JP2010538299A - 機能性高分子の単離方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2007年9月6日出願の米国仮特許出願第60/967,667号の優先権を主張し、この仮特許出願の全内容は参照によりここに組み込まれる。
a)機能性高分子を含むサンプルを、充填アルミナ吸着剤を含む固相抽出(SPE)装置に、機能性高分子がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードする工程;および
b)吸着した機能性高分子をアルミナ吸着剤から溶出し、それにより機能性高分子をサンプルから選択的に単離する工程、
を含む方法を提供する。
a)機能性高分子複数を含むサンプルを、充填アルミナ吸着剤を含む第1固相抽出(SPE)装置に、機能性高分子複数がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードする工程;および
b)吸着した機能性高分子をアルミナ吸着剤から溶出する工程;
c)少なくとも1つの画分を収集する工程;
d)少なくとも1つの画分を、充填アルミナ吸着剤を含む第2固相抽出(SPE)装置に、少なくとも2つの機能性高分子がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードする工程;および
c)少なくとも2つの吸着した機能性高分子を第2固相抽出(SPE)装置のアルミナ吸着剤から溶出し、それにより機能性高分子複数をサンプルから選択的に単離する工程、
を含む方法を提供する。
a)機能性高分子を含むサンプルを、充填アルミナ吸着剤を含む固相抽出(SPE)装置に、機能性高分子がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードし;および
b)吸着した機能性高分子をアルミナ吸着剤から溶出し、それにより機能性高分子をサンプルから選択的に単離し、それにより機能性高分子を精製する、
ことを含む方法を提供する。
a)機能性高分子を含むサンプルを、充填アルミナ吸着剤を含む固相抽出(SPE)装置に、機能性高分子がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードする工程;および
b)吸着した機能性高分子をアルミナ吸着剤から溶出し、それにより機能性高分子をサンプルから選択的に単離し、それにより機能性高分子を精製する工程;および
c)機能性高分子を検出する工程、
を含む方法を提供する。
a)酸および有機溶媒を含む溶液中にサンプルを溶解する工程;
b)溶解したサンプルを、充填アルミナ吸着剤を含む固相溶出プレートまたはカラムに、リン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはリン脂質がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードする工程;
c)塩基性移動相を用いてリン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはリン脂質をアルミナから溶出する工程;および
d)単離されたリン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはリン脂質を収集し、それによりリン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはリン脂質を選択的に単離する工程、
を含む方法を提供する。
本発明のさらなる説明に先立ち、本発明をより容易に理解できるように、便宜上まず特定の用語を定義してここに集める。
本発明は、アルミナ吸着剤を含む固相抽出(SPE)装置であって、アルミナ吸着剤がSPE装置に充填される装置を用いて、機能性高分子もしくは機能性高分子の混合物を選択的に単離/分離、精製、検出および/もしくは分析するための方法を提供する。本発明の方法は化合物の複合混合物を分離し、それにより分解(resolving)することが可能であり、これによりこのような混合物の成分化合物の迅速な単離/分離、精製、検出および/または分析を可能にする。
本発明によると、固相抽出(SPE)装置は、器具または容器、例えば、溶出プレートのリザーバ、カラムまたはカートリッジに充填される、アルミナ吸着剤を含む。装置において用いられるアルミナ吸着剤粒子には、これらに付着する、標的または妨害物質のいずれかの、少なくとも1つの物質を有することが可能であるあらゆるアルミナ粒子物質が含まれる。当業者は、過度の負担または実験なしに、並びに本発明の範囲を逸脱することなしに、吸着剤粒子のサイズ、形状、表面積および細孔容積を決定することができる。
ある実施形態において、本発明において用いられる固相抽出装置は微量溶出プレートを含む。これらの実施形態において、アルミナ吸着剤粒子の床は微量溶出プレートに充填される。
本発明の方法は、典型的には、関心分析物をサンプル溶液から固相抽出装置のアルミナ抽出表面上に吸着させ、吸着した分析物をアルミナ抽出表面に結合させたままにしながらサンプル溶液を実施的に排出し、脱着溶液中でチャンネルから分析物を溶出することを含む。脱着した分析物は収集することができ、典型的には、幾つかの技術(このうちの幾つかはここでより詳細に説明される。)のうちのいずれかによって分析される。幾つかの実施形態においては、溶出に先立ち、アルミナ抽出表面を洗浄する。この抽出法は、一般には、分析物もしくは関心分析物の濃厚化(entichment)、濃縮(concentration)および/または精製を生じる。
本発明の幾つかの実施形態においては、脱着溶媒勾配、段階溶出および/もしくは多元溶出を行う。勾配の使用はクロマトグラフィーの分野においては周知であり、例えば、ここで引用される一般的なクロマトグラフィー参考文献の幾つかに詳細に記載される。本発明の抽出チャンネルに適用する場合、基本原理には、分析物をアルミナ抽出表面に吸着させた後、脱着溶媒勾配で溶出することが含まれる。この勾配は溶媒の少なくとも1つの特徴の変化、例えば、pH、イオン強度、極性もしくは結合相互作用の強度に影響を及ぼす幾つかの薬剤の濃度の変化を指す。勾配は、相互作用、特には、特異的結合相互作用を妨害またはこれを安定化する化学的実体の濃度に関するものであり得る。
本発明の抽出は、典型的には、サンプル溶液中のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質分析物のローディング、すすぎ溶液での場合による洗浄および脱着溶液中への分析物の溶出を含む。好ましい場合において、分析物はリン酸化ペプチドである。サンプル溶液に関しては、これは、典型的には、溶媒に溶解した分析物からなり、この溶媒中では分析物が可溶であり、分析物がアルミナ抽出表面に結合する。好ましくはこの結合は強力であって分析物の実質的な部分の結合を生じ、最適には、この手順において用いられるローディングプロトコルの下で分析物の実質的にすべてが結合する。溶媒は、分析物の本来の構造および機能がアルミナ抽出表面からの脱着時に保持されるように、穏やかでもなければならない。典型的には、溶媒は、緩衝剤、塩および/または表面活性剤を典型的に含んで分析物を可溶化および安定化する、水性溶液である。サンプル溶液の例には、細胞溶解物、ハイブリドーマ成長培地、細胞非含有翻訳または転写反応混合物、組織、器官もしくは生物学的サンプルからの抽出物および生体液から誘導される抽出物が含まれる。
混合物中に存在する分析物または化合物は、例えば、(例えば、ペプチド合成または、タンパク質もしくはタンパク質の混合物の消化を含む、生物学的サンプルからの)ペプチドもしくはポリペプチド、(例えば、生物学的サンプルもしくは合成ポリヌクレオチドからの)核酸もしくはポリヌクレオチド、合成もしくは天然ポリマーまたはこれらの物質の混合物であり得る。化合物のタイプは、ここに記載されるように、化合物分離用に選択されるクロマトグラフィー法によってのみ制限される。ある好ましい実施形態において、検出、分析または精製しようとする分析物はペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、特には、リン酸化ペプチドである。
本発明の抽出チャンネルおよび関連方法には、様々な技術によって分析または検出するための分析物のサンプルの調製における格別の有用性が見出される。特には、これらの方法は、生物学的サンプル、例えば、生体液を起源とする生体分子からの分析物、分析物のクラス、分析物の凝集体(例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質および/もしくはリン酸化ペプチド)等の精製に有用である。多くの場合、分析のこれらの形態の結果は分析物濃度を高めることによって改善される。本発明の幾つかの実施形態において、関心分析物はタンパク質であり、抽出は分析に先立ってタンパク質を精製および濃縮する役割を果たす。これらの方法はラベルフリーの検出方法または機能的、未変性(即ち非変性タンパク質)を必要とする方法での使用に特に適するが、あらゆる関心タンパク質または核酸に一般に有用である。
本発明は、上述の固相抽出装置並びにこのような装置およびこの装置をここに記述される本発明の方法に従って用いるための取扱説明書を含むキットを提供する。
本発明を以下の例によってさらに説明するが、これらの例はさらに限定するものと解釈されてはならない。
試験サンプルは、4種類の合成リン酸化ペプチド(トリプシンエノラーゼペプチドの修飾体であるT18_1P、T19_1P、T43_1PおよびT43_2P)を非修飾酵母エノラーゼトリプシンペプチドと1:10モル比で混合することによって調製した。試験サンプルは、SPE装置にロードするため、低pH(<1)、高有機溶媒(例えば、80%アセトニトリル)で戻した。SPEは同じ低pH、高有機溶媒で洗浄した。親和性結合した分析物は高塩基性pHの溶離液(>10)で溶出した。
本出願を通して引用されるすべての参考文献(参考文献、発行特許、公開特許出願および同時係属特許出願を含む。)の内容は参照によりこれらの全体がここに明白に組み込まれる。
当業者は本明細書に記述される発明の特定の実施形態の多くの等価物を認めるか、または、定型的な実験に収まるものを用いて、確認することができる。このような等価物は、以下の請求の範囲によって包含されることが意図される。
Claims (64)
- 機能性高分子をサンプルから選択的に単離するための方法であって、
a)機能性高分子を含有するサンプルを、充填アルミナ吸着剤を含む固相抽出(SPE)装置に、機能性高分子がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードする工程;および
b)吸着した機能性高分子をアルミナ吸着剤から溶出し、それにより機能性高分子をサンプルから選択的に単離する工程、
を含む方法。 - 複数の機能性高分子をサンプルから選択的に単離するための方法であって、
a)複数の機能性高分子を含むサンプルを、充填アルミナ吸着剤を含む第1固相抽出(SPE)装置に、複数の機能性高分子がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードする工程;および
b)吸着した機能性高分子をアルミナ吸着剤から溶出する工程;
c)少なくとも1つの画分を収集する工程;
d)少なくとも1つの画分を、充填アルミナ吸着剤を含む第2固相抽出(SPE)装置に、少なくとも2つの機能性高分子がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードする工程;および
c)少なくとも2つの吸着した機能性高分子を第2固相抽出(SPE)装置のアルミナ吸着剤から溶出し、それにより複数の機能性高分子をサンプルから選択的に単離する工程、
を含む方法。 - サンプルに含まれる機能性高分子を精製するための方法であって、
a)機能性高分子を含むサンプルを、充填アルミナ吸着剤を含む固相抽出(SPE)装置に、機能性高分子がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードすること、および
b)吸着した機能性高分子をアルミナ吸着剤から溶出し、それにより機能性高分子をサンプルから選択的に単離し、それにより機能性高分子を精製すること、
を含む方法。 - サンプル中の機能性高分子を検出するための方法であって、
a)機能性高分子を含むサンプルを、充填アルミナ吸着剤を含む固相抽出(SPE)装置に、機能性高分子がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードする工程;および
b)吸着した機能性高分子をアルミナ吸着剤から溶出し、それにより機能性高分子をサンプルから選択的に単離し、それにより機能性高分子を精製する工程;および
c)機能性高分子を検出する工程、
を含む方法。 - 機能性高分子がペプチド、ポリペプチド、リン酸化ペプチド、糖ペプチド、タンパク質、リンタンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、リン脂質、合成または天然ポリマーおよびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 機能性高分子がペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リン酸化ペプチドおよびオリゴヌクレオチドおよびリン脂質からなる群より選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 機能性高分子が高酸性側鎖を含む、請求項6に記載の方法。
- 機能性高分子がリン酸、スルホン酸もしくはシアリレート基を含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である、請求項6に記載の方法。
- ペプチドがリン酸化ペプチドである、請求項6に記載の方法。
- リン酸化ペプチドがT18_P、T19_1P、T43_1PおよびT43_2Pからなる群より選択される、請求項9に記載の方法。
- 機能性高分子が酸性ペプチド、中性ペプチドまたは塩基性ペプチドを上回って選択的に単離される、請求項8に記載の方法。
- 機能性高分子が酸性ペプチドを上回って選択的に単離される、請求項9に記載の方法。
- 機能性高分子がリン酸化ペプチド、シアル化糖ペプチド、スルホン化ペプチドまたはスルホン化糖ペプチドである、請求項8に記載の方法。
- 機能性高分子がリン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはリン脂質である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 機能性高分子がシアル化糖ペプチドである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- SPE装置が微量溶出プレート、クロマトグラフィーカラム、薄層プレート、サンプル浄化装置、注入カートリッジ、マイクロタイタープレートおよびクロマトグラフィー準備装置からなる群より選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- SPE装置が微量溶出プレートまたはクロマトグラフィーカラムである、請求項16に記載の方法。
- SPE装置が96−ウェル微量溶出プレートである、請求項17に記載の方法。
- SPE装置がクロマトグラフィーカラムである、請求項17に記載の方法。
- アルミナ吸着剤がアルミナA、アルミナNおよびアルミナBからなる群より選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- アルミナAが約4.5のpHを有する、請求項20に記載の方法。
- アルミナNが約7のpHを有する、請求項20に記載の方法。
- アルミナBが約10のpHを有する、請求項20に記載の方法。
- アルミナ吸着剤がアルミナBである、請求項20に記載の方法。
- アルミナ吸着剤がHPLC級である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- カラムがマイクロボアカラム、キャピラリーカラムもしくはナノカラムである、請求項19に記載の方法。
- 微量溶出プレートにHPLC級アルミナ吸着剤が充填される、請求項18に記載の方法。
- アルミナがアルミナBである、請求項27に記載の方法。
- アルミナ吸着剤粒子のサイズが約18から約32μmの範囲をとる、請求項27から29のいずれか一項に記載の方法。
- サンプルが血液、尿、脊髄液、滑液、痰、精液、唾液、涙、胃液およびこれらの抽出物並びに/または希釈液/溶液からなる群より選択される生体液であるか、またはこれらから誘導される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- サンプルが化合物の生物学的複合体(complex biological of compounds)を含む、請求項30に記載の方法。
- サンプルが反応混合物、調製用HPLC、クロマトグラフィー溶離液もしくは画分または環境サンプルであるか、またはこれらから誘導される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- サンプルを、ローディングに先立ち、酸溶液/有機溶液の混合液に溶解する、請求項30から32のいずれか一項に記載の方法。
- 酸溶液が約0から約4の範囲のpHを有する、請求項33に記載の方法。
- 酸溶液が約1から約3の範囲のpHを有する、請求項33に記載の方法。
- 酸溶液がトリフルオロ酢酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルホン酸、リン酸、パラ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、重酒石酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ベシル酸、フマル酸、グルコン酸、グルクロン酸、ギ酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、乳酸、シュウ酸、パラ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸もしくは酢酸の水溶液から選択される、請求項33に記載の方法。
- 有機溶液が有機溶媒または有機溶媒および非有機溶媒の混合液である、請求項33に記載の方法。
- 有機溶媒がアセトニトリル、アセトン、エタノール、メタノール、2−プロパノール、エーテル、テトラヒドロフラン、1,4−ジオキサン、ベンゼン、トルエン、クメン、塩化メチレン、トリクロロメタン、四塩化炭素、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリジン−2−オンおよびジメチルスルホキシドから選択される、請求項37に記載の方法。
- 非有機溶媒が水である、請求項37に記載の方法。
- 吸着した機能性高分子を塩基性移動相溶液でアルミナ吸着剤から溶出する、請求項8に記載の方法。
- 塩基性移動相溶液が水酸化アンモニウム溶液、トリエチルアミンもしくはリン酸ジアンモニウムから選択される、請求項40に記載の方法。
- サンプルを第1pHを有する溶液に溶解し、固相抽出(SPE)装置にロードし、第2pHを有する移動相溶液で機能性高分子をアルミナから溶出する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- ローディング工程で置換剤を添加することをさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 置換剤が置換カルボン酸誘導体である、請求項43に記載の方法。
- 機能性高分子を検出する工程をさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 検出工程が質量分析もしくは液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)を含む、請求項45に記載の方法。
- 生物学的混合物を含むサンプルからリン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはリン脂質を選択的に単離するための方法であって、
a)酸および有機溶媒を含む溶液中にサンプルを溶解する工程;
b)溶解したサンプルを、充填アルミナ吸着剤を含む固相溶出プレートまたはカラムに、リン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはリン脂質がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードする工程;
c)塩基性移動相を用いてリン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはリン脂質をアルミナから溶出する工程;および
d)単離されたリン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはリン脂質を収集し、それによりリン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドもしくはリン脂質を選択的に単離する工程、
を含む方法。 - 溶出プレートが微量溶出プレートである、請求項47に記載の方法。
- カラムがマイクロボアカラム、キャピラリーカラムまたはナノカラムである、請求項47に記載の方法。
- 微量溶出プレートが96のウェルを含み、HPLC級アルミナ吸着剤で充填される、請求項48に記載の方法。
- アルミナがアルミナBである、請求項50に記載の方法。
- アルミナ吸着剤粒子のサイズが約18から約32μmの範囲をとる、請求項51に記載の方法。
- 機能性高分子がリン酸化ペプチドである、請求項1から52のいずれか一項に記載の方法。
- 機能性高分子がオリゴヌクレオチドである、請求項1から52のいずれか一項に記載の方法。
- 機能性高分子がリン脂質である、請求項1から52のいずれか一項に記載の方法。
- 充填アルミナ吸着剤を含む固相抽出(SPE)装置を含む固相抽出(SPE)装置および請求項1から55に記載のいずれか一項に記載の方法に従って用いるための取扱説明書を含むキット。
- SPE装置が微量溶出プレート、クロマトグラフィーカラム、薄層プレート、サンプル浄化装置、注入カートリッジ、マイクロタイタープレートおよびクロマトグラフィー準備装置からなる群より選択される、請求項56に記載のキット。
- SPE装置が微量溶出プレートまたはクロマトグラフィーカラムである、請求項57に記載のキット。
- SPE装置が96−ウェル微量溶出プレートである、請求項58に記載のキット。
- SPE装置がクロマトグラフィーカラムである、請求項56に記載のキット。
- カラムがマイクロボアカラム、キャピラリーカラムまたはナノカラムである、請求項60に記載のキット。
- アルミナ吸着剤がアルミナA、アルミナNおよびアルミナBからなる群より選択される、請求項56から61のいずれか一項に記載のキット。
- アルミナ吸着剤がHPLC級である、請求項56から61のいずれか一項に記載のキット。
- アルミナ吸着剤粒子のサイズが約18から約32μmの範囲をとる、請求項56から61のいずれか一項に記載のキット。
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