JP2010528058A - コンジュゲートされた物質を組織に送達するためのアプロチニン様ポリペプチド - Google Patents
コンジュゲートされた物質を組織に送達するためのアプロチニン様ポリペプチド Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】 図16
Description
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19
[式中、X1〜X19のそれぞれ(例えば、X1〜X6、X8、X9、X11〜X14、およびX16〜X19)は、独立して、任意のアミノ酸(例えば、Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, およびVal等の天然に存在するアミノ酸)であるか、または不存在であり、かつX1、X10、およびX15の少なくとも1つはアルギニンである]。いくつかの実施形態では、X7はSerまたはCysであり; またはX10およびX15はそれぞれ独立してArgまたはLysである。いくつかの実施形態では、X1〜X19の残基は、両端を含めて、配列番号1〜105および107〜112(例えば、Angiopep-1、Angiopep-2、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、およびAngiopep-7)のいずれか1つの任意のアミノ酸配列と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、アミノ酸X1〜X19の少なくとも1個(例えば、2個、3個、4個、または5個)はArgである(例えば、X1、X10、およびX15のいずれか1個、2個、または3個)。
本発明は、本明細書中に記載の任意のポリペプチド、例えば表1に記載の任意のポリペプチド(例えば、配列番号1〜105および107〜112、例えば配列番号1〜97、99、100、101、または107〜112のいずれかで定義されるポリペプチド)、またはその任意の断片、アナログ、誘導体、または変異体を特徴とする。特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書中に記載のポリペプチドに対して少なくとも35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%さえもの同一性を有してよい。ポリペプチドは、本明細書中に記載の配列の1つと比較して1個以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個)の置換を有してよい。他の改変は以下でさらに詳細に記載される。
本発明はまた、本明細書中に記載のアミノ酸配列の改変を有するポリペプチド(例えば、Angiopep-3、-4a、-4b、-5、-6、または-7等の配列番号1〜105および107〜112のいずれかに記載の配列を有するポリペプチド)を含む。特定の実施形態では、改変は所望の生物学的活性を顕著には破壊しない。いくつかの実施形態では、改変は生物学的活性の(例えば、少なくとも5%、10%、20%、25%、35%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、または95%の)低減を生じさせる。他の実施形態では、改変は生物学的活性に対して影響を有さないか、または元のポリペプチドの生物学的活性を(例えば、少なくとも5%、10%、25%、50%、100%、200%、500%、または1,000%)増加させる。改変ポリペプチドは、ある場合に必要であるかまたは望ましい本発明のポリペプチドの1つ以上の特性を有するか、または最適化する。そのような特性には、in vivo安定性、バイオアベイラビリティ、毒性、免疫学的活性、または免疫学的同一性が含まれる。
(1) 疎水性: ノルロイシン、メチオニン(Met)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、ヒスチジン(His)、トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)、
(2) 中性親水性: システイン(Cys)、セリン(Ser)、スレオニン(Thr)
(3) 酸性/負電荷: アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)
(4) 塩基性: アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、ヒスチジン(His)、リシン(Lys)、アルギニン(Arg)
(5) 鎖の向きに影響する残基: グリシン(Gly)、プロリン(Pro);
(6) 芳香族: トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)、ヒスチジン(His)、
(7) 極性: Ser、Thr、Asn、Gln
(8) 塩基性正電荷: Arg、Lys、His、および;
(9) 荷電: Asp、Glu、Arg、Lys、His。
本発明のポリペプチドおよびコンジュゲートは、当技術分野において公知のアプロチニンのポリペプチドアナログを含んでよい。例えば、米国特許第5,807,980号では、配列番号102のポリペプチドを含む、ウシ膵臓トリプシンインヒビター(アプロチニン)由来のインヒビターならびにその製造方法および治療上の使用が記載されている。これらのポリペプチドは、異常な血栓症等の組織因子および/または因子VIIIaの異常な出現または量を特徴とする症状の治療に使用されている。米国特許第5,780,265号では、配列番号103を含む、血漿カリクレインを阻害可能なセリンプロテアーゼインヒビターが記載されている。米国特許第5,118,668号では、配列番号105を含む、ウシ膵臓トリプシンインヒビター変異体が記載されている。アプロチニンのアミノ酸配列(配列番号98)、Angiopep-1アミノ酸配列(配列番号67)、および配列番号104、ならびにいくつかの生物活性アナログ配列が国際出願公開第WO 2004/060403号に見出せる。
天然に存在するアミノ酸のみから構成されるポリペプチドに加えて、ペプチド模倣体またはポリペプチドアナログもまた、本発明によって包含される。ポリペプチドアナログは、一般に、鋳型ポリペプチドの特性と類似の特性を有する非ポリペプチド薬物として製薬産業で使用される。非ポリペプチド化合物は「ポリペプチド模倣体」またはペプチド模倣体と称される(Fauchere et al., Infect. Immun. 54:283-287,1986; Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229-1239, 1987)。治療的に有用なポリペプチドに構造的に関連しているポリペプチド模倣体を使用して、等価なまたは向上した治療的もしくは予防的効果を得ることができる。概して、ペプチド模倣体は、天然に存在する受容体結合ポリペプチド等の模範ポリペプチド(すなわち、生物学的または薬理学的活性を有するポリペプチド)に構造的に類似しているが、当技術分野において周知の方法によって、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH- (シスおよびトランス)、-CH2SO-、-CH(OH)CH2-、-COCH2-等の結合によって場合により置換されている1個以上のペプチド結合を有する(Spatola, Peptide Backbone Modifications, Vega Data, 1(3):267, 1983); Spatola et al. (Life Sci. 38:1243-1249, 1986); Hudson et al. (Int. J. Pept. Res. 14:177-185, 1979); およびWeinstein. B., 1983, Chemistry and Biochemistry, of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein eds, Marcel Dekker, New-York)。そのようなポリペプチド模倣体は、天然に存在するポリペプチドより優れた顕著な利点を有し、それには、経済的な生産、高い化学的安定性、増強された薬理学的特性(例えば、半減期、吸収、効力、効率)、低減された抗原性および他の利点が含まれる。
上記のように、本発明の方法によって特定されたポリペプチドの主鎖形状およびファルマコフォアディスプレイを再現するように作製された非ペプチジル化合物(ペプチド模倣体)は、高い代謝安定性、高い効力、長い作用期間および良好なバイオアベイラビリティの属性を有することが多い。
本明細書中に記載のポリペプチドまたはその誘導体を物質に連結することができる。例えば、ポリペプチド(例えばAngiopep-7)を、治療剤、診断剤、または標識に取り付けてよい。特定の実施形態では、疾患または症状の診断のための、ラジオイメージング物質等の検出可能な標識にポリペプチドを連結するか、または該標識で標識する。これらの物質の例には、抗体が疾患または症状特異的抗原に結合する、ラジオイメージング物質-抗体-ベクターコンジュゲート(例えば診断または治療用)が含まれる。他の結合分子もまた、本発明によって想定される。他の場合では、ポリペプチドまたは誘導体を、疾患または症状を治療するための治療剤に連結するか、またはその混合物に連結するかもしくはその混合物で標識してよい。BBBを横切る物質の輸送または特定の細胞タイプ内への物質の輸送を可能にする条件下でベクター-物質コンジュゲートを個体に投与することによって該疾患または症状を治療することができる。各ポリペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、または7個の物質を含んでよい。他の実施形態では、各物質は、それに結合している少なくとも1、2、3、4、5、6 7、10、15、20個、またはそれ以上のポリペプチドを有する。本発明のコンジュゲートは、被験体の特定の細胞タイプまたは組織、例えば肝臓、肺、腎臓、脾臓または筋肉における物質の(例えば取り込みの増加または除去の低減に起因する)蓄積を促進することができる。
治療剤は任意の生物活性物質であってよい。例えば、治療薬は、疾患を治療するための(例えば癌細胞を死滅させるための)薬物、医薬、放射能を放出する物質、細胞毒素(例えば化学療法剤)、その生物活性断片、またはその混合物であるか、または個体の疾患または症状を治療するための物質であってよい。治療剤は、合成品または、真菌、細菌または他の微生物(例えばマイコプラズマまたはウイルス)、動物、例えば爬虫類、または植物起源の産物であってよい。治療剤および/またはその生物活性断片は酵素活性物質および/またはその断片であるか、または重要なかつ/または必須の細胞経路を阻害もしくはブロックすることによって、または重要なかつ/または必須の天然に存在する細胞成分と競合することによって働く。他の治療剤には、抗体および抗体断片が含まれる。
検出または診断目的で本発明のコンジュゲートを標識してよい。検出可能な標識、またはマーカーは、放射性標識、蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、発光標識、発色団標識、PETスキャナー用のポジトロン放出同位体、化学発光標識、または酵素標識であってよい。放射能を放出する典型的なラジオイメージング物質(検出可能な放射性標識)には、インジウム-111、テクニチウム(technitium)-99、または低用量のヨウ素-131が含まれる。ガンマおよびベータ放出放射性核種には、67Cu、67Ga、90Y、111In、99mTc、および201Tl)が含まれる。ポジトロン放出放射性核種には、18F、55Co、60Cu、62Cu、64Cu、66Ga、68Ga、82Rb、および86Yが含まれる。蛍光標識には、Cy5.5、緑色蛍光タンパク質(GFP)、フルオレセイン、およびローダミンが含まれる。化学発光標識には、ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼが含まれる。酵素標識には、ペルオキシダーゼおよびホスファターゼが含まれる。hisタグもまた、検出可能な標識である。例えば、コンジュゲートはベクター部分および抗体部分(抗体または抗体断片)を含んでよく、それは標識をさらに含んでよい。この場合、該標識はベクターまたは抗体に結合させてよい。
当技術分野において公知の任意の手段によって(例えば本明細書中に記載のコンジュゲーションストラテジーを使用して)本発明のポリペプチドに抗体をコンジュゲートしてもよい。任意の診断用または治療用抗体を1個以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上)の本発明のベクターにコンジュゲートしてよい。さらに、抗体断片(例えば抗原に結合可能な抗体断片)を本発明のベクターにコンジュゲートしてもよい。抗体断片には、抗体の(例えば本明細書中に記載の任意の抗体の) FabおよびFc領域、重鎖、および軽鎖が含まれる。癌の診断および治療における使用に典型的な抗体には、ABX-EGF (パニチムマブ(Panitimumab))、OvaRex (オレゴベマブ(Oregovemab))、Theragyn (ペムツモマブイットリウム-90 (pemtumomabytrrium-90))、Therex、ビバツズマブ(Bivatuzumab)、Panorex (エドレコロマブ)、ReoPro (レオプロ) (アブシキシマブ)、Bexxar (ベキサール) (トシツモマブ)、MAb、イディオタイプ105AD7、抗-EpCAM (カツマキソマブ)、MAb肺癌(Cytoclonal製)、Herceptin (ハーセプチン) (トラスツズマブ)、Rituxan (リツキサン) (リツキシマブ)、Avastin (アバスチン) (ベバシズマブ)、AMD Fab (ラニビズマブ)、E-26 (2nd gen. IgE) (オマリズマブ)、Zevalin (ゼヴァリン) (Rituxan +イットリウム-90) (イブリツモマブチウキセタン)、セツキシマブ、BEC2 (ミツモマブ(Mitumomab))、IMC-1C11、nuC242-DM1、LymphoCide (エプラツズマブ(Epratuzumab))、LymphoCide Y-90、CEA-Cide (ラベツズマブ)、CEA-Cide Y-90、CEA-Scan (Tc-99m-標識アルシツモマブ)、LeukoScan (Tc-99m-標識スレソマブ(sulesomab))、LymphoScan (Tc-99m-標識ベクツモマブ(bectumomab))、AFP-Scan (Tc-99m-標識)、HumaRAD-HN (+イットリウム-90)、HumaSPECT (ボツムマブ(Votumumab))、MDX-101 (CTLA-4)、MDX-210 (her-2過剰発現)、MDX-210/MAK、Vitaxin、MAb 425、IS-IL-2、Campath (キャンパス) (アレムツズマブ)、CD20ストレプトアビジン、Avidicin、(アルブミン+ NRLU13)、Oncolym (+ヨウ素-131) Cotara (+ヨウ素-131)、C215 (+ブドウ球菌エンテロトキシン、MAb肺/腎臓癌(Pharmacia Corp.製)、ナコロマブタフェナトキス(nacolomab tafenatox) (C242ブドウ球菌エンテロトキシン)、Nuvion (ヌヴィオン) (ビジリズマブ)、SMART M195、SMART 1D10、CEAVac、TriGem、TriAb、放射性標識NovoMAb-G2、Monopharm C、GlioMAb-H (+ゲロニン毒素)、Rituxan (リツキシマブ)、およびING-1が含まれる。追加の治療用抗体には、5G1.1 (エクルイズマブ(Ecluizumab))、5G1.1-SC (ペキセリズマブ(Pexelizumab))、ABX-CBL (ガビリモマブ(Gavilimomab))、ABX-IL8、Antegren (アンテグレン) (ナタリズマブ)、抗-CD11a (エファリズマブ)、抗-CD18 (Genetech製)、抗-LFA1、Antova、BTI-322、CDP571、CDP850、Corsevin M、D2E7 (アダリムマブ)、Humira (ヒュミラ) (アダリムマブ)、Hu23F2G (ロベリズマブ(Rovelizumab))、IC14、IDEC-114、IDEC-131、IDEC-151、IDEC-152、インフリキシマブ(Remicade (レミケード))、LDP-01、LDP-02、MAK-195F (アフェリモマブ)、MDX-33、MDX-CD4、MEDI-507 (シプリズマブ)、OKT4A、OKT3 (ムロモナブ-CD3)、およびReoPro (アブシキシマブ)が含まれる。
当技術分野において公知の任意の架橋(コンジュゲーション)試薬またはプロトコル(多数市販されている)を使用して、コンジュゲート(例えばタンパク質-タンパク質コンジュゲート)を得ることができる。そのようなプロトコルおよび試薬には、アミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、カルボニル、炭水化物および/またはフェノール基と反応性の架橋剤が含まれる。そのようなプロトコルの量、時間、および条件を変動させてコンジュゲーションを最適化することができる。架橋試薬は少なくとも2個の反応基を含有し、概して、ホモ官能性(homofunctional)架橋剤(同一の反応基を含有する)およびヘテロ官能性(heterofunctional)架橋剤(同一でない反応基を含有する)に分けられる。本発明の架橋剤は、ホモ二官能性および/またはヘテロ二官能性であってよい。さらにまた、架橋剤は反応性部分の間に「スペーサー」を含むか、または架橋剤中の2個の反応性部分が直接連結されてもよい。結合には、エステル結合が含まれる。
本明細書中に記載のベクターに物質をコンジュゲートすることによって、望ましい特性、例えば改変された薬物動態、改変された組織分布(例えば特定の組織または細胞タイプ、例えば肝臓、脳、肺、脾臓、または腎臓への送達の増加)を達成することができる。簡潔に言えば、発明者らは、BBBを横切って効率的に物質を輸送するベクター(例えば、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、およびAngiopep-6)を特定した。Angiopep-2のように、これらのベクターは他の細胞タイプまたは組織(例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、または筋肉)に物質をターゲティングすることが可能でもある。発明者らはまた、BBBを横切って効率的には輸送されないが、特定の組織(例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、または筋肉)に輸送されるベクター、Angiopep-7を特定した。したがって、この活性を有するベクターは、BBBを横切る輸送が望ましくない場合に有用である。
種々の化学療法剤、例えばビンクリスチン、エトポシド、およびドキソルビシンに対する耐性はP-gp (MDR1)過剰発現によって媒介されるため(図9)、この流出ポンプをバイパスすると、種々の癌タイプに対するこれらの薬物の作用を増強することができる。ベクターをそのような物質にコンジュゲートすることによって、P-gp媒介性の物質の流出を減少させることが可能になる。これらのコンジュゲートはP-gpによって媒介される耐性と関連する薬物の効力を増加させるために有用である。以下で例証されるように、本明細書中に記載のベクターを、P-gpによる排除を回避するその能力に関して試験した。
本発明者らの以前の成果(国際特許出願第PCT/CA2004/00011号(該文献は参照によりここに組み入れられる)を参照のこと)に基づき、受容体関連タンパク質(RAP)は血液脳関門のin vitroモデルにおいてアプロチニンの経細胞輸送を阻害した。LRPは種々の癌細胞上で発現される(例えば国際公開第WO 2007/009229号を参照のこと)。したがって本発明者らは、低密度リポタンパク質関連受容体(LRP)が脳内へのアプロチニンの浸透に関与することを提唱した。また、血液脳関門のin vitroモデルを横切るAngiopep-1およびAngiopep-2輸送の類似の阻害が得られた(データは示していない)。これは、脳内皮細胞を横切るこれらのポリペプチドの経細胞輸送にもLRPが同様に関与することを示唆する。これに基づいて、本発明者らは、概して、本明細書中に記載のアプロチニン関連ポリペプチドの取り込みにLRPが関与すると考える。
本発明はまた、本明細書中に記載のポリペプチドコンジュゲートを使用する治療方法を特徴とする。BBBを横切って効率的に輸送されるコンジュゲート(例えば、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、およびAngiopep-6)を使用して任意の脳または中枢神経系疾患を治療することができる。これらのコンジュゲートはまた、肝臓、肺、腎臓、脾臓または筋肉に効率的に輸送され、したがってこれらのコンジュゲートを適切な治療剤と組み合わせて使用して、これらの組織と関連している疾患(例えば癌)を治療してもよい。Angiopep-7は脳に効率的には輸送されないが、組織および細胞、例えば肝臓、肺、腎臓、脾臓および筋肉に効率的に輸送されるため、Angiopep-7は、脳への物質のターゲティングが望ましくない場合に、前記組織と関連している疾患の治療のためのベクターとして特によく適している。
本発明の医薬組成物は本明細書中に記載のポリペプチドまたはコンジュゲートを製薬的に許容される担体とともに含んでよい。そのような組成物は液体または凍結乾燥製剤もしくは別の方法で乾燥された製剤であり、種々のバッファー内容(例えば、Tris-HCl、酢酸、リン酸)、pHおよびイオン強度の希釈剤、表面への吸収を防ぐための添加物、例えばアルブミンまたはゼラチン、界面活性剤(例えば、Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩)を含む。可溶化剤(例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存剤(例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン)、増量物質または張性改変因子(tonicity modifiers) (例えば、ラクトース、マンニトール)、タンパク質に対するポリエチレングリコール等のポリマーの共有結合性付加、金属イオンとの錯体形成、またはポリマー化合物、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、等の微粒子調製物内または微粒子調製物上への物質の取り込み、またはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層または多層状小胞、赤血球ゴースト、またはスフェロプラスト上への物質の取り込みを含む。そのような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、in vivo放出の割合、およびin vivoクリアランスの割合に影響する。制御放出または徐放性組成物は親油性デポー(例えば、脂肪酸、ろう、油)中に製剤を含む。また、ポリマー(例えばポロキサマーまたはポロキサミン(poloxamines))でコーティングされた微粒子組成物も本発明に含まれる。本発明の組成物の他の実施形態は、微粒子形式保護コーティング、プロテアーゼインヒビターまたは、種々の投与経路、例えば非経口、肺、鼻、経口、膣、経直腸経路のための浸透エンハンサーを含む。一実施形態では、非経口、癌の近く(paracancerally)、経粘膜(transmucosally)、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、頭蓋内、および腫瘍内で医薬組成物を投与する。
経口用途の製剤には、無毒の製薬的に許容される賦形剤との混合物中で活性成分(群)を含有する錠剤が含まれ、そのような製剤は当業者に公知である(例えば、U.S.P.N.: 5,817,307, 5,824,300, 5,830,456, 5,846,526, 5,882,640, 5,910,304, 6,036,949, 6,036,949, 6,372,218 (該文献は参照によりここに組み入れられる))。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または充填剤(例えば、ショ糖、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶性セルロース、ジャガイモデンプンを含むデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム); 造粒剤および崩壊剤(例えば、微結晶性セルロースを含むセルロース誘導体、ジャガイモデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギナート、またはアルギン酸); 結合剤(例えば、ショ糖、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶性セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはポリエチレングリコール); および潤滑剤、流動促進剤、および抗接着剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油、またはタルク)であってよい。他の製薬的に許容される賦形剤は、着色剤、香味物質、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤、等であってよい。
本明細書中に記載の、または本明細書中に記載の方法を使用して特定される任意のコンジュゲートまたは組成物の用量は、投与方法、治療対象の疾患(例えば癌)、疾患の重症度、癌を治療しようとするかまたは予防しようとするか、ならびに治療対象の被験体の年齢、体重、および健康を含むいくつかの要因に依存する。
物質(薬剤)をベクターにコンジュゲートすることの、物質の分布に関する効果を、標識ポリペプチドまたはコンジュゲートを動物に投与しかつポリペプチドまたはコンジュゲートの器官への分布を測定することによって評価することができる。一例では、3H-タキソール(Taxol) (5 mg/kg)または125I-Taxol-Angiopep-1 (TxlAn-1) (10 mg/kg, 5 mg Taxol/kgと等価)をマウスに投与する。Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、およびAngiopep-7のいずれかを用いて類似の実験を実施することができる。ここでは、コンジュゲートされていない抗癌剤およびコンジュゲートをボーラスとしてマウスに静脈内注射する。種々の時点(0.25、0.5、1、および4時間)で組織を回収し、ホモジナイズする。3H-Taxolの量を定量するために、組織ホモジネートを組織可溶化剤で消化し、10 mlの液体シンチレーターをサンプルに加えた。種々の組織中の125I標識コンジュゲートの量をTCA沈殿後に測定する。組織に付随する放射能を定量する。Prismソフトウェアを使用して曲線下面積(AUC 0-4)を見積もり、種々の組織に関してプロットする。Angiopep-1コンジュゲートを使用すると、コンジュゲートに関して得られたAUC 0-4値は、脳、腎臓、肝臓、および眼を含む種々の組織においてTaxolより高い(図10A)。このことは、これらの組織における、コンジュゲートされていない物質と比較して高いコンジュゲートの蓄積を示す。肺では、コンジュゲートの蓄積はコンジュゲートされていない物質より非常に高い(図10B)。
Angiopep-7は血液脳関門を横切って効率的には輸送されない。IV注射の30分間後のラットの脳中のAngiopep-2およびAngiopep-7の蓄積を測定すると、Angiopep-7はAngiopep-1またはAngiopep-2より低レベルでしか脳に存在しなかった(図13)。
実施例2に記載のようにCy5.5にコンジュゲートされたAngiopep-2またはAngiopep-7を投与されたラットを使用して、肝臓、腎臓、および肺等の器官においてAngiopep-7およびAngiopep-2のレベルを測定した。これらの器官では、Angiopep-7を用いた場合に、Angiopep-2と比較して類似のレベルのポリペプチドが観察された。これらの結果を考慮して、本発明者らは、Angiopep-7は、脳への送達が望ましくない適用における肝臓、腎臓、および肺への物質の送達に特に有用であると考える。
in situ脳灌流実験モデルを使用して前記ベクターの脳における取り込みを測定した。結果(以下の表5に示す)では、前記ベクターがBBBを横切る能力に関して第10位および第15位のリシンが重要であることが示された。
癌細胞を死滅させる、ベクターおよび抗癌剤を含むコンジュゲートの能力の検査をin vitroで実施することができる。一例では、Taxol (コンジュゲートされていない)は、約10 nMのIC50値でグリア芽細胞腫(gliobiastoma)細胞(U-87)の増殖をブロックすることが示される(図17)。本明細書中に記載のベクターにコンジュゲートされた場合のコンジュゲートされたTaxolの効果を評価し、コンジュゲートされていないTaxolと比較する。表6Aに示されるように、Taxol-Angiopep-2 (TxlAn2)コンジュゲートに関して得られたIC50値は、多数の癌細胞において、コンジュゲートされてないTaxolと非常に類似していた。ラット脳由来の内皮細胞(RBE4)は、試験された癌細胞系より低感受性であった。比較のために、得られた結果をTaxol濃度に換算して表記した。
腫瘍増殖を阻害するコンジュゲートの能力をin vivoモデルで評価することができる(例えば図18Aを参照のこと)。U-87細胞をマウスの右側腹部に皮下移植し、移植の3日後、ビヒクル(DMSO/リンゲル:80/20; コントロール)、コンジュゲートされていない物質(例えばTaxol (5 mg/kg))またはコンジュゲートの部分としての物質(例えば5 mg Taxol/kgと等価のTaxol-Angiopep-2 (10 mg/kg))をマウスに注射する。腫瘍増殖の阻害は、コンジュゲートされていない抗癌剤で処置されたマウスより、コンジュゲートで処置されたマウスにおいて、より顕著である。
コンジュゲートが、皮下移植された肝細胞癌細胞(SK-Hep 1)の増殖を阻害できるかどうかを決定するin vivo研究を行う。ヌードマウスの右側腹部に2.5 x 106のヒトSK-Hep 1細胞の皮下注射を施す。移植された腫瘍のサイズが約200 mm3に達したら処置を開始する。動物に腹腔内注射によるコンジュゲートまたはビヒクルでの処置を施す。
本明細書中に記載の実施例では、以下の方法を使用した。
in vitro細胞増殖アッセイでは、24ウェル組織培養マイクロプレートにおいて10%血清を含む最終容量1 mlの培地中に2.5〜5 x 104の範囲のU87またはA549細胞を播種し、37℃で5% CO2で24時間インキュベートする。そして培地を無血清培地に交換し、一晩インキュベートする。翌朝、物質をジメチルスルホキシド(DMSO)に新たに溶解し、3回重複して種々の濃度の物質を含有する完全培地に培地を交換する。DMSOの終濃度は0.1%である。使用されるコントロールは、細胞を含むが物質を含まないマイクロプレートウェルである。37℃で5% CO2で48〜72時間細胞をインキュベートする。インキュベーション後、培地を変え、[3H]-チミジン(1 pCi/アッセイ)を含有する1 mlの完全培地に交換する。プレートを37℃で5% CO2で4時間インキュベートする。培地を取り出し、37℃のPBSで細胞を洗浄する。細胞をエタノール:酢酸(3:1)の混合物で固定し、水で洗浄し、10%の氷冷TCA (トリクロロ酢酸)で3回沈殿させる。最終的に500μlのPCA (過塩素酸)をウェルに加え、マイクロプレートを65℃で30分および75℃で30分加熱する。そして、10 mlのシンチレーション反応混液を含むシンチレーションバイアルに各ウェルに内容物を移し、Packard製の液体シンチレーションカウンターTri-CarbでCPM (カウント/分)単位で活性を測定する。
Sigma製のヨード-ビーズを使用する標準的手順でポリペプチドをヨウ素化する。簡潔に言えば、ポリペプチドを0.1 M リン酸バッファー(pH 6.5) (PB)中に希釈する。各タンパク質に2つのヨード-ビーズを使用する。これらのビーズをWhatmanフィルターで3 mlのPBで2回洗浄し、60μlのPBに再懸濁する。Amersham-Pharmacia biotech製の125I (1 mCi)をビーズ懸濁液に室温で5分間加えた。ポリペプチド(100μg)を加えることによって各ヨウ素化を開始した。室温で10分間のインキュベーション後、遊離のヨウ素をHPLCによって除去した。
腫瘍増殖に対するコンジュゲートおよび製剤の効力を見積もるために、本発明者らはグリア芽細胞腫の皮下モデルを開発した。このモデルでは、1%メチルセルロースを含有する血清を含まない100μlの細胞培地中の2.5 x 106細胞をマウス側腹部に皮下注射する。腫瘍ははっきりと可視であり、バーニアキャリパーを使用して測定することができる。そして、見積もられた腫瘍容積を時間の関数としてプロットした。
マウス脳における物質の取り込みを研究するために本発明者らの実験室で構成されたin situ脳灌流法を使用してマウス脳毛細管の腔側への[125I]-ポリペプチドの取り込みを測定する。簡潔に言えば、ケタミン/キシラジン(140/8 mg/kg i.p.)で麻酔されたマウスの右総頸動脈を露出させ、後頭動脈の吻側の総頸動脈の分岐のレベルで結紮する。そして、ヘパリン(25 U/ml)で充填されかつ26ゲージ針にマウントされたポリエチレンチューブを用いて総頸動脈の吻側にカテーテルを挿入する。灌流液(95% O2および5% CO2でガス供給されたpH7.4のKrebs/重炭酸塩バッファー中の[125I]-ポリペプチドまたは[14C]-イヌリン)を含有するシリンジを注入ポンプ(Harvard pump PHD 2000; Harvard Apparatus)に配置し、カテーテルに連結する。灌流前に、心室を分断することによって反対側の血流寄与を排除する。1.15 ml/分の流速で指定の時間、脳を灌流する。14.5分の灌流後、Krebsバッファーで60秒間、脳をさらに灌流して過剰の[125I]-タンパク質を洗浄する。そして、マウスの頭部をはずして(decapitated)灌流を終結させ、右半球を氷上で単離した後、毛細管枯渇に付する。一定分量のホモジネート、上清、ペレットおよび灌流液を採取して、TCA沈殿によってその[125I]-コンジュゲート含量を測定し、見かけの分布容積を評価する。
コンジュゲートされた治療剤の作用機序の研究を実施することもできる。一例では、肺癌細胞(NCI-H460)を遊離Taxol (30 nM)またはTaxolコンジュゲート(例えばTxlAn2 10 nM; 30 nMのタキソールと等価)と24時間インキュベートする(図19)。FITCに連結された二次抗体を使用して細胞のβ-チューブリンを標識した後、可視および蛍光様式で写真を撮影する。この例では、TaxolおよびTaxolコンジュゲートの両者は、ポリマー化に至るβ-チューブリンに対して類似の効果を有する。図20で例証されるように、TaxolおよびTaxolコンジュゲートを加えると、G2/M期でのNCI-H460細胞のブロックが誘発される。これらの結果は、TxlAnコンジュゲートが、Taxolと類似の、癌細胞に対する作用機序を有することを示唆する。
本明細書中に記載のベクターへの物質のコンジュゲーションは図23A〜23Bに例示される。この例では、まずTaxolをN-スクシンイミド(2'-NHS-Txl)誘導体に活性化する。例えばベクター中に見出されるアミン(例えばアミノ末端アミンまたはリシン残基)を活性化Taxolと反応させてペプチド結合(アミド結合)を形成させる。複数のアミンが利用可能である場合、この反応は、例えば使用されるモル比に応じて1、2または3つのTaxolがポリペプチドに付加されているコンジュゲートの複数の組み合わせを生じさせる。コンジュゲーション産物をHPLCによって分析し、質量分析(Maldi-Tof)によってコンジュゲーションを確認する。Taxolはエステラーゼでのエステル結合の切断によってベクターから放出可能であることが見出される。
米国特許出願公開第2006/0189515号に記載されるように抗体をアプロチニンにコンジュゲートすることができる。本明細書中に記載の任意のベクターを用いて類似の結果を得ることができる。
上皮細胞成長因子受容体を介するシグナル伝達は細胞増殖シグナルを誘導し、正常細胞から悪性細胞への形質転換と関連している。EGFR中のいくつかの突然変異が腫瘍細胞において検出される。EGFRの最も一般的な突然変異の1つは、アミノ酸6〜273が欠失しているEGFRvIII突然変異である。
本発明のベクターへの抗体のカップリングの多用性および適用可能性をさらに実証するために、別の典型的な治療用抗体であるアバスチン(Avastin)を使用した。Avastinは、Roche Biochemicalから入手可能な抗VEGF組換えヒト化モノクローナルIgG1κアイソタイプ抗体であり、該抗体は生物活性形式の血管内皮増殖因子(VEGF)に結合し、それを阻害する。
ベクター二量体を輸送することもできる。一例では、Angiopep-1を4℃で少なくとも12時間インキュベートし、それによってポリペプチドの多量体化/二量体化を生じさせた。Angiopep-1二量体の経細胞輸送能力をin vitroで評価した。Angiopep-1二量体はIgGより良好に経細胞輸送される。さらに、表5に示されるように、二量体形式のAngiopep-1はAngiopep-1より高い分布容積を示す。ゆえに、BBBを横切ってベクター二量体を輸送することができる。
典型的に、架橋反応によって、1分子の抗体、重鎖および軽鎖あたり1〜6分子のベクターが得られる。
本出願中で記載される各刊行物、特許、および特許出願の内容は参照により組み入れられる。該刊行物、特許、および特許出願には、2007年5月29日提出の米国出願第11/807,597号、および2007年5月30日提出の第11/807,917号、および2007年12月20日提出の米国仮出願第61/008,825号が含まれる。
Claims (54)
- 以下の式:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19
[式中、
X1〜X19は任意のアミノ酸または不存在であり、
X1、X10、およびX15の少なくとも1つはArgである]
を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該アミノ酸配列は、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、およびAngiopep-7 (配列番号109〜112)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも50%の同一性を有する、前記ポリペプチド。 - Angiopep-7の配列に対して少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1記載のポリペプチド。
- 前記同一性が少なくとも70%である、請求項1記載のポリペプチド。
- 前記同一性が少なくとも90%である、請求項1記載のポリペプチド。
- X10がLysもしくはArgであるか、X15がLysもしくはArgであるか、またはその双方である、請求項1記載のポリペプチド。
- X1がArgである、請求項1記載のポリペプチド。
- X10がArgである、請求項1記載のポリペプチド。
- X15がArgである、請求項1記載のポリペプチド。
- X10およびX15がArgである、請求項1記載のポリペプチド。
- X7がSerまたはCysである、請求項1記載のポリペプチド。
- X7がSerである、請求項1記載のポリペプチド。
- Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、およびAngiopep-7からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載のポリペプチド。
- Angiopep-7のアミノ酸配列を含む、請求項12記載のポリペプチド。
- Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、およびAngiopep-7からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項12記載のポリペプチド。
- Angiopep-7のアミノ酸配列からなる、請求項14記載のポリペプチド。
- 肝臓、肺、腎臓、脾臓、および筋肉からなる群から選択される少なくとも1つの細胞または組織に輸送される、請求項1記載のポリペプチド。
- 血液脳関門(BBB)を横切って効率的には輸送されない、請求項1記載のポリペプチド。
- Angiopep-7に対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、請求項17記載のポリペプチド。
- 請求項1記載のポリペプチドを含む組成物。
- 製薬的に許容される担体を含む、請求項19記載の組成物。
- (a) 請求項1記載のポリペプチドを含むベクター、および、
(b) 前記ベクターにコンジュゲートされている治療剤、診断剤または検出可能な標識、
を含むコンジュゲート。 - 前記ベクターが、Angiopep-7の配列に対して少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項21記載のコンジュゲート。
- 前記同一性が少なくとも70%である、請求項21記載のコンジュゲート。
- 前記同一性が少なくとも90%である、請求項21記載のコンジュゲート。
- X10がLysもしくはArgであるか; X15がLysもしくはArgであるか; またはその双方である、請求項21記載のコンジュゲート。
- X1がArgである、請求項21記載のコンジュゲート。
- X10がArgである、請求項21記載のコンジュゲート。
- X15がArgである、請求項21記載のコンジュゲート。
- X10およびX15がArgである、請求項21記載のコンジュゲート。
- X7がSerまたはCysである、請求項21記載のコンジュゲート。
- X7がSerである、請求項21記載のコンジュゲート。
- 前記ベクターが、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、およびAngiopep-7からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項21記載のコンジュゲート。
- 前記ベクターがAngiopep-7のアミノ酸配列を含む、請求項21記載のコンジュゲート。
- 前記ベクターが、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、およびAngiopep-7からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項21記載のコンジュゲート。
- 前記ベクターがAngiopep-7のアミノ酸配列からなる、請求項21記載のコンジュゲート。
- 前記ベクターが治療剤にコンジュゲートされている、請求項21記載のコンジュゲート。
- 前記治療剤が抗癌剤である、請求項21記載のコンジュゲート。
- 前記ベクターが、肝臓、肺、腎臓、脾臓、および筋肉からなる群から選択される少なくとも1つの細胞または組織に効率的に輸送される、請求項21記載のコンジュゲート。
- 前記ベクターがBBBを横切って効率的には輸送されない、請求項21記載のコンジュゲート。
- 前記抗癌剤が、アバレリックス、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミフォスチン、アナキンラ、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、生BCG、ベバクジマブ(bevacuzimab)、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾムビ(bortezombi)、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン(calusterone)、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコキシブ、セツキシマブ、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、アクチノマイシンD、ダルテパリン、ダーベポエチンアルファ、ダサチニブ、ダウノルビシン、ダウノマイシン、デシタビン、デニロイキン、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エクリズマブ、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド(例えばリン酸塩)、エキセメスタン、フェンタニル、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、5-FU、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ゴセレリン、ヒストレリン、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ-2b、イリノテカン、ラパチニブジトシラート、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、CCNU、メクロレタミン(meclorethamine) (ナイトロジェンマスタード)、メゲストロール、メルファラン(L-PAM)、メルカプトプリン(6-MP)、メスナ、メトトレキセート、メトキサレン、マイトマイシンC、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロンフェンプロピオナート、ネララビン、ノフェツモマブ(nofetumomab)、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パリフェルミン、パミドロナート、パニツムマブ、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグインターフェロンアルファ-2b、ペメトレキセド、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン(ミトラマイシン)、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、マレイン酸スニチニブ、タルク、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド(VM-26)、テストラクトン、サリドマイド、チオグアニン(6-TG)、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ/I-131 (トシツモマブ)、トラスツズマブ、トレチノイン(ATRA)、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ボリノスタット、ゾレドロナート、およびゾレドロン酸からなる群から選択される、請求項37記載のコンジュゲート。
- 前記抗癌剤がパクリタキセルである、請求項40記載のコンジュゲート。
- 前記薬剤が抗体である、請求項37記載のコンジュゲート。
- 前記抗体が、ABX-EGF (パニチムマブ(Panitimumab))、OvaRex (オレゴベマブ(Oregovemab))、Theragyn (ペムツモマブイットリウム-90 (pemtumomabytrrium-90))、Therex、ビバツズマブ(Bivatuzumab)、Panorex (エドレコロマブ)、ReoPro (レオプロ) (アブシキシマブ)、Bexxar (ベキサール) (トシツモマブ)、MAb、イディオタイプ105AD7、抗-EpCAM (カツマキソマブ)、MAb肺癌(Cytoclonal製)、Herceptin (ハーセプチン) (トラスツズマブ)、Rituxan (リツキサン) (リツキシマブ)、Avastin (アバスチン) (ベバシズマブ)、AMD Fab (ラニビズマブ)、E-26 (2nd gen. IgE) (オマリズマブ)、Zevalin (ゼヴァリン) (Rituxan +イットリウム-90) (イブリツモマブチウキセタン)、セツキシマブ、BEC2 (ミツモマブ(Mitumomab))、IMC-1C11、nuC242-DM1、LymphoCide (エプラツズマブ(Epratuzumab))、LymphoCide Y-90、CEA-Cide (ラベツズマブ)、CEA-Cide Y-90、HumaRAD-HN (+イットリウム-90)、MDX-101 (CTLA-4)、MDX-210、MDX-210/MAK、Vitaxin、MAb 425、IS-IL-2、Campath (キャンパス) (アレムツズマブ)、CD20ストレプトアビジン、Avidicin、(アルブミン+ NRLU13)、Oncolym (+ヨウ素-131) Cotara (+ヨウ素-131)、C215 (+ブドウ球菌エンテロトキシン)、MAb肺/腎臓癌(Pharmacia Corp.製)、ナコロマブタフェナトキス(nacolomab tafenatox) (C242ブドウ球菌エンテロトキシン)、Nuvion (ヌヴィオン) (ビジリズマブ)、SMART M195、SMART 1D10、CEAVac、TriGem、TriAb、放射性標識NovoMAb-G2、Monopharm C、GlioMAb-H (+ゲロニン毒素)、Rituxan (リツキシマブ)、およびING-1からなる群から選択される、請求項42記載のコンジュゲート。
- 肝臓、肺、腎臓、または脾臓細胞において、前記ベクターにコンジュゲートされていない場合の前記薬剤または標識と比較して、迅速に蓄積し、高濃度に蓄積し、減少したP-gp媒介性流出を示す、請求項21記載のコンジュゲート。
- 請求項21記載のコンジュゲートおよび製薬的に許容される担体を含む組成物。
- 癌を有する被験体の治療方法であって、該被験体を治療するために十分な量の請求項37記載のコンジュゲートを該被験体に提供するステップを含む、前記方法。
- 前記癌が、肺、肝臓、腎臓または脾臓の癌である、請求項46記載の方法。
- 前記癌が、肝細胞癌、乳癌、頭部および頸部の癌、リンパ腫、外套細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、腺腫、扁平上皮癌、喉頭癌、網膜の癌、食道の癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮癌、黒色腫、結腸直腸癌、膀胱癌、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、膵癌、子宮頸癌、頭部および頸部癌、皮膚癌、上咽頭癌、脂肪肉腫、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺癌、子宮内膜肉腫および多剤耐性癌からなる群から選択される、請求項46記載の方法。
- 前記コンジュゲートが、肝臓、肺、腎臓、脾臓、または筋肉からなる群から選択される少なくとも1つの細胞または組織に効率的に輸送されるベクターを含む、請求項46記載の方法。
- 前記コンジュゲートが、BBBを横切って効率的には輸送されないベクターを含む、請求項46記載の方法。
- 前記コンジュゲートがAngiopep-7を含む、請求項50記載の方法。
- 前記抗癌剤がパクリタキセルである、請求項46記載の方法。
- 前記抗癌剤が前記ポリペプチドにコンジュゲートされた場合に、該ポリペプチドにコンジュゲートされていない場合の該抗癌剤と比較して、増加した効力または減少した副作用を有する、請求項46記載の方法。
- 前記被験体がヒトである、請求項46記載の方法。
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