JP2010521157A - 糖尿病および肥満の治療薬の同定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、部分的に、米国国立衛生研究所(NIH)からの認可番号P50 CA94056、RO1 GM56203およびR01 DK40936に基づく政府支援によってなされた。政府は、本発明についてある種の権利を有し得る。
本発明は、糖尿病および肥満を含む疾患を処置するためのPar−1b活性の阻害に関する。本発明はまた、糖尿病および肥満の処置に有用な、Par−1bタンパク質の活性を阻害する剤のスクリーニングに関し、さらに、糖尿病および肥満の処置のための化合物の製造に関する。
インスリン抵抗性および肥満は、2型糖尿病の発症に重要な2つの生理学的摂動である。推定1570万人の米国人が糖尿病を有し、成人発症2型糖尿病は糖尿病全体の90〜95%を占める。米国の全糖尿病患者のほぼ3分の1がこの疾患を有していることを自覚せず、気付かれずコントロールされていない糖尿病は、例えば、失明、心疾患、神経疾患および肝臓疾患などの重篤な副作用を有し得る。臨床的リスクの増加に加えて、2型糖尿病はまた、罹患した人々の生活の質の低下ももたらし得る。
2型糖尿病および肥満は、健康および生活の質に重大な結果をもたらす、現代社会における主要な疾患であるため、より少ないおよび/または低度の低い副作用で、糖尿病および肥満のより優れた処置を提供するために、改善された処置方法が必要である。
いくつかの態様において、方法はまた、候補薬剤の不在下でのPar−1bポリペプチドのキナーゼ活性の第2の量を決定すること、および該Par−1bポリペプチドの活性の第2の量を、活性の対照量として用いることを含む。
他の好ましい態様においては、Par−1bポリペプチドは細胞内に含まれており、該細胞を候補薬剤と接触させる。
本発明の他の態様により、インスリン反応性の低下または肥満を特徴とする疾患を有するか、有することが疑われる対象を処置する方法が提供される。該方法は、かかる処置を必要とする対象に、該疾患の処置として、該対象のPar−1bポリペプチドのキナーゼ活性を低下させる化合物または組成物の有効量を投与することを含む。
他の態様において、化合物または組成物は、Par−1bポリペプチドの量を低下させる。好ましくは、Par−1bポリペプチドの量を低下させる化合物または組成物は、siRNA/RNAi分子またはアンチセンス核酸分子である;より好ましくは、siRNA/RNAi分子は、ヌクレオチド配列
本発明の他の側面により、インスリン反応性の低下または肥満を特徴とする疾患の処置のための薬物を製造する方法が提供される。該方法は、Par−1bポリペプチドのキナーゼ活性を低下させる化合物または組成物を同定すること、および該化合物または組成物を、かかる処置が必要な対象への投与のために製剤化することを含む。
他の態様において、Par−1bポリペプチドのキナーゼ活性を低下させる化合物または組成物は、糖尿病または肥満の処置のための薬剤として有用な化合物または組成物を同定するための、前述の任意の方法により同定される。
他の側面において、本発明は、前述の剤、化合物および分子の、医薬、特に2型糖尿病や肥満などの、インスリン反応性の低下の処置のための医薬の製造における使用を提供する。
本発明のこれらおよび他の側面は、以下にさらに記載される。
(A)交尾後13.5〜18.5日(d.p.c.)の胎児の体重(1時点・1遺伝子型当たりn=5〜13)。(B)出生〜3週齢のマウスの体重(1時点・1遺伝子型当たりn=4〜19)。(C)1歳齢における、Par−1b野生型マウス(Par−1b+/+、黒色棒グラフ)、異型接合マウス(Par−1b+/−、赤色棒グラフ)またはヌルマウス(Par−1b−/−、灰色棒グラフ)の体重(性別・1遺伝子型当たりn=7〜13)。(D)Par−1b野生型およびヌルマウスの、鼠径部(I)および副睾丸(E)の脂肪体の比較。(E)10〜12週齢の雄Par−1b野生型マウスおよびヌルマウスの過脂肪の散布図であって、1H−MRSにより決定された脂肪量の体重に対する比率で表わしたもの。各遺伝子型の個々のマウスは平均値で示し、p値も示した(遺伝子型当たりn=18〜20)。(F)Par−1b野生型マウスおよびヌルマウスの褐色および白色脂肪組織(BATおよびWAT)のヘマトキシリン・エオジン染色。全ての値は平均値±標準誤差で示す。スチューデントt検定により群間の比較を行った。p値は以下のとおりである:****(p<0.05)、***(p<0.01)、**(p<0.005)、*(p<0.001)。
雄のPar−1b野生型マウスおよびヌルマウス(遺伝子型当たりn=5)に、高脂肪食を16週間、3週齢時から開始して与えた。(A)高脂肪食の期間中のPar−1b野生型マウスおよびヌルマウスの体重。平均値は±標準誤差と共に示す。全てのデータ点は、p<0.05で野生型とヌルマウスの間の統計的有意差を示す。独立した実験において、雄のPar−1ヌルマウス(紫色棒グラフ)および野生型マウス(白抜き棒グラフ)(遺伝子型当たりn=18〜20)に高脂肪食を8週間与えて分析した。Par−1ヌルマウスは、高脂肪食により、代謝率の増加(B)、エネルギー消費の増加(C)、および食物の摂取の増加(D)を示す。Par−1ヌルマウスの呼吸指数(VCO2/VO2)は、野生型対照(E)と統計的な差はない。スチューデントt検定のp値はパネル内に示す。
(A)食餌を与えられたかまたは絶食(12時間)のPar−1b+/+マウス(白抜き棒グラフ)およびPar−1b−/−マウス(紫色棒グラフ)から、後方眼窩出血を得て、血清インスリン濃度をラジオイムノアッセイにより測定した(遺伝子型当たりn=18マウス)。(B)食餌を与えられたかまたは絶食のマウスについて、血糖値を決定した(遺伝子型当たりn=18マウス)。(C)インスリン耐性試験(ITT)を、Par−1b+/+(黒線、菱形印)およびPar−1b−/−(紫色線、丸印)の同腹子に、0.30IU/kgのインスリンを腹腔内注射して行った(遺伝子型当たりn=14マウス)。尾から出血を得て、血糖値を、インスリン注射後に15分間隔でモニタリングした。データは、注射前の0時点に対する血糖値%としてプロットした。(D)耐糖能試験を、Par−1b+/+およびPar−1b−/−の同腹子に、Dブドウ糖を1mg/体重1gで腹腔内注射して行った(遺伝子型当たりn=10)。尾から出血を得て、血糖値を、ブドウ糖注射後に20分間隔でモニタリングした。データを、注射前の0時点に対する血糖値%としてプロットした。パネルA〜Dにおいて、全ての値に対し標準誤差をy軸上にプロットした。2群間の比較についてはスチューデントt検定を行った。p値は以下のとおりである:****(p<0.05)、***(p<0.01)、**(p<0.005)、*(p<0.001)。
Par−1b+/+およびPar−1b−/−マウスの18F−FDG注射の1時間後の、代表的な冠状断面図である。Par−1b−/−マウスは、肩甲骨内褐色脂肪(BAT)パッドにおける取込みの、定常的な上昇レベルを示す。
図5 Par−1b−/−マウスにおける肝臓脂肪症に対する耐性。
(A)および(B):ヘマトキシリン・エオジン染色肝臓切片の低倍率の図は、野生型において、小葉の強調を有する脂肪症を示し、一方、ヌルマウスからの切片は、正常な肝臓の実質組織を示す(スケールバー:1mm)。(C)肝小葉内での脂肪の分散(点線)は主に小葉中心性である;肝腺房のゾーン3内(直線)。(スケールバー:500mm)。(D)小葉中心性脂肪症は、ヌルマウスからの切片には存在しない(スケールバー:500mm)。(E)および(F):それぞれ、野生型(E)およびKOマウス(F)からの新鮮凍結肝組織オイルレッドO染色。挿入図は、野生型でのマイクロ小嚢およびマクロ小嚢であって、Fにおいては最小の活性のみが見られる。
高インスリン−正常血糖クランプ実験に続いて、Par−1b+/+マウス(白色棒グラフ)およびPar−1b−/−マウス(紫色棒グラフ)からの白色脂肪組織(A)、褐色脂肪組織(B)、および骨格筋(腓腹筋)への放射標識ブドウ糖取込みの定量化を行った。平均値は、遺伝子型当たりn=8〜9を用いて、±標準誤差と共にプロットする。
Par−1b+/+マウス(白抜き棒グラフ、n=4)およびPar−1b−/−マウス(黒色棒グラフ、n=4)の肩甲骨内褐色脂肪パッド、骨格筋、脳および心臓における、18F−FDG注射の1時間後の示された条件下での、18F−FDG取込みのグラフによる解析を示す。18F−FDG取込みのデータは、平均標準取込み値(SUV)として表わす。誤差バーは、平均値の標準誤差(SEM)である。
図8 Par−1bはBAT、WAT、肝臓および脳において発現されるが、骨格筋には発現されない。
組織を、そのβ−ガラクトシダーゼ活性について、β−ガラクトシダーゼカセットを担持しその発現が内因性のPar−1bプロモータにより駆動されるマウスを用いて解析した。
褐色脂肪組織を均一化し、全細胞抽出物からの50μgのタンパク質を、示された抗体を用いる免疫ブロット法により解析した。
図10 インスリン刺激BAT解析は、Par−1b−/−マウスにおいて近接するインスリンシグナルが変化しないことを示す。
野生型およびPar−1b−/−マウスに、インスリンの準最大用量(0.3U/体重1kg)を(腹腔内)注射した。20分後組織を収集し、褐色脂肪組織(上図)からIRS−1を免疫沈降させた。全細胞溶解産物(50μg)も、示された抗体を用いる免疫ブロット法により解析した(下図)。
現在用いられている2型糖尿病の治療剤は、それらの開発において分子的または生化学的に標的化されておらず、その治療的成功(限定的ではあるが)の理由は知られていない。そのため、Par−1bシグナル伝達の直接阻害剤は、その治療的可能性においてより強力であることが期待される。Par−1bシグナル伝達を直接阻害することにより、糖尿病の組織においてインスリンのシグナル伝達を最大に回復でき、より強力で長期に有効な治療法をもたらす可能性がある。これに基づき、我々は、Par−1bの化学的直接阻害剤をスクリーニングして、潜在的治療化合物を同定することを提言する。かかる化合物は、2型糖尿病またはインスリン反応性の低下から生じる任意の臨床状態の処置に有用である。
本発明はさらに、Par−1b活性を低下させるのに有用な薬剤または剤のためのリード化合物を同定する、効率的な方法を提供する。一般に、スクリーニング法には、基質のリン酸化を低下させる(すなわち、阻害する)化合物のためのアッセイが関与する。かかる方法は、化合物の自動化高スループットスクリーニングに適合させることができる。
候補薬剤は、例えば、組合せペプチドライブラリ、小分子ライブラリ、または天然産物ライブラリなどに由来するものであってよい。
Par−1b阻害剤はまた、構造に基づく合理的な方法を用いて、例えばPCT/US98/10876およびこれに記載の参照文献に記載されている方法などにより、設計することもできる。
本明細書に記載の方法により同定される、Par−1bポリペプチド活性(例えばキナーゼ活性)の阻害剤は、Par−1bポリペプチド活性の増加または過剰による疾患または状態を処置するのに有用であり、これには、インスリン反応性の損失(またはその減少)を特徴とする疾患(例えば2型糖尿病)および肥満を含む。かかる状態の処置のために、Par−1bポリペプチド活性阻害剤の有効量を、対象に投与する。
Par−1bの発現を低下させる剤(例えば、内因性遺伝子の発現を減少させることにより)もまた、これらの目的に用いることができる。かかる剤は、アンチセンス核酸分子およびSiRNAまたはRNAi分子を含む。本発明にしたがって用いることのできる既知のPar−1b阻害剤は、siRNA配列AAG ACU CAA CUG AAC UCC UCC(配列番号1)を含み、これらはPar−1bのコードヌクレオチド256〜276(参考文献22参照)、またはTang et al. PNAS. 2006, 103:2087-92において用いられる配列に対応する。
本明細書で用いる用語「改変オリゴヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドであって、ここで(1)少なくとも2つのそのヌクレオチドが、合成ヌクレオシド間結合(すなわち、1つのヌクレオチドの5’末端と他のヌクレオチドの3’末端の間の、ホスホジエステル結合以外の結合)を介して共有結合されているか、および/または(2)通常は核酸と関連しない化学基が、オリゴヌクレオチドに共有結合している、前記オリゴヌクレオチドを言う。好ましい合成ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバミン酸塩、炭酸塩、リン酸トリエステル、アセトアミド、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
低分子干渉RNA(siRNA)分子を用いることによりPar−1bの発現を低下させる方法を用いてもよい。1つの側面において、細胞をsiRNA分子に接触させて、1または2以上の前述の遺伝子の発現を低減させるRNA干渉(RNAi)を作製する。siRNA分子は、関連するポリペプチド(例えば、非翻訳および翻訳領域を含むRNA転写物)をコードする核酸に対するものである。ウェスタンブロット法などの周知の方法を用いて、タンパク質発現のレベルを決定でき、ノーザンブロット法またはRT−PCRを用いて、標的遺伝子のmRNA転写物のレベルを決定することができる。
異常に増加したPar−1b活性に関連する疾患、インスリン反応性の低下を特徴とする疾患、または肥満を有するか、またはこれを有することが疑われる対象を同定するための方法は、以下を含むがこれに限定されない:健康診断、対象の病歴の解析、対象の家族歴の解析、血液検査、目視による検査、平均体重評価、および/または体重評価。インスリン反応性の低下を特徴とする疾患を有するか、またはこれを有することが疑われる対象を同定するための診断方法は、医学分野の当業者に周知であるが、Par−1b活性の増加に必ずしも関連する必要はない。
本明細書において、生体試料は組織、細胞、または体液(例えば血液またはリンパ節液)を含むが、これには限定しない。液体試料は、細胞および/または液体を含んでよい。組織および細胞は、対象から得るか、または培養物中で増殖させてもよい(例えば、細胞株から)。本発明のいくつかの態様において、生体試料は対照試料である。
したがって、本発明はまた、対象におけるPar−1b活性の増加または過剰に関連する疾患の発症、進行、または後退を、例えば、対象から順次試料を得ること、かかる試料をPar−1b核酸分子の発現レベル、Par−1bポリペプチド分子の発現レベル、および/またはPar−1bポリペプチドの活性レベル(例えば、キナーゼ活性)についてアッセイすることによりモニタリングする方法も含む。対象は、Par−1b活性の増加または過剰に関連する疾患を有することが疑われるものであってよく、またはかかる疾患を有さないと考えられるものであってよく、後者の場合は、試料の発現または活性レベルは、続く試料との比較用の対照として機能することができる。
本発明はまた、Par−1bポリペプチドまたはかかるポリペプチドの基質に結合する、ポリペプチドなどの剤の使用も含む。かかる結合剤は、例えば、Par−1bポリペプチドまたはその基質の有無を検出するためのスクリーニングアッセイにおいて、および、Par−1b、その基質またはPar−1bポリペプチドとそれらの基質の複合体を単離する精製プロトコルにおいて、用いることができる。
完全なヒトモノクローナル抗体もまた、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の座の大部分について遺伝子導入されたマウスを免疫化することにより作製できる。これらマウス(例えば、XenoMouse (Abgenix)、HuMAbマウス(Medarex/GenPharm))の免疫化に続き、モノクローナル抗体を、標準のハイブリドーマ技術にしたがって調製可能である。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、したがってヒトに投与された場合に、ヒト抗マウス抗体(HAMA)反応を引き起こさない。
患者に投与してPar−1b活性を低下させる剤の用量は、異なるパラメータに応じて選択することができ、特に、用いる投与の方法および患者の状態に応じて選択できる。他の要因としては、処置の所望の期間を含む。対象における応答が、適用された最初の用量では不十分な場合には、より高い用量(または、より局所的な異なる送達経路による、より有効な高い用量)を、患者の耐容性が許す範囲で用いてもよい。
医薬組成物は、上述のように好適な緩衝剤を含有してよく、以下を含む:酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、グリシン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、水酸化物(および他の塩基)および前述の化合物の薬学的に許容し得る塩類。
医薬組成物は、単一用量形態において便利に提供されてよく、薬学の分野で周知の任意の方法により調製されてよい。全ての方法は、活性成分を、1または2以上の補助的成分を構成する担体と関連させるステップを含む。一般に組成物は、活性化合物を液体担体、微細に分割された固体担体、またはこれらの両方と均一かつ緊密に関連させ、次に必要に応じて製品に形成することにより、製造される。
非経口投与に好適な組成物は、Par−1b活性を低下させる剤を便利に含有する。この製剤は、既知の方法により、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて製剤化されてよい。無菌の注射製剤も、非毒性の非経口的に許容し得る希釈剤または溶媒などにおける、無菌の注射溶液または懸濁液であってよく、例えば1,3−ブタンジオール中の溶液とされる。用いることのできる許容し得るビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー溶液、および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として便利に用いられる。この目的に対して、任意の無刺激性固定油を用いてよく、合成のモノ−またはジ−グリセリドを含む。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射物の調製に用いてもよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に好適な担体処方は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PAに見出すことができる。
本発明のキットの他の例は、本発明のPar−1b核酸分子の発現レベルを決定するのに必要な成分を提供するキットである。かかる成分は、Par−1b核酸分子の増幅に有用なプライマー、および/またはPCR増幅のための他の化学物質を含むことができる。
前述のキットは、キットを、診断目的または化合物スクリーニングの目的のために、キットの種々の成分をどのようにして用いるかについての、指示書または他の印刷物を含むことができる。
緒言
Par−1b/MARK2/Emk遺伝子産物は、細胞極性の生成および/または維持を含む多数の細胞過程の調節に関与する。もともと線虫(Caenorhabdhitis elegans)において初期胚性極性の重要なプレーヤーとして同定されたPar−1は、酵母、ショウジョウバエ、アフリカツメガエルおよびいくつかの哺乳類細胞型(1〜13)における細胞極性を調節することが見出されている。Par−1は、Wntシグナル経路である、微小管安定性の調節物質であり、また小胞性輸送(vesicular trafficking)(2、8、12、14〜19)において役割を果たす。2つの重要な調節物質であるPar−1、LKB1(Par−4)および異型PKCζ/λ(aPKC)は、複数の系において同定された。LKB1は、Par−1のキナーゼドメインの活性化ループThr残基のリン酸化を触媒し、一方aPKCは、Par−1キナーゼの「スペーサー」ドメイン(20〜22)の保存Thr残基をリン酸化する。LKB1により触媒されたリン酸化の活性化とは対照的に、aPKCは、Par−1の局在化および活性を負に調節する(22〜25)。
Par−1bヌルマウスは、体重減少および過脂肪の減少を有する
Par−1bキナーゼヌルマウス(Par−1b−/−)の作製については前に記載した(31)。Par−1b−/−マウス(雄および雌)は、胎児期および出生後の成長の両方の間、その野生型同腹子より〜20%軽い(118±12mg対150±16mg、交尾後13.5日、p<0.005)(図1A〜C)。Par−1bヘテロ接合体(Par−1b+/−)も、1歳齢において統計的に有意な体重減少を示す。1歳齢における鼻から肛門までの長さは、ヌルの雄(Par−1b−/−9.35cm±0.57対Par−b+/+10.10cm±0.42、p=0.04)および、雌(Par−1b−/−9.08±0.35対Par−1b+/+9.75±0.32、p=0.01)において有意に減少していた(〜8%)。
Par−1bヌルマウスは不均等にやせているとの所見に基づき、Par−1b−/−マウスが、高脂肪食を与えられた場合に体重増加に抵抗性であるかどうかを決定することを試みた。Par−1bヌルマウスおよび野生型マウスを、高脂肪食(カロリー含量で42%脂肪)に16週間供し、体重変化および食物摂取についてモニタリングした。Par−1b−/−雄マウスは、野生型対照と比べて体重増加に抵抗性であった(20週目においてPar−1b−/−21.37g対Par−1b+/+38.25g、p=0.005、図2A)。雌のPar−1bヌルマウスは、高脂肪食誘発性の体重増加に対して抵抗性を示さないが(データ示されず)、ただし雌Par−1b−/−マウスも、雄のPar−1b−/−マウス同様、通常の固形飼料でやせていた(データ示されず)。インスリン、レプチン、アディポネクチン、遊離脂肪酸、トリグリセリド、およびコレステロールの血清濃度を測定し、Par−1b−/−マウスが高脂肪食誘発性の体重増加に抵抗性である潜在的メカニズムを明らかすることを試みた(表1)。
Par−1bヌルマウスはやせており、代謝亢進性であり、高脂肪食を与えられると血清インスリン濃度の低下を有するため、これらのマウスは、インスリンに対する感受性が増強されているとの仮説をたてた。高脂肪食を与えられたマウスにおける測定値と整合し(表1)、Par−1bヌルマウスの血清インスリン濃度は、標準の固定食餌を与えられたかまたは絶食条件下の野生型の同腹子より、有意に低かった(図3A)。低インスリン血症であるにも関わらず、Par−1b−/−マウスは絶食条件下で正常血糖性であり、給餌条件下で軽度に低血糖症であった(図3B)。インスリン抵抗性試験により、Par−1bヌルマウスは、実際にそれらの野生型同腹子よりインスリンに対して感受性が高いことが示された(図3C)。Par−1bヌルマウスはまた、ブドウ糖負荷試験により評価されたように、増強された耐糖能を示し(図3D)、膵β細胞の機能が、外在的に供給されたブドウ糖ボーラスに対処するのに十分であることを示す。Par−1bヌルマウスにおけるインスリン感受性をさらに解析するために、高インスリン−正常血糖クランプ試験を記載のようにして行った(33)。
Par−1b−/−マウスにおける脂肪細胞媒介性糖取込みの、観察された増加は、いくつかの可能性のあるメカニズムにより説明できる可能性がある(考察参照)。我々は、インスリン感受性組織におけるPar−1b発現を、内因性Par−1bプロモータ(図8)が駆動するβ−ガラクトシダーゼリポーターおよびウェスタンブロット解析を用いて評価した(データ示さず)。Par−1bは、BAT、WATおよび肝臓において高度に発現され、骨格筋においては顕著な発現はみられない。この発現パターンに基づくと、Par−1bは糖取込みを、脂肪細胞自律的メカニズムを介して調節するようである。Par−1b−/−およびPar−1b+/+マウスの脂肪組織からのいくつかの代謝調節物質の発現をモニタリングした。ウェスタンブロット解析は、BAT(図9)またはWAT(データ示さず)のUCP1、UCP2、PPARγまたはGLUT4タンパク質レベルにおける、いかなる一貫した差も示さなかった。
この研究において、Ser/Thrタンパク質キナーゼであるPar−1b/MARK2/Emkは、過脂肪、インスリン感受性および糖代謝の新規な調節物質であることを、Par−1bがヌルであるマウスを用いて示した。Par−1b−/−マウスは、胚形成の間(交尾後13.5日間)および出生後、成長が遅延する。出生後、Par−1bヌルマウスは、全体的に器官サイズの〜20%の減少を示し、ただし例外は白色および褐色脂肪組織である(10週齢において野生型と比較して40%の減少)。これらの器官質量および過脂肪の減少には、血清IGF−1濃度における25%の減少が伴う。IGF−1シグナル伝達は、胚成長および出生後の成長に重要である(34、35)。IGF−1受容体ハイポモルフおよびIGF−1の肝臓特異的欠失のマウスモデルもまた、脂肪組織における不均等な減少と共に、全体的成長の遅延を示す(36、37)。IGF−1シグナル伝達はまた、in vitroにおける脂肪細胞の増殖および分化に重要であることが示されている(38)。これらを考慮すると、我々のデータは、Par−1bがIGF−1媒介性の成長に非常に重要であり、IGF−1駆動の脂肪生成における欠損によって、過脂肪の減少をもたらす可能性があることを示唆する。Par−1b−/−マウスと対照的に、IGF−1/IGF−1Rシグナル伝達が欠損したヒトおよびマウス両方は、インスリン抵抗性を示す。結果として、IGF−1欠損のみに基づいて、Par−1b−/−マウスのインスリン過感受性を説明することは困難である。成長ホルモン受容体(GHR−/−)欠損マウスは、Par−1bヌルと同様、インスリン感受性の増加および成長の遅延を示す。しかし、Par−1bヌルマウスと異なり、GHR−/−マウスは、年齢と共に過脂肪の増加、食餌誘発性の肥満の起こしやすさ、体温の低下および正常な胚成長の減少(39〜41)も示す。これらのデータは、本明細書に記載のPar−1b−/−代謝性表現型は、GH媒介性効果の結果のみによるものではないらしいことを示す。
動物の処置
全ての動物の処置は、ワシントン大学のSchool of Medicine Animal Studies Committeeにより承認された。Par−1bヌルマウスの作製は、前に記載されている(31)。株背景C57B1/6;129X1SvJのヘテロ接合Par−1bマウスを異種交配して、本研究で用いるマウスを作製した。Par−1b遺伝子のβガラクトシダーゼをコードするマウスは、M. Darmonの好意により提供された(30)。他の記載がない限り、マウスには標準の固形飼料を与えた(脂肪4.5%、炭水化物55%、タンパク質20%、繊維4.7%を含むLab Diet 5053, Purina Mills)。
異種交配から作製した胚および仔の体重を測り、遺伝子型決定を尾切断(tail clipping)のPCR解析により行った。指定された時点において、胚を収集し、PBSですすぎ、Mettler AE50秤(Mettler Toledo AG, New Jersey, USA)を用いて計量した。プラグ(plug)の観察は、交尾後(dpc)0.5日に記録した。出生後の成長曲線は、指定時点でOhaus Scout秤(Ohaus Corp., New Jersey, USA)を用いてマウスを計量して得た。各時点での平均体重を、各遺伝子型毎に5〜13個の胚または4〜19匹のマウスから計算した。
組織学的検討については、組織を10%中性緩衝ホルマリン中に固定し、PBSですすぎ、70%エタノール中に保存した。固定した組織を標準の手法によりパラフィンに包埋した。ブロックを切片化し(5μm)、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。白色脂肪細胞数および大きさを、複数の独立した視野で30倍率でOlympus BX60顕微鏡を用いて計測した。
3〜5月齢のマウスの脳、褐色脂肪、白色脂肪、心臓、ヒラメ筋、膵臓および肝臓を解剖した。mPar−1bマウスについては記載されている(30)。ホールマウント組織を解剖して数個の3〜6mm切片にし、PBSで3回洗浄し、1%のホルムアルデヒド、0.2%のグルタールアルデヒド、0.02%のNP40、1mMのMgCl2を含有するPBSに4℃で固定した。固定後、組織をPBSで3回洗浄し、DMF中1mg/mlのX−gal、PBS中の2mMのMgCl2、5mMのフェリシアン化カリウム、5mMのフェロシアン化カリウム、100mMのDガラクトースを用いて、37℃で一晩染色した。組織をPBSで洗浄し、PBS中の4%パラホルムアルデヒドで後固定し、加工し、パラフィン化して、顕微鏡観察用に切片化した。
4週齢において、Par−1bKOおよびWTマウスを計量し、それらの標準のげっ歯類用固形飼料を、Harlan Teklad (88137)からのAdjusted Calories Diet(42%脂肪)に置き換えた。高脂肪固形飼料の重量を記録し、食物消費およびマウスの体重を、個別のマウスについて1週間に1回の割合で16週間測定した。
高インスリン−正常血糖クランプ試験
雄のPar−1bヌルマウスと野生型同腹子(n=19〜22)をNIH-Yale Mouse Metabolic Phenotyping Centerにおいて試験し、in vivoでの組織特異的インスリン作用および糖代謝における変化を評価した。Yaleの施設における1ヶ月の環境順化(続いて高脂肪食検討のために8週間の高脂肪食投与)の後に、全体脂肪重量および除脂肪体重を覚醒マウスにおいて、前に記載のように1H−MRS(Bruker Mini-spec Analyzer, Echo Medical Systems, Houston, TX)を用いて測定した(33)。プロトコルの詳細については、補足の資料および方法を参照のこと。
活動性、食物および水消費量、およびエネルギー消費量を含む広範囲の代謝測定の検討のために、総合的動物代謝モニタリングシステム(CLAMS: Columbus instruments, Columbus, OH, USA)を用いた。データ解析に際し、エネルギー消費量、摂食および飲水は、体重に関して正規化する。エネルギー消費および呼吸商(RQ)は、前に収集したガス変換データから計算した:RQはVCO2のVO2に対する比率として、Heat=(3.815+1.232*RQ)*VO2。活動性は、xおよびz軸上で赤外線を用いて特定の測定期間中に赤外線が遮られた回数を計測して測定した。摂食は、1時点から次の時点までの、Center-Feederの秤量における差を記録して測定した。飲水は、飲水容量モニターを通して測定した。
ランダムに餌を与えるかまたは絶食させた(12時間)マウスを、記載のようにして解析した。血清インスリン濃度は、放射性免疫測定法により、ラットのインスリンを標準としてELISA(R&D Systems、製造業者の指示による)を用いて決定した。血糖値はB−ブドウ糖光度計およびB−ブドウ糖キュベット(HemoCue AB, Angelholm, Sweden)を用いて決定した。インスリン抵抗性試験(ITT)は、絶食(6時間)した8〜10週齢のマウスで行った。血糖値は、インスリン(0.30IU/kg、HumulinR, Eli Lilly and Company, Indianapolis, USA)の腹腔内注射の直前およびその後15分間隔で測定した。ブドウ糖負荷試験(GTT)は、絶食(12時間)した12週齢のマウスで行った。マウスに、D−ブドウ糖(20%溶液;1g/体重1kg)を腹腔内注射し、血糖値を注射後の指定時点において測定した。
インスリン、トリグリセリド、アディポネクチン、レプチン、遊離脂肪酸およびコレステロールの血清濃度を、Ani Lytics Incorporated(Gaithersburg, MD)により決定した。血清IGF−1(R&D Systems, Minneapolis, MN)および成長ホルモン(Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster, TX)の濃度を、ELISAにより、製造業者の指示に従って測定した。
microPET画像化のために、8週齢の雄の野生型およびPar−1bヌルマウスのコホートを、週1回、連続して4週間、各回に異なる条件下で、繰り返し画像化した。マウスは、一晩絶食させるか、または標準のげっ歯類用固形飼料に自由にアクセス可能とした(非絶食)。翌朝、0.5IU/kgのインスリン(Humulin N)または生理食塩水のどちらかをマウスにIP注射で投与した。IP注射の30分後、マウスにイソフルランで軽度の麻酔を施し、続いて18F−FDG
抗UCP1および抗UCP2はAlpha Diagnostic Intl. Inc.(San Antonio, Tx)より入手した;抗GLUT1および抗GLUT4はAbcam(Cambridge, MA)より入手した;抗p110αはBD Biosciences(San Jose, CA)より入手した;抗PPARγ、抗p85および抗IRS−1抗体は、Upstate(Lake Placid, NY)より入手した;抗ホスホ−AMPK、総AMPK、ホスホ−GSK−3、GSK−3α、GSK−3βは、Cell Signaling Techonologies(Danvers, MA)より入手した;抗P−Tyr(4G10)は、Tom Roberts博士から贈られたものである。組織溶解産物は、(31)に記載のように標準法により調製した。プロトコルの詳細については、補足資料および方法を参照のこと。
動物の体重測定
異種交配から作製した胚および仔の体重を測り、遺伝子型決定を尾切断(tail clipping)PCR解析により行った。指定された時点において、胚を収集し、PBSですすぎ、Mettler AE50秤(Mettler Toledo AG, New Jersey, USA)を用いて計量した。プラグ(plug)の観察は、交尾後(dpc)0.5日に記録した。出生後の成長曲線は、指定時点でOhaus Scout秤(Ohaus Corp., New Jersey, USA)を用いてマウスを計量して得た。各時点での平均体重を、各遺伝子型毎に5〜13個の胚または4〜19匹のマウスから計算した。
組織学的検討については、組織を10%中性緩衝ホルマリン中に固定し、PBSですすぎ、70%エタノール中に保存した。固定した組織を標準の手法によりパラフィンに包埋した。ブロックを切片化し(5μm)、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。白色脂肪細胞数および大きさを、複数の独立した視野で30倍率でOlympus BX60顕微鏡を用いて計測した。
3〜5月齢のマウスの脳、褐色脂肪、白色脂肪、心臓、ヒラメ筋、膵臓および肝臓を解剖した。mPar−1bマウスについては記載されている(30)。ホールマウント組織を解剖して数個の3〜6mm切片にし、PBSで3回洗浄し、1%のホルムアルデヒド、0.2%のグルタールアルデヒド、0.02%のNP40、1mMのMgCl2を含有するPBSに4℃で固定した。固定後、組織をPBSで3回洗浄し、DMF中1mg/mlのX−gal、PBS中の2mMのMgCl2、5mMのフェリシアン化カリウム、5mMのフェロシアン化カリウム、100mMのDガラクトースを用いて、37℃で一晩染色した。組織をPBSで洗浄し、PBS中の4%パラホルムアルデヒドで後固定し、加工し、パラフィン化して、顕微鏡観察用に切片化した。
抗UCP1および抗UCP2はAlpha Diagnostic Intl. Inc.(San Antonio, Tx)より入手した;抗GLUT1および抗GLUT4はAbcam(Cambridge, MA)より入手した;抗p110αはBD Biosciences(San Jose, CA)より入手した;抗PPARγ、抗p85および抗IRS−1抗体は、Upstate(Lake Placid, NY)より入手した;抗ホスホ−AMPK、総AMPK、ホスホ−GSK−3、GSK−3α、GSK−3βは、Cell Signaling Techonologies(Danvers, MA)より入手した;抗P−Tyr(4G10)は、Tom Roberts博士から贈られたものである。組織溶解産物は、(31)に記載のように標準法により調製した。免疫ブロット分析用の組織は、以下:50mMトリス[pH8.0]、100mMのNaCl、2mMのジチオトレイトール[DTT]、5mMのEDTA、0.5%NP−40、1mMのミクロシスチン、1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム、2mMのフッ化フェニルメチルスルホニル、1ml当たり0.15Uのアプロチニン、20mMのロイペプチン、20mMのペプスタチン、を含有する溶解緩衝液中での、4℃で20分間の均質化により調製した。溶解産物は遠心分離により精製し、タンパク質濃度をBio-Radタンパク質アッセイキットを用いて決定した。ウェスタンブロット解析のために、50μgの総タンパクを、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)(7%ポリアクリルアミド)により分解した。IRS−1の免疫沈降を、1ugの抗IRS−1抗体を1mgの総組織溶解産物で2時間インキュベートし、続いてタンパク質Gセファロースにより4℃で1時間インキュベートして、実施した。
ランダムに餌を与えるかまたは絶食させた(12時間)マウスを、記載のようにして解析した。血清インスリン濃度は、放射性免疫測定法により、ラットのインスリンを標準としてELISA(R&D Systems、製造業者の指示による)を用いて決定した。血糖値はB−ブドウ糖光度計およびB−ブドウ糖キュベット(HemoCue AB, Angelholm, Sweden)を用いて決定した。インスリン抵抗性試験(ITT)は、絶食(6時間)した8〜10週齢のマウスで行った。血糖値は、インスリン(0.30IU/kg、HumulinR, Eli Lilly and Company, Indianapolis, USA)の腹腔内注射の直前およびその後15分間隔で測定した。ブドウ糖負荷試験(GTT)は、絶食した(12時間)12週齢のマウスで行った。マウスに、D−ブドウ糖(20%溶液;1g/体重1kg)を腹腔内注射し、血糖値を注射後の指定時点において測定した。
インスリン、トリグリセリド、アディポネクチン、レプチン、遊離脂肪酸およびコレステロールの血清濃度を、Ani Lytics Incorporated(Gaithersburg, MD)により決定した。血清IGF−1(R&D Systems, Minneapolis, MN)および成長ホルモン(Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster, TX)の濃度を、ELISAにより、製造業者の指示に従って測定した。
代謝実験の少なくとも4日前に、マウスを麻酔し、留置カテーテルを右内頸静脈に前に記載のようにして(33)挿入した。全ての操作は、Yale University Animal Care and Use Committeeにより承認された。一晩の絶食後、2時間の高インスリン−正常血糖クランプを、覚醒したPar−1bヌルマウスおよび野生型同腹子で実施した。簡潔に述べると、インスリン(HumulinR insulin, Eli Lilly, Indianapolis, IN)をプライムし(150mU/体重1kg)、連続して15pmol/kg/分で注入し、次に20%ブドウ糖を異なる割合で、ブドウ糖を基底濃度に維持するように注入した。基底およびインスリン刺激性の全身の糖代謝回転(turnover)を、連続した(3−3H)グルコース(PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Ind.)の注入により、クランプの2時間前(0.05μCi/分)および、クランプ中(0.1μCi/分)においてそれぞれ推定した。個別組織におけるインスリン刺激性の糖取込みを推定するために、2−デオキシ−D−[1−14C]グルコース(2−[14C]DG)をボーラス(10μCi)で、クランプ開始の75分後に投与した。
雄のPar−1bヌルマウスと野生型同腹子(n=19〜22)をNIH-Yale Mouse Metabolic Phenotyping Centerにおいて試験し、in vivoでの組織特異的インスリン作用および糖代謝における変化を評価した。Yaleの施設における1ヶ月の環境順化(続いて高脂肪食検討のために8週間の高脂肪食投与)の後に、全体脂肪重量および除脂肪体重を覚醒マウスにおいて、前に記載のように1H−MRS(Bruker Mini-spec Analyzer, Echo Medical Systems, Houston, TX)を用いて測定した(33)。
活動性、食物および水消費量、およびエネルギー消費量を含む広範囲の代謝測定の検討のために、総合的動物代謝モニタリングシステム(CLAMS: Columbus instruments, Columbus, OH, USA)を用いた。データ解析に際し、エネルギー消費量、摂食および飲水は、体重に関して正規化する。エネルギー消費および呼吸商(RQ)は、前に収集したガス変換データから計算した:RQはVCO2のVO2に対する比率として、Heat=(3.815+1.232*RQ)*VO2。活動性は、xおよびz軸上で赤外線を用いて特定の測定期間中に赤外線が遮られた回数を計測して測定した。摂食は、1時点から次の時点までの、Center-Feederの秤量における差を記録して測定した。飲水は、飲水容量モニターを通して測定した。
細胞ベースの高スループットアッセイを、ホスホ−タウ、ホスホ−Dv1、ホスホ−Par−3、ホスホ−Cdc25C、ホスホ−MAP2またはホスホ−MAP4に対するリン酸化型特異的抗体を用いて、細胞株のスクリーニングにより、これらのタンパク質をPar−1bに対する基質として同定することに基づき実施した(Drewes et al., Cell. 1997 Apr 18;89(2):297-308; Ebneth et al., Cell Motil Cytoskeleton. 1999 Nov;44(3):209-24参照)。かかる抗体は、例えばUpstate Biotechnologyから市販されている。候補となる阻害化合物を、96または384ウェルプレート内の細胞(例えば、HEK293細胞、CHO細胞、NIH3T3線維芽細胞または3T3L1脂肪細胞など)に加え、次に処置した細胞を、リン酸化たんぱく質について免疫細胞化学法によりスクリーニングした。Par−1bキナーゼ活性を、直接的に、または経路の上流のタンパク質に影響を及ぼすことにより阻害する候補阻害化合物は、リン酸化タンパク質シグナルを減少させるものである。かかる化合物がPar−1bに直接結合してこれを阻害するかどうかを、例えば例3に記載のin vitroアッセイを用いて確認する。
さらに直接的なアッセイは、in vitroでPar−1b阻害剤を直接スクリーニングすることである。これは、キナーゼ活性を測定する生化学的アッセイである。Par−1bのキナーゼ活性を決定するための、種々の検出可能な分子が利用可能である。Elbert et al. Mol Biol Cell. 2006 Aug;17:3345-3355に記載されている、Par−1bによるDv1タンパク質のリン酸化をin vitroで測定するアッセイを用いることができる。
用いた用語および表現は、説明のための用語として用いたものであり、限定のためではなく、かかる用語および表現の使用において、ここに示され記載された特徴またはその一部の、任意の均等物を除外することは意図されず、本発明の範囲内で種々の修正が可能であることが認識される。
Claims (13)
- 糖尿病または肥満の処置のための薬剤として有用な化合物または組成物を同定するための方法であって、
Par−1bポリペプチドを候補薬剤と接触させること、および
接触したPar−1bポリペプチドのキナーゼ活性を決定することを含み、ここで候補薬剤と接触したPar−1bポリペプチドのキナーゼ活性の、Par−1bポリペプチドのキナーゼ活性の対照量と比較しての減少が、候補薬剤が糖尿病または肥満の処置において有用であることを示す、前記方法。 - 候補薬剤の不在下でのPar−1bポリペプチドのキナーゼ活性の第2の量を決定すること、および該Par−1bポリペプチドの活性の第2の量を、活性の対照量として用いることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- Par−1bポリペプチドのキナーゼ活性を、タウ、Dv1、Par−3、Cdc25C、MAP2もしくはMAP4タンパク質、またはタウ、Dv1、Par−3、Cdc25C、MAP2もしくはMAP4タンパク質のリン酸化部位を含むペプチドのリン酸化により測定する、請求項1または2に記載の方法。
- リン酸化を、リン特異的抗体またはその抗原結合断片により測定する、請求項3に記載の方法。
- Par−1bポリペプチドが細胞内に含まれており、該細胞を候補薬剤と接触させる、請求項1に記載の方法。
- インスリン反応性の低下または肥満を特徴とする疾患を有するか、有することが疑われる対象を処置する方法であって、
かかる処置を必要とする対象に、該疾患の処置として、該対象のPar−1bポリペプチドのキナーゼ活性を低下させる化合物または組成物の有効量を投与すること、
を含む、前記方法。 - インスリン反応性の低下を特徴とする疾患が、2型糖尿病である、請求項6に記載の方法。
- 化合物または組成物が、Par−1bポリペプチドの量を低下させる、請求項6に記載の方法。
- Par−1bポリペプチドの量を低下させる化合物または組成物が、siRNA/RNAi分子またはアンチセンス核酸分子である、請求項8に記載の方法。
- インスリン反応性の低下または肥満を特徴とする疾患の処置のための薬物を製造する方法であって、
Par−1bポリペプチドのキナーゼ活性を低下させる化合物または組成物を同定すること、および
該化合物または組成物を、かかる処置が必要な対象への投与のために製剤化すること、
を含む、前記方法。 - インスリン反応性の低下を特徴とする疾患が、2型糖尿病である、請求項11に記載の方法。
- Par−1bポリペプチドのキナーゼ活性を低下させる化合物または組成物が、請求項1〜5のいずれかに記載の方法により同定される、請求項11に記載の方法。
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Patent Citations (1)
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