JP2010539898A - ペプチドの高発現に適した融合タンパク質システム - Google Patents
ペプチドの高発現に適した融合タンパク質システム Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、一態様において、GCSFまたはその適切なバリアント(variant)を融合パートナーとして使用することを含む、ペプチド産生方法を提供する。一実施形態において、新規融合パートナーであるG-CSFまたはその適切なバリアントを用いて、ペプチドを融合産物として発現させる方法を提供する。本発明の他の態様において、ペプチドを融合産物として発現させるための新規融合パートナー、G-CSFを提供する。
本発明は、新規融合パートナーであるG-CSFを使用することにより、広範囲にわたる大きさおよび薬効分類の組換えペプチドを産生させる方法を提供する。これらのペプチドは、化学的または酵素的切断部位を介してG-CSFのC末端と連結していることが好ましい。この新規発現システムは、E.coli宿主細胞の生合成機構を利用し、形質転換した宿主細胞内で上記融合ペプチドを発現させるが、この発現は融合産物の不溶性凝集体の形態であることが好ましい。封入体は宿主細胞から容易に単離でき、ペプチドはその封入体から、公知の技法によって融合パートナーのG-CSFから切断した後、標準的なタンパク質精製方法を用いて精製可能である。
本発明は、宿主細胞内でペプチドを産生させるための発現システムを提供し、ここで所望のペプチドは融合パートナーに作動可能に連結されている。この連結または結合は、適当な切断部位の作製により行い、それによって完全な融合産物が形成される。融合産物は、不溶性の凝集体であることが好ましい。
本発明に記載の新規発現システムは、適切なペプチドと融合して融合タンパク質を形成する融合パートナーであるG-CSF(Genbank受託番号gi:27437050)を含む。G-CSFの適切なミュータント(mutant)またはバリアント(variant)も、G-CSFと同じ機能を果たす限りは融合パートナーとして企図され、包含される。融合タンパク質の好ましい利点は、融合タンパク質が前記ペプチドの高レベルでの発現をもたらすことである。より詳細には、本発明の融合パートナーは、メチオニルヒトGCSF(配列番号1)である。
融合ペプチドは、融合パートナーと一緒に単一の融合産物構築物の形で発現されるペプチドである。この融合ペプチドは、いくつかの形態を有してよい。融合ペプチドには、天然の対象のペプチドおよび/または任意のそのミュータントもしくはバリアントが含まれ、かつ/または、自然界で発見されていない新規ペプチド、および完全に人間が設計した新規ペプチドが含まれてよい。
本発明の融合産物構築物は次式で表される。
N末端 融合パートナー-------CS-------対象ペプチド C末端
N末端 対象ペプチド-------CS-------融合パートナー C末端
本発明のさらに好ましい実施形態において、以下の式の融合産物が企図されている。
N末端 対象ペプチド-------CS-------融合パートナー C末端
式中、CSは酵素的または化学的切断部位を表す。本発明の好ましい実施形態として、以下の式の融合タンパク質が企図されている。
G-CSF-------エンテロキナーゼ切断部位-------PTH(G-CSF-PTH)、配列番号4
G-CSF-------CNBr切断部位-------プロインスリン(G-CSF-プロインスリン)、配列番号9
G-CSF-------エンテロキナーゼ切断部位-------アンジオテンシン(G-CSF-アンジオテンシン)、配列番号12
上記発明において企図されている切断部位は、臭化シアンまたは2-(2-ニトロフェニルスルフェニル)-メチル-3'-ブロモインドレニン、BNPS-スカトール(3-ブロモ-3-メチル-2-(2-ニトロフェニル)チオール-3H-インドール)、N-ブロモスクシンアミド、O-ヨードソ安息香酸、HBr/DMSO、NTCB(2-ニトロ-5-チオシアノベンゾエート)、金属ナトリウムの液体アンモニア溶液、ヒドロキシルアミン、酸加水分解用の希酸などによって切断可能な化学的切断部位、またはエンテロキナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、ペプシン、パパイン、サブチリシン、サーモリシン、V8プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼArg C(顎下腺プロテアーゼ)、クロストリペイン(Clostripain)、トロンビン、コラゲナーゼ、リソバクター・エンザイモゲネス(Lysobacter enzymogenes)(Lys C)、粘液細菌Al-1プロテアーゼ、血液凝固因子Xa(Factor Xa)などによって認識される酵素的切断部位を含む。この切断部位は、ポリメラーゼ連鎖反応などの標準的な分子生物学的技法を用いて挿入し、その反応は上記の遺伝子(ペプチドおよび融合パートナー)の片方または両方を鋳型として、前記部位を導入することができる変異オリゴを反応のプライマーとして用いて行う。あるいは、切断部位は、ペプチドまたは融合パートナー内に天然に存在してもよい。
発現ベクターは、例えば上記の融合産物または融合産物構築物などの遺伝子をコードする発現カセットを含む適切なプラスミドベクターであり、ここで発現カセットは、上記の誘導産物を発現させるために発現ベクターが形質転換またはトランスフェクトされた発現宿主内で機能する適切なプロモーターおよび他の適切な調節要素に作動可能に連結されている。発現ベクターの例としては、E.coliにおいて融合産物を発現できるベクターが挙げられる。そのような発現ベクターの例としては、T7プロモーターシステムを用いるpET27、pET11、pET3、pET32など、アラビノースオペロンおよびAraC活性化因子に基づくpBADまたはpARA(Invitrogen社)ベクターシリーズが挙げられる。他の例としては、pGW7などのラムダPLプロモーター含有ベクター、ラムダPLプロモーターを含有する、pBR322に基づくベクター、温度を42℃に変えることにより誘導されるPLベクターシリーズ(Invitrogen社)、または、E.coliにおいて発現させるためにlac、lacUV5、tac、trc(IPTG誘導性)、trp(トリプトファン)、araBAD(アラビノース)、phoA(リン酸欠乏)、cst-l(グルコース欠乏)、cspA(低温誘導性)、SP6、T3プロモーターを含むように設計された他のプラスミドベクターが挙げられる。
外来タンパク質の遺伝子をコードする組換え発現ベクターと、宿主細胞の生合成機構の相互作用によって前記タンパク質を発現させる技法は、タンパク質の生化学合成において周知のものである。「発現システム」という用語は、例えば上記の融合産物または融合産物構築物などの遺伝子をコードする発現ベクター、およびその細胞内で融合産物を産生する、形質転換されたE.coli宿主細胞を指す。
ペプチドを融合産物の形で産生させるために、予め企図された融合産物構築物をコードする発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。発現ベクターは、対象の宿主に適合する任意のベースベクターから、融合産物をコードするDNAセグメントを適当な宿主適合性プロモーターの制御下でベースベクター中にクローニングすることにより得ることができる。プロモーターに加えて、ベースベクターはさらに、遺伝子産物の転写および翻訳の調節に関連するような他の宿主適合性調節要素からなっていてもよい。一般に、ベースベクターおよびその中の調節要素の選択は、融合産物を高発現で得るための、ベクターと宿主の適合性に基づく。本発明で企図される宿主細胞は、細胞内でのタンパク質の高発現に際して封入体を形成しやすい任意の微生物宿主細胞であってよい。本発明の好ましい一実施形態においては、微生物宿主細胞はE.coliである。
バッチ培地の組成
成分 濃度(1/L)
KH2PO4 13.3g
(NH4)2HPO4 4.0g
酵母抽出物 1.0g
グルコース 20.0g
クエン酸 1.7g
MgSO47H2O 1.2g
微量金属溶液 20ml
カナマイシン 50mg
フェッドバッチ供給培地の組成
成分 濃度(1/L)
グルコース 700g
MgSO47H2O 20g
カナマイシン 500mg
微量金属溶液 20ml
所望のGCSF(174アミノ酸バリアント)遺伝子配列を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)に基づいてクローニングするための鋳型として、ヒト胎盤の全RNA(Clontech社)を使用した。遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー対(配列番号2および3a)を用いてPCRを行った。このオリゴヌクレオチドは、クローニング部位と、メチオニンをコードする開始コドンも含み、アミノ酸配列に影響を及ぼさずに5'領域のGC含有量を減少させて、その最適化したコドンもE.coliによって効率的に使用されるように、遺伝子の5'末端を改変するよう設計した。5'末端において7つのコドンを改変した。二本鎖cDNAを、MMLV逆転写酵素(MBI Fermentas社、USA)を用いた遺伝子特異的プライミングによってヒト胎盤全RNAから合成した[Maniatisら、Molecular cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), (1990)]。次いでこのcDNAについて、Tris-Cl(pH8.3)50mM、MgCl22.5mM、4dNTPそれぞれ200μM、およびPfuポリメラーゼ2.5ユニットを含む体積100μl中100ピコモルの遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR増幅を40サイクル行った。PCRの各増幅サイクルは、94℃30秒(変性)、61℃30秒(アニーリング)、および72℃1分(伸長)のインキュベーションで構成した。ここで増幅されたPCR産物をGel extraction Kit(Qiagen社)を用いて不純物を取り除き、制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびBamHIで消化した。消化されたPCR産物を、Gel Extraction kit(Qiagen社)を用いてさらに精製した。プラスミドベクターpET27b(+)(Novagen社)を、制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびBamHIで消化し、続いて直線化されたプラスミドベクターを、Gel extraction kit(Qiagen社)を用いてゲル精製した。この精製された直線化ベクターDNAを、NdeIおよびBamHIで消化した精製GCSF PCR産物とライゲーションさせた。このライゲーション産物をE.coli DH5αに形質転換し、形質転換体をアンピシリン耐性に基づいて評価した。そのような10コロニーから単離したプラスミドDNAについて、種々の制限酵素を用いた制限消化によってGCSF遺伝子の存在を分析した。そのようなプラスミドの1つについて、自動DNAシーケンサー(ABI)を用いて配列決定し、その結果、タンパク質遺伝子の正しい組み込みおよび配列を有することが認められた。このプラスミドDNAをpET27b(+)-GCSF-1と名付けた。このプラスミドDNAを、CaCl2を用いた化学的転換法により、E.coli BL21 DE3コンピテント細胞中に導入し形質転換して、G-CSFを発現するE.coli細胞クローンを得た。そのようなE.coliクローンの1つを早い段階で使用し、国際特許出願公開第2007/102174A2号に記載の発酵方法を用いて、最大9.5g/Lという非常に高い発現レベルを得た。
ヒトGCSF遺伝子を、NdeI制限部位を含むフォワードプライマー(配列番号2)とBamHI制限酵素部位を含むリバースプライマー(配列番号3b)とのオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて、それより前に調製しておいたpET27b(+)-GCSF-1プラスミドベクターからPCR増幅させた。この増幅PCR産物をGel extraction Kit(Qiagen社)を用いて不純物を除去し、制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびBamHIで消化した。消化されたPCR産物を、Gel Extraction kit(Qiagen社)を用いてさらに精製した。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)に基づいた、所望のプロインスリン遺伝子配列クローニングの鋳型として、ヒト膵臓の全RNA(Clontech社)を使用した。プロインスリン遺伝子(配列番号9)のコード領域に対応する遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの対(配列番号10および11)を用いてPCRを行った。二本鎖cDNAを、MMLV逆転写酵素(MBI Fermentas社、USA)を用いた遺伝子特異的プライミングによってヒト胎盤全RNAから合成した[Maniatisら、Molecular cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)、(1990)]。次いでこのcDNAについて、Tris-Cl(pH8.3)50mM、MgCl22.5mM、4dNTPそれぞれ200μM、およびPfuポリメラーゼ2.5ユニットを含む体積100μl中、100ピコモルの遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR増幅を40サイクル行った。PCRの各増幅サイクルは、94℃30秒(変性)、58℃30秒(アニーリング)、および72℃1分(伸長)のインキュベーションで構成した。PCR反応による増幅産物を1.5%アガロースゲルで分離した。大きさが約280塩基対である所望の断片をゲルから切り出してQiagen Gel extraction kitを用いて精製した。この精製DNA断片を、ベクターと精製PCR産物の両方をBamHIおよびBpul 102 I(MBI Fermentas社、USA)で制限消化した後、pET27b-GCSF-PTH(1〜34)内にライゲーションさせた。BamHIおよびBpul 102 Iによるベクター構築物の消化により、構築物からPTH(1〜34)遺伝子を切り出し、消化された発現ベクターをQiagen Gel extraction kitを用いて精製した。精製したベクターを、消化、精製したプロインスリンPCR産物とのライゲーションに用いた。ライゲーション産物をE.coli DH5αに形質転換し、形質転換体をカナマイシン耐性に基づいて評価した。そのような10コロニーから単離したプラスミドDNAについて、種々の制限酵素を用いた制限消化によってプロインスリン遺伝子の存在を分析した。そのようなプラスミドの1つについて、自動DNAシーケンサー(ABI)を用いて配列決定し、その結果Hu-GCSF-プロインスリン融合タンパク質(配列番号9)の正しい組み込みおよび配列を有することが認められた。このプラスミドDNAをpET27B-GCSF-プロインスリンと名付けた。
アンジオテンシン融合タンパク質をコードする遺伝子を、配列番号13および14のオリゴヌクレオチドフォワードプライマー、リバースプライマーを用いたPCR反応の鋳型としてpET27b-GCSF-PTHベクター構築物を用いて構築した。ここで、フォワードプライマーはベクターの上流領域に相補的であり、リバースプライマーはエンテロキナーゼ切断部位とアンジオテンシン(1〜10)非コード領域とを含み、G-CSFの3'末端に相補的であり、それによってその反応のPCR産物がG-CSF-エンテロキナーゼ-アンジオテンシン融合産物(配列番号12)のコード配列になった。PCR反応は、Tris-Cl(pH8.3)50mM、MgCl22.5mM、4dNTPそれぞれ200μM、およびPfuポリメラーゼ2.5ユニットを含む体積100μl中100ピコモルの遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR増幅を40サイクル行った。PCRの各増幅サイクルは、94℃30秒(変性)、55℃30秒(アニーリング)、および72℃1分(伸長)のインキュベーションで構成した。PCR反応による増幅産物を1%アガロースゲルで分離した。大きさが約600塩基対である所望の断片をゲルから切り出してQiagen Gel extraction kitを用いて精製した。この精製DNA断片を、ベクターと精製PCR産物の両方をXbaIおよびBpul 102 I(MBI Fermentas社、USA)で制限消化した後、pET27b内にライゲーションさせた。このライゲーション産物をE.coli DH5αに形質転換し、形質転換体をカナマイシン耐性に基づいて評価した。そのような10コロニーから単離したプラスミドDNAについて、種々の制限酵素を用いた制限消化によってGCSF-アンジオテンシン融合タンパク質遺伝子の存在を分析した。そのようなプラスミドの1つについて、自動DNAシーケンサー(ABI)を用いて配列決定し、その結果、融合タンパク質の正しい組み込みおよび配列を有することが認められた。このプラスミドDNAをpET27b-GCSF-アンジオテンシンと名付けた。
上記3種の融合タンパク質発現ベクター構築物全てを、上記各自のE.coli DH5α宿主から抽出し、CaCl2化学的転換法を用いてE.coli BL21(DE3)中に導入し再度形質転換した。それぞれの組から得られた個々のコロニーをカナマイシン含有(50mg/L)LB培養液中に接種した。OD600が0.8に達したところで2mM IPTGを用いて培養を誘導した。誘導の16時間後に細胞を回収した。細胞懸濁液25μlをSDSおよびベータメルカプトエタノール(ゲルローディング緩衝液)の存在下で溶解させて、15%SDS PAGEにローディングし、誘導されたタンパク質バンドを濃度測定により定量化した(Image quant 400, image quant TL ver 2005, 1D gel analysis.)。
本発明の発現システムを使用すると、発酵槽における組換えPTH融合タンパク質の産生が、工業的に実行可能なようになされ得る。PTH融合タンパク質発現ベクターを有する組換えE.coli BL21(DE3)の単一コロニーを、カナマイシン含有(50mg/L)LB培地5mLに移した。培養物を37℃、200rpmにて12〜15時間増殖させた。その培養液をカナマイシン含有(50mg/L)LB培地100mLへの播種に用いた。培養物を継代培養して約1Lの培養液を得、その培養液を30Lの発酵槽内の培養培地10Lへの播種に用いた。発酵の増殖段階は、バッチ培養かフェッドバッチ培養のどちらかで行うことができ、バッチ培養およびフェッドバッチ培養の供給培地の組成は以下の通りである。具体的には、本実施例ではフェッドバッチ方式で発酵増殖段階を実施した。
バッチ培地の組成
成分 濃度(1/L)
KH2PO4 13.3g
(NH4)2HPO4 4.0g
酵母抽出物 1.0g
グルコース 20.0g
クエン酸 1.7g
MgSO47H2O 1.2g
チアミン 0.1g
微量金属溶液 20ml
カナマイシン 50mg
フェッドバッチ供給培地の組成
成分 濃度(1/L)
グルコース 700g
MgSO47H2O 20g
カナマイシン 500mg
微量金属溶液 20ml
産生段階用のフェッドバッチ供給培地の組成
成分 濃度(1/L)
グルコース 270g
酵母抽出物 214g
MgSO47H2O 1g
カナマイシン 500mg
本発明の発現システムを使用すると、組換えプロインスリン融合タンパク質が、発酵槽において、工業的に実行可能なように産生され得る。プロインスリン融合タンパク質発現ベクターを有する組換えE.coli BL21(DE3)の単一コロニーを、カナマイシン含有(50mg/L)LB培地5mLに移した。培養物を37℃、200rpmにて12〜15時間増殖させた。その培養液をカナマイシン含有(50mg/L)LB培地100mLへの播種に用いた。培養物を継代培養して約1Lの培養液を得、その培養液を30Lの発酵槽内の培養培地10Lへの播種に用いた。発酵の増殖段階は、バッチ培養かフェッドバッチ培養のどちらかで行うことができ、バッチ培養およびフェッドバッチ培養の供給培地の組成は以下の通りである。具体的には、本実施例ではフェッドバッチ方式で発酵増殖段階を実施した。
バッチ培地の組成
成分 濃度(1/L)
KH2PO4 13.3g
(NH4)2HPO4 4.0g
酵母抽出物 1.0g
グルコース 20.0g
クエン酸 1.7g
MgSO47H2O 1.2g
チアミン 0.1g
微量金属溶液 20ml
カナマイシン 50mg
フェッドバッチ供給培地の組成
成分 濃度(1/L)
グルコース 700g
MgSO47H2O 20g
微量金属溶液 20ml
産生段階用のフェッドバッチ供給培地の組成
成分 濃度(1/L)
グルコース 270g
酵母抽出物 214g
MgSO47H2O 1g
Claims (32)
- 融合パートナーとしてGCSFまたはその適切なバリアントを使用することを含む、ペプチドの産生方法。
- GCSFがペプチドとの融合産物を形成する、請求項1に記載の方法。
- 融合産物構築物が次式で表される、請求項1または2に記載の方法。
- 融合ペプチドが生理活性ペプチドである、請求項3に記載の方法。
- CSが融合パートナーもしくは融合ペプチドのアミノ酸配列内に存在するか、または適切なリンカーである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 融合パートナーのC末端とペプチドのN末端が切断部位を介して連結している、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 生理活性ペプチドが、長さが約10アミノ酸〜約90アミノ酸であるポリペプチドから選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 生理活性ペプチドが、カルトリン、カルシトニン、インスリン、アンジオテンシン、組織プラスミノーゲン活性化因子、成長ホルモン、成長因子、成長ホルモン放出因子、サイトカイン、エリスロポエチン、インターフェロン、インターロイキン、オキシトシン、バソプレシン、ACTH、コラーゲン結合性タンパク質、副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド、グルカゴン、プロインスリン、腫瘍壊死因子、サブスタンスP、脳性ナトリウム利尿ペプチド、個々の抗体重鎖および抗体軽鎖、ペプチド抗生物質、フューゼオン、オクトレオチド、ソマトスタチン、およびこれらのペプチドの適切なバリアントからなる群から選択されるペプチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 融合産物構築物をコードする発現カセットが適切な発現ベクター中にクローニングされている、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 融合産物構築物が、E.coliにおいて融合産物を発現できる発現ベクターから選択される適切な発現ベクターにコードされている、請求項9に記載の方法。
- 生理活性ペプチドが、PTH(1〜34)、アンジオテンシン、およびプロインスリンから選択される、請求項7または8に記載の方法。
- 生理活性ペプチドが、配列番号6のPTH(1〜34)である、請求項7、8または11に記載の方法。
- 生理活性ペプチドのPTH(1〜34)が、MTCC受託番号5425で寄託されている発現ベクターpET27B-GCSF-PTHによって発現される、請求項12に記載の方法。
- 生理活性ペプチドが、配列番号12および13のプロインスリンである、請求項7、8または11に記載の方法。
- 生理活性ペプチドのプロインスリンが、MTCC受託番号5424で寄託されている発現ベクターpET27B-GCSF-プロインスリンによって発現される、請求項14に記載の方法。
- 生理活性ペプチドが、配列番号16および17のアンジオテンシンである、請求項7、8または11に記載の方法。
- 生理活性ペプチドのプロインスリンが、発現ベクターpET27B-GCSF-アンジオテンシンによって発現される、請求項16に記載の方法。
- 切断部位が酵素的または化学的切断部位である、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 切断部位が化学的切断部位である、請求項18に記載の方法。
- 切断部位が酵素的切断部位である、請求項18に記載の方法。
- 切断部位が、臭化シアン、2-(2-ニトロフェニルスルフェニル)-メチル-3'-ブロモインドレニン、BNPS-スカトール、N-ブロモスクシンアミド、O-ヨードソ安息香酸、HBr/DMSO、NTCB、金属ナトリウムの液体アンモニア溶液、ヒドロキシルアミン、または希酸から選択される化学薬品によって切断可能なものである、請求項18または19に記載の方法。
- 化学薬品が臭化シアンである、請求項21に記載の方法。
- 酵素的切断部位が、エンテロキナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、ペプシン、パパイン、サブチリシン、サーモリシン、V8プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼArg C(顎下腺プロテアーゼ)、クロストリペイン、トロンビン、コラゲナーゼ、リソバクター・エンザイモゲネス(Lys C)、粘液細菌Al-1プロテアーゼ、または血液凝固因子Xaによって認識されるものである、請求項18または20に記載の方法。
- 酵素がエンテロキナーゼである、請求項23に記載の方法。
- (a)融合産物構築物をコードする遺伝子を適切な発現ベクター中にクローニングするステップと、
(b)適切な宿主細胞を上記発現ベクターで形質転換するステップと、
(c)宿主細胞において所望のポリペプチドを融合タンパク質として発現させるステップと、
(d)前記宿主細胞を破壊し、融合タンパク質を封入体として回収するステップと、
(e)融合タンパク質を含有する封入体を他の宿主成分から分離するステップと、
(f)融合タンパク質を適切な変性剤で可溶化するステップと、
(g)切断部位を適切な酵素または化学薬品で切断して融合ペプチドを遊離させるステップと、
(h)反応混合物から融合ペプチドを精製するステップと
をさらに含む、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。 - 融合産物を発現させるための宿主細胞がE.coliである、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GCSF融合パートナーが、配列番号1および2で示すヌクレオチド配列によってコードされる、請求項1に記載の方法。
- 請求項1から27のいずれか一項に記載の融合産物。
- 次式を有する、請求項28に記載の融合産物。
- 請求項1から29のいずれか一項に記載の融合産物構築物をコードする発現カセットを含む発現ベクター。
- 発現カセットが、発現宿主内で機能するプロモーターおよび他の適切な調節要素に作動可能に連結されている、請求項30に記載の発現ベクター。
- pET27B-GCSF-PTH、pET27B-GCSF-プロインスリン、およびpET27B-GCSF-アンジオテンシンから選択される、請求項30または31に記載の発現ベクター。
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