JP2011168614A - 血管形成及び腫瘍成長を阻害するためのポリペプチド化合物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】EphB4の細胞外部分に位置したエピトープに結合し、かつ、EphB4活性を阻害する、単離された抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【選択図】なし
Description
本願は、2004年9月23日に出願された米国仮特許出願第60/612908号、2004年9月23日に出願された米国特許出願第10/949720号及び2004年3月12日に出願された米国特許出願第10/800350号について優先権を主張する。これらの参照した出願の教示全体をそれら全体における参照によってここに援用するものとする。
エフリン受容体B4又は肝細胞癌膜貫通型キナーゼ(HTK)とも呼ばれるEphB4は、膜貫通型受容体蛋白質−チロシンキナーゼのファミリーに属する。EphB4は、リガンド結合ドメイン(球状ドメインとも呼ばれる)と、システインリッチドメインと、一対のフィブロネクチンIII型反復配列(例えば、図5参照)とから構成される細胞外ドメインを有する。この細胞質ドメインは、2つの保存チロシン残基を含有する膜近傍領域、蛋白質チロシンキナーゼドメイン、不稔性αモチーフ(SAM)及びPDZドメイン結合モチーフからなる。EphB4は、膜結合リガンドのエフリンB2と相互作用する(Sakano,S.外,Oncogene,1996年8月15日;13(4):813−22;Brambilla R.外,EMBO J.1995年7月3日;14(13):3116−26)。EphB4は、Ephファミリーの他の種類と同様に、クラスターを形成した膜結合エフリンリガンドの結合によって活性化される(Davis S外,Science.1994年11月4日;266(5186):816−9)が、これは、該受容体を発現する細胞と該リガンドを発現する細胞との間の接触がEph受容体の活性化に必要であることを示している。リガンドの結合中に、EphB4受容体は二量体化し、そして膜近傍のチロシン残基を自己燐酸化させて完全な活性化を獲得する。EphB4発現細胞がエフリンB2発現細胞と遭遇したときに、EphB4−エフリンB2の相互作用と凝集が両細胞におけるシグナル伝達の引き金となると一般に考えられてきた。
ある態様では、本発明は、特定の方法でEphB4に結合しかつそれに作用する抗体及びその抗原結合部位を含め、EphB4仲介機能を阻害するポリペプチド剤を提供する。ここで立証するように、EphB4及びエフリンB2は、癌及び望ましくない又は過剰な血管形成に関連する疾患を含め、様々な病状に関与している。したがって、ここに開示されるある種のポリペプチド剤を使用してこのような疾患を治療することができる。さらなる態様では、本開示は、EphB4及び/又はエフリンB2が様々な腫瘍においてしばしば高レベルで発現するという発見に関する。そのため、EphB4又はエフリンB2機能を下方調節するポリペプチド剤は、腫瘍細胞に及ぼす直接的な影響並びに腫瘍によって補充される血管形成プロセスに及ぼす間接的な影響によって腫瘍に影響を及ぼすことができる。ある具体例では、この開示は、EphB4又はエフリンB2機能を下方調節する試薬による治療に特に適した腫瘍型の同定を提供する。
I.EphB4抗体及び他の結合ポリペプチド
この開示は、部分的には、抗体、抗体の抗原結合部分及び非免疫グロブリン抗原結合骨格のような、ポリペプチド結合因子によって効果的に標的にされ得るEphB4分子の特定部分を提供する。ここに記載されたEphB4ポリペプチド結合因子は、様々な疾患、特に癌及び望ましくない血管形成に関連する疾患を治療するために使用できる。この開示は、エフリンB2の結合又はEphB4キナーゼ活性のような1種以上のEphB4仲介機能を阻害する抗体及びその抗原結合部分を提供する。このような結合因子は、試験管内及び生体内でEphB4機能を阻害するために使用でき、そして好ましくは癌又は望ましくない血管形成に関連する疾患を治療するために使用できる。また、この開示は、EphB4キナーゼ活性(典型的には、EphB4の燐酸化状態を評価することによって算定される)を活性化させる抗体又はその抗原結合部分も提供する。驚くべきことに、このような抗体は、細胞系のアッセイ法又は生体内アッセイ法においてEphB4機能をも阻害する。したがって、このような結合因子は、試験管内及び生体内でEphB4機能を阻害するために使用でき、そして好ましくは癌又は望ましくない血管形成に関連する疾患を治療するために使用できる。いかなる特定の機構に制限されることを望まないが、これらの抗体は、EphB4キナーゼ活性だけでなく、膜からのEphB4の除去も刺激し、しかして全体的なEphB4レベル減少させることが予期される。
ヒト化用抗原の調製並びにポリクローナル抗体及びモノクローナルの作製をここに説明した通りに又は別の好適な技術を使用して実行することができる。様々な方法が説明されている。例えば、Kohler外,Nature,256:495−497(1975)及びEur.J.Immunol.6:511−519(1976);Milstein外,Nature 266:550−552(1977);Koprowski外,米国特許第4,172,124号;Harlow,E.及びD.Lane,1988,Antibodies:A Laboratory Manual(コールドスプリングハーバー研究所:ニューヨーク州コールドスプリングハーバー);Current Protocols In Molecular Biology,第2巻(補遺27,94年夏号),Ausubel,F.M.外著(John Wiley & Sons:ニューヨーク州ニューヨーク)第II章(1991)を参照されたい。一般に、ハイブリドーマは、好適な不死化細胞株(例えば、SP2/0のようなミエローマ細胞株)と抗体産生細胞とを融合させることによって作製できる。この抗体産生細胞、好ましくは脾臓又はリンパ節の抗体産生細胞は、対象の抗原で免疫化された動物から得られる。これらの融合細胞(ハイブリドーマ)は、選択培養条件を使用して単離でき、そして限界希釈法によってクローン化できる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、好適なアッセイ法(例えば、ELISA)によって選択できる。
ある態様では、本発明の様々な抗体は、内皮細胞(例えば、静脈内皮細胞)上又はEphB4受容体遺伝子がトランスフェクトされた細胞上でのEphB4受容体の発現を検出し又は測定するために使用できる。したがって、これらのものは、診断又は研究の目的で、細胞分類及び画像化(例えば、フローサイトメトリー及び蛍光活性化細胞分類)のような用途にも有用性を有する。
ある具体例では、本発明は、血管形成を阻害しかつ血管形成関連の病気(又は疾患)を治療するための組成物及び方法を提供する。他の具体例では、本発明は、腫瘍成長を阻害し又は低減させる方法及び癌に罹患した個体を治療する方法を提供する。これらの方法は、該個体に上記のような1種以上の抗体の治療上有効な量を投与することを伴う。これらの方法は、特に、動物、より具体的にはヒトの治療及び予防的治療を目的とする。
ある具体例では、本発明の主題の抗体は、薬剤として許容できるキャリヤーと共に処方される。このような抗体は、単独で又は医薬処方物(組成物)の成分として投与できる。これらの化合物は、ヒト用医薬又は動物薬に使用するにあたって任意の簡便な方法で投与するために処方できる。また、湿潤剤、乳化剤及び滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色料、離型剤、被覆剤、甘味料、香味剤及び香料、保存料及び酸化防止剤も該組成物中に存在し得る。
本発明を一般的に説明してきたが、次の実施例を参照することによってさらに容易に理解されるであろう。この実施例は、単に本発明のある種の態様及び具体例を例示する目的のために含めており、本発明を限定することを意図するものではない。
2種のEphB4ポリクローナル抗体(H−200及びN−19)をサンタクルーズバイオテック社(米国カリフォルニア州サンタクルーズ)から購入した。H−200抗体(sc−5536ともいう)は、ヒトEphB4の細胞外ドメイン内にアミノ酸201〜400に相当するエピトープ領域を有するが、N−19抗体(sc−7285ともいう)は、ヒトEphB4のN末端細胞外ドメイン内にエピトープ領域を有する。さらに、エフリンB2ポリクローナル抗体をR&Dシステムズ社(ミネソタ州ミネアポリス)から購入した。
3種の中皮腫細胞株(H28、H2052及びH2373)をATCC社(バージニア州マナッサス)から得、そしてこれらを使用してこれらのEphB4及びエフリンB2ポリクローナル抗体の抗腫瘍活性を試験した。これらの細胞(約5000細胞/ウェル)を48ウェルプレート中で平板培養し、そして次の日に異なる濃度の各抗体で処理した。細胞生死判別アッセイ法(MTT)を4日目に行った。腫瘍細胞成長に及ぼすエフリンB2及びEphB4ポリクローナル抗体の影響を図6に示した。
A.EphB4抗体の生成及び機能分析
抗EphB4モノクローナル抗体をマウスにおいてEphB4の細胞外ドメイン(ECD)に対して産生させた。EphB4ECD(例えば、図5参照)を発現ベクター(例えば、pGEX)にクローン化させてEphB4ECD融合蛋白質(例えば、GST−ECDを生成させた。E. coli BL21株中で発現するEphB4ECD融合蛋白質を親和性クロマトグラフィーによって精製した。GST融合蛋白質の場合には、そのGSTドメインをトロンビンによって開裂させた。モノクローナル抗体をハイブリドーマの上澄みから蛋白質Aクロマトグラフィーによって精製した。
これらのモノクローナル抗体は、EphB4抗体第1、23、35、47、57、79、85L、85H、91、98、121、131及び138号を包含する(図5)。抗体マッピング研究から、これらの抗体のそれぞれについてのエピトープドメインが示された(図5)。それぞれのEphB4抗体の結合親和性を分析した。これを図7に示している。
エフリンB2のようなこれらの抗体の結合相手と競合する能力、EphB4チロシン燐酸化を活性化させる能力、HUAECにおける試験管内管形成を阻害する能力、マトリゲルプラグアッセイ法による生体内血管形成を阻害する能力、SCC15腫瘍細胞におけるアポトーシス又はネクローシスを刺激する能力及びSCC15異種移植片成長を阻害する能力を含め、これらの抗体の機能活性を分析するためにさらなる実験を実施した。これらの結果を以下の表1にまとめる。
表1にまとめたEphB4抗体の抗腫瘍活性を例示するために、代表的な実験を図9に示している。BaIbCヌードマウスに2.5×106個の生存能力のある腫瘍細胞(SCC15:頭部及び頸部の扁平上皮細胞癌株)を皮下注射した。nu/nuマウスにおいてマトリゲル及び成長因子と予備混合された2.5〜5×106個の細胞を注射することによって腫瘍を開始させ、そして抗体を皮下注射して腫瘍異種移植を開始させた。注射後14日目にマウスを切開した。SCC15は頭部及び頸部の扁平上皮細胞癌株であり、B16はメラノーマ細胞株であり、MCF−7は乳癌株である。これらの処置に対する腫瘍の応答を、PBS注射を受けたコントロールの処置済みマウスと比較した。動物を腫瘍成長について毎日観察し、そして皮下腫瘍を、2日毎にキャリパーを使用して測定した。抗体第1及び23号は、特にいかなる追加の成長因子を添加することなしに、コントロールと比較してSCC15腫瘍寸法の有意な退行を示したが、これは、EphB4抗体がSCC15細胞の生体内腫瘍成長を阻害したことを示している。
表1にまとめたEphB4抗体の抗腫瘍活性及び抗血管形成活性を例示するために、図10に別の代表的な実験を示す。血管形成をCD31の免疫組織化学分析によって評価した。処置を受けたマウス及び処置を受けなかったマウスからの腫瘍組織切片をCD31に対して染色した。アポトーシスを免疫組織化学的TUNNELによって評価し、そして増殖をBrdUアッセイ法によって評価した。外科切除後に、腫瘍を直ちに2mmの連続切片にスライスし、そして標準的な手順を使用してパラフィンに包埋した。パラフィンに包埋された組織を5μmの切片にし、このワックスを取り除き、そしてこの組織を再水和させた。この再水和された組織を抗原抽出溶液中でマイクロ波照射した。スライドをPBSですすぎ、そしてTUNNEL反応混合物(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びフルオレセイン標識ヌクレオチド溶液)及びBrdUを、完全に遮光された湿度室内で添加した。次いで、このTUNNEL及びBrdU反応混合物を除去し、スライドをすすぎ、そしてホースラディッシュペルオキシダーゼが結合した抗フルオレセイン抗体を添加した。インキュベーション及びリンス後、3,3’−ジアミノベンジジンを添加した。また、形態を視覚化するために、マッソントリクロームとヘマトキシリンとエオシンとを使用してスライドを染色した。マッソントリクロームは、ネクローシス及び線維症を視覚化することを可能にする。腫瘍は、腫瘍/皮膚、筋肉の境界から血液の支援を受ける。腫瘍が成長すると、内部領域は、栄養が枯渇する。これは、好ましくは腫瘍中央部でのネクローシス(細胞死)に至らしめる。細胞死の後に、(腫瘍)細胞は、線維芽組織による置換を受ける。スライドを20倍率下で視覚化し、デジタル画像を取得した。投与されたそれぞれの抗体によりSCC腫瘍について異なる形態が得られた。抗体第1号は、ネクローシス及び線維症の増加を示したが、アポトーシスの増加は示さなかった。抗体第23号は、アポトーシス、ネクローシス及び線維症の増加及び血管浸潤の減少を示した。抗体第35号は、ネクローシス及び線維症の増加と、アポトーシスの僅かな増加と、血管浸潤の減少を示した。抗体第79号は、アポトーシス、ネクローシス及び線維症の大きな増加を示した。抗体第91号は、アポトーシスにおいていかなる変化も示さなかったが、増殖の増加を示した。そして、抗体第138号は、アポトーシス、ネクローシス及び線維症の増加と、増殖及び血管浸潤の減少を示した。コントロールのPBSで処理された腫瘍は、大きな腫瘍密度及び強い血管形成応答を示した。EphB4抗体で処理された腫瘍は、腫瘍細胞密度の減少及び生存能力のある細胞の領域内における腫瘍血管形成の顕著な阻害並びに腫瘍のネクローシス及びアポトーシスを示した。これらの結果は、EphB4抗体がSCC15頭部及び頚部癌腫瘍型においてアポトーシス、ネクローシス及び減少した血管形成を生じさせたことを示している。
表1にまとめたEphB4抗体の抗腫瘍活性を例示するために、図11にさらなる代表的な実験を示す。EphB4モノクローナル抗体又はコントロールとして等容量のPBSによる隔日処理を腫瘍の定着後4日目に開始し、そして14日にわたって続行した。全身投与を有意な相違なくIP又はSCのいずれかで行った。これらの実験の全てを二重盲検方式で実施して研究者の偏りを排除した。2週間の処理期間の終了時にマウスを犠牲にした。免疫組織化学検査のために、死後直ちに腫瘍を採取し、固定し、そして処理した。体重kg当たり40mgのEphB4抗体が投与された。EphB4抗体による処理は、コントロール処理マウスと比較してヒトSCC腫瘍成長を有意に阻害した(p<0.05)。EphB4抗体による処理は、コントロール処理マウスと比較して腫瘍重量を有意に抑制した(P<0.05)。これらの結果は、異種移植物への抗体の全身投与がSCC15異種移植物における腫瘍の緩解に至らしめることを示している。
(1)免疫組織化学
ホルマリン固定された組織切片を脱蝋し、そして−70℃で10分間10%のヤギ血清と共にインキュベートし、そしてEphB4モノクローナル抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。アイソタイプ特異的ラビットIgGをコントロールとして使用した。これらの受容体に対する免疫反応性を、ベクターラボラトリーズ社製のアビジン−ビオチンキットを使用して明らかにした。ペルオキシダーゼ活性をジアミノベンジジン(シグマ社)細胞化学反応によって明らかにした。次いで、これらのスライドを0.12%のメチレンブルー又はH&Eで対比染色した。凍結切片用に、OCT包埋組織を5μmの切片にし、そして燐酸緩衝4%パラホルムアルデヒド中で固定した。切片をPBSで3×5分間洗浄し、そして内因性ペルオキシダーゼを0.3%H2O2のPBS溶液中で10分間室温でインキュベートすることによってブロックした。切片をEph4(C−16)抗体(1:50)と共に1時間にわたって室温でインキュベートし、その後PBSで3回洗浄し、そしてロバ抗ヤギ二次抗体(サンタクルーズバイオテック社)と共に1時間にわたって室温でインキュベートした。PBSで3回洗浄後、DAB基質溶液(ベクターラボラトリーズ社,カリフォルニア州バーリンゲーム)中で10分間室温でインキュベートすることによってペルオキシダーゼ活性を局在化させた。切片をヘマトキシリンで20秒間対比染色し、脱水し、そして固定した。染色についてのネガティブコントロールは、一次抗体を正常のヤギ血清と置き換えたものであった。
全細胞溶解物を、特に示さない限り、プロテアーゼ阻害剤カクテル(ピアス社,イリノイ州ロックフォード)を加えた細胞溶解緩衝液(ジーンハンター社,テネシー州Basgvukke)を使用して調製した。全蛋白質を、DC試薬系(バイオラド社,カリフォルニア州ハーキュリーズ)を使用して決定した。典型的には、20μgの全細胞溶解物を4〜20%のトリス−グリシン勾配ゲルで流した。これらの試料をPVDF膜に電気移行させ、そして非特異的な結合を、5%の脱脂乳を含有するTBST緩衝液(0.5mMのTris−HCl,45mMのNaCl,0.05%のTween−20,pH7.4)でブロックした。膜を、まず一次抗体で一晩プローブし、Restore(商標)ウェスタンブロット用ストリッピング緩衝液(ピアス社,イリノイ州ロックフォード)でストリップし、そしてβ−アクチンで再プローブして蛋白質の等量のローディング及び移動を確認した。シグナルを、スーパーシグナルWest Femto Maximum Sensitivity基質(ピアス社)を使用して検出した。
60mm皿中で増殖させた細胞を血清飢餓培養(1%のFBS添加RPMI1640,24時間)し又は通常の条件(10%のFBS)で培養し、次いで、1μg/mLのマウスエフリンB2/Fcで10分間処理して(又は処理せず)EphB4受容体を活性化させた。透明な細胞溶解液をEphB4モノクローナル抗体と共に一晩4℃でインキュベートした。抗原−抗体複合体を100μLの蛋白質G−セファロースの20mM燐酸ナトリウム溶液(pH7.0)の添加と共に一晩4℃でのインキュベーションによって免疫沈降させた。免疫沈降物を1:1000希釈のホスホチロシン(pTyr)特異的抗体(アップステート社,クローン4G10)によりウェスタンブロットし、その後1:5000希釈の蛋白質G−HRP(バイオラド社)と共にインキュベートすることによって分析した。免疫沈降効率を監視するために、複写膜をEphB4特異的モノクローナル抗体でプローブした。
正常HUVECをキャンブレックス社(バイオホイッテカー)から得、そして0.1mg/mLの内皮成長補助因子(ウシ脳からの粗抽出物)、ペニシリン(50U/mL)、ストレプトマイシン(50U/mL)、2mmol/Lのグルタミン及び0.1mg/mLのヘパリンナトリウムを添加したEBM2培地中で保持した。細胞のアリコートを継代1〜3の間で冷凍状態で保存した。全ての実験について、HUVECを継代4以下で使用し、そして合流皿から採取した。
NCI H28及びNCI H2373中皮腫細胞株をATCC(バージニア州マナッサス)から得た。細胞を10%の加熱不活性化ウシ胎仔血清(FBS;ライフテクノロジーズ社,ミッドランド州ゲーサーズバーグ)及び抗生物質が添加されたRPMI1640培地中で保持した。初代細胞を中皮腫患者の胸水から得た。
マトリゲル(10mg/mLの60μL;コラボラティブラボ,カタログ番号35423)を氷冷96ウェルプレートのそれぞれのウェルに置いた。このプレートを室温で15分間置き、次いで37℃で30分間インキュベートしてマトリゲルを重合させた。平均時間内に、ヒト臍帯静脈内皮細胞を2×105細胞/mLの濃度のEGM−2(クロネティック社,カタログ番号CC3162)中で調製した。細胞(500μL)と試験EphB4抗体を混合し、この懸濁液の200μLを重合マトリゲル上に重複して置いた。24時間のインキュベーション後、それぞれの濃度について3枚の写真を、Bioquant画像分析装置を使用して撮影した。蛋白質添加効果(IC50)を、形成された索状組織の長さ及び結合部の数を測定することによって未処理コントロールと比較して評価した。
HUVECのVEGFへの化学走性を、改良型モイデンチャンバーと、24ウェルプレート中のトランスウェル膜フィルター挿入物と、6.5mmの直径、8μmの細孔寸法、10μLの厚さのマトリゲル被覆ポリカーボネート膜(BDバイオサイエンセズ)とを使用して評価した。HUVEC(2×105細胞/mL)の200μLのEBM細胞懸濁液を上部チャンバー中に接種し、そして試験EphB4抗体を刺激因子(VEGF又はbFGF)と同時に該チャンバーの下部区画に添加し、そして100nM〜1μMの試験化合物による(又はそれなしの)10〜20ng/mLのVEGFに応答したポリカーボネートフィルターにわたるそれらの移動を調査した。37℃で4〜24時間のインキュベーション後に、該フィルターの上部表面を綿棒で解体し、フィルターを固定し、そしてディフクイックで染色した。200×倍率での10の無作為の領域をカウントし、そしてそれらの結果を領域当たりの平均#として表した。ネガティブ非刺激コントロール値を刺激コントロール及び蛋白質処理試料値から引き、そしてデータを平均移動細胞±S.Dとしてプロットした。IC50をこのプロットしたデータから算出した。
HUVEC(1.5×103個の細胞)を96ウェルプレートにおいて100μLのEBM−2(クローンティック社,カタログ番号CC3162)中で平板培養した。24時間(0日)後に、この試験EphB4抗体をEBM−2培地における所望の濃度でそれぞれのウェルに添加した。0日目に、一つのプレートを0.5%のクリスタルバイオレットの20%メタノール溶液で10分間にわたり染色し、水ですすぎ、そして風乾した。残りのプレートを37℃で72時間インキュベートした。72時間後に、プレートを0.5%のクリスタルバイオレットの20%エタノール溶液で染色し、水ですすぎ、そして風乾した。染色物をエタノール:0.1Mクエン酸ナトリウムの1:1溶液で溶離させ(0日のプレートを含む)、そして吸光度をELISA読み取り装置(ダイナテックラボラトリーズ社)を使用して540nmで測定した。0日の吸光度を72時間のプレートから引き、そしてデータをコントロールの増殖(賦形剤処理した細胞)のパーセンテージとしてプロットした。IC50値をこのプロットしたデータから算出した。
生体内での血管形成は、試験試料を含有するマトリゲルプラグへの皮下組織由来の血管の成長として、マウスにおいて評価した。マトリゲルは、周囲の組織への持続放出及び長期暴露を可能にするように該因子を閉じこめる固形ゲルを体温で迅速に形成する。4℃で液状のマトリゲル(8.13mg/mL,0.5mL)を内皮細胞成長補助因子(ECGS)、試験EphB4抗体+ECGS又はマトリゲル+賦形剤単独(0.25%のBSAを含有するPBS)と混合させた。マトリゲル(0.5mL)を雌のnu/nuマウス(生後6週間)の腹部皮下組織に腹膜の中央線に沿って注入した。それぞれの群には3匹のマウスが存在した。これらの動物を制度上の及びNIHの指針に従って管理した。6日目に、マウスを犠牲にし、そしてプラグを回収し、組織学的分析のために処理した。典型的には、覆っている皮膚を取り除き、そしてゲルを、サポートのために腹膜の内側を保持することによって摘出し、10%の緩衝化ホルマリンPBS溶液中で固定し、そしてパラフィンに包埋した。3μmの切片を切断し、そしてH&E又はマッソン三色染色法により染色し、光学顕微鏡下で試験した。
マウス角膜マイクロポケットアッセイ法をKenyon外,1996に詳述されたものに従って実行した。簡単に言えば、90ngのbFGF(R&D)又は180ngのVEGF(R&Dシステムズ社,米国ミネソタ州ミネアポリス)のいずれかと40μgのスクロース硫酸アルミニウム(シグマ)とを含有するヒドロンペレット[ポリヒドロキシエチルメタクリレート(ポリHEMA),インターフェロンサイエンセズ社,米国ニュージャージー州ニューブランズウィック]を調製した。手術用顕微鏡を使用して、間質直線角膜切開を、麻酔をかけられた動物における外直筋の付着点に平行に手術用ナイフ(バード・パーカー第15号)で行った。基質内マイクロポケットを、改良型フォン・グレーフェナイフ(2”30mm)を使用して解剖した。単一のペレットを埋め込み、そして側頭角膜縁に向かって進めた(bFGFペレットについては0±7±1±0mm、VEGFペレットについては0±5mm)。それぞれの成長因子についてのペレット位置の相違は、このモデルにおいてVEGFの比較的弱い毛管形成刺激を与えるのに必要であると決定された。次いで、抗生物質軟膏(エリスロマイシン)を、手術を受けた眼球に塗布して感染を予防し、そしてムラを低減させた。その後の血管応答を周縁血管系からペレット及び新血管形成の隣接周縁帯域に向けて延長させて測定した。ここに提供するデータ及び臨床写真は、ペレット埋め込み後6日目に得たものであり、これは最大の血管形成応答の日であることが分かった。
「マトリゲル」マトリックス被覆9mm細胞培養インサート(細孔寸法8μm;ベクトンディッキンソン社,ニュージャージー州フランクリンレーク)を24ウェルプレートにセットした。HUVEC細胞を該培養インサートの上層にウェル当たり5×103個の細胞の密度で接種し、試験EphB4抗体の存在下で血清フリーのEBMで24時間培養した。コントロール群をEphB4抗体なしの同一の培地で培養した。次いで、ヒトSCC15細胞株ならし培地の0.5mLを化学誘引物質として培養インサートの下層に充填した。これらの細胞を24時間にわたってインキュベートし、次いで、上層中の残りの細胞を綿で吸い取り、そして下層中の浸透細胞を5%のグルタルアルデヒドで固定し、そしてディフクイックで染色した。マトリゲルマトリックスと該培養インサートの各8μm細孔とを通過する細胞の総数を、光学顕微鏡を使用してカウントし、そしてこれを侵襲指数(細胞数/面積)と表した。
対数的に増殖しているSCC15頭部及び頚部扁平上皮癌細胞株を、5×106個の細胞密度で(ヒトbFGFの存在下又は非存在下に試験EphB4抗体と共に又はそれなしで)、胸腺欠損Balb/cヌードマウスにマトリゲル(BDバイオサイエンス)合成基底膜(1:1v/v)と共に皮下注射し、そして2週間以内に腫瘍を検査した。移植後の成長因子の存在下及び非存在下での試験EphB4抗体群における腫瘍容積は、賦形剤群における腫瘍容積よりも3倍小さかった。これらの群間において体重に差はなかった。切除された腫瘍の断面並びにTUNEL陽性アポトーシス又はネクローシス、CD34免疫染色及びBrdU増殖速度の免疫組織化学的検査は、脱パラフィンし、再水和させ、そして内因性ペルオキシダーゼ活性のための急冷した後及び10分のプロテインキナーゼKによる浸透化後に実行されるであろう。また、血管密度の定量的評価も実行されるであろう。また、試験EphB4抗体の局所的腫瘍内デリバリ又はIVデリバリも1週間当たり2回実行されるであろう。
30匹の胸腺欠損ヌードマウスBALB/c(nu/nu)に、それぞれ1×106個のB16メラノーマ細胞を、0.1mLのマトリゲルと混合された0.1mLのPBSと共に注射し、又は1.5×106個のSCC15細胞を200μLのDMEM血清フリー培地に再懸濁させ、そして0日目にマウスの右肩領域に皮下注射した。試験EphB4抗体を腫瘍の周囲に静脈内注射又は皮下注射したが、ここで、1日目に4μg/mgの負荷量で始めて、2μg/mgを毎週注射し(10μg/g、50μg/kg/日)、そして2週間で接種を終えた。マウスを14日目に犠牲にした。コントロールマウスは、各日にPBS50μLを受けた。
全ての動物を(米国)動物保護協会委員の承認済みプロトコールの下で処理した。癌細胞(5×106)をヌードマウスの背面皮膚に皮下接種した。腫瘍が約10mm3の寸法にまで成長したときに(通常12日かかる)、試験EphB4抗体を1日1回腹腔内又は皮下注射し、そして腫瘍形成を2週間にわたって監視した。腫瘍容積を式a2×b(ここで、a及びbは、それぞれ最も小さい直径及び最も大きい直径である)に従って算出した。スチューデントtテストを使用して腫瘍容積を比較した(P<0.05は有意であるとみなされる)。
腫瘍を4%のホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンで包埋し、5μmの切片にし、そしてヘマトキシリン−エオシンで染色した。血管密度を、コンピューターベースの画像解析機(それぞれの群において3匹のマウスから切片当たり5種の領域)を使用して半定量した。
本明細書において言及した全ての文献及び特許文献は、あたかもそれぞれ個々の文献又は特許文献が具体的かつ個別的に参照によって援用されていることが示されるように、それらの全体における参照によって援用するものとする。
Claims (1)
- EphB4の細胞外部分に位置したエピトープに結合し、かつ、EphB4活性を阻害する、単離された抗体又はその抗原結合部分。
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