JP2010538625A - 核酸担持ウイルス様粒子を用いた遺伝子発現の下方制御 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(i)少なくとも1つのウイルスキャプシドタンパク質の幾つかの分子で構成されるウイルス様粒子(VLP)及び少なくとも1つの細胞型特異的なリガンドの結合体(ここで、VLP及びリガンドは、例えばカチオンポリマーのようなアンカー基により、又はヘテロ二官能性リンカーを通じて互いに結合される)、及び
(ii)VLP及びリガンドの結合体へ組み込まれるRNAi誘導分子を含む組成物である。
(i)上記RNAi誘導分子の存在下でのウイルスキャプシドタンパク質のVLPへの構築工程、及び
(ii)上記標的細胞への上記RNAi誘導分子の取込みが起こり得る条件下で、上記RNAi誘導分子を担持した上記VLPを上記標的細胞と接触させる工程を含む方法である。
材料及び方法
siRNA分子の構築及び合成
化学的に合成されたRNAオリゴヌクレオチドは、Dharmacon(コロラド州、ラフィーエット)から入手した。siRNA分子は全て、3’−dTdTオーバーハングを含有した。蛍光標識は、その官能性に影響を及ぼさないように、siRNA分子のセンス鎖の5’末端に連結させた。PCR用のヌクレオチド(dNTP)は、Boehringer(ドイツ、マンハイム)から入手し、in vitroでの転写を用いてshRNAを生産するためのPCRプライマー及びDNAフラグメントは、NAPS(ドイツ、ゲッティンゲン)により供給された。化学的に合成された、27ヌクレオチドの長さを有する二重鎖RNA(27merdsRNA)は、IBA(ドイツ、ゲッティンゲン)により供給された。
形質導入された細胞を、処理の44時間後にVLPとともに−20℃冷メタノールで処理した。一次抗体として、マウス抗ラミン A/C抗体(クローン636.23)、マウス抗エメリン抗体(Novagen)及びマウス抗α−チューブリン抗体(D1H、Sigma、ドイツ)を使用した。二次抗体として、ローダミン又はフルオレセイン結合ヤギ抗マウスIgGを使用した。固定化後、PBSで洗浄した細胞を、37℃にて湿気チャンバ中で一次抗体とともに1時間インキュベートした。次に、細胞をPBSで3回洗浄して、蛍光二次抗体を37℃で1時間添加した。PBSで3回洗浄することにより、未結合抗体を除去した後、2μM ヘキスト33342色素(Hoechst、ドイツ)でDNAを可視化させた。これに関して、細胞を、スライドガラス上でモヴィオール(Hoechst、ドイツ)により固定化させた。
SDSゲル電気泳動は、標準的なプロトコルに従って実施した。タンパク質は、標準的なSDSゲル電気泳動を用いて分離させて、半乾燥転写方法を使用してニトロセルロース膜上へ転写した。膜をTBST(20mM トリスHCl、150mM NaCl、0.2%ツイーン20、pH7.4)でブロックした。ここで、TBSTは、脱脂粉乳粉末を5%含有していた。ラミンA/C、エメリン又はビメンチンに対する抗体もまた、TBST中で希釈した。ここで、TBSTは、脱脂粉乳粉末を2.5%含有していた。そのようにして希釈した抗体を、室温で1時間膜とともにインキュベートした。ウェスタンブロットにおいて同一量のタンパク質の分析を可能にするために、ビメンチンタンパク質含有量を確定した。膜をTBSTで2度、0.5%トリトンX−100を加えたTBSTで1度洗浄した。アフィニティ精製したホースラディッシュ結合ブタ抗マウス免疫グロブリンは、Dako(デンマーク、コペンハーゲン)から入手した。それらを、脱脂粉乳を2.5%含有するブロッキング緩衝液中に1:10000で希釈して、室温で2時間、膜とともにインキュベートした。ECLキット(Amersham Biosciences)を使用してバンドを検出して、ルミイメージャー(Boehringer/Roche、ドイツ)で定量化した。
ポリオーマJCウイルスのVP1タンパク質を、バキュロウイルス系を使用して昆虫細胞(SF)で発現させた。分泌されたタンパク質を、勾配遠心分離又はイオン交換FPLCを使用して培地上清から単離した。
siRNA担持VLPによる処理の24時間前に、細胞をそれぞれ、24ウェルプレートに50000細胞/ml〜100000細胞/mlで播いた。浮遊状態で培養された細胞(即ち、SupT1細胞株及びHeLa S3細胞株)の場合、トランスフェリン代謝を刺激するために、また細胞表面上のトランスフェリン受容体の密度を増大させるために、培養培地に、0.5ng/mlのデスフェリオキサミンを補充した。VLPによる直前に、作用物質の細胞毒性副作用を回避するために、刺激培地を正常な培養培地と取り替えた。
ヒトグリオーマ細胞へのDNA及びsiRNAの導入
siRNA担持VLPを、ヒトグリオーマSW103細胞の培養培地へ添加した。処理の1時間後、ヒトラミンA/C(siLamA−F)に対して作用する蛍光標識されたsiRNAを、グリオーマ細胞の細胞質で観察することができた(図1を参照)。裸のsiRNA及び空VLPによる対照細胞の処理により、VLPにパッケージングされたsiRNAのみの特異的な取込みが確認された。VLP形質導入の24時間後に、RNA干渉効果を考慮して、間接的免疫蛍光顕微鏡法及びウェスタンブロット分析を用いて細胞を検査した。標的タンパク質ラミンA/Cの量は、siLamA−F−VLPで処理した細胞中で有効に下方制御されたのに対して、このことは対照細胞では観察することができなかった(図1)。
siRNA担持VLPを、種々のヒト細胞株の培養培地へ添加した。HeLa SS6細胞に関して幾つかの実験を実施した。VLPによる処理の24時間前に、細胞を静置培養した。検査は、この処理の24時間後又は48時間後に行った。
1.siRNA分子のPEI−Tf−VLP媒介性導入による用量依存的及び機能的RNA干渉
HeLa細胞を約75000細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートで培養し、24時間後にVLP 1μg又は5μgで処理した。機能的且つ有効なRNA干渉に要されるsiRNA分子の量を確定するために、再構築緩衝液中でVLPに50nM又は3μMのsiRNAを添加した。空VLP、非関連siRNA分子を担持したVLP及び単にPEI−Tfと複合体形成したsiRNA分子は、対照として用いた。トランスフェリン受容体を用いた細胞への取込みを可能にするために、PEI−Tfを1:5(PEI−Tf 1μg:siRNA−VLP 5μg)の比で再構築された担持VLPへ添加した。24ウェルプレートの各ウェルの約100000細胞において効率的なRNA干渉を行うためには、これらを3μM siRNAで担持されたVLP 5μgで処理する必要がある(図2)。50nM siRNA担持VLPによるsiRNAの形質導入は、単に標的タンパク質ラミンA(/C)の若干の減少を招いたに過ぎなかった。siRNAの取込みは、蛍光標識されたsiRNA siLamA−Fの形質導入を用いて確認され、下方制御の影響は、定量的ウェスタンブロット分析及び間接的免疫蛍光顕微鏡法を用いてタンパク質レベルに関して検査された。空PEI−Tf−VLPによるか又は非関連siRNAを含有するVLPによる細胞の形質導入は、ラミンA(/C)タンパク質含有量の減少に至らなかった。VLPを伴わないPEI−Tfと複合体形成されたsiRNAは、ラミンA(/C)発現の弱い阻害を引き起こし(ここでは、それにも関わらず、下方制御は15%〜20%に限られた)のに対して、siLamA−PEI−Tf−VLPは、適切な濃度で使用される場合に標的タンパク質のほぼ完全な下方制御(「ノックダウン」)を引き起こした(HeLaAの図)。ラミンA/Cに対して作用する3つの異なるsiRNA分子(そのうちの1つは、蛍光標識された)は、細胞への及び細胞質へのVLPの取込みを可視化するためにHeLa細胞に関して検査された。siRNA分子は全て、それらがPEI−Tf−VLPの形態で細胞へ投与された場合に、標的タンパク質発現の有効な下方制御を導いた。
さらに、非古典的なsiRNA、即ちsiL27AC(これは、3’オーバーハングを有さない27ヌクレオチドの長さを有する5’リン酸化dsRNAで構成される)をHeLa細胞へ形質導入して、これがラミンA/Cタンパク質の発現の効率的な下方制御を引き起こした。したがって、本発明による組成物はまた、VLPを細胞のRNA干渉機構に利用可能とするために、VLPの27merdsRNA担持により標的細胞の細胞質へエンドヌクレアーゼダイサー用の基質を導入することも可能にする。
ヒトエメリン遺伝子に対して作用する3つの異なるsiRNA分子の第2の組を、上述したようにヒト乳癌MCF−7細胞へ形質導入した。定量的ウェスタンブロット分析により、これらの実験で使用された3つのsiRNA種は全て、標的遺伝子の下方制御を首尾よく引き起こすことが示された(図2A)。これらの結果は、種々のタイプの細胞において代替標的遺伝子に対して作用するsiRNA分子の効率的なトランスファーの観点からVLPが広範に適用可能であることを強調するものである。
ヒトSupT1 T細胞を浮遊状態で培養し、VLPによる処理の24時間前に静置培養した。細胞エネルギー代謝を誘導するために、また細胞の表面上のトランスフェリン受容体の密度を増大させるために、15nMのデスフェリオキサミンを培養培地に添加した。VLPによる処理の直前に、培地を標準的な培養培地で取り替えて、VLPは上記で挙げられるような量で添加した。SupT1細胞は、内因性ヒトエメリンに対して作用するsiRNA分子を含有するVLP、非関連siRNA(GL2)を含有するVLP又はsiRNAを含有しないVLPで形質導入した(図3)。同じVLPをPEI−トランスフェリンを伴わせるかまたは伴わせずに対照として使用した。さらなる対照として、細胞をPEI−Tfと複合体形成されたsiRNA分子で処理したが、このRNAは、VLPへ組み込まれなかった。細胞の細胞質へのsiRNA分子の取込みを示すために、蛍光標識されたsiRNAを使用した。共焦点顕微鏡法を使用して、SupT1細胞の細胞質における蛍光siRNAの均質な分散が示された。かかる細胞のX軸に沿った切片を図3Aに示す。VLP導入されたsiRNAを用いた標的遺伝子発現の有効な下方制御は、間接的免疫蛍光顕微鏡法(図3B)及びウェスタンブロット分析(図3C)を使用して確認された。結果として、処理した細胞のほぼ100%でエメリン遺伝子発現の非常に効率的な下方制御が示された一方で、非関連siRNAによる処理では、エメリンの含有量に影響を与えなかった。ウェスタンブロットデータにより、細胞をsiEme担持PEI−Tfと複合体形成されたVLPで処理した場合にのみ、エメリンの十分な下方制御が達成され得る一方で、PEI−Tf複合体形成単独ではタンパク質の測定可能な下方制御に至らないことが示された。
野生型配列と比較して、アミノ末端領域に修飾を有する修飾タンパク質VP1−Mut2を生産した。この修飾のため、ウイルスSV40又はBKVの配列に基づく異種核局在化シグナルのアミノ酸配列が導入された。異種核局在化シグナルの配列を図4Aに示す。
ヘテロ二官能性リンカーを使用して、リガンドをVP1タンパク質へ直接結合させることができる。かかる連結方法に関する好ましい実施形態を図5に表す。
Claims (43)
- 少なくとも1つのウイルスキャプシドタンパク質の幾つかの分子で構成されるウイルス様粒子(VLP)を含む組成物であって、少なくとも1つのRNA干渉(RNAi)誘導分子が、該VLPの内部に含まれることを特徴とする組成物。
- 前記RNAi誘導分子が、RNA及び/又はRNA類似体である、請求項1に記載の組成物。
- 前記RNAが、siRNA、miRNA、dsRNA、shRNA又はそれらの前駆体である、請求項2に記載の組成物。
- 前記RNAi誘導分子が、siRNA、miRNA、dsRNA、shRNA若しくはそれらの前駆体をコードするDNA及び/又はDNA類似体である、請求項1に記載の組成物。
- 該DNAが、標的細胞中での発現を可能にする調節エレメントをさらに含むことを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
- VLP対RNAi誘導分子の質量比が、100:1〜1:100の範囲に存在することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- VLP対RNAi誘導分子の質量の比が、1:1〜20:1の範囲に存在することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記VLPが、ヒトポリオーマJCウイルスのキャプシドタンパク質VP1で構成される、請求項1に記載の組成物。
- 前記VLPが、標準のウイルスの他の構成成分を含まない、請求項1に記載の組成物。
- 該VLPの少なくとも1つのキャプシドタンパク質が修飾される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 該VLPの少なくとも1つのキャプシドタンパク質が、化学的に修飾される、請求項10に記載の組成物。
- 該VLPの少なくとも1つのキャプシドタンパク質が、少なくとも1つの標的細胞特異的なサブユニットと結合される、請求項11に記載の組成物。
- 前記標的細胞特異的なサブユニットが、該標的細胞の細胞表面上に提示される受容体に結合することが可能であるリガンドであることを特徴とする、請求項12に記載の組成物。
- 前記リガンドがトランスフェリンであり、前記受容体がトランスフェリン受容体であることを特徴とする、請求項13に記載の組成物。
- 前記標的細胞特異的なサブユニットが、化学リンカー基を用いて該VLPの少なくとも1つのキャプシドタンパク質に結合されることを特徴とする、請求項12〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記リンカー基が、カチオンポリマーであることを特徴とする、請求項15に記載の組成物。
- 前記カチオンポリマーが、ポリエチレンイミンであることを特徴とする、請求項16に記載の組成物。
- 前記キャプシドタンパク質が、融合タンパク質である、請求項10に記載の組成物。
- 前記融合部分が、前記VLPの形成を妨害しないことを特徴とする、請求項18に記載の組成物。
- 前記融合部分が、標的細胞の細胞表面上に提示される受容体に結合することが可能であることを特徴とする、請求項18又は19に記載の組成物。
- 修飾されたキャプシドタンパク質から成る該VLPが、非修飾VLPの宿主スペクトルと同一でない宿主スペクトルを有することを特徴とする、請求項1〜20のいずれか1項に記載の組成物。
- 該VLPの前記キャプシドタンパク質が、組換え的に生産されることを特徴とする、請求項1〜21のいずれか1項に記載の組成物。
- RNAi誘導分子を標的細胞へ導入するための請求項1〜22のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- 該標的細胞が、真核細胞であることを特徴とする、請求項23に記載の使用。
- 該真核細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする、請求項24に記載の使用。
- 該哺乳類細胞が、ヒト由来であることを特徴とする、請求項25に記載の使用。
- 該標的細胞中の少なくとも1つの遺伝子の発現が、病的状態と相関する、請求項23〜26のいずれか1項に記載の使用。
- 少なくとも1つの遺伝子が、病原性ウイルスから生じるか又は病原性ウイルスに由来する標的細胞中で発現される、請求項27に記載の使用。
- 少なくとも1つの内因性遺伝子の発現が、該標的細胞で増加される、請求項23〜26のいずれか1項に記載の使用。
- 該内因性遺伝子の該発現の増加が、病的状態と相関する、請求項29に記載の使用。
- 薬剤としての使用ための請求項1〜22のいずれか1項に記載の組成物。
- 病原性生物から生じるか又は病原性生物に由来する核酸の発現により、或いは内因性遺伝子の発現の増加又は望ましくない発現により引き起こされる疾患若しくは疾患状態の診断、予防及び/又は治療のための薬剤を製造するための請求項1〜22のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- 該RNAi誘導分子の存在下での該ウイルスキャプシドタンパク質のVLPへの構築を含む、請求項1〜22のいずれか1項に記載の組成物を製造する方法。
- 標的細胞の細胞表面上の受容体に結合することが可能である該VLPへの標的細胞特異的な基の連結をさらに含む、請求項33に記載の組成物を製造する方法。
- RNAi誘導分子を標的細胞へ導入する方法であって、
(i)該RNAi誘導分子の存在下でのウイルスキャプシドタンパク質のVLPへの構築の工程、及び
(ii)該RNAi誘導分子を担持する該VLPを、該標的細胞への該RNAi誘導分子の取込みを可能にする条件下で該標的細胞と接触させる工程を含む方法。 - 標的細胞の細胞表面上の受容体に結合することが可能である該VLPへの標的細胞特異的な基の連結をさらに含む、請求項35に記載の方法。
- 標的細胞中で少なくとも1つの遺伝子を下方制御する方法であって、
(i)請求項1〜22のいずれか1項に記載の組成物を供給する工程、及び
(ii)工程(i)からの該組成物を、該標的細胞への該RNAi誘導分子の取込みを可能にする条件下で該標的細胞と接触させる工程
を含む方法。 - 請求項1〜22のいずれか1項に記載の組成物を含む、RNAi誘導分子を標的細胞へ導入するための試験キット。
- 任意で一般的な緩衝液、助剤、添加剤及び/又は希釈剤とともに、請求項1〜38のいずれか1項において規定されるようなVLP及びRNAi誘導分子を含む薬学的組成物。
- 病原性生物から生じるか又は病原性生物に由来する核酸の発現により、或いは内因性遺伝子の発現の増加又は望ましくない発現により引き起こされる疾患若しくは疾患状態の治療及び/又は診断のための請求項39に記載の薬学的組成物の使用。
- 異種核局在化シグナル、異種核局在化シグナルをコードする核酸を含有する修飾JCV−VP1キャプシドタンパク質、又はそれ相応に修飾された少なくとも1つのキャプシドタンパク質を含有するVLP組成物。
- 少なくとも1つの免疫刺激性核酸が、任意でポリペプチド若しくはペプチド免疫原、アプタマー又はsiDNA分子と組み合わせてVLPの内部に含まれることを特徴とするVLP組成物。
- 少なくとも1つの異種結合パートナー、例えばポリペプチドへ、アミノ酸残基K60及び/又はK164を介して結合されるJCV−VP1キャプシドタンパク質。
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