１の頻度を有するヒトの有力な
遺伝病である。成人のＰＫＤ（ＡＤＰＫＤ）は、約５００，０００人のアメリカ
人を冒している常染色体優性障害であり、毎年約７，０００人の新しい患者が確
認される。常染色体劣性（ＡＲ）ＰＫＤに罹患している乳児は、急速に発生する
形態を遺伝し、これにより新生児期間に腎不全を生じ得る。

【０００４】この疾患は、上皮細胞の増殖、腎嚢胞腫、肝嚢胞腫、頭蓋内動脈瘤の形成、お
よび腎不全の進行によって、特徴付けられる。ＰＫＤ１（ヒトの常染色体優性多
発性腎疾患（ＡＤＰＫＤ）の症例の約８５％にて変異している遺伝子）が、最近
同定された（ＴｈｅＥｏｕｒｏｐｅａｎＰｏｌｙｃｙｓｔｉｃＫｉｄｎｅ
ｙＤｉｓｅａｓｅＣｏｓｏｒｔｉｕｍ，１９９４）。罹患した家族にて同定
されたほとんどの変異は、ＰＫＤ１およびＰＫＤ２遺伝子を不活性化するようで
ある。最近の証拠は、正常なＰＫＤ１対立遺伝子もまた不活性化されている、ツ
ーヒット機構が嚢胞成長に必要であり得ることを示唆してきた。

【０００５】ＰＫＤに罹患しているヒトおよびげっ歯類由来の嚢胞腎で、異常な発現を示す
遺伝子の多数は、シグナル伝達、転写調節、および細胞周期制御に関連する細胞
プロセスが、嚢胞形成に関係すること、およびＰＫＤの細胞内欠損が、上皮の分
化の調節に直接影響を与えることを意味する（Ｃａｌｖｅｔ，１９９８；Ｔｏｒ
ｒｅｓ，１９９８）。

【０００６】腎臓の嚢胞発生におけるｃ−ｍｙｃの役割および高いｃ−ｍｙｃの発現とＰＫ
Ｄとの間の相互関係が、確立されてきた。ＰＫＤに対する効力の潜在的な治療薬
剤を試験するために、げっ歯類のモデルが、入手できる（Ｃａｌｖｅｔ，１９９
８）。これらのモデルは、天然に存在する変異を利用し、その変異は、ＡＲＰＫ
Ｄ表現型およびＡＤＰＫＤ表現型を付与する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｃｐｋ／ｃｐ
ｋマウスは、ヒトの疾患において観察される腎病理に類似した腎病理を有するヒ
トＡＲＰＫＤのモデルである。

【０００７】この疾患におけるｃ−ｍｙｃの役割に基づいてＰＫＤを処置するアプローチが
、大いに望ましい。合併症を最小限にするために、このアプローチは、ＰＫＤの
症状を調節するのに有効であり、投薬するのに簡単であり、かつ重大な副作用も
ないべきである。

【０００８】（発明の要旨）本発明は、ｃ−ｍｙｃに対してアンチセンスであるモルホリノに基づくオリゴ
マーを投与することによる多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）の処置法を提供すること
によって、先行技術に固有の１つ以上の欠点に取り組み、このオリゴマーは、長
さが８〜４０ヌクレオチドでかつ、非荷電リン含有サブユニット間結合を有する
。

【０００９】１つの実施形態では、上記モルホリノに基づくアンチセンスオリゴマーのサブ
ユニット間結合は、図３Ａ−Ａ〜図３Ｅ−Ｅまでに示されている構造からなる群
より選択され、好ましくは、図３Ｂ−Ｂで示される結合を含み、ここで、Ｘ＝Ｎ
Ｈ₂，Ｙ＝Ｏ，およびＺ＝Ｏである。

【００１０】別の好ましい実施形態では、上記アンチセンスオリゴマーは、１２〜２５塩基
の長さを有し、好ましくは、配列番号１として同定される配列を有する。

【００１１】本発明の方法では、そのアンチセンスオリゴマーは、注射、経皮送達、吸収、
または経口投与によって投与され得、そして、好ましくは、後者である。

【００１２】さらに好ましい局面では、上記被験体は、ヒト被験体であり、上記ｃ−ｍｙｃ
アンチセンスオリゴマーは、被験体においてＰＫＤの検出可能な症状を減少させ
るかまたは、除去するのに効果的な方法で投与される。

【００１３】本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明と一緒
により十分に理解される。

【００１４】（発明の詳細な説明）（Ｉ．定義）本明細書中で使用される場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「
アンチセンスオリゴマー」および「ＡＳＯ」とは、交換可能に使用され、標的配
列とヘテロ二重鎖を形成するためにワトソン−クリック塩基対形成によってその
アンチセンスオリゴマーが標的配列にハイブリダイズするのを可能にするヌクレ
オチド塩基配列およびサブユニット−サブユニット骨格についていう。このオリ
ゴマーは、標的配列に対して正確な配列相補性またはそれに近い相補性を有し得
る。そのようなアンチセンスオリゴマーは、標的配列を含むｍＲＮＡの翻訳をブ
ロックまたは阻害し得、または遺伝子転写を阻害し得、二本鎖配列または一本鎖
配列に結合し得、そしてそれがハイブリダイズする配列に「対している」といわ
れ得る。

【００１５】本発明の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの例示的な構造は、図
２Ａ−Ｅで示されるβモルホリノサブユニット型を含む。ポリマーは、１つより
多くの結合型を含み得ることが理解される。

【００１６】図２Ａのサブユニットは、図３においてＡ−Ａに示される５原子反復ユニット
骨格を形成する１原子リン含有結合を含み、ここでそのモルホリノ環は、１原子
ホスホンアミド結合によって連結される。

【００１７】図２Ｂのサブユニットは、図３Ｂ−Ｂに示されているように、６原子反復ユニ
ット骨格のために設計されている。構造Ｂでは、５’モルホリノ炭素をリン基に
連結させる原子Ｙは、硫黄、窒素、炭素または、好ましくは酸素であり得る。リ
ンから吊り下がるＸ部分は、以下のいずれかであり得る：フッ素；アルキルまた
は置換アルキル；アルコキシまたは置換アルコキシ；チオアルコキシまたは置換
チオアルコキシ；または非置換窒素、一置換窒素、または二置換窒素（環状構造
を含む）。

【００１８】図２Ｃ−Ｅのサブユニットは、図３Ｃ−ＣからＥ−Ｅに示される７原子ユニッ
ト長骨格のために設計されている。構造Ｃでは、Ｘ部分は、構造Ｂにある通りで
あり、そしてＹ部分はメチレン、硫黄、または好ましくは酸素である。構造Ｄで
は、Ｘ部分およびＹ部分は、構造Ｂにある通りである。構造Ｅでは、Ｘは構造Ｂ
の通りであり、そしてＹは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲである。図２Ａ−Ｅに示される
全てのサブユニットでは、Ｚは、ＯまたはＳであり、そしてＰ_iまたはＰ_jは、ア
デニン、シトシン、グアニンまたはウラシルである。本明細書で使用される場合
、「モルホリノオリゴマー」とは、代表的ポリヌクレオチドに水素が結合可能な
塩基を支える骨格を有するポリマー分子をいい、ここで、このポリマーは、ペン
トース糖骨格部分を欠いていて、そしてさらに特異的には、ヌクレオチドおよび
ヌクレオシドに典型的なホスホジエステル結合によって結合されるリボース骨格
を欠いているが、代わりに、その環窒素を介した結合を有する環窒素を含む。好
ましい「モルホリノ」オリゴヌクレオチドは、図２Ｂに示される形態のモルホリ
ノサブユニット構造から構成され、ここで（ｉ）その構造は、１〜３原子長のリ
ン含有結合によって一緒に連結され、１つのサブユニットのモルホリノ窒素が、
隣接したサブユニットの５’環外炭素に連結され、そして（ｉｉ）Ｐ_iおよびＰ_j は、塩基特異的な水素結合によって、ポリヌクレオチドの塩基に結合するのに効
果的なプリンまたはピリミジン塩基対合部分である。

【００１９】本発明のこの好ましい局面は、図３Ｂ−Ｂに例示されており、これは、ホスホ
ロジアミデート結合によって結合される２つのこのようなサブユニットを示して
いる。モルホリノオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴマーを含む）は、例
えば、共有に係る米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号
、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３
１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号、および同第５
，５０６，３３７号に詳細に説明され、それら特許の全ては、本明細書に参考文
献として明確に援用される。

【００２０】本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ耐性の」オリゴマー分子（オリゴ
マー）は、その骨格がホスホジエステル結合のヌクレアーゼ切断に対して感受性
ではないオリゴマーである。例示的なヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴマー
は、オリゴヌクレオチドアナログである（例えば、ホスホロチオネートおよびホ
スフェート−アミンＤＮＡ（ｐｎＤＮＡ）などであり、その両方が荷電骨格を有
し、そしてメチルホスホネート、モルホリノ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）オ
リゴヌクレオチドなどであり、これら全ては、非荷電の骨格を有する）。

【００２１】本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴマ
ーは、そのオリゴマーが生理学的条件下（Ｔｍ的に、実質上３７℃より高く、好
ましくは少なくとも５０℃で、代表的には６０℃〜８０℃またはそれ以上）で、
標的にハイブリダイズするならば、標的オリゴヌクレオチドに「特異的にハイブ
リダイズする」。そのようなハイブリダイゼーションは、好ましくはストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件に対応し、この条件は、規定のイオン強度
およびｐＨでの特定の配列の熱融解温度（Ｔ_[m]）より約１０℃、そして好まし
くは約５℃低く選択される。所定のイオン強度およびｐＨにおいて、Ｔ_[m]は、
標的配列の５０％が、相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度であ
る。

【００２２】ポリヌクレオチドは、２つの一本鎖ポリヌクレオチドの間で、ハイブリダイゼ
ーションが、逆平行構造で起こる場合、互いに「相補的」であると記載される。
二本鎖のポリヌクレオチドは、別のポリペプチドに対して、第一のポリヌクレオ
チドの鎖のうちの１つと第二のポリヌクレオチド鎖との間でハイブリダイゼーシ
ョンが起こり得る場合に、「相補的」であり得る。相補性（１つのポリペプチド
が、別のポリペプチドに対して相補的である度合い）は、一般的に受け入れられ
る塩基対形成規則によって、お互いに水素結合を形成することが予測される相対
する鎖の塩基の比率によって定量化できる。

【００２３】本明細書で使用される場合、オリゴマーについていう用語「アナログ」とは、
参照オリゴマーの構造および化学特性と類似した構造および化学特性の両方を有
する物質を意味する。

【００２４】本明細書で使用される場合、生理学的条件下で、第一の配列であるポリヌクレ
オチド配列が、第二のヌクレオチド配列に特異的に結合するかまたは特異的にハ
イブリダイズする場合、その第一の配列は、その第二の配列に関して、「アンチ
センス配列」である。

【００２５】本明細書中で使用される場合、「標的ＲＮＡを含む塩基特異的細胞内結合事象
」とは、オリゴマーと細胞内の標的ＲＮＡ配列との特異的結合についていう。そ
のような結合の塩基特異性は、配列特異的である。例えば、一本鎖ポリヌクレオ
チドは、配列において相補的である一本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し得
る。

【００２６】本明細書中で使用される場合、「ヌクレアーゼ耐性のヘテロ二重鎖」とは、相
補的な標的へのアンチセンスオリゴマーの結合によって形成されるヘテロ二重鎖
についていい、これは遍在する細胞内および細胞外のヌクレアーゼによる、イン
ビボでの分解に対して耐性である。

【００２７】本明細書中で使用される場合、「ｃ−ｍｙｃ」とは、癌または腫瘍の発生およ
び増殖に細胞を向けるオンコジーンまたは遺伝子についていう。「ｃ−ｍｙｃ」
は、種々の型の癌での遺伝子増幅に関連している。

【００２８】本明細書中で使用されている場合、用語「ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー
」とは、相補的または相補的に近いｃ−ｍｙｃ核酸配列に対して、高い親和性を
有する（すなわち、「特異的にハイブリダイズする」）ヌクレアーゼ耐性アンチ
センスオリゴマーについていう。

【００２９】本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドに関する用語「発現調節」
とは、発現、すなわちＲＮＡの翻訳に干渉することによって、所定のタンパク質
の発現を増加または減少のいずれかをするアンチセンスオリゴマーの能力につい
ていう。タンパク質の発現が減少する場合には、そのアンチセンスオリゴマーは
、所定の遺伝子の発現を直接ブロックし得るか、またはその遺伝子（例えば、ｃ
−ｍｙｃなどのオンコジーン）から転写されるＲＮＡの分解の増加に貢献し得る
。

【００３０】本明細書中で使用される場合、アンチセンスオリゴマーに関する「有効量」ま
たは「薬学的有効量」とは、標的ＲＮＡとアンチセンスオリゴマーとの間のヘテ
ロ二重鎖の形成によって、選択標的配列（例えば、ｃ−ｍｙｃ）のすべてまたは
一部に特異的にハイブリダイズするのに有効である、単用量または一連の用量の
一部のどちらかとして、哺乳動物被験体に投与されるアンチセンスオリゴマーの
量についていう。

【００３１】本明細書中で使用される場合、個体または細胞の「処置」とは、その個体また
は細胞の天然経過を変化させるための、任意の型の介入である。処置は、例えば
、薬学的組成物の投与を含むがそれに限定されず、そして予防治療（ｐｒｏｐｈ
ｙｌａｃｔｉｃｔｈｅｒａｐｙ）、予防治療（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅｔ
ｈｅｒａｐｙ）、または治療療法（病理事象の開始に続いてなされる（例えば、
ＰＫＤの診断））であり得る。

【００３２】本明細書中で使用される場合、用語「ＰＫＤを処置するために伝統的に使用さ
れる組成物」および「ＰＫＤを処置するための伝統的に使用される様式で、被験
体を処置すること」とは、ＰＫＤに罹患すると診断された被験体での治療介入の
ために、一般的に使用されるかまたは当該分野で公知の処置レジメンについてい
う。

【００３３】本明細書中で使用される場合、「ＰＫＤの症状」とは、異常なレベルの尿素窒
素血清（ＳＵＮ）（腎機能の指標）によって例示され；そして／または腎嚢胞の
検出（例えば、超音波、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）または磁気共鳴画像
法（ＭＲＩ）による）によって例示される。

【００３４】（ＩＩ．多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ））多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）は、ヒトの末期の腎疾患の主要な原因である。Ｐ
ＫＤは、回収管の重篤な拡張によって特徴付けられ、そして常染色体優性形質（
ＡＤ）または常染色体劣性（ＡＲ）形質として遺伝され得る。ヒトでは、ＡＤＰ
ＫＤは、ＡＲＰＫＤよりも遅い開始および遅い進行を有しており、通常、ＡＲＰ
ＫＤは、新生児または幼い子供を冒す。ＡＲＰＫＤは、左右の腎臓の拡大の原因
となり得る。新生児期を生き残ったほとんどの個体は、最終的に、腎不全を発症
する。

【００３５】ヒトＡＲＰＫＤ遺伝子は第１６染色体に位置するが、まだクローニングされて
いない。ＰＫＤを罹患しているヒトおよびげっ歯類由来の嚢胞腎において、異常
発現を示す遺伝子の多数は、シグナル伝達、転写調節、および細胞周期制御に関
連する細胞プロセスが、嚢胞形成に関係すること、およびＰＫＤにおける細胞欠
損が、上皮の分化の調節に直接影響を与えることを示唆する（Ｃａｌｖｅｔ，１
９９８；Ｔｏｒｒｅｓ，１９９８）。嚢胞の上皮細胞が上皮増殖因子（ＥＧＦ）
（嚢胞内腔に分泌され、ＥＧＦレセプターを活性化し、増殖の増加をもたらす）
を合成するオートクラインループを含む嚢胞発生のモデルが、提案されている。
ヒトＡＤＰＫＤの腎臓は、ｃ−ｍｙｃｍＲＮＡを過剰発現することが、示され
ている（Ｌａｎｏｉｘら、１９９６）。

【００３６】プロトオンコジーンｃ−ｍｙｃは、ＥＧＦ誘導性の細胞増殖の後に、細胞周期
のＧ１期を短くすることによって増殖を増加させるようにＥＧＦと相乗作用する
と考えられている（ＮａｓｓおよびＤｉｃｋｓｏｎ、１９９８）。

【００３７】トランスジェニックマウスでのｃ−ｍｙｃの過剰発現は、肝ＥＧＦレセプター
の発現の４倍を越える増加の原因となることが示されており、これはＥＧＦレセ
プターシグナル伝達カスケードをより大きく引き起こすとともに増殖は増加する
という仮設と一致している（Ｗｏｉｔａｃｈら、１９９７）。肝細胞の異常増殖
のこの経路は、ヒト嚢胞の上皮（ＥＧＦおよびＥＧＦレセプターの過剰発現が、
嚢胞の並ぶ上皮細胞について記載されている）においても同様であり得る（Ｋｌ
ｉｎｇｅｌら、１９９１）。

【００３８】（Ａ．ＰＫＤのげっ歯類モデル）先天性多発性嚢胞腎（ｃｐｋ）遺伝子変異についてホモ接合性のＣ５７ＢＬ／
６Ｊマウスは、最も広く利用されるＡＲＰＫＤモデルの１つである（Ｇａｔｔｏ
ｎｅ，Ｖ．Ｈ．ら、１９８８）。ｃｐｋ遺伝子は、ヒトＡＲＰＫＤ遺伝子とは類
似していないが、この十分に特徴付けられたマウスモデルでのＰＫＤは、ヒトＡ
ＲＰＫＤと非常に類似したパターンで両側腎嚢胞腎を提示する。集合管嚢胞は、
優勢の病理であり、４〜５週齢までに、正常な実質腎に取って代わって病的な尿
素をもたらす。

【００３９】ｃ−ｍｙｃ遺伝子（マウスの第１５染色体に位置する）は、核局在化、非特異
的ＤＮＡ結合および配列特異的ＤＮＡ結合、およびオリゴマー化において機能す
るドメインを含む６４〜６７ｋＤａのタンパク質をコードする（Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎ，Ｅ．Ｂ．，１９９８）。ｃ−ｍｙｃは、他のタンパク質と二量体化し、ＤＮ
Ａと結合する転写因子として機能する（Ｒｙａｎ，Ｋ．Ｍ．およびＢｉｒｎｉｅ
，Ｇ．Ｄ．，１９９６）。これらのヘテロ二量体ＤＮＡ結合複合体は、多数の遺
伝子の転写の活性化および抑制の両方を行なう（Ｈｏａｎｇ，Ａ．Ｔ．ら、１９
９４）。ｃ−ｍｙｃの発現の増加は、増殖細胞で観察されそして細胞増殖、形質
転換、分化の阻害、そしてアポトーシスを調節する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｂ
．，１９９８；Ｒｙａｎ，Ｋ．Ｍ．およびＢｉｒｎｉｅ，Ｇ．Ｄ．，１９９６）
。

【００４０】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｃｐｋ／ｃｐｋマウスは、腎ｃ−ｍｙｃｍＲＮＡを過剰
発現することが以前に示されている（Ｃｏｗｌｅｙ，Ｂ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，８３９４−８３９８，１９８７；Ｃ
ｏｗｌｅｙ，Ｂ．Ｄ．ら、ＪＡｍＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ，１０４８−１０
５３，１９９１）。ｃ−ｍｙｃｍＲＮＡは、嚢胞性細管および正常なサイズの
細管からのＰＫＤモデルの上皮において、過剰発現される。腎ｃ−ｍｙｃｍＲ
ＮＡはまた、他のげっ歯類（例えばＨａｎ：ＳＰＲＤ−ｃｏｙ／ｃｙラット、Ｃ
Ｄ−１−ｐｃｙ／ｐｃｙマウス、およびＢａｌｂ−ｃ−ｃｐｋ／ｃｐｋマウス）
で、過剰発現される。ｃ−ｍｙｃ導入遺伝子を過剰発現するマウスは、ＰＫＤを
発症し、６週齢〜３か月齢までに、腎不全によって死亡することが観察されてい
る（Ｔｒｕｄｅｌ，Ｍ．ら、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ３９：６６５−６７１，１
９９１；Ｔｒｕｄｅｌ，Ｍ．ら、ＡｍＪＰａｔｈｏｌ１５２：２１９−２
２９，１９９８）。

【００４１】さらに、活性型プロモーターによって駆動される遺伝子の挿入によって、シグ
ナル伝達、細胞周期制御または細胞分化に関連する遺伝子を過剰発現するように
遺伝子操作されているマウスは、ＰＫＤ表現型をしばしば生成する。例えば、ｃ
−ｅｒＢ−２（Ｓｔｏｃｋｌｉｎら、１９９３）、ｃ−ｍｙｃ（Ｂａｒｉｓｏｎ
ｉら、１９９５）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（Ｗａｎｋｅら、１９９１）、
ヒトケラチノサイト成長因子（ｈＫＧＦ）（Ｎｇｕｙｅｎら、１９９６）、Ｈ−
ｒａｓＴ２４（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら、１９９３）、Ｐａｘ−２（Ｄｒｅｓｓｌ
ｅｒら、１９９３）およびＴＧＦ−α（Ｌｏｗｄｅｎら、１９９４）過剰発現は
、マウスにおいて腎嚢胞を生成する。げっ歯類のＰＫＤは、遺伝子的に複雑なよ
うであるが、ｃ−ｍｙｃの発現の調節不全（ｄｉｓｒｇｕｌａｔｉｏｎ）が、Ｐ
ＫＤの病因における主要な因子であると考える理由が存在する。ＡＤＰＫＤは、
ＳＶ４０エンハンサーおよび成体βグロブリンプロモーターによって駆動される
ネズミのｃ−ｍｙｃ遺伝子を有するトランスジェニックマウス（ＳＢＭマウスを
生成する）において、生成された。これらのマウスは、ＰＫＤを発症し、異常な
細胞増殖および嚢胞発生をもたらす腎の管状上皮でのｃ−ｍｙｃの過剰発現によ
って生じるようである腎不全で死亡する（Ｂａｒｉｓｏｎｉら、１９９５）。継
続して繁殖させる過程で、そのようなトランスジェニック系統は、部分的な欠失
および生じ得る導入遺伝子挿入物再配列によって特徴付けられる自然発生的な導
入遺伝子変異を起こすことおよび復帰変異体マウスおよびその子孫は疾患の証拠
がないことが発見されており、ｃ−ｍｙｃの過剰発現は、ＳＢＭマウスのＰＫＤ
表現型に不可欠であることを示唆している（Ｔｒｕｄｅｌら、１９９４）。

【００４２】ＰＫＤに対する可能な治療薬剤を試験するために利用可能なげっ歯類モデルは
、ＡＲＰＫＤ表現型およびＡＤＰＫＤ表現型を付与する天然に存在する変異を利
用する。ＰＫＤに関連したｃ−ｍｙｃの増加は、常染色体劣性すなわち小児性の
ＰＫＤのＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ｃｐｋマウスモデルに由来する腎で最初に発見され
た（Ｃｏｗｌｅｙら、１９８９）。最近、何人かの研究者が、そのｃｐｋ遺伝子
を、他のマウス系統に戻し交配した（Ｇａｔｔｏｎｅら、１９９６）。

【００４３】ｃｐｋ変異を有するＢａｌｂ−ｃモデルは、ヒトＡＲＰＫＤと類似した腎およ
び腎外の病理の両方を有する。このモデルは、腎および腎外の病理に対する処置
の効果の評価を可能とする。ヒトＡＤＰＫＤと類似した、ゆっくりと進行するＰ
ＫＤモデル（この疾患の一般的な方の成体開始形態）は、ラットのＡＤＰＫＤモ
デル（ｃ−ｍｙｃをまた過剰発現するＨａｎ：ＳＰＲＤｃｙ／＋ラット（Ｃｏ
ｗｌｅｙら、１９９３））を含み、それはまた、処置アプローチを評価するため
に広範に使用されている（Ｃｏｗｌｅｙら、１９９７）。

【００４４】（Ｂ．ＰＫＤでのｃ−ｍｙｃの役割）腎ｃ−ｍｙｃｍＲＮＡは、ＰＫＤの多くの動物モデルで過剰発現される（Ｔ
ｒｕｄｅｌ，Ｍ．ら、ＡｍＪＰａｔｈｏｌ１５２：２１９−２２９、１９
９８；Ｇａｔｔｏｎｅ，Ｖ．Ｈ．ら、ＪＬａｂＣｌｉｎＭｅｄ１２７
：２１４−２２２，１９９６）。腎臓ではｃ−ｍｙｃは、アポトーシス（Ｌａｎ
ｏｉｘら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１３：１１５３−１１６０，１９９６；Ｓａｋａ
ｍｕｒｏ，Ｄ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１１：２４１１−２４１８，１９９５；
Ｔｒｕｄｅｌ，Ｍ．ら、ＪＥｘｐＭｅｄ１８（６）１８７３−１８８４，１
９９７；Ｚｈａｎ，Ｙ．ら、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１７：６７５５−６
７６４，１９９７）、および増殖（Ｌａｎｏｉｘら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１３：
１１５３−１１６０，１９９６；Ｚｈａｎ，Ｙ．ら、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏ
ｌ１７：６７５５−６７６４，１９９７）の両方において重要な役割を果たす
。インビトロでは、正常な血清の存在下で、ｃ−ｍｙｃの過剰発現は細胞の増殖
を促進するが、成長因子が存在しない場合、細胞のアポトーシスを生じる（Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｂ．ＡｎｎｕＲｅｖＰｈｙｓｉｏｌ６０，５７５−６
００，１９９８）。従って、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ
Ｏ）処置は、細胞の増殖および／またはアポトーシス（それはＰＫＤの開始およ
び進行に重要な役割を果たすようである。）を減少させる手法として提案されて
きた（Ｇｒａｎｔｈａｍ，ＪＪら、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ３１：１１４５−１１
５２，１９８７；Ｗｏｏ，Ｄ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３３３：１８２５
，１９９５）。

【００４５】Ｔｒｕｄｅｌら、１９９４は、ｐ５３およびｂｃｌ−２ファミリーのメンバー
を含む経路を介するアポトーシスの調節におけるｃ−ｍｙｃの影響をさらに特徴
付けた。ｐ５３およびｂｃｌ−２ファミリーのメンバーは、それぞれアポトーシ
スを誘導し、および阻害する。ＳＢＭ腎組織（それはｃ−ｍｙｃを過剰発現する
）は、顕著に増加した（１０〜１００倍）アポトーシス指標を示したが、コント
ロールの腎組織と比較して、ｂｃｌ−２、ｂａｘ、またはｐ５３の発現における
有意な差異は、全く観察されなかった。ＳＢＭおよびｐ５３（−／−）マウスの
間の連続交配は、ＰＫＤにおける高められた腎細胞アポトーシスが、ｐ５３を介
して起こっていないという直接の証拠を提供した。全てのＳＢＭ子孫は、ｐ５３
の遺伝子型に関わらず、腎上皮アポトーシス指標が少し増加し、ＰＫＤを発症し
た。２重トランスジェニックマウス（ＳＢＢ＋／ＳＢＭ＋）におけるｂｃｌ−２
およびｃ−ｍｙｃの両方の過剰発現が、高いアポトーシス率を有する類似したＰ
ＫＤ表現型を生成することがさらに観察され、このことはｃ−ｍｙｃは、インビ
ボにてｂｃｌ−２を回避し得ることを示し、ＳＢＭマウスのインビボｃ−ｍｙｃ
アポトーシス経路は、ｐ５３およびｂｃｌ−２と独立した機構を介して起こるこ
とを示唆した（Ｔｒｕｄｅｌら、１９９７）。

【００４６】ヒトＡＤＰＫＤは、腎ｃ−ｍｙｃ発現を一貫して１５倍にまで上昇させ、プロ
トオンコジーンの異常発現を示す。高レベルのｃ−ｍｙｃ発現は、嚢胞の上皮に
おける１０〜１００倍に増加した増殖指標と相関関係がある。さらに、ヒトの疾
患では、ｂｃｌ−２のｍＲＮＡの定常レベルが、２０倍にまで増加し、ｂａｘお
よびｐ５３の発現が実質上変化せずに、Ｂｃｌ−２タンパク質は、顕著に増加し
た。けれども、増加したアポトーシスが、ＡＤＰＫＤ腎において観察された。Ｓ
ＢＭマウスにおける研究からの結果はこれらの観察と一致しており、ここで、正
常な腎恒常性に要求される増殖およびアポトーシスは、ＡＤＰＫＤにおいて調節
解除されており、嚢胞発生をもたらす上皮細胞の腎発生プログラムを反復する（
Ｌａｎｏｉｘら、１９９６）。

【００４７】（ＩＩＩ．本発明の方法）本発明は、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスを、被験体に投与する
ことによって、ＰＫＤを処置する方法を提供する。本発明は、ヌクレアーゼ耐性
のオリゴヌクレオチド（相補的なまたは相補的に近いｃ−ｍｙｃ配列に高い親和
性で結合可能）が、被験体に投与され得、有害な副作用なしで、被験体でインビ
ボでのｃ−ｍｙｃの発現を続いて調節し得るという発見に基づいている。患者へ
のｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスの投与後の、毒性の欠損および上
皮増殖の腎特異的な調節は、先行技術に基づいて予想可能ではなかった。

【００４８】この発見の基礎となる機構は、特許請求される発明の一部ではないが、この発
見は、投与されたアンチセンスオリゴマーが、（ｉ）身体中を移動して体細胞に
入り、（ｉｉ）ＲＮＡの標的領域で、ヘテロ２重鎖を形成するように、ｃ−ｍｙ
ｃ配列の相補的または相補的に近い標的領域に、ワトソン−クリック塩基対形成
による高い親和性で結合し、（ｉｉｉ）上皮増殖（例えば、ＰＫＤで観察される
ような）に対するｃ−ｍｙｃ発現の効果を調節することが可能であることを示唆
している。

【００４９】（Ａ．アンチセンスオリゴマー）アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的な配列（例えば、ｍＲＮＡ）に結
合し、そして特異的に核酸の翻訳を妨げ、それにより、遺伝子機能を破壊する（
Ｈａｌｌｅｒ，Ｈ．ら、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ５３：１５５０−１５５８，１
９９８；Ｇｅｗｉｒｔｚ，Ａ．Ｍ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１８：３０５６−３０
６２，１９９９）。多数のヒト臨床試験が、現在進行中であるが（Ａｎｇｒａｗ
ａｌ，Ｓ．およびＺｈａｏ，Ｑ．，ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｈｅｍＢｉｏ２
：５１９−５２８，１９９８）、ＡＳＯによる遺伝子発現の阻害は興味深い（Ｆ
ｌａｎａｇａｎ，Ｗ．Ｍ．，ＣａｎｃｅｒＭｅｔａｓｔａｓｉｓＲｅｖ１
７：１６９−１７６，１９９８）。不十分な特異性、非効果的な送達、不安定性
、および細胞における予想不可能な活性は、ＡＳＯ技術を含む処置に関連した問
題のうちの一部である（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．およびＷｅｌｌｅｒＤ．，
ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ７：１８７
−１９５，１９９７）。

【００５０】ｃ−ｍｙｃＡＳＯは、ｃ−ｍｙｃ誘導性の腎上皮細胞の増殖（Ｋｏｕｌ，Ｈ
．ら、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ５０：１５２５−１５３０，１９９６）およびイ
ンビトロでの慢性骨髄性白血病細胞の増殖（Ｓｋｏｒｓｋｉ，Ｔ．ら、Ｂｌｏｏ
ｄ８８：１００５−１０１２，１９９６）を効果的に阻害することが示されて
いる。インビボでは、創傷した動脈における新しい内膜の増殖もまた、ｃ−ｍｙ
ｃＡＳＯ処置によって実証された（Ｏｂｅｒｂａｕｅｒ，Ｒ．ら、Ｋｉｄｎｅ
ｙＢｌｏｏｄＰｒｅｓｓＲｅｓ１９：２２１−２２４，１９９６）。

【００５１】アンチセンス技術は、最近、腎状況に適用されてきた：ＩＣＡＭ−１ＡＳＯ
で処理されたラットは、無酸素再灌流障害後の、腎炎症の減少および腎機能の改
善を示した（Ｈａｌｌｅｒ，Ｈ．ら、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ５３：１５５０−
１５５８，１９９８）。腎の近位細管細胞は、それらを分解すること無く循環中
のオリゴヌクレオチドを効率的に取り込む能力を有することがまた実証された（
Ｒａｐｐａｐｏｒｔ，Ｊ．ら、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ４７：１４６２−１４６
９，１９９５）。

【００５２】アンチセンスオリゴヌクレオチドは、構造的ＤＮＡ模倣物として開発され（Ｎ
ｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．，ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｐｈｙｓＢｉｏｍｏｌ
Ｓｔｒｕｃｔ２４：１６７−１８３，１９９５）、それはインビトロで、配列
特異的な遺伝子阻害可能である（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎ
ｓｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ７：６３−７０，１９９
７；Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｆ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ９：６７２−６８１，１９９
７；Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｆ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ
８：１９９−２０５，１９９８）。これらのＡＳＯは、それらに中性電荷、高
い水溶性（Ｓｕｍｍｅｔｒｏｎ，Ｊ．およびＷｅｌｌｅｒ，Ｄ．，Ａｎｔｉｓｅ
ｎｓｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ７：１８７−１９５，
１９９７）、およびヌクレアーゼ耐性（Ｗａｇｅｓ，Ｊ．Ｍ．ら、ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ２３：１１１６−１１２１，１９９７）を付与するモルホリノ
骨格を有している。

【００５３】本発明の方法におけるアンチセンスオリゴマーの使用は以下を含む、好ましく
は１つ以上の特性を有する：（１）非荷電の骨格（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎら、
１９９０）、（２）高い親和性で、すなわち、３７℃より実質的に高いＴｍで、
標的ＲＮＡの相補的な配列とハイブリダイズする能力（３）少なくとも８塩基、
概して、約８〜４０塩基であり、好ましくは１２〜２５塩基長のサブユニットで
ある、そして、（４）ヌクレアーゼ耐性（Ｈｕｄｚｉａｋら、１９９６）。

【００５４】本発明の方法において、有用性を発見し得るヌクレアーゼ耐性アンチセンスオ
リゴマーは、オリゴヌクレオチドアナログ（例えば、モルホリノ、メチルホスホ
ネートおよびペプチドオリゴヌクレオチド）であり、非荷電の骨格を有する（例
えば、Ｕｈｌｍａｎｎら、１９９０を参照のこと）。

【００５５】好ましいアンチセンスオリゴマーは、非荷電骨格を有するヌクレアーゼ耐性オ
リゴマーであり、そして特に、選択されたＲＮＡ標的配列の領域に相補的な塩基
配列に加えて、オリゴマー骨格（オリゴマーサブユニットおよび結合によって定
義され、標的ＲＮＡおよびオリゴマーにおける相補的な塩基間のワトソン−クリ
ック塩基対形成によって、標的ＲＮＡ配列にそのオリゴマーが結合するのを可能
とする）を有するモルホリノオリゴマーである。モルホリノオリゴマーの合成、
構造、および結合特徴は、上記に引用された米国特許第５，６９８，６８５号、
同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０
６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、および同第５，
５０６，３３７号に詳細に説明されており、それら特許の全ては本明細書中に参
考文献として援用される。二本鎖のＤＮＡは、アンチセンス分子によって標的化
され得るが、概して、本発明のアンチセンス法を使用する遺伝子発現の調節のた
めの標的は、ｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡ翻訳開始コドンに広がる配列を含む。しかし
、いくつかの場合では、ｃ−ｍｙｃｍＲＮＡの他の領域が標的化され得、それ
は、１つ以上のイニシエーター部位またはプロモーター部位、イントロンまたは
エクソン結合部位、３’非翻訳領域、および５’非翻訳領域を含む。さらに、ス
プライシングされたＲＮＡおよびスプライシングされていないＲＮＡの両方が、
本発明の方法での使用のためのアンチセンスオリゴマーの設計の鋳型として作用
し得る。

【００５６】本発明の方法では、アンチセンスオリゴマーは、３７℃より実質的に大きい（
例えば、少なくとも５０℃そして好ましくは６０℃〜８０℃の）Ｔｍ値を有し、
生理学的条件下で、ｃ−ｍｙｃ核酸配列の領域にハイブリダイズするように設計
されている。そのオリゴマーは、核酸に対して高い結合親和性を有するように設
計されており、そしてｃ−ｍｙｃ標的配列に対して１００％相補的であり得、ま
たはオリゴマーとｃ−ｍｙｃ標的配列との間で形成されるヘテロ二重鎖が、それ
の細胞から体液への移行中に、細胞のヌクレアーゼ作用および他の分解様式に耐
えるために十分安定している限り、ミスマッチを（例えば、対立遺伝子変異体に
適応するために）含み得る。ミスマッチは、存在するとしても、中間領域よりも
、末端領域のハイブリッド二重鎖の末端領域に向ってより不安定化しない。十分
に理解された二重鎖安定の原理によると、許されるミスマッチの数は、オリゴマ
ーの長さ、二重鎖中のＧ：Ｃ塩基対の割合および二重鎖中のミスマッチの位置に
依存している。

【００５７】１５〜２０塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、哺乳動物ゲノムにおけ
る１つの相補的な配列を有するのに、通常は十分に長い。さらに、少なくとも長
さ１７ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス化合物は、それらの標的ｍＲＮ
Ａと十分にハイブリダイズする（Ｃｏｈｅｎら、１９９１）。

【００５８】そのようなアンチセンスオリゴマーは、ｃ−ｍｙｃ標的配列に対して必ずしも
１００％相補的であるとは限らないが、ｃ−ｍｙｃの発現が調節されるように安
定してそして特異的に標的配列に結合することは効果的であることが、理解され
る。適切な特異性と組み合わせて、安定した、効果的な結合を可能とするオリゴ
マーの適切な長さは、約８〜４０ヌクレオチド塩基単位であり、そして好ましく
は、約１２〜２５ヌクレオチドである。標的塩基との縮重塩基対形成を可能とす
るオリゴマー塩基もまた、企図されており、標的との塩基対特異性が維持される
と想定される。

【００５９】急性および慢性的な細胞毒性について、周知の方法（例えば、³Ｈ−ロイシン
および³Ｈ−チミジンの取り込みによってそれぞれ測定される、タンパク質およ
びＤＮＡ合成に対する効果）によって、候補アンチセンスオリゴマーは、評価さ
れる。さらに、候補アンチセンスオリゴマーの結合特異性を確かめるために、種
々のコントロールオリゴヌクレオチド（例えば、センス配列、非センス配列また
はスクランブルアンチセンス配列、あるいはミスマッチ塩基を含む配列）が、評
価され得る。そのような試験の結果は、無差別の抑制から遺伝子発現のアンチセ
ンス阻害の特異的効果を区別するために重要である（例えば、Ｂｅｎｎｅｔら、
１９９５を参照のこと）。従って、非標的配列へのアンチセンスオリゴマーの非
特異的結合を制限するために、配列は必要に応じて改変され得る。

【００６０】概して、非標的配列へのオリゴマー分子の非特異的結合は、制限されることが
望ましい。そのようなオリゴマーのいくつかの非配列特異的な相互作用は、治療
効果を示し得るが（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ら、１９９６）、その
ような相互作用は、しばしば不必要な副作用を生じる。非特異的結合について試
験するために、コントロール配列（例えば、センス配列または非センス配列）、
またはミスマッチ塩基を含む配列が、予備スクリーニング試験（インビトロ）に
含まれ得る。過剰な標的タンパク質またはｍＲＮＡもまた、アンチセンスオリゴ
マーの効果が逆転するかどうかを確かめるために、細胞培養に加えられ得る（Ｂ
ｅｎｎｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．ら、１９９５）。

【００６１】さらなる配列が、１つ以上の所望の標的配列を考慮している、当業者によって
調製され得、当業者によって慣例的に使用される方法よって、スクリーニングは
実施される。

【００６２】標的ＲＮＡとヘテロ二重鎖を形成する際の、所定のオリゴマー分子の有効性は
、当該分野で公知のスクリーニング法によって決定され得る。例えば、オリゴマ
ーは、インビトロで、ｃ−ｍｙｃを発現する細胞とともにインキュベートされ、
そして、当業者に公知の手順を使用して、ヘテロ二重鎖の存在または不在が検出
されるか、あるいは標準的技術（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッテ
ィングなど）によって、コードされたタンパク質の存在または不在を決定される
（例えば、Ｐａｒｉ，Ｇ．Ｓ．ら、１９９５；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ら、
１９９６参照のこと）。非標的配列へのオリゴマー分子の非特異的結合は、制限
されることが一般的に所望される。

【００６３】上記記載のように、アンチセンスオリゴマーは、その標的配列に対し高い親和
性を有するべきである。これに関して、モルホリノオリゴマー（例えば、以下に
説明される）は、特にＲＮＡ標的に対して、優れた標的結合親和性を生じる。そ
れらはまた、ヌクレアーゼによる分解に対して、高度に耐性である（Ｈｕｄｚｉ
ａｋ，Ｒ．Ｍ．ら、１９９７）。これらの化合物は、図２Ａ〜Ｅおよび図３ＡＡ
〜ＥＥおよび上記に引用した特許に示されている形態のモルホリノサブユニット
構造から構成され、ここで、（ｉ）モルホリノ基は、好ましくは非荷電結合（１
〜３原子長）によって、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接したサブユ
ニットの５’環外炭素に結合されて、一緒に連結され、そして（ｉｉ）モルホリ
ノ基に結合した塩基は、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩
基に結合するのに有効なプリンまたはピリミジン塩基対形成部分である。このプ
リンまたはピリミジン塩基対形成部分は、代表的には、アデニン、シトシン、グ
アニン、ウラシルまたはチミンである。そのようなオリゴマーの調製は、米国特
許第５，１８５，４４４号（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ，１９９３
）に詳細に説明されており、この特許は本明細書にその全体が参考文献として援
用される。この参考文献に示されているように、いくつかの非イオン結合が、モ
ルホリノ骨格を構築するために使用され得る。

【００６４】メッセンジャーＲＮＡ配列の標的化が好ましいが、二本鎖ＤＮＡは、二重鎖Ｄ
ＮＡの主溝配位に配列特異的に結合するように設計された非イオンプローブを使
用して、標的化され得る。そのようなプローブ型は、米国特許第５，１６６，３
１５号（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ，１９９２）（本明細書中に参
考文献として援用される）に詳細に説明されており、そしてまた、一般的に本明
細書中でアンチセンスオリゴマーと呼ばれ、さらに標的遺伝子の発現を阻害する
能力についていう。

【００６５】モルホリノオリゴマーは、安定した、非荷電の骨格結合によるポリマーの形態
で結合され得、そして相補的な塩基の標的核酸（標的ＲＮＡを含む）と高い親和
性で、ハイブリダイズし得る。この特性の組み合わせ（それぞれのモルホリノサ
ブユニットの環窒素を介するサブユニット結合に関する）は、天然のポリヌクレ
オチドでも、または種々の荷電結合もしくは非荷電結合を含むポリヌクレオチド
でも、または天然に存在するヌクレオチドの「１つ以上の」アナログを含むポリ
ヌクレオチドでも、見い出されない。

【００６６】本発明の方法での使用に好ましいアンチセンスオリゴマーは、５’−ＡＣＧ
ＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＣＧＴＣＧＣ−３’として提示された配列を
有する（オリゴヌクレオチド１−２２−１２６；配列番号１）。

【００６７】（Ｂ．アンチセンスオリゴマーのインビボ投与）標的ＲＮＡへのアンチセンスオリゴマーの効果的な送達は、本発明の方法の重
要な側面である。本発明に従って、アンチセンスオリゴマーの送達のそのような
経路は、種々の全身経路（経口経路および非経口的な経路（例えば、静脈内、皮
下、腹腔内、および筋内）および吸入および経皮送達を含む）を含むがそれに限
定されない。

【００６８】ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーを標的細胞に送達するため、または薬物を
血流に導入するために効果的な任意の方法が企図されていることが理解される。

【００６９】アンチセンスオリゴマーの経皮送達は、例えば、局所投与に適合された薬学的
に受容可能なキャリアの使用によって、達成され得る。モルホリノオリゴマー送
達の１つの例は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／４０８５４に記載されており、この
出願は、本明細書中に参考文献として援用される。

【００７０】１つの好ましい実施形態では、オリゴマーは、モリホルノオリゴマーであり、
薬学的に受容可能なキャリアに含まれて、そして経口送達される。この実施形態
のさらなる局面では、モルホリノｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドは
、短い期間定期的に（例えば、２週間以下に毎日）投与される。しかし、いくつ
かの場合では、アンチセンスオリゴマーは、より長い期間にわたって断続的に投
与される。

【００７１】代表的には、単用量以上のアンチセンスオリゴマーが、一般的に約１〜２週間
の期間定期的に投与される。経口投与に好ましい用量は、約１ｍｇオリゴマー／
患者〜約２５ｍｇオリゴマー／患者である（成体体重７０ｋｇに基づく）。いく
つかの場合では、２５ｍｇオリゴマー／患者より多い用量が必要であり得る。Ｉ
Ｖ投与においては、好ましい用量は、約０．５ｍｇオリゴマー／患者〜１０ｍｇ
オリゴマー／患者である（成体体重７０ｋｇに基づく）。

【００７２】アンチセンス化合物は、少なくとも２００〜４００ｎＭのｃ−ｍｙｃアンチセ
ンスオリゴマーの最高血中濃度を生じるのに十分な量で一般的に投与される。

【００７３】概して、本方法は、被験体に、適切な薬学的キャリアで、腎臓のインビボｃ−
ｍｙｃ核酸配列の発現を阻害するのに有効なアンチセンス薬剤の量を投与するこ
とを含む。

【００７４】アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、生理学的に受容可能な任意の便利
なビヒクルにて投与され得る。そのようなオリゴヌクレオチド組成物は、当業者
によって使用される標準的な生理学的に受容可能な任意の種類のキャリアを含み
得る。そのような薬学的キャリアの例は、生理食塩水、リン酸緩衝化食塩水（Ｐ
ＢＳ）、水、水性エタノール、エマルジョン（例えば、水／油エマルジョン、ト
リグリセリドエマルジョン）、湿潤剤、錠剤およびカプセルを含むがそれに限定
されない。適切な生理学的に受容可能なキャリアの選択は、選択される投与方法
によって、変化することが理解される。

【００７５】いくつかの場合において、リポソームが、細胞へのアンチセンスオリゴヌクレ
オチドの取り込みを容易にするために使用され得る（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ
，１９９６；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、１９９４；Ｕｈｌｍａｎｎら、１９９
０；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９７９を参照のこと）。ヒドロゲルもまた、ア
ンチセンスオリゴマー投与のためのビヒクルとして使用され得る（例えば、ＷＯ
９３／０１２８６に記載されている）。あるいは、オリゴヌクレオチドは、微粒
子または微小粒子にして投与され得る（例えば、ＷｕおよびＷｕ，１９８７を参
照のこと）。

【００７６】徐放性組成物もまた、本願の範囲内で企図されている。これらは、フィルムま
たはミクロカプセルのような形の物品の形態で、半透性のポリマーマトリックス
を含み得る。

【００７７】本方法の好ましい適用においては、被験体は、ＰＫＤに罹患していると以前に
診断されたか、またはＰＫＤを発症する危険があると以前に診断された、ヒト被
験体である。

【００７８】本発明の方法での使用のためのｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドの
インビボで有効な用量は、投与の頻度および経路ならびに処置下の被験体の状態
によって変化することが理解される。従って、そのようなインビボ治療は、最適
な治療結果を達成するために、処置される条態に適切な試験によるモニタリング
、および用量または処置レジメンの対応する調節を一般的に必要とする。

【００７９】ＰＫＤを処置するためのｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は
、さらなる治療の介入の後に、同時に、および／または前に、例えば、ＰＫＤを
処置するために当業者によって代表的に使用される治療アプローチを使用して、
使用され得ることがさらに理解される。

【００８０】（Ｃ．処置のモニタリング）本明細書に記載された方法を含む所定の治療レジメンの効力は、以下の１つ以
上によってモニタリングされ得る：（１）腎臓の状態を評価するために、腎細胞
または腎組織切片を染色することによる、組織学または免疫組織学（例えば、ｃ
−ｍｙｃに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いる）；（
２）ｃ−ｍｙｃまたは別のｍＲＮＡの転写を定量化するためのＲＮＡ分析（例え
ば、ドットブロット、ノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメ
ラーゼ連鎖反応による））；（３）インサイチュハイブリダイゼーション（例え
ば、ｃ−ｍｙｃをプローブとして使用する）；（４）ウエスタンブロット分析；
（５）全体重、全腎重および体重の割合としての腎重量の決定；（６）腎機能の
指標としての血清尿素窒素（ＳＵＮ）の決定；（７）ヘマトクリット；および（
８）嚢胞の検出（例えば、超音波、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、または
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）による）。そのような方法の多数の例は、当該分野で
一般的な公知であり、そのいくつかはさらに以下で記載される。

【００８１】アンチセンスオリゴマー処置レジメンは、上記記載のような種々のアッセイの
結果に基づいて、示されるように、調整され得る（用量、頻度、経路など）。

【００８２】ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置に関連したさらなる情報
は、以下の１つ以上から獲得し得る：（１）種々の組織での抽出およびｃ−ｍｙ
ｃＡＳＯレベルの分析；（２）上皮増殖因子（ＥＧＦ）発現（代表的に正常な
腎において高度に発現され、その発現は嚢胞腎において、有意減少する）の決定
；（３）ＳＧＰ−２（未成熟な集合管のマーカーの発現／正常な腎に対して、代
表的に嚢胞で過剰発現される）の評価；そして（４）腎増殖細胞核抗原（ＰＣＮ
Ａ）（細胞増殖のマーカー）の発現の評価。

【００８３】以下の実施例は、本発明を例証するが、いかなる方法においても制限すること
は意図されない。

【００８４】（材料および方法）（免疫組織学）ｃ−ｍｙｃＡＳＯで処理した正常なマウスおよび嚢胞性のマウス由来の腎臓
のパラフィン切片および未処理の正常なマウスおよび嚢胞性のマウスが、ｃ−ｍ
ｙｃの免疫組織化学によって分析され得る。代表的には、２０日齢のマウスが、
そのような分析に使用される。１つの例示的な方法は、以下の工程を含む：腎切
片を調製し、次いで内因性のペルオキシダーゼ活性を、メタノールペルオキシド
でクエンチし、そして組織切片を正常なヤギのブロッキング血清で処理する。腎
切片を次いで、４℃で１８時間、１：２５に希釈したヒトｃ−ｍｙｃに対するウ
サギポリクローナル抗体とともに（カタログ＃ｓｃ−７６４、ａＳａｎｔａ
ＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，Ｃ
Ａ）インキュベートする。結合抗体は、色原体としてニッケル増幅ＤＡＢを用い
て、アビジンビオチン複合体法（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂ
ｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用して可視化する。ネガティブコントロールの
切片は、一次抗体の代わりに正常なウサギ血清を使用して、同一の方法で処理す
る。

【００８５】（ＲＮＡの単離およびノーザンハイブリダイゼーション）ＲＮＡは、当該分野で公知の多数の方法のいずれかを使用して、正常なマウス
および嚢胞性のマウス、ならびにｃ−ｍｙｃＡＳＯおよびスクランブルオリゴ
ヌクレオチドで処置した正常なマウスおよび嚢胞性のマウスの腎臓から抽出しお
よび精製し得る。代表的には２０日齢のマウスが、そのような分析に使用される
。

【００８６】１つのアプローチにおいては、酸グアニジウムチオシアネート−フェノール−
クロロホルム抽出法が使用される。手短には、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａ
ｔｉ，ＯＨ）中で、凍結された腎臓をホモジナイズし、そして製造者の指示書に
従って、ＲＮＡを単離する。このＲＮＡを、１％アガロース／ホルムアミドゲル
中で、それぞれのレーンに、１０μｇの総腎ＲＮＡを含んで、電気泳動によって
分画する。ＲＮＡは、次いで一晩Ｚｅｔａｂｉｎｄメンブレン（Ｃｕｎｏ，Ｉｎ
ｃ．，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）に転写し、そしてメチレンブルーで染色し、それ
ぞれのレーンのＲＮＡの量が均等であるかを確かめる。このメンブレンを、次い
でベーキングし（８０℃で２時間）、そしてチャーチ緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡ
を含む０．５％リン酸ナトリウム中の１％ＢＳＡおよび７％ＳＤＳ）中で、³²Ｐ
標識のｃＤＮＡプローブ（ランダムプライムラベリング法、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ
ＩＩ，ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ａｒｌｉｎ
ｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いて、６５℃で一晩ハイブリダイズする
。ハイブリダイズしたノーザンブロットを、６５℃で各１０分間洗浄する；洗浄
緩衝液Ａで２回（４０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１ｍＭＥＤＴＡ中の０．５
％ＢＳＡおよび５％ＳＤＳ）、そして洗浄緩衝液Ｂで４回（４０ｍＭリン酸ナト
リウム中および１ｍＭＥＤＴＡの１％ＳＤＳ）。オートラジオグラフィーを、
ｍＲＮＡの相対的な発現を可視化するために使用する。特定のｍＲＮＡを、オー
トラジオグラフのデンシトメトリーを使用して定量化し得る。ノーザンブロット
ハイブリダイゼーション研究は、異なったセットのＲＮＡを用いて一般的に２連
で行なう。

【００８７】（ウエスタンブロット分析）正常なマウスおよび嚢胞性マウス、ならびにｃ−ｍｙｃＡＳＯ処置およびス
クランブルオリゴヌクレオチドで処置した正常なマウスおよび嚢胞性のマウスの
腎臓由来のタンパク質はまた、当該分野で公知の多数の方法のいずれかを使用し
て分析し得る。

【００８８】１つの例示的なアプローチでは、ｃ−ｍｙｃＡＳＯで処置および未処置のＣ
５７ＢＬ／６Ｊ−ｃｐｋ／ｃｐｋマウスから新鮮な腎臓を、２１日目に取り出し
、そして直ぐにプロテアーゼインヒビター（カタログ＃１８３６１７０、Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含
む放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（１×ＰＢＳ、１％Ｎｏｎｉｄｅ
ｔＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．２％ＳＤＳ）中でホモジナイズす
る標準技術を使用してタンパク質を単離し、ウェスタンブロット分析用に処理す
る。タンパク質サンプルは、次いで６％ＳＤＳ／アクリルアミドスタッキングゲ
ルを用いて、１２．５％ＳＤＳ／アクリルアミドゲル上で３３ｍＡで１４時間分
画した。このゲルを転写緩衝液（１９２ｍＭグリシン、２５ｍＭＴｒｉｓｂａ
ｓｅ、および１０％メタノール、ｐＨ８．３）中で２０分間浸漬し、Ｉｍｍｏｂ
ｉｌｏｎ−Ｐ転写メンブレン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，
Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，８０ボルト８０分間）に転写する。このメンブレンを短
くメタノールに浸漬し、そして４０℃で乾燥し、次いでメタノールで簡単に脱水
し、洗浄緩衝液（０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）でリンスして、ブロッ
キング緩衝液（ＰＢＳ，０．３％Ｔｗｅｅｎ２０および３％粉末ミルク）中で、
３０分間インキュベートする。メンブレンを次いで、ブロッキング緩衝液中でそ
れぞれ１：５００に希釈した、以下に対する一次抗体とともに１時間インキュベ
ートする：ｃ−ｍｙｃ（カタログ＃ｓｃ−７６４、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ）、グルココ
ルチコイドレセプター（カタログ＃ｓｃ−１００４、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ）、または
増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ；カタログ＃ｓｃ−７９０７、ＳａｎｔａＣｒｕｚ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ）。メ
ンブレンは洗浄緩衝液で５分間３回洗浄し、そして適切なホースラディッシュペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体とともに３０分間インキュベートする。
メンブレンを洗浄緩衝液で再びリンスし、ＥＣＬ検出剤（ＰｒｏｍｅｇａＣｏ
ｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）とともにインキュベートし、ＫｏｄａｋＢｉ
ｏＭａｘフィルムを使用して、オートラジオグラフィーを行なう。

【００８９】（腎ｃ−ｍｙｃＡＳＯの抽出および分析）標的組織中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの量もまた、分析され得る。分
析の１つの例示的な方法において、内部標準オリゴヌクレオチド５００ｎｇまた
はその配列がｃ−ｍｙｃＡＳＯの５’の切断に由来する１５マーのホスホロジ
アミデートモルホリノオリゴマーを、ＲＩＰＡ緩衝液中で調製された腎溶解液の
５００μｌアリコートと混合する。等容量のエタノールを加え、生じる沈殿を１
０分間遠心分離する。上清を回収し、ペレットを１００μｌの０．０２５ＭＴ
ｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄し、再び遠心分離する。生じる上清を集収
し、７０℃で、１０分間加熱し、再び遠心分離する。上清を、１００μｌの０．
０２５ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた後、凍結乾燥する。生じる
粘性油性残渣を、１００μｌの５’フルオレセイン標識ＤＮＡ（ＦＤＮＡ、Ｈｙ
ｂｒｉｄｏｎ，Ｉｎｃ．，ＭＡ）溶液で再構成する（１００μｌの０．０２５Ｍ
Ｔｒｉｓ緩衝液中ＯＤ値０．２）。ＦＤＮＡは、ｃ−ｍｙｃＡＳＯの配列に
対して相補的な配列を有しており、そして安定した二重鎖を生じる。サンプル全
体は、注入され、ＨＰＬＣ（ＲａｉｎｉｎＡｌ−２００自動サンプリング機に
接続したＶａｒｉａｎ９０１０ＨＰＬＣｐｕｍｐ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，
ＣＡ，およびＤＮＡＰａｃＰＡ−１００陰イオン交換カラム、Ｄｉｏｎｅｘ
Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡに接続したＶａｒｉａｎ９０７５蛍光検
出機）によって分析する。

【００９０】移動相Ａとしての０．０２５ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）および移動
相Ｂとしての０．０２５ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）／１ＭＮａＣｌ
からなる２成分のグラジエント（０分で１０％のＢ〜２０分で４５％のＢ）は、
クロマトグラフィー分離を達成するために使用される。フルオレセイン励起およ
び発光波長は、４９４ｎｍおよび５１８ｎｍにそれぞれ設定されている。腎溶解
サンプルに存在するｃ−ｍｙｃＡＳＯ量は、次いでインターナルスタンダード
を含む一連のｃ−ｍｙｃＡＳＯスタンダードを流すことによって得られる標準
曲線使用して決定し得る。

【００９１】統計分析。血清尿素窒素、総体重、体重の割合としての腎重量、およびヘマト
クリットの統計的分析を、ＭＩＮＩＴＡＢソフトウェア（ＳｔａｔｅＣｏｌｌ
ｅｇｅ，ＰＡ）を用いて、分散分析（ＡＮＯＶＡ）（ｐ＜０．０５）を使用して
、行なう。データは平均値±ＳＥＭとして示される。

【００９２】（実施例１）ＰＫＤに対するｃ−ｍｙｃｍＲＮＡ発現の関係を評価するために、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６Ｊ−ｃｐｋ／ｃｐｋマウスを、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドで処置した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｃｐｋ／ｃｐｋマウス（ＪａｃｋｓｏｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥから元々入手したストック由
来、ＫＵＭＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ）をコントロール／正常（＋／＋ま
たはｃｐｋ／＋）マウスおよび嚢胞性（ｃｐｋ／ｃｐｋ）マウスを生成するよう
に交配させた。ｃｐｋ／ｃｐｋマウスおよびコントロールマウスを用量４．３ナ
ノモル（３０μｇ／マウス／日）で、ｃ−ｍｙｃに対するモルホリノオリゴマー
アンチセンスで、出生後７〜２０日の間に腹腔内に（ＩＰ）注射して処置した。

【００９３】何匹かのマウスは、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）のより高い
（１４．３ｎＭ；１００μｇ）または低い（１．４ｎＭ；１０μｇ）投薬量で処
置した。このｃ−ｍｙｃＡＳＯは、５’−ＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣ
ＡＴＣＧＴＣＧＣ−３’（オリゴヌクレオチド１−２２−１２６；配列番号
１）として示されるヌクレオチド配列を有するモルホリノ骨格を有していた。コ
ントロールとして、マウスに、擬似注射するか、または５’−ＡＣＴＧＴＧ
ＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＴＧＣ−３’（オリゴヌクレオチド１−２２−
１４４；配列番号２）として示されるヌクレオチド配列を有するスクランブルＡ
ＳＯの等量を付与するかのいずれかを行った。これらのマウスは、最後の注射の
４時間後、屠殺した。コントロール、スクランブルおよびｃ−ｍｙｃＡＳＯで
処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ｃｐｋマウスに、２０日齢で、麻酔し（６５ｍｇ／
ｋｇペントバルビタールナトリウム、ＩＰ）そして屠殺した。

【００９４】総体重、総腎重量および体重の割合としての腎重量を決定した。血液を心臓よ
り収集し、ヘマトクリットを測定し、そして腎機能を評価するために血清を使用
した。血清尿素窒素（ＳＵＮ）は、比色定量アッセイを利用して決定した（Ｓｉ
ｇｍａ＃６４０，ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ）。表１および図１Ａ〜Ｄは、体重（ＢＷ）の割合（％）としての腎重量；
血清尿素窒素（ＳＵＮ）（ｍｇ／ｄｌ）；総体重（ｇ）；およびヘマトクリット
として報告されているこれらの分析の結果を示す。

【００９５】（表１．アンチセンスｃ−ｍｙｃで処置した嚢胞性マウスおよび正常マウスな
らびに未処置の嚢胞性マウスおよび正常マウスの比較）

【００９６】

【表１】 ¹＊アンチセンス処置での差異についてｐ＜０．０５ ² ＊＊＝正常との差異についてのｐ＜０．０５ｃ−ｍｙｃＡＳ処置は、図１Ａに示されているように、腎臓の肥大の度合い
を有意減少させ（コントロールマウスにおいて２１．６８±１．８８％に対して
１１．９１±０．４５％、ｐ＜０．０５）そして図１Ｂに示されるように、腎機
能の低下を阻害した（コントロール嚢胞性マウスにおいて６２．４±６．８０ｍ
ｇ／ｄＩに対して３８．４２±３．２０ｍｇ／ｄＩ、ｐ＜０．０５）。腎機能は
、減少したＳＵＮによって示されるように、処置された嚢胞性マウスにおいて改
善した。このｃ−ｍｙｃアンチセンス処置は、総体重またはヘモクリットに対し
て効果も有さず、高度に増殖する過程（例えば、増殖および造血）には有害な影
響を与えないことを示した（それぞれ図１Ｃおよび図１Ｄ）。

【００９７】さらにマウスを分析するために、左腎を取り出し、体重を測定し、液体窒素中
で急速に凍結し、そしてＲＮＡの単離の処理まで、−８０℃で貯蔵した。この動
物は次いで、左心室を通して０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒ
ドで、灌流固定した。右腎は、パラフィン包埋のために処理し、そして、切片を
過ヨウ素酸シッフ反応で染色するか、またはｃ−ｍｙｃについて免疫染色した。

【００９８】腎切片の顕微鏡分析は、ＡＳＯ処置は、腎の肥大を遅らせたが、ＡＳＯ処置し
たＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ｃｐｋ腎はなお有意な嚢胞病理を示し、これに対して、ｃ
−ｍｙｃＡＳＯ処置の後に、正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、腎変化
は見られないことを示した（データは示されていない）。

【００９９】ノーザンブロット解析は、ｃ−ｍｙｃｍＲＮＡは、嚢胞性腎において過剰発
現されること、および過剰発現は、ｃ−ｍｙｃＡＳＯ処置によって変化されな
いことを示した。しかし、ＡＳＯ処置したマウス由来の腎におけるの検出可能な
ｃ−ｍｙｃタンパク質の減少した量により示されるように、ＡＳＯ処置は、ｃ−
ｍｙｃタンパク質発現を阻害した（ウエスタンブロット分析により約５９％の減
少）。

【０１００】ノーザンブロット解析はまた、ＥＧＦｍＲＮＡが、正常な腎で高度に発現さ
れることを示したが、嚢胞性腎では、減少する。ｃ−ｍｙｃＡＳＯ処置後、Ｅ
ＧＦｍＲＮＡの発現は、嚢胞性腎において、１２倍近く増加した。ＳＧＰ−２
（未成熟な集合組織管において典型的に発現されるマーカー）のｍＲＮＡは、正
常の腎に比べて嚢胞性腎で過剰発現されたが、ｃ−ｍｙｃＡＳＯ処置後では、
約４０％減少した。増加したＥＧＦｍＲＮＡ発現および減少したＳＧＰ−２
ｍＲＮＡ発現は、ｃ−ｍｙｃＡＳＯ処置が、それぞれ遠位尿細管および集合管
の増加した成熟をもたらしたことを示している。ヒストンＨ４（増加した細胞増
殖に関連したマーカー）のｍＲＮＡは、正常な腎に比べて嚢胞性腎で、過剰発現
されたが、ｃ−ｍｙｃＡＳＯ処置は、嚢胞性腎のヒストンＨ４メッセージレベ
ルを有意には減少させなかった。しかし、ＡＳＯ処置は、ＰＣＮＡ（細胞増殖の
マーカー）の３０％減少に関連していた（データは示されていない）。

【０１０１】さらなる分析は、正常の腎と比較して嚢胞性腎で、ｃ−ｍｙｃが多いことを示
した。免疫組織学化は、ｃ−ｍｙｃが、嚢胞性尿細管および非嚢胞性尿細管の内
側を覆う上皮細胞の核に局在化することが示した。ｃ−ｍｙｃＡＳＯ処置の後
に、低いｃ−ｍｙｃタンパク質レベルが、非嚢胞性尿細管でのｃ−ｍｙｃの減少
に大きく起因するようであった。

【０１０２】２０日齢のｃ−ｍｙｃＡＳＯ処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ｃｐｋマウスから
得た腎溶解物中の腎ｃ−ｍｙｃＡＳＯの分析は、０．４７μＭを示したが、ｃ
−ｍｙｃＡＳＯは、２０日齢のコントロールＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ｃｐｋマウス
からの腎溶解物では検出されなかった。

【０１０３】ｃ−ｍｙｃＡＳＯでの処置の効力はまた、高い（１４．３ｎＭ；１００μｇ
）および低い（１．４ｎＭ；１０μｇ）ＡＳＯ投薬量で処置したマウスにおいて
明らかであった。相対的な腎重量およびＳＵＮレベルは、４１３ｎＭ（３０μｇ
）のｃ−ｍｙｃＡＳＯで処置した後に観察されるのと同程度までに減少した。
総体重およびヘマトクリットレベルはまた、これらの投薬量のｃ−ｍｙｃＡＳ
Ｏによって影響されなかった。

【０１０４】これらの結果は、ｃ−ｍｙｃアンチセンス処置が、腎におけるｃ−ｍｙｃの過
剰発現に関連するＰＫＤの症状を減少させ得ることを示唆している。

【０１０５】（表２．本願を支援するために提供される配列）

【０１０６】

【表２】本発明は組成物および方法に関して、記載されているが、本発明から逸脱する
ことなく、特許請求の範囲内で、種々の変化および改変がなされ得ることが理解
される。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄは、２０日齢の正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび嚢胞性Ｃ５７
ＢＬ／６Ｊマウスにおける（Ａ）腎臓重量体重の割合（相対的な腎臓重量として
）；（Ｂ）血清尿素窒素（ＳＵＮ）；（Ｃ）総体重；および（Ｄ）ヘマトクリッ
トに対するｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチド処置の効果を例示する。

【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｄは、２０日齢の正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび嚢胞性Ｃ５７
ＢＬ／６Ｊマウスにおける（Ａ）腎臓重量体重の割合（相対的な腎臓重量として
）；（Ｂ）血清尿素窒素（ＳＵＮ）；（Ｃ）総体重；および（Ｄ）ヘマトクリッ
トに対するｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチド処置の効果を例示する。

【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｄは、２０日齢の正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび嚢胞性Ｃ５７
ＢＬ／６Ｊマウスにおける（Ａ）腎臓重量体重の割合（相対的な腎臓重量として
）；（Ｂ）血清尿素窒素（ＳＵＮ）；（Ｃ）総体重；および（Ｄ）ヘマトクリッ
トに対するｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチド処置の効果を例示する。

【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｄは、２０日齢の正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび嚢胞性Ｃ５７
ＢＬ／６Ｊマウスにおける（Ａ）腎臓重量体重の割合（相対的な腎臓重量として
）；（Ｂ）血清尿素窒素（ＳＵＮ）；（Ｃ）総体重；および（Ｄ）ヘマトクリッ
トに対するｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチド処置の効果を例示する。

【図２】図２Ａ〜Ｅは、ポリマーを形成するのに適した５原子（Ａ）、６原子（Ｂ）お
よび７原子（Ｃ−Ｅ）の連結基を有するいくつかの好ましいモルホリノサブユニ
ットを示す。

【図３】図３Ａ−Ａ〜図３Ｅ−Ｅは、それぞれ図２のＡ〜Ｅのサブユニットを使用して
構築された、例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復サブユニットセグメ
ントを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 AA01 CA06 HA17 4C057 BB02 DD01 MM01 4C084 AA02 AA13 BA35 DB61 MA52 MA59 MA63 MA66 NA14 ZA811 ZB261 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA52 MA59 MA63 MA66 NA14 ZA81 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物の被験体における多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）を処置
のための薬学的組成物の調製のための、標的ヒトｃ−ｍｙｃ核酸配列に対するモ
ルホリノに基づくアンチセンスオリゴマーの使用であって、該オリゴマーが、長さ８〜４０ヌクレオチドでありかつ、非荷電のリン含有サ
ブユニット間結合を有する、使用。
【請求項２】請求項１に記載の使用であって、ここで、前記モルホリノに基
づくアンチセンスオリゴマーのサブユニット間結合が、図３Ａ−Ａ〜図３Ｅ−Ｅ
において示される構造からなる群から選択される、使用。
【請求項３】請求項２に記載の使用であって、ここで、前記結合が、図３Ｂ
−Ｂで示される、ホスホロジアミデート結合を含み、Ｘ＝ＮＨ₂、Ｙ＝Ｏ、およ
びＺ＝Ｏである、使用。
【請求項４】請求項１に記載の使用であって、ここで、前記アンチセンスオ
リゴマーが、長さ１２〜２５塩基を有する、使用。
【請求項５】請求項１に記載の使用であって、ここで、前記アンチセンスオ
リゴマーが、配列番号１として同定される配列を含む、使用。
【請求項６】請求項１に記載の使用であって、ここで、前記薬学的組成物が
、経口経路、皮下経路、鼻腔内経路、経皮経路または静脈内経路のうちのいずれ
か１つにより投与される、使用。
【請求項７】請求項６に記載の使用であって、ここで、前記薬学的組成物が
、経口経路により投与される、使用。
【請求項８】請求項１に記載の使用であって、ここで、前記被験体が、ヒト
被験体である、使用。
【請求項９】請求項１に記載の使用であって、ここで、前記ｃ−ｍｙｃに対
するオリゴヌクレオチドアンチセンスが、前記被験体おいてＰＫＤの検出可能な
症状を減少させるかまたは除去するのに有効な様式で投与される、使用。