CN114096842A - 寡核苷酸的无离子对lc-ms生物分析 - Google Patents

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Abstract

本文公开了对不含离子对试剂的寡核苷酸进行LC‑MS分析的方法。历史上，离子对试剂已被用于质谱分析之前的可接受的萃取和色谱法。本文的公开内容提供了在从萃取到LC‑MS终点的每个阶段都不含离子对试剂的方法。这些方法改善了测定的可靠性和重现性，延长了柱寿命，并减少了在先去除离子对残留物所必不可少的仪器停机时间。本文还公开了用于实施这些方法的系统。

Description

寡核苷酸的无离子对LC-MS生物分析
相关申请
本申请要求2019年6月14日提交的美国临时专利申请No.62/861,572的优先权。
背景
从历史上看，通过液相色谱法与质谱法联用对治疗性寡核苷酸进行生物分析与离子对试剂的使用密切相关。传统上，这些不仅存在于LC-MS分析终点，而且还存在于上述样品制备中，并且离子对在所有报道的寡核苷酸LC-MS方法中的某个时间点为可操作的。离子对伴随着相关现象，如信号抑制和信号稳定性差，导致重现性差、柱寿命缩短和仪器停机时间增加以去除离子对残留物。
需要一种用于寡核苷酸分析的定量LC-MS方法，其中该方法在所有阶段都从离子对中解放出来。
概述
本文公开了一种在无离子对的条件下对寡核苷酸进行LC-MS分析的方法的实施方案。
在一些实施方案中，该方法包括提供认为包含至少一种关注的组分的样品；在无离子对的条件下进行所述至少一种关注的组分的萃取，其中所述萃取是固相萃取，并且其中所述至少一种关注的组分为寡核苷酸；在无离子对的条件下通过液相色谱法来分离所述组分；并且在无离子对的条件下通过质谱分析来分析所述组分。
还公开了在无离子对的条件下对寡核苷酸进行LC-MS分析的系统的实施方案。
附图简述
图1描绘寡核苷酸RM1和内标VA1的序列。
图2描绘根据本公开的实施方案的样品制备和萃取方案。
图3显示根据本公开的一个实施方案进行的不同水性:有机组合物的固相萃取(SPE)洗脱筛选的相对回收率。
图4为根据本公开的一个实施方案在任何步骤无离子对产生的Waters’MassPREPOSTTM标准寡核苷酸测试混合物的200nM稀释液的亲水相互作用液相色谱(HILIC)的色谱图。
图5显示与使用本文提出的方法的实施方案生成的分析物RM1的定量下限(5A)和随附内标VA1(5B)相关的代表性色谱图。
图6显示与使用本文提出的方法的一个实施方案生成的RM1的定量上限(6A)和随附内标VA1(6B)相关的代表性色谱图。
发明详述
以下描述叙述了本方法和系统的各个方面和实施方案。没有特定实施方案旨在定义所述方法和系统的范围。相反，所述实施方案仅提供至少包括在所述方法和系统的范围内的各种方法和系统的非限制性实施例。从本领域普通技术人员的角度来解读本说明书；因此，本领域技术人员众所周知的信息不一定包括在内。
定义
现在在下文更完整地描述本公开。本公开可以以许多不同的形式具体体现并且不应被解释为限于本文所举出的方面；相反，提供这些方面是为了使本公开满足适用的法律要求。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文涉及的所有专利、申请、公布申请和其他出版物均通过引用整体并入。如果本节中阐述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公布申请和其他出版物中阐述的定义相反或不一致，则本节中阐述的定义优先于以引用方式并入本文的定义。
当介绍本公开或其实施方案的要素时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在是包括性的，并且意味着除了所列要素之外可能还存在其他要素。应当理解，本文所述的本公开的方面和实施方案包括“由......组成”和/或“基本上由......组成”的方面和实施方案。
术语“和/或”当在两个或多个项目的列表中使用时是指所列项目中的任何一个自身可以单独使用或与任何所列项目的一个或多个组合使用。例如，表述“A和/或B”旨在表示A和B之一或两者，即单独的A、单独的B或A和B的组合。表述“A、B和/或C”旨在表示单独的A、单独的B、单独的C、A和B的组合、A和C的组合、B和C的组合或A、B和C的组合。
本公开的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了便利和简洁，而不应理解为对本公开范围的不灵活限制。因此，应当认为对范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，范围例如1-6的描述应被认为具有具体公开的子范围，例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及该范围内的各个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
本发明的实施方案可用于分析样品或生物样品。所述样品可以为液体、固体和/或半固体形式。所述生物样品可以包括组织、血液、生物流体、生物固体等及其组合。因此，作为实例，术语“生物样品”包括、但不限于原始形式和/或制品形式的全血、血浆或血清、尿液、脑脊液(CSF)、淋巴样品、唾液、痰、粪便样品、灌洗液、精液、组织和/或体液及其化学成分。
如本文所用，术语“关注的组分”或“关注的生物标志物”为可以提供有关生物体生理状态的生物学信息的任何标志物。在某些实施方案中，生物标志物的存在或不存在可以提供信息。在其他实施方案中，生物标志物的水平可以提供信息。在一个实施方案中，关注的组分可以包括肽、激素、核酸、脂质或蛋白质。或者，可以测定其他关注的组分。
如本文所用，术语“受试者”和“个体”可互换使用。受试者可以包括动物。因此，在一些实施方案中，样品得自哺乳动物，包括、但不限于狗、猫、马、大鼠、猴子等。在一些实施方案中，样品得自人类受试者。在一些实施方案中，受试者为患者，即自身在临床环境中出现以诊断、预后或治疗疾病或病症的活人。
如本文所用，术语“纯化”或“分离”或其派生词不一定是指从样品基质中除去关注的分析物以外的所有材料。相反，在一些实施例中，术语“纯化”或“分离”是指相对于存在于样品基质中的一种或多种其他组分富集一种或多种关注的分析物的量的方法。在一些实施方案中，“纯化”或“分离”方法可用于去除样品中可能干扰关注的生物标志物检测的一种或多种组分，例如可能干扰通过质谱法检测分析物的一种或多种组分。
如本文所用，“色谱法”是指其中由液体或气体携带的化学混合物由于化学实体在它们围绕或流过固定液相或固相时的差异分布而被分离成组分的过程。
如本文所用，“液相色谱法”(LC)是指当流体通过细粉物质柱或通过毛细管通道渗滤时选择性阻滞流体溶液的一种或多种组分的过程。当该流体相对于固定相移动时，延迟是由混合物的组分在一种或多种固定相与整体流体(即，流动相)之间的分布引起的。“液相色谱法”包括反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)和亲水相互作用液相色谱法(HILIC)。HILIC是一种有效的色谱模式，其涉及静电相互作用和吸附到极性固定相的富水层与高-乙腈流动相之间的分配的组合，并且其中保留通常随着分析物极性而增加。
如本文所用，术语“分析柱”是指具有足够色谱板以实现测试样品基质的组分分离的色谱柱。优选地，从分析柱洗脱的组分以允许测定关注的分析物的存在或量这样的方式进行分离。在一些实施方案中，分析柱包含具有平均直径为约5μm的颗粒。在一些实施方案中，分析柱是官能化二氧化硅或聚合物-二氧化硅杂化物，或聚合物颗粒或整体二氧化硅固定相，例如苯基-己基官能化分析柱。
如本文所用，“离子对试剂”是化学添加剂盐，其将根据离子对复合物的标称化学与正在用色谱法分析或经受其他分析过程的溶质或分析物静电结合，从而允许某些色谱模式的表现。离子对试剂的实例包括烷基磺酸盐和烷基铵盐。
分析柱可以与“萃取柱”区分开来，“萃取柱”典型地用于从非保留材料中分离或萃取保留材料，以得到“纯化”样品用于进一步纯化或分析。
如本文所用，“寡核苷酸治疗剂”可以是设计用于干扰疾病相关蛋白表达的短链DNA或RNA寡聚体。寡聚体的序列可以为约15-50个核苷酸单位。
方法
本文公开了在无离子对的条件下寡核苷酸的LC-MS分析方法的实施方案。在一些实施方案中，该方法包括提供认为包含至少一种关注的组分的样品；在无离子对的条件下进行所述至少一种关注的组分的萃取，其中所述萃取是固相萃取，并且其中所述至少一种关注的组分为寡核苷酸；在无离子对的条件下通过液相色谱分离所述组分；并且在无离子对的条件下通过质谱分析来分析所述组分。
在一些实施方案中，所述样品为生物样品。在一些实施方案中，所述生物样品为血浆。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸为治疗性寡核苷酸。
系统
还描述了用于进行本文公开的方法的系统。在一些实施方案中，该系统包含非离子对试剂、固相萃取系统、液相色谱系统和质谱检测系统。
本文已经描述了本公开的各种实施方案。应当认识到，这些实施方案仅是对本公开的示例。通过阅读上述描述，那些优选实施方案的变型对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。预期本领域技术人员可以适当地采用这样的变化形式，并且本公开旨在以不同于本文具体描述的方式来实施。因此，本公开包括适用法律允许的所附权利要求中记载的主题的所有变型和等效方案。此外，除非另有说明或以其他方式与上下文明显矛盾，否则本公开涵盖以其所有可能变化形式的上述要素的任意组合。
实施例
实施例1-人血浆中5,436Da 18-聚体寡核苷酸的无离子对定量LC-SRM方法
■材料和方法
分析物的参比材料RM1和类似物内标VA1得自Integrated DNA Technologies(Skokie,IL,USA)。寡核苷酸RM1和内标VA1的序列如图1中所示。乙腈、浓磷(85％)、浓氢氧化铵(25％)、浓甲酸和甲酸铵均得自Sigma Aldrich并且为LC-MS级，但磷酸除外，其为ACS级。使用Thermo Scientific Barnstead Nanopure净化系统通过反渗透过滤和随后的去离子化至电阻率为18.2MΩcm对水进行内部净化。包含K2EDTA抗凝剂的对照人血浆得自BioIVT(Hicksville,NY,USA)，包括来自六个用于差异测试和选择性的个体供体，以及来自两个高脂血症个体用于适当的相关测试。
·初始HILIC可行性测试
为了研究对寡核苷酸无离子对的HILIC的可行性，最初的工作使用Waters’MassPREP OSTTM标准寡核苷酸测试混合物的200nM稀释液和探查HILIC梯度进行，所述标准寡核苷酸测试混合物包含不同胸苷(T-)序列(15、20、25、30和35-聚体)。所述测试混合物的稀释剂为1:1乙腈:0.02％氢氧化铵的10mM甲酸铵(水溶液)的溶液。梯度从90％乙腈线性上升到50％，历时4.0分钟，没有延迟。分析柱为Waters XBridge Amide,3.5μm 50x2.1mm，温度30℃；流速为0.6mL/min，且流动相的水性组分为0.02％氢氧化铵的10mM甲酸铵(水溶液)的溶液。质谱仪为单离子监测(SIM)模式下的Sciex 4000，监测m/z 1510、m/z 1505和m/z1499处特别强烈的离子簇，它们相当于分别带有6个电荷的30-聚体、带有4个电荷的20-聚体和带有3个电荷的15-聚体。
使用Waters’MassPREP OSTTM标准寡核苷酸测试混合物的200nM稀释液注入的初步工作提供了图4中的色谱结果证据。在所使用的SIM实验中可以便利地追踪混合物的三种不同胸腺嘧啶序列组分。色谱在保留、峰对称、最小谱带展宽和响应稳定性方面具有明显的完整性。
优化了洗涤和洗脱方式，在温和碱性和高有机物二次洗涤后，从高酸性水溶液条件发展为高度碱化的洗脱。作为洗脱条件筛选的结果，洗脱在70％的水溶液中进行，这揭示出在达到最低30％的水溶液水平之前回收率为零，如图3中所示。
·校准标准品和质量控制样品
RM1初级溶液和内标VA1初级溶液分别以200μM和100μM的浓度在1:1v:v水:乙腈中制备。这些初级溶液在所提供的小瓶中制备，所述小瓶分别包含250和100纳摩尔的每种化合物，通过添加适用的738μL和1000μL稀释剂进行重构，然后涡旋30秒。校准和QC样品加标溶液以及内标加标溶液在聚丙烯管中用1:1v:v水:乙腈制备。在类似的聚丙烯管中制备血浆，校准样品的浓度为10、20、50、200、500、1000、2500和5000nM，并且QC样品的浓度为10、20、250和5000nM。加标溶液的体积不超过加标血浆体积的2％。制备空白溶血血浆用于加标，通过将预先快速冷冻的人全血添加至来自主要储备溶液的包含K2EDTA的常规空白人血浆中来进行，所得溶血水平为2％。
·优化的样品制备
RM1和类似物内标VA1从人血浆中的固相萃取如下进行。SPE吸附剂为Waters(Milford,MA,USA)
Figure BDA0003387640840000071
WAX，10mg，即一种带有阳离子交换和反相部分的混合模式相，以96-孔的格式。96-孔1mL收集板是来自Porvair(Wrexham,UK)的常规惰性聚丙烯。施加液体的每个步骤均借助于在最小的正压进行，以有助于液体样品渗透和通过吸附剂床。正压歧管来自Agilent Technologies(Wilmington,DE,USA)。
在1:1v:v乙腈:水中，将浓度为2500nM的类似物内标VA1以20μL等分部分加入到1.5mL常规聚丙烯管中的100μL血浆中。这导致基质中的内标浓度为500nM。然后，将每个试管均进行2秒的涡流。然后向每个样品中加入225μL 4.5％H3PO4(水溶液)并进行另一个涡旋步骤。
图2描绘了本公开的实施方案的样品制备和萃取示意图。该方案首先使用300μL乙腈调节吸附剂，随后的平衡涉及使用300μL 0.2％甲酸(水溶液)。将制备的样品(340μL)加载到平衡的吸附剂床上，此后使用0.2％甲酸(水溶液)进行300μL洗涤。下一次洗涤使用300μL 0.1％氢氧化铵的[1:1v:v乙腈:水]溶液进行。通过将2x 125μL 2％氢氧化铵的[3:7乙腈:水]溶液加入到1mL圆孔规则聚丙烯96-孔收集板中，实现分析物和内标的洗脱。最终，将洗脱液在40℃下在无氧氮气下蒸发，然后在200μL 1:1乙腈:[0.02％氢氧化铵的10mM甲酸铵(水溶液)溶液]中重构。然后将块密封，置于500rpm的板式振荡器上20分钟，然后在10℃下放入自动进样器隔室中等待注入。在分析开始前等待1小时期限以确保温度平衡。
■优化的LC-SRM分析
RM1定量的分析柱为Waters(Milford,MA,USA)Acquity UPLC BEH Amide，其具有为2.1x50mm的尺寸和为1.7μm的粒径。LC-MS前端为典型的Waters Acquity UPLC系统，其包括泵、脱气机、自动进样器、柱加热器和流动相预热器。将自动进样器隔室维持在10℃。采用梯度洗脱，其中流动相组分为0.02％氢氧化铵的10mM甲酸铵(水溶液)和乙腈溶液，以0.35mL/min递送，流动相和固定相均在30℃。对于每个梯度循环，最初流动相组合物从20％水溶液开始，然后流动相组成在接下来的3.5分钟内线性偏移至50％水溶液。该组成保持0.5分钟，然后在5分钟总运行时间的剩余1.0分钟内发生再平衡。注入体积为10.0μL，使用带针头溢出(PLNO)模式的部分环，以及0.02％氢氧化铵的10mM甲酸铵(水溶液)溶液的强洗涤组合物和1:1v:v的乙腈:[0.02％氢氧化铵的10mM甲酸铵(水溶液)]的溶液的弱洗涤组合物。三重四极杆质谱仪为Sciex(Concord,ON,Canada)API6500+，其具有Turbo Ionspray源条件和加热至550℃的辅助气体。在IonDrive源上，探头定位在垂直方向为0mm和在水平方向为7mm。仪器在高质量模式下运行。LC流没有分流进入离子源。
在负离子选择反应监测(SRM)模式下，所使用的跃迁为RM1的1358→914和1358→1059相加，以及VA1的1522→634和1217→1074相加，其中所有值表示m/z。所有这些峰均基于引人注目的强度和可验证性来选择。m/z 1358处的分析物前体离子和m/z 1522处的内标前体离子相当于[M-4H]4-的电荷状态，而m/z 1217处的内标前体离子相当于[M-5H]5-。将初始定性HILIC测试和RM1完全定量方法中使用的分析条件的比较概括在下表1中。
表1
Figure BDA0003387640840000091
Figure BDA0003387640840000101
■方法性能：批间和批内
本文所述的方法在10nM至5000nM的校准范围内产生了97.9％至111％和2.75％至9.66％的批间和批内准确度和精密度。将该性能数据概括在下表2中。色谱图如图5和图6中所示。图5显示了与分析物RM1的定量下限(5A)以及使用本文提供的方法的一个实施方案生成的伴随内标VA1(5B)相关的代表性色谱图。图6显示了与RM1的定量上限(6A)以及使用本文提供的方法的实施方案生成的内标VA1(6B)相关的代表性色谱图。
表2：批间和批内方法性能
标称浓度(nM) 10 20 250 5000
批内
平均值 11.1 19.6 247 5510
CV(％) 5.16 2.75 4.79 4.14
RE(％) 10.7 -2.08 -1.07 10.1
批间
平均值 10.6 20.4 258 4990
CV(％) 9.50 5.73 5.64 9.66
RE(％) 6.21 1.89 3.00 -0.211
■方法性能：选择性、差异基质效应、基质因子和回收率
无显著性基质效应表现，选择性也不存在问题，50％的回收率被认为是可以接受的。
差异基质效应样品一起显示出可接受的精密度，证明了测试的性质和目的是可接受的。此外，六个中每一个的偏差都是可以接受的，这是方法耐用性的额外指示。基质因子结果显示总比值为1.05，且单独峰面积为RM1的0.92和VA1的0.88，所有这些均表明方法有效地避免了基于基质的信号改变。这些数据如表3中所示。
表3：方法性能指标，标称浓度20nM(LQC)
Figure BDA0003387640840000111
实施例2-某些实施方案的实例
下文列举了所述技术的某些实施方案的非限制性实例。
A1.包含通过LC-MS来分析寡核苷酸的方法，包括：
提供认为包含至少一种关注的组分的样品；
在无离子对的条件下进行所述至少一种关注的组分的萃取，其中所述萃取是固相萃取，并且其中所述至少一种关注的组分为寡核苷酸；
在无离子对的条件下通过液相色谱法来分离所述组分；和
在无离子对的条件下通过质谱分析来分析所述组分。
A2.实施方案A1的方法，其中所述样品为生物样品。
A3.实施方案A2的方法，其中所述生物样品为血浆。
A4.实施方案A1的方法，其中所述寡核苷酸为治疗性寡核苷酸。B1.用于进行上述实施方案任一项的方法的系统。
C1.用于对寡核苷酸进行无离子对分析的系统，包含：
非离子对试剂；
固相萃取系统；
液相色谱系统；和
质谱检测系统。

Claims (5)

1.包括通过LC-MS来分析寡核苷酸的方法，包括：
提供认为包含至少一种关注的组分的样品；
在无离子对的条件下进行所述至少一种关注的组分的萃取，其中所述萃取是固相萃取，并且其中所述至少一种关注的组分为寡核苷酸；
在无离子对的条件下通过液相色谱法来分离所述组分；和
在无离子对的条件下通过质谱分析来分析所述组分。
2.权利要求1的方法，其中所述样品为生物样品。
3.权利要求2的方法，其中所述生物样品为血浆。
4.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸为治疗性核苷酸。
5.用于对样品中的寡核苷酸进行无离子对分析的系统，包含：
非离子对试剂；
固相萃取系统；
液相色谱系统；和
质谱检测系统。
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