JP2011093871A

JP2011093871A - 抗ウイルス剤

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Publication number: JP2011093871A
Application number: JP2009252451A
Authority: JP
Inventors: Motoyasu Nakanishi; 幹育中西
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-11-02
Filing date: 2009-11-02
Publication date: 2011-05-12

Abstract

【課題】有害微生物の感染防御機能を有する新たな植物抽出物を含有する抗ウイルス剤または抗菌剤の提供。
【解決手段】ヤシャブシ（Ａｌｎｕｓｆｉｒｍａ）の抽出物、特にケンフェロール、カテキン、ケルセチンからなる群より選ばれた１種以上の物質を含有することを特徴とする抗ウイルス剤又は抗菌剤。特にインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有する。
【選択図】なし

Description

本発明は、抗ウイルス剤または抗菌剤に関するものである。

輸送機関の発達により、新型インフルエンザウイルスやＳＡＲＳ等によるパンデミックが頻発している現在、ウイルスや細菌といった有害微生物の制御及び感染防御は強く求められているテーマである。そのため、有害微生物の制御及び感染防御に有効な薬剤や物質の開発が進められている。そして、これらの薬剤や物質の開発においては、植物が病害抵抗性等を有することから植物中に存在する生理活性物質が着目され、種々の植物抽出物について研究が行われている。例えば、特許文献１には、センダンの抽出物を含有するインフルエンザウイルスの感染予防剤が記載されている。

一方、ヤシャブシ（夜叉五倍子、学名Ａｌｎｕｓｆｉｒｍａ）は、カバノキ科ハンノキ属に属する落葉樹である。日本固有種で東北南部以南、四国、九州に多く分布する樹木であり、古来より果実は褐色の染料として用いられている。そして、特許文献２には、ヤシャブシの抽出物が化粧料組成物として用いられることが記載されている。

特許第４３０７４５９号公報特開２０００−１２８７２８号公報

しかしながら、ヤシャブシ抽出物にはメラニン生成抑制機能及び活性酸素抑制機能を有することが見出されているが（特許文献２）、ヤシャブシ抽出物の他の生理活性機能については見出されていなかった。

本発明は、有害微生物の感染防御機能を有する新たな植物抽出物を含有する抗ウイルス剤または抗菌剤を提供することを目的とする。

本発明者は、多種多数の植物体から植物抽出物を抽出し、それらの生理活性機能について研究を行った。この結果、ヤシャブシ抽出物が有害微生物の感染防御機能に優れることを知見し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の抗ウイルス剤は、ヤシャブシ（Ａｌｎｕｓｆｉｒｍａ）の抽出物を含有することを特徴とする。

上記構成によれば、抗ウイルス剤中に含まれるヤシャブシの抽出物がウイルスに作用し、ウイルスを死滅させる等して、ウイルスを不活化する。

また、本発明の抗ウイルス剤は、抽出物が温熱水抽出または亜臨界抽出により得られることを特徴とする。

上記構成によれば、抗ウイルス効果を有するヤシャブシの抽出物を得るにあたり、適当かつ迅速な抽出方法が選択される。

また、本発明の抗ウイルス剤は、抽出物が、ケンフェロール、カテキン、ケルセチンからなる群より選ばれた１種以上の物質を含むことを特徴とする。

上記構成によれば、ヤシャブシ抽出物には、ケンフェロール、カテキン、ケルセチンといったフラボノイド類成分が含まれる。

また、本発明の抗ウイルス剤は、インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有することを特徴とする。

上記構成によれば、抗ウイルス剤中に含まれるヤシャブシの抽出物は、インフルエンザウイルスに作用し、インフルエンザウイルスを死滅させる等してインフルエンザウイルスを不活化する。

さらに、本発明の抗菌剤はヤシャブシ（Ａｌｎｕｓｆｉｒｍａ）の抽出物を含有することを特徴とする。

上記構成によれば、抗菌剤中に含まれるヤシャブシの抽出物が細菌に作用し、細菌を死滅させる等して、細菌を不活化する。

また、本発明の抗菌剤は、抽出物が温熱水抽出または亜臨界抽出により得られることを特徴とする。

上記構成によれば、抗菌効果を有するヤシャブシの抽出物を得るにあたり、適当かつ迅速な抽出方法が選択される。

また、本発明の抗菌剤は、抽出物が、ケンフェロール、カテキン、ケルセチンからなる群より選ばれた１種以上の物質を含むことを特徴とする。

上記構成によれば、ヤシャブシ抽出物中にはケンフェロール、カテキン、ケルセチンといったフラボノイド類成分が含まれる。

また、本発明の抗菌剤は、歯周病菌に対する抗菌活性を有することを特徴とする。

上記構成によれば、抗菌剤中に含まれるヤシャブシの抽出物は、歯周病菌に作用し、歯周病菌を死滅させる等して歯周病菌を不活化する。

本発明によれば、有害微生物の増殖抑制機能・感染防御機能に優れた植物由来の成分からなる抗ウイルス剤または抗菌剤を提供することができる。

以下、本発明の実施形態に係る抗ウイルス剤または抗菌剤について説明する。

ヤシャブシ（夜叉五倍子、学名Ａｌｎｕｓｆｉｒｍａ）とは、カバノキ科ハンノキ属に属する落葉樹である。本発明において、ヤシャブシの抽出物とは、ヤシャブシの実、枝、樹皮、果穂、葉及び茎を抽出対象物とし、これらに抽出処理を施して得られたものをいう。
ヤシャブシの抽出にあたっては、ヤシャブシの植物体を直接用いてもよいが、たとえば、ヤシャブシの枝や実などを乾燥させて粗破砕した木材チップ又は未加工の枝や実などを適当な大きさに裁断したものを準備し、それを用いて抽出処理を行うことができる。また、予めセルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素処理を施したヤシャブシ酵素処理物を用いて抽出処理を行うことができる。

ヤシャブシの抽出物は、抽出材料を抽出溶媒に浸漬又は接触させて抽出処理を行うことにより得られ、抽出方法は特に限定されない。抽出処理は常圧下及び加圧下のいずれでも行うことができる。抽出温度は０℃〜１５０℃、好ましくは室温〜１２０℃の範囲であり、抽出時間は１分〜２４時間、好ましくは１分〜３時間で抽出され得る。抽出に用いる溶媒には水若しくは有機溶媒又はそれらを組み合わせたものを用いることができる。具体的な抽出溶媒としては、水、メタノール・エタノール・ポリエチレングリコール・グリセリン・ソルビトールなどのアルコール類、アセトン・ジメチルケトンなどのケトン類、酢酸エチル、ジメチルスルホキシドなどが挙げられるが、取り扱いの容易さ及び製剤とするときの安全性から水若しくはエタノール又はそれらの混合物が望ましい。抽出装置としては特に限定されないが、具体的には、加熱抽出装置、加圧熱水抽出装置、ソックスレー抽出装置、亜臨界抽出装置、超臨界抽出装置、超音波抽出装置などを利用することができる。

温熱水抽出とは５０℃以上の含水溶媒を用いて行う抽出処理のことをいう。本発明の実施形態に係る温熱水抽出物は、ヤシャブシの木材チップ又は実の破砕物等の抽出対象物を５０℃以上の含水溶媒に接触または浸漬させ、３分〜２４時間、好ましくは３分〜３時間、より好ましくは５分〜３０分間抽出処理することにより得られる。

亜臨界抽出とは、臨界点（水の臨界点は２２ＭＰａ、３７４℃）より温度・圧力の低い条件における亜臨界状態にある溶媒を利用して行う抽出のことをいう。本発明の実施形態に係る亜臨界抽出物は、水溶媒又は水とエタノールなどの親水性溶媒を混合した溶媒を亜臨界状態下におき、ヤシャブシの木材チップ・実の破砕物等の抽出対象物について、１分〜２４時間、好ましくは１分〜６０分間、より好ましくは３分〜１０分間抽出処理することにより得られる。亜臨界条件としては圧力０．２ＭＰａ〜１５ＭＰａ、温度１００℃〜２００℃が好ましい。

ヤシャブシの抽出物にはケンフェロール、カテキン、ケルセチン等のフラボノイド類物質が少なくとも１種以上含まれ得る。フラボノイド類物質には抗酸化作用があることが知られているが、本発明のヤシャブシ抽出物中に含まれるフラボノイド類物質は、抗ウイルス活性又は抗菌活性を有するか、これらの活性を助長するような作用を有すると考えられる。

抗ウイルス剤とは、ウイルスを死滅させる等ウイルスを不活化して、ウイルスの増殖を抑制したり、感染を防いだりすることができるもののことをいう。本発明の抗ウイルス剤は、特にインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス作用を有する。インフルエンザウイルスには、たとえば、Ａ型ヒトインフルエンザウイルス、Ｂ型ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス等が挙げられる。

抗菌剤とは、細菌を死滅させる等細菌を不活化して、細菌の増殖を抑制したり、感染を防いだりすることができるもののことをいう。本発明の抗菌剤の対象となる細菌としては、特に限定されないが、好ましくは歯周病菌である。歯周病菌としては、たとえばＰ．ｇ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）菌、Ａ．ａ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）菌、Ｐ．ｉ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）菌、Ｂ．ｆ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）菌、Ｔ．ｄ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ）菌が挙げられる。

本発明の抗ウイルス剤または抗菌剤は、ヤシャブシの抽出物をそのまま又は１〜１００倍程度に希釈して液体で使用することができる。さらに、ヤシャブシの抽出物を乾燥・凍結乾燥処理を施して粉末で使用することもできる。
本発明の抗ウイルス剤または抗菌剤は、抗ウイルス機能または抗菌機能が求められる種々の製品に混合、添加、塗布、噴霧等されて使用され得る。

次に、実施例を用いて、本発明を詳細に説明する。

ヤシャブシ抽出物の抽出方法
ヤシャブシの枝を乾燥させた木材チップと、ヤシャブシの実を乾燥させた破砕物について、温熱水抽出及び亜臨界抽出を行った。
温熱抽出は、木材チップ１８ｇについては、溶媒として水３００ｍｌを用い、温度６０℃で１０分間抽出、実の破砕物１８ｇについては、溶媒として水３００ｍｌを用い、１００℃で１０分間抽出を行った。
亜臨界抽出は、木材チップ５ｇについては、溶媒として水１：エタノール１（体積割合）で混合したものを２００ｍｌ用い、温度１００℃、圧力６ＭＰａで５分間抽出を行った。実の破砕物５ｇについては、溶媒として水７：エタノール３(体積割合)で混合したものを２００ｍｌ用い、温度１００℃、圧力６ＭＰａで５分間抽出を行った。
得られた抽出物を凍結乾燥して保存した。

ヤシャブシ抽出液中に含まれるフラボノイド類の分析
実施例１で得た各ヤシャブシ抽出物を秤量し、濃度がそれぞれ６０ｍｇ／ｍＬになるように脱イオン水で溶解した後、０．２μｍのフィルターで不純物をろ過した。質量分析装置を用いて、各ヤシャブシ抽出物中に含まれるフラボノイド類を分析した（表１）。

表１より、ヤシャブシ抽出物中には、ケンフェロール、カテキン、ケルセチンをはじめとするフラボノイド類が多く含まれていることが確認された。中でも、ケルセチンの含有量が他のフラボノイド類と比較して多いことが示された。

３−１．実験材料及び実験方法
インフルエンザウイルス株は、ヒトインフルエンザウイルスＡ型Ａ／ＰＲ／８／３４株（Ｈ１Ｎ１）を用いた。

３−２．インフルエンザウイルスの精製
赤血球凝集活性（ＨＡＵ）が２^{−３〜−４}となるように、インフルエンザウイルス懸濁液を滅菌ＰＢＳで希釈し、ＰＳＧ（ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン）（インビトロジェン製）を１０００倍希釈で加えた。これを１１日齢発育鶏卵のしょう尿腔に卵１個あたり０．２ｍＬ植種し、３４℃で４８時間培養した。この卵を４℃で一晩静置させた後、しょう尿液を回収し、４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して（日立製ＳＣＲ２０Ｂ、ＲＰＲ９ローター）赤血球等の混在する夾雑物を除去した。さらにこの上清を４℃、８０００ｒｐｍで３時間遠心し、得られたペレットをＰＢＳ１ｍＬで懸濁して濃縮ウイルス液を得た。

５０％（ｗ／ｖ）グリセロール含有ＰＢＳ溶液５ｍＬに上記濃縮ウイルス液５ｍＬを重層し、４℃、３８０００ｒｐｍで２時間遠心した（日立製ＣＰ６５β、Ｐ４０ＳＴローター）。得られたペレットにＰＢＳ１ｍＬを加え、２２Ｇ、続いて２５Ｇの針を装着したシリンジでペレットを懸濁した後、さらに４℃、１５０００ｒｐｍで１時間遠心した。遠心後得られたペレットを再びＰＢＳ１ｍＬで懸濁し、４０％（ｗ／ｖ）スクロース含有ＰＢＳ１７ｍＬに１０％（ｗ／ｖ）スクロース含有ＰＢＳ溶液１７ｍＬを滴下して作製した密度勾配溶液の上にウイルス懸濁液を重層して、４℃、２００００ｒｐｍで９０分間１０−４０％スクロース連続密度勾配遠心を行った（日立製ＣＰ６５β、Ｐ２８Ｓローター）。遠心チューブ中央付近にできたウイルスの白濁バンドを回収し、ＰＢＳを加えて４℃、８０００ｒｐｍで３時間遠心して（日立製ＳＣＲ２０Ｂ、ＲＰＲ１８ローター）ペレットを得た。このペレットをＰＢＳ１００μＬで懸濁して分注し、精製ウイルスとして−８０℃で保存した。

３−３．インフルエンザウイルスの赤血球凝集活性（ＨＡＵ）測定
マイクロプレート（ファルコン製Ｕ底９６ウェル・フレキシブルプレート、製品番号３５３９１１）上にて０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン含有ＰＢＳ溶液で精製したインフルエンザウイルスを段階的に倍々希釈し、５０μＬとした。この各ウェルに０．６％（ｖ／ｖ）モルモット赤血球含有ＰＢＳ溶液５０μＬを加えて４℃で２時間静置した後、凝集層を観察した。この時、赤血球の凝集に必要なウイルスの最高希釈倍数をウイルスタイター（ＨＡＵ）として表した。

３−４．ＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス感染実験
感染阻害実験に用いたインフルエンザウイルスのウイルスタイター（ＨＡＵ）について、メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ細胞）に対する感染実験を予め行い、至適感染ＨＡＵを決定した。

９６ウェル培養用マイクロプレート（ヌンク製、製品番号１６７００８）にＭＤＣＫ細胞を１．４×１０^４細胞／ウェルでまきこみ、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地（ニッスイ製、製品番号０５９００）１００μＬ中で３７℃、５％ＣＯ_２存在下で１５〜１８時間培養した。コンフルエントな単層となった細胞を無血清ＭＥＭ培地１００μＬ／ウェルで３回洗浄し、無血清ＭＥＭ培地で段階希釈したインフルエンザウイルス懸濁液を５０μＬ／ウェル加えて、３４．５℃、５％ＣＯ_２存在下で３０分間感染させた。なお、対照にはウイルスを含まない無血清ＭＥＭ培地を同様に段階希釈して用いた。感染後ウイルス懸濁液を除去し、無血清ＭＥＭ培地１００μＬ／ウェルで３回洗浄した後、０．５％（ｗ／ｖ）トラガカントゴム（和光純薬製）及び０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＭＥＭ培地を５０μＬ／ウェル加え、３４．５℃、５％ＣＯ_２存在下で２０〜２４時間培養した。その後培地を取り除き、メタノールを１００μＬ／ウェル加えて室温で１０分間静置し、細胞を固定した。ＰＢＳ溶液１００μＬ／ウェルで３回洗浄した後、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で希釈した抗ヌクレオプロテイン抗体（モノクローナル抗体、ＡＴＣＣ番号Ｈ１６Ｌ−１０−４Ｒ５）溶液を５０μＬ／ウェル加えて、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ溶液１００μＬ／ウェルで３回洗浄後、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で希釈したペルオキシダーゼ結合Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソン・イムノリサーチ製）溶液を５０μＬ／ウェル加えて、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ溶液１００μＬ／ウェルで３回洗浄し、発色基質溶液（コニカ製、コニカイムノステインＨＲＰ−１０００、製品番号６１０１−１２）を５０μＬ／ウェル添加して発色させた後、ＰＢＳ溶液で洗浄し最後にＰＢＳ溶液を５０μＬ／ウェルとなるように加えた。
なお実験は３系列で行い、光学顕微鏡下でウイルス感染細胞（染色された細胞）を計数して平均１００〜１５０個／ウェルとなるＨＡＵを以後の感染阻害実験における各インフルエンザウイルス株の至適ウイルスタイターとして使用した。

４−１．センダン抽出物の抽出方法
センダンの枝を乾燥させた木材チップとセンダンの葉を乾燥させた破砕物について、温熱水抽出及び亜臨界抽出を行った。
温熱抽出は、木材チップ１８ｇについては、溶媒として水３００ｍｌを用い、温度６０℃で１０分間抽出、葉の破砕物１８ｇについても溶媒に水３００ｍｌを用い、６０℃で１０分間抽出を行った。
亜臨界抽出は、木材チップ５ｇについては、溶媒として水１：エタノール１（体積割合）で混合したものを２００ｍｌ用い、温度１００℃、圧力６ＭＰａで５分間抽出を行った。葉の破砕物５ｇについても同様に、溶媒として水１：エタノール１（体積割合）で混合したものを２００ｍｌ用い、温度１００℃、圧力６ＭＰａで５分間抽出を行った。
得られた抽出物を凍結乾燥して保存した。

４−２．センダン抽出物溶液の調整
凍結乾燥したセンダン抽出物を秤量し、濃度がそれぞれ１００ｍｇ／ｍＬになるようにジメチルスルホキシドで溶解し、遠心操作で不要物を沈澱させた。上清を分注して、使用するまで−３０℃の冷凍庫で保存した。

５−１．ヤシャブシ抽出物によるインフルエンザウイルスｉｎｖｉｔｒｏ感染阻害実験
実施例１で得た凍結乾燥したヤシャブシ抽出物を秤量し、濃度がそれぞれ１００ｍｇ／ｍＬになるようにジメチルスルホキシドで溶解し、遠心操作で不要物を沈澱させた。上清を分注して、使用するまで−３０℃の冷凍庫で保存した。このヤシャブシ抽出物を用いて、インフルエンザウイルスｉｎｖｉｔｒｏ感染阻害実験を行った。
９６ウェル丸底マイクロプレート（コスター製、製品番号３７９９）上の無血清ＭＥＭ培地で希釈したインフルエンザウイルス懸濁液５０μＬ／ウェルに対して、段階希釈したヤシャブシ各抽出物溶液を等量加え、４℃で１時間プレインキュベーションした。また対照としてウイルスを含まない無血清ＭＥＭ培地を使用した。コンフルエントな単層となったＭＤＣＫ細胞を無血清ＭＥＭ培地１００μＬ／ウェルで３回洗浄し、プレインキュベーションしたウイルス／ヤシャブシ抽出物混合溶液をそれぞれ５０μＬ／ウェル加え、３４．５℃、５％ＣＯ_２存在下で３０分間感染させた。以後実施例３の３−４．の方法に準じて実験を行った。
光学顕微鏡下で各ウェルの染色細胞数を計数した。ヤシャブシ抽出物を含まないウイルスのみを感染させたウェルの染色細胞数を１００％とし、各ヤシャブシ抽出物存在下における染色細胞数の相対的な割合を感染率（％）とした。さらに、５０％の感染率を示すヤシャブシ抽出物濃度を５０％阻害濃度（ＩＣ５０）として算出した（表２）。なお実験は３系列で行った。

５−２．センダン抽出物によるインフルエンザウイルスｉｎｖｉｔｒｏ感染阻害実験（比較試験）
実施例４で得たセンダン抽出物について、ヤシャブシ抽出物と同様の方法（実施例５−１）に基づき、インフルエンザウイルスのｉｎｖｉｔｒｏ感染阻害実験を行った（表３）。

表２及び表３の結果より、本発明のヤシャブシ抽出物とインフルエンザウイルスの予防効果を有するセンダンの抽出物(特許文献１)を比較した。その結果、ヤシャブシ抽出物はセンダン抽出物よりも、亜臨界抽出物では５．５〜９．５倍、温熱水抽出物では１２６〜１１００倍高いインフルエンザウイルスの阻害効果を示した。このことより、ヤシャブシ抽出物はインフルエンザウイルスの増殖を効果的に阻害できることがわかった。

Claims

ヤシャブシ（Ａｌｎｕｓｆｉｒｍａ）の抽出物を含有することを特徴とする抗ウイルス剤。
前記抽出物が温熱水抽出または亜臨界抽出により得られる請求項１記載の抗ウイルス剤。
前記抽出物が、ケンフェロール、カテキン、ケルセチンからなる群より選ばれた１種以上の物質を含む請求項１又は２記載の抗ウイルス剤。
インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有することを特徴とする請求項１、２又は３記載の抗ウイルス剤。
ヤシャブシ（Ａｌｎｕｓｆｉｒｍａ）の抽出物を含有することを特徴とする抗菌剤。
前記抽出物が温熱水抽出または亜臨界抽出により得られる請求項５記載の抗菌剤。
前記抽出物が、ケンフェロール、カテキン、ケルセチンからなる群より選ばれた１種以上の物質を含む請求項５又は６記載の抗菌剤。
歯周病菌に対する抗菌活性を有することを特徴とする請求項５、６又は７記載の抗菌剤。