JP2010518127A

JP2010518127A - スタキタルフェタ種（Ｓｔａｃｈｙｔａｒｐｈｅｔａｓｐ．）に基づく医薬組成物、その取得のための方法及び白斑症を処置するためのその使用

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Publication number: JP2010518127A
Application number: JP2009549340A
Authority: JP
Inventors: フェレイラ，エメルゾンケイロス
Original assignee: アシェラボラトリオスファルマセウチコスソシエダッドアノニマ
Priority date: 2007-02-15
Filing date: 2007-11-14
Publication date: 2010-05-27
Anticipated expiration: 2027-11-14
Also published as: AR065365A1; EP2117533A1; WO2008098325A1; BRPI0700767A; BRPI0700767B1; PT2117533E; US20180071356A1; US10813970B2; ES2531759T3; US20220000961A1; MX2009008799A; CL2008000484A1; CA2678407C; US20190134136A1; EP2117533B1; US10813971B2; UY30920A1; CA2678407A1; DK2117533T3; BRPI0700767B8

Abstract

本発明は、スタキタルフェタ（Stachytarpheta）属（クマツヅラファミリー）の植物の１又は複数の部分、並びに根、茎、皮及び葉から得られる化合物及び標準医薬品であって、抽出物又は濃縮画分、又は純粋単離化合物又は合成もしくは半合成から得られた化合物の状態であり、白斑症の処置のために、適切な経路（局所又は経口）で使用される医薬組成物、具体的には、錠剤、カプセル、色素、エマルション、Ｗ／Ｏ及びＯ／Ｗ（クリーム及びゲル）、リポソーム、微小カプセル、ナノ粒子、エアロゾル、軟膏等、並びに徐放性移植物用の製剤を組成するために、単独で又はその他の天然物もしくは合成物と異なる比率で混合して使用される、化合物及び標準医薬組成物の獲得について一般的に述べる。

Description

本発明は、スタキタルフェタ（Stachytarpheta）属（クマツヅラファミリー）の植物の根、茎、皮及び葉から得られる化合物及び標準医薬品であって、抽出物又は濃縮画分、又は純粋単離化合物又は合成もしくは半合成から得られた化合物の状態であり、白斑症及びその徴候（すなわち皮膚色素の消失）の処置のために、適切な経路（局所又は経口）で使用される医薬組成物、具体的には、錠剤、カプセル、色素、エマルション、Ｗ／Ｏ及びＯ／Ｗ（クリーム及びゲル）、リポソーム、微小カプセル、ナノ粒子、エアロゾル、軟膏等、並びに徐放性移植物用の製剤を組成するために、単独で（純粋抽出物）又はその他の天然物もしくは合成物と異なる比率で混合して使用される、化合物及び標準医薬組成物の獲得について一般的に述べる。

白斑症（vitiligo）の名は、ローマ人内科医のケルスス（Celsus (西暦50年)）により初めて使用された。白い斑点を意味するラテン語の"vitilus"に由来する。この疾患の記載は、Ebers Papyrus（紀元前1500年）及びいわゆるSchwetakusthaである、ヒンズー教の聖典Ａｎｔｈｅ（紀元前1400年）に記録された。

白斑症は、複数の身体部位に、主に腕、脚、口、及び目に出現する可能性のある皮膚斑点を特徴とする疾患である。全ての場合において、メラニンの消失が観察される。白斑症は、メラノサイトの破壊により発生するが、その原因は完全に明らかではない。白斑症の発症について提案された４つの理論、すなわち自己免疫、自己破壊、神経性及びその混合治療がある。

白斑症は、内因性、すなわち遺伝的及びメラノサイト的酸化に起因する、又は外因性、すなわち摩擦、皮膚病変（ケブネル現象）に起因する、特異的な免疫学的及び多因子性の疾患として表される、自己免疫性疾患と考えられる。

近年の研究では、白斑症患者の皮膚での、カタラーゼ活性の特定の生化学的不具合及び水素化過酸化物の集積の存在が実証されている。カタラーゼは白斑症におけるケラチノサイトが、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−チロシンにヒドロキシル化するためのアジュバント因子である、５,６,７,８−テトラヒドロビオプテリン（６−ＢＨ₄）を再利用できることを示している。これは、ケラチノサイトによりカテコールアミンを増加させ、メラニン産生のためのＬ−チロキシンの供給を断ち、メラノサイトを損傷する可能性のある毒性フリーラジカルの集積をもたらす。

変色領域の発生に関して、白斑症は形態学的に８つの形態で発生し得る。

利用可能な処置としては、以下のものがある。
心理的処置：単純に白斑症に直面する必要がある。心理的な疾患であるため、この処置は、患者が、彼／彼女が回復できると信じる前に考慮すべきでない。
メラゲニン（melagenine）の使用：患者の75％で斑点の減少に役立つ。
ディプロサリック（Diprosalic）の使用：メラゲニンより有効性の低いディプロサリック溶液を、斑点上に局所的に使用する。

保護因子の使用：全ての処置のバリエーションで使用される。日焼けは潜在的な光発ガンをもたらし、無色素領域を広げ得る（ケブネル現象）。
局所的な副腎皮質ステロイドの使用：数週間又は数ヶ月後に応答がある白斑症の小斑点に使用する。最も強力なものの一つには、ベタメタゾン及びプロピオン酸クロベタゾールがある。毎月又は隔月ベースでの追跡処置は、例えばクモ状静脈、アクネ及び皮膚萎縮等の副作用の制御を保証する。これらの副作用についてどんな兆候があっても、間欠的使用は避けるべきである。処置の結果は、これらが免疫抑制薬物であることを考慮すると、３ヶ月以内で観察されるはずである。

ＰＵＶＡ：最も一般的な白斑症の処置は、ソラレン（通常は８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ））及び315〜400 nm蛍光ランプへの約10分間の人工的暴露と組み合わせた光色彩治療（photochromotherapy）である。色素形成は、一般的に毛包周囲の様態で出現し、少ないケースではあるが、領域全体に作用する。３ヶ月以内に応答に達しない場合、処置は中止すべきである。再色素形成応答の場合は、これらの薬物は肝臓毒性、腎毒性と考えられるとともに胃障害及び眼障害を引き起こすため、常に約２ヶ月の休止間隔を空けて１年〜１年半投与できる。眼発ガンのリスク回避のため、当該処置は100〜150の説明を伴って投与されるべきである。ＰＵＶＡ治療を受けた患者のうち30％のみが良好な再色素形成に達したが、彼らのうちの約75％が２〜３年以内に再発した。

以上の点から、現存の処置は白斑症の発症に対抗するには不十分であることが示された。処置及び予防の両方のための有効且つ安全な薬物、特に天然薬物及び低毒性薬物の使用は重要である。これらの天然物は、適切な経路で使用される医薬製剤を含む必要がある。

従来技術であるが、文書ＰＩ 0406343-0は、白斑症の処置のために使用されるスタキタルフェタ・ポリウラ（Stachytarpheta polyura）種の葉及び／又は地上部分からの、水抽出物、含水アルコール抽出物、アルコール抽出物又は有機溶媒抽出物の使用に関する。このスタキタルフェタ・ポリウラ種は、天然ではめったに発見されず、且つサイズが小さいために工業スケールでの抽出物の生産は実現不能で、コストが高く且つ無益である。

本発明により、Ｓ．カエンセンシス（cayensensis）、Ｓ．ジャマイセンシス（jamaicensis）及びＳ．エリオチス（eliotis）種の一種類の植物又はその混合物の、１又は複数の部分からの、アルコール抽出物、含水アルコール抽出物及び水抽出物を用いて行われた、毒物学及び薬理学的評価に関する、インビトロ（in vitro）インビボ（in vivo）両方での実験室レベルの予備臨床試験と、その後の有意な患者数での臨床評価を通して、科学的に証明されたことには、本発明は、天然物であっても合成物であってもよく、単独であっても、異なる比率で互いに、もしくは他の物質と混合した状態であってもよい、強力な治療剤からなり、以下に記載のデータ及び結果により白斑症に対抗できる。

当初我々の研究は、白斑症に対抗する、再色素形成特性を示すことが経験的に知られているブラジルの一般医薬品で使用される植物の民族薬理学的評価から得られたデータを使用して実施していた。その後、スタキタルフェタ属の複数種を含む30以上の植物の地上部分からの、アルコール抽出物、含水アルコール抽出物及び水抽出物を用いて、植物化学、薬理学及び毒物学的研究を実施した。これらのスクリーニングを通じて、Ｓ.カエンセンシス、Ｓ.ジャマイセンシス及びＳ.エリオチスからの煎出物及び含水アルコール抽出物の両方に、瘢痕形成性及び抗炎症性の薬理学活性が残存することが明らかになった。これらのデータを、家庭医薬品のバーベナの使用で確認した。結果の分析から、上述の抽出物は、アルテミア・サリナ（Artemia salina）の微小幼虫で評価した場合に細胞毒性を示さず、ポエキリア・レチクラタ（Poecilia reticulata）の稚魚及びマウスで評価した場合にも関連毒性を示さないことが実証された。異なる濃度で実施した微生物学的、抗細菌的及び抗真菌的なインビトロの評価からは、低度の抗微生物活性が観察される。

新たに開発された物質は、合成しても、半合成しても、又は以下の（Ｓ.カエンセンシス、Ｓ.ジャマイセンシス及びＳ.エリオチス）一種の植物又は混合物の、１又は複数の部分からの、アルコール抽出物、水抽出物又は含水アルコール抽出物から得てもよい。

本発明で使用される種は、従来技術として述べたスタキタルフェタ・ポリウラよりも天然で容易に、大量に、及び大きなサイズで発見され、工業スケールでの生産の実現可能性を向上させる。当該種は、他の一般名の中でも、ゲルヴァオ（gervao）、ゲルバオ（gerbao）、オベルハオ（overjao）、チャ−ド−ブラジル（cha-do-Brasil）（"verbena/vervain"）として一般に知られ、瘢痕形成薬、胃障害の処置及び解熱剤として伝統的医薬で使用される。

新規な医薬の発明は、単独であっても、又は互いに混合した状態であっても、又はさらに抽出物、固定油、精油、香料、粉末もしくは他の天然又は合成原料由来の賦形剤との組み合わせでもよい、純粋抽出物、合成もしくは半合成化合物又は植物の抽出物からの単離物を使用する。

予備臨床及び臨床試験から、同定された化合物が、白斑症の処置のために、医薬製剤の一部として、錠剤又はカプセル中で使用される場合は経口で、及び色素、クリーム、ゲル、エアロゾル又はその他を補助剤として用いて、局所経路で使用されることが証明された。本発明は、上述の抽出物に加えて、白斑症の処置又は予防に適用される医薬品の製剤化のために使用される、これらの抽出物の画分又は成分（天然物又は合成物）を含有する医薬組成物にも及ぶ。

第一の態様によれば、本発明は、白斑症を処置するための医薬として使用される、クマツヅラファミリーの、スタキタルフェタ属、Ｓ. カエンセンシス、Ｓ.ジャマイセンシス及びＳ.エリオチス種の植物からの、標準化抽出物、画分又は単離分子から得られる医薬物質の製造のための方法に関する。本発明による製造方法は、以下の段階、
（ａ）生又は乾燥状態の、スタキタルフェタ属の植物、根、茎、皮及び葉の１又は複数の部分を形成するバイオマスを、微粉砕（pulverize）、又は粉砕（grind）、又は切断（chop）、又は粉化（crumb）すること、ここで原材料は、限定するものではないがＳ.カエンセンシス、Ｓ.ジャマイセンシス又はＳ.エリオチス種又はその混合を含んでなるものでもよく；
（ｂ）段階（ａ）から得られたバイオマスを、浸透、又は浸漬、又はソックスレー（soxlhet）により、又は超臨界状態でのガス使用により抽出し、又は塩基もしくは酸の媒体又は有機溶媒を用いて抽出し、又は蒸気蒸留により抽出すること；ここで有機溶媒としては、例えばハロゲン化化合物、アルコール、アルデヒド、ケトン、シクロアルカン又はアルカン、フェノール化合物、ベンゼン及び誘導体、この他、単独又はその混合物があり；酸／塩基抽出の場合、抽出は、希釈又は濃縮された、単独又は混合状態の、強酸又は弱酸、例えば酢酸、塩酸、ギ酸で行い；抽出で使用される塩基は、単独又は混合状態の、濃縮又は希釈した塩基、例えば水酸化アンモニウム（ＮＨ₄ＯＨ）及び炭酸ナトリウム（Ｎａ₂ＣＯ₃）により形成され；
（ｃ）得られた抽出物を、吸気温度が約150〜190℃、及び排気温度が約60〜90℃で噴霧乾燥機を用いるか；又は25℃〜75℃の温度範囲の減圧下で、；又は室温で、乾燥させてもよい。

本発明による方法により、処理時間が低減され、適切な収率が示され、その結果として医薬物質がもたらされるために、工業スケールでの製造が可能となった。本発明による医薬は、化学構造式（I）、（II）、（III）、（IV）、（V）、（VI）、及び（VII）の、少なくとも１つの化合物又は混合物を、遊離形態又は塩の状態（例えば、塩素酸炎、硫酸塩又はホウ酸塩）で、約0.001〜99％含有する。

（式中、Ｒは、同一であるか又は異なっており、及び各々はＨ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＯＣＨ₃、アルカリ金属、ハロゲン、単糖、二糖又は多糖、ＣＯ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃、（ＣＨ₂）_nＣＨ₃からなる群から独立に選択され、ここでｎは２〜16である。）

本発明により得られた医薬抽出物は、患者への直接投与及び医薬組成物の調製での使用の両方において有用であり、医薬組成物においては、含量が、１日に１回又は複数回に分けられ、約0.001〜約5000 mg/kg/日、特に約200〜400 mg/kg/日の範囲である。

別の態様では、本発明は、約0.001〜約5000 mgの抽出物、及び医薬的に許容可能な賦形剤を含有する医薬組成物に関する。医薬化合物は、薬物、ビタミン、塩及び糖と組み合わせた状態で使用してもよい。

本発明に適した医薬的に許容可能な賦形剤としては、限定するものではないが、例えば以下の研究、北アメリカ出版社Mack Publishingにより出版されたRemington's Pharmaceutical Sciences、並びに欧州薬局方、ブラジル薬局方に記載のもの、並びに開発され得る新規賦形剤がある。

本発明による医薬物質及び医薬組成物は、好ましくは白斑症の処置のために有効であると考えられる。

３種のクマツヅラの地上部分の、アルコール抽出物、含水アルコール抽出物及び水抽出物についての予備臨床及び臨床試験を展開するため、当該抽出物を以下に記載の通りに得た。

アルコール抽出物、含水アルコール抽出物、水抽出物、又は有機抽出物を得るために使用される、以下の種、Ｓ.カエンセンシス、Ｓ.ジャマイセンシス及びＳ.エリオチスを、ブラジル連邦共和国のパライバ、ペルナンブコ及びバイア州で、1995年〜2002年まで採取した。foliorum exsiccataのサンプルを、Herbario Lauro Pires Xavier Universidade Federal da Paraxba （ジョアン・ペリア市、ブラジル）のファイルに個別に貯蔵した。

植物の葉及び地上部分のアルコール抽出物は、溶媒としてエタノールを使用し、連続して72〜144時間、浸出（percolation）により個別に抽出した。ロータリーエバポレーターでの抽出及び濃縮後、乾燥抽出物の質量を決定し、植物質の生質量と比較した各々の収率を求めた。

種当たりの、葉及び地上部分のエタノール抽出の収率は以下の通りである。

植物の葉及び地上部分の水抽出物は、溶媒として水を使用し、連続して72〜144時間、煎出（decoction）により個別に抽出した。ロータリーエバポレーターでの抽出及び濃縮後、乾燥抽出物の質量を決定し、植物質の生質量と比較した各々の収率を求めた。検討した種の３つの抽出物の平均収率は（個別に）以下の収率を示した。Ｓ.カエンセンシス：12％（葉）及び11％（地上部分）；Ｓ.ジャマイセンシス：14％（葉）及び12％（地上部分）；Ｓ.エリオチス：11％（葉）及び9％（地上部分）。これらの抽出物の分配（液−液）を、ヘキサン、クロロホルム、ブタノール及び水で極性の順序を上げながら、溶媒を用いて実施し、減圧下ロータリーエバポレーターで蒸発させた。

植物の葉及び地上部分の水抽出物の精製は、ＭｅＯＨ及び0.05％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有のＨ₂Ｏの混合溶出系において、グラジエントモード（３日間で５％〜100％）で、ＣＭＰによる10 gの水抽出物と共に使用することにより実施した。産物を254 nmのＵＶで検出した。40フラクションがこの第一の精製段階から得られた。このフラクション番号12（400 mg）を、Symmetry（登録商標）カラム（7 μm、19×150 mm、Waters、ＭｅＯＨ／Ｈ₂Ｏ 3：97 ／ＴＦＡ 0.05％、流速10 ml/分、ＵＶ254 nm）を用いてＨＰＬＣ調製スケールで精製し、化合物Ｉを単離させた（300 mg、Ｒｔ＝12分）。フラクション番号15から化合物IIを単離させる（145 mg）。フラクション番号18から化合物IIIを単離させる（80 mg）。化合物IVはフラクション番号19から直接単離した。化合物V（40 mg）、VI（35 mg）及びVII（5 mg）を、フラクション番号21から単離した。

単離化合物の化学構造を、紫外線（ＵＶ）、核磁気共鳴（１Ｄ及び２ＤＮＭＲ）、低分解能及び高分解能質量分析（ＭＳ及びＨＲＭＳ）を含む分光学的方法により、並びに化学的及び酵素的反応により解明した。化合物Ｉ及びIIは、イリドイドとして同定され、ここでＲ基は、Ｈ、ＣＨ₃、ＣＯＣＨ₃、ＣＯ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃（ここでｎは２〜16である）、ハロゲン、単糖、二糖又は多糖からなる群から選択でき、同一であっても異なっていてもよい。化合物IIIは、フラボノイドとして同定され、ここでＲ基は、Ｈ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＯＣＨ₃、ＣＯ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃（ここでｎは２〜16である）、ハロゲン、単糖、二糖又は多糖からなる群から選択できる。化合物IV、V、VI及びVIIはエチルフェニルプロパングリコシレート誘導体として同定され、ここでＲ基は、Ｈ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＯＣＨ₃、ＣＯ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃（ここでｎは２〜16である）、ハロゲン、単糖、二糖又は多糖からなる群から選択できる。

２植物種各々の葉は、以下の、小（幼葉）及び大（成葉）の分析のために選択された。この材料を用いて、葉湿潤度を、約120℃の温度で事前に処理及び加熱した、150 mlの乾燥トルエンを含有する丸底フラスコ中で、系が沸騰するまで維持し、その後蒸気蒸留の水の体積を記録した。各検討種類の３回の葉湿潤度分析の平均から、以下の収率を得た：スタキタルフェタ・カエンセンシスは69％（幼葉）及び67％（成葉）；スタキタルフェタ・ジャマイセンシスは68％（幼葉）及び64％（成葉）；及びスタキタルフェタ・エリオチスが66％（幼葉）及び64％（成葉）。

各種の葉ワックス割合の分析は、採取及び同定された植物質で個別に実施した。各分析では、1000 mlビーカーを使用し、そこに150 gの植物を添加し、その後500 mlのクロロホルムＰ.Ａ.を添加した。抽出の５分後、これを定性的濾紙（qualitative filter paper）で濾過し、クロロホルム抽出物を得て、これを減圧ロータリーエバポレーターで濃縮した。葉ワックス割合の決定は、真空乾燥機中で乾燥後に行われ、一定質量になるまで秤量された。この定量分析を同じ方法の後に３回繰り返し、検討した種の地上部分は以下の葉ワックス収率であることが明らかになった：スタキタルフェタ・カエンセンシスは0.21％；スタキタルフェタ・ジャマイセンシスは0.22％；及びスタキタルフェタ・エリオチスは0.19％。

ジアゾメタンとのエーテル化処理後の、上記方法により得られたワックスの抽出物（0.1 g）を用いて、３種の葉ワックスの定性分析を実施した。組成物を、データベースと接続し、質量分析と連結されたガスクロマトグラフィで評価した。分析を実施するため、各メチル化物質を5 mlのｎ−ヘキサン（クロマトグラフ用）に溶解させ、この溶液から5 μlを、100％のジメチルポリシロキサン充填の30 ｍＤＢＩカラムを装備するＧＣ／ＭＳシステムモデルHP-5890-シリーズ２に注入した。使用したキャリアガスはヘリウムで、初期温度が60℃、10℃／分グラジエントで、240℃に達するまでの条件で行い、この装置はデータベースと接続した質量分析と連結している。

葉ワックスの化学成分の同定を、システム中で利用できる135,000の有機化合物に対するデータベースの同時比較を行うことにより、質量分析のフラグメンテーションの及びその分子量の記録をもとに行った。３種の葉ワックスには、以下の炭化水素成分、ドデカン、トリコサン並びにヘキサデカン酸、ドデカン酸、トリコサン酸及びエイコサン酸が存在する。

Ｓ.カエンセンシス、Ｓ.ジャマイセンシス及びＳ.エリオチスの地上部分からのアルコール抽出物及び液−液分配物（ヘキサン、クロロホルム及び水）、及び化学成分の単離物から得られた全ての生物学的活性の評価を、フリーラジカル捕捉（captation）活性（ＡＢＴＳラジカル）、ＳＯＤ擬態性、一酸化炭素合成及びキサンチンオキシダーゼの阻害について、実験室レベルの試験をインビトロで行った。

Ｓ.カエンセンシス、Ｓ.ジャマイセンシス及びＳ.エリオチスの抽出物は、ヒポキサンチン／キサンチン系で、強力なＯ₂捕捉活性を示した。約40 μg/mlの濃度で、抽出物は、マクロファージでのキサンチンオキシダーゼ活性の阻害及び一酸化窒素の生成を示した。単離化合物の中では、化合物II、III及びIVが、10μMの濃度で抗酸化活性に影響を与えた。一方でIV化合物は、10μMの濃度で一酸化窒素でのアッセイにおいて重要な活性を示した。

Ｓ.カエンセンシス、Ｓ.ジャマイセンシス及びＳ.エリオチスの地上部分からのアルコール抽出物及び液−液分配物（ヘキサン、クロロホルム及び水）、及び化学成分の単離物から得られた全ての生物学的活性の評価を、以下の通りにインビボ試験で実施した。細胞毒性試験は、ポエキリア・レチクラタの稚魚を用いて実施した。毒性試験はアルテミア・サリナの幼虫を使用し、微生物学的試験は、７つの真菌、５つの酵母様真菌及び６つの線維状真菌を使用した。

魚毒性又は殺魚性の特徴を評価するためのアッセイは、Joao Pessoa市−ＰＢ（パライバ州）のジャグアリベ川（River Jaguaribe）から採取したポエキリア・レチクラタの稚魚に、魚餌を与えて48時間実験室で環境馴化させ、アッセイを実施した。生物学的アッセイで使用された稚魚は、平均体長が17.1 mmであった。アルコール抽出物、含水アルコール抽出物及び水（煎出）抽出物を、水で希釈し、１、10及び100μg/mLの濃度にした。

３つの濃度の物質溶液は、各物質400 mLの溶液を含有させたチュールネットで覆った1000 mLビーカー中で、生物学的評価の試験に使用した。アッセイを、10匹の稚魚群それぞれ24時間晒して行った。この期間中、前述の溶液に、室温条件下で、適切な装置を用いて空気を送った。各生物学的アッセイについて、蒸留し空気を送った水中でのコントロール試験を、同様に採取し処理した10匹の稚魚について実施した。

稚魚についてこれらの物質の活性の総合評価を、生理学的及び行動的変化により、例えば機能亢進、痙攣運動、平衡感覚障害、ボウルから逃れる試み及び死亡等で評価した。

アルコール及び含水アルコールの抽出物及び煎出物についての細胞毒活性を、１、10及び100μg/mLの濃度で、直近に孵化したアルテミア・サリナ・リーチの幼虫を入れた塩性培地で評価した。バイオアッセイを実施するため、Fontenele等の方法に適合する方法を使用した。各溶液を、10匹のアルテミア・サリナを用いて、３重の毒性試験で評価した。この実験を室温（26〜28℃）で、人工照明の下、連続的に24時間継続した。コントロール試験を、前述の試験と同じ実験条件で、10匹のＡ.サリナの幼虫を用いて5 mLの生理食塩水を使用して用意した。これらのバイオアッセイの結果から、抽出物はいずれも100μg/mLまでの濃度で毒性がないことが明らかになった。

微生物試験をアルコール及び含水アルコール抽出物、並びに３種（Ｓ.カエンセンシス、Ｓ.ジャマイセンシス及びＳ.エリオチス）の地上部分から個別に得られた煎出物について、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、2500、1250、625、313及び156 mg/mLの濃度で行った。

上記の抽出物について、比率２での段階希釈法を用いる固体培地中、Sabouraud Dextrose Agar (DIFCO）及びNutrient Agar (Merck)中で、生物学的アッセイを実施した。12×120 mmの試験管中、3 mLの培地を第一の管に、その他の管には1.5 mLを添加した。15 mgの抽出物を第一の管に添加し、他の希釈を作製した。その後10μLの標準化微生物懸濁物を、0.5 McFarland濁度により10⁶ CFUになるよう添加し、90％Ｔ（530 nm）に調節した。抽出物を、Vicent & Vicent及びAllegrini法によっても試験した。微生物懸濁物と共に添加した培養培地を、各抽出物0.02 mLで浸透させた濾紙ディスク（CECO/SP）にも添加した。各微生物について、標準的抗菌（クロラムフェニコール30μg/mL、テトラサイクリン30μg/mL及びケトコナゾール1000μg/mL）でコントロールを作製した。アッセイを37℃で24〜48時間（細菌及び酵母）及び室温で10〜14日間（線維状真菌）インキュベートした。上記産物の微生物学的アッセイをグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対して実施した。酵母様真菌及び線維状真菌アッセイを、以下の微生物に対して実施した。細菌：バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）；酵母様真菌：カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・トロピカリ（Candida tropicali）及びクリプトコッカス・ネオフォルマン（Cryptococcus neoforman）；線維状真菌：アスペルギルス・パラシチクス（Aspergillus parasiticus）、ペニシリウム（Penicilium）種及びトリコフィロン・ラブラム（Trichophyton rubrum）。上記物質の微生物アッセイでは、試験された微生物のいずれに対しても抗菌活性を示さなかった。

Ｓ.カエンセンシス、Ｓ.ジャマイセンシス及びＳ.エリオチスの地上部分の、アルコール抽出物及び水抽出物（煎出物）についての薬理学的、予備臨床的及び臨床的評価は、それぞれ、以下に記載の活性についてインビトロ及びインビボの両方で評価を行った。

評価は、各抽出物を経口で、0.5及び1.0 mg/Kgの用量で投与されたSwiss-Websterマウス（10／群）で実施した。コントロール群の動物は、生理食塩水0.9％（10 mL/Kg、経口）のみを投与された。この結果、３つの植物種の、アルコール抽出物、含水アルコール抽出物及び水（煎出）抽出物で処理した群においていずれも死亡は発生しなかった。Ｓ.エリオチスの抽出物で処理した１群のみ、死亡率10％であった。長期処理群及びコントロールにおいては、重量変化、器官重量（心臓、脾臓、肝臓、胃、腎臓、肺、精巣、卵巣及び子宮）、血液学的及び生化学的パラメータについての顕著な変化についての毒性の証拠は観察されなかった。マウスにおける急性毒性評価試験の結果は、スタキタルフェタ・カエンセンシス、Ｓ.ジャマイセンシス及びＳ.エリオチスの地上部分の、アルコール抽出物、含水アルコール抽出物及び水（煎出）抽出物を異なる濃度で評価した場合、それぞれは経口で1.0 g/Kgまでの用量で毒性影響がないことが実証された。

各植物の地上部分の濃縮水抽出物（煎出物）から、植物性治療医薬を開発した。植物当たりの植物性治療医薬濃度は、カプセル当たり乾燥抽出物粉末が60及び120 mgであった。Lanetteベースを伴う局所使用のためのクリームも、防腐剤としてのパラベン及び各植物の水抽出物の３％を使用して開発した。推奨される薬量学は、１日に１カプセル３回、クリームについては１日に２回の塗布であった。

植物性治療医薬の各280 mgカプセルは、以下を含有する。

植物性治療医薬の各1 mLは、以下を含有する。

３つの植物性治療医薬について、22人の女性と14人の男性の、36人の成人ボランティア（年齢は22〜53歳）であって、段階及び範囲が異なる白斑症に罹患し、そのほとんどが、対称的無色素を示しており且つ臨床的分析に基づいて診断されている人で、臨床的評価を実施した。患者は無制御な方法で12人ずつ３つの群に分けられた。患者は最初に研究について知らされ、その時点で各患者に分析のための尿と血液サンプルを依頼した。処置の開始時に、全ての患者は、斑点を撮影され、無色素領域を記録するため透明紙にマップ化され、処置工程の追跡を改善した。

推奨される薬量学は、活性成分（乾燥抽出物）１〜60 mgのカプセルを１日３回、及び臨床的評価を月に１回であった。臨床処置は14〜18ヶ月の範囲にし、全ての事例で、朝の７時〜９時の間に30〜45分間の日光浴を推奨した。この研究はプラセボを使用せず、投薬中止は発生しなかった。

全ての患者は、白斑症に対して少なくとも１回の処置を既に受け、60％以上が既に２回以上の処置を受けたことが記録された。最も使用された医薬をビトクロミン（Viticromim）と呼んだ。結果の分析から、50％以上の患者が18ヶ月間連続的なカプセル使用の後に、斑点の再色素形成がもたらされたことが報告され、３つの植物性治療医薬が肯定的な結果に達したことが判明した。スタキタルフェタ・エリオチスのカプセルで処置した群１は、他の群の結果と比較して、最も相対的な結果に達した。Ｓ.ジャマイセンシスのカプセルで処置した群２は、Ｓ.カエンセンシスのカプセルで処置した群３と同等の結果であった。これらの結果は、以下のように区分された。再色素形成された斑点を有する21人の患者のうち、9人が群１、3人が群２及びその他が群３であった。これに関連して、群１の6人の患者（群の50％）では、写真記録を通じて観察できる再色素形成の結果及びその領域は、この物質を使用して４月及び５月後すぐに観察された。他の群においては、再色素形成の結果は、植物性治療を使用して６及び８月後にしか報告されなかった。

植物性治療物質の使用の継続の間、倦怠感、めまい、頭痛又は嘔吐の病訴は報告されなかった。再色素形成の結果は、10人の患者（27.8％）においては部分的であり、彼等は結果に満足したが、5人だけはこの結果を不満足と考えた。斑点の再色素形成が完結した患者は、大変喜んだ。

以下の記載は、限定するものではないが、スタキタルフェ・カエンセンシス、Ｓ.ジャマイセンシス及びＳ.エリオチスの葉又は地上部分の、アルコール抽出物、含水アルコール抽出物及び水抽出物から得られる、画分、純粋化合物の、取得及び調製に関する方法及び技術の数例であり、ここで示した本発明による使用に適合している。

アルコール抽出物取得のために使用される方法
機械的攪拌を装備する抽出装置のボウル中、60℃制御温度のオーブン中で乾燥させ、電気ミルで粉砕した、100 kgの（上記３種のうちの１種）の植物の葉又は地上部分を添加する。その後、280リットルの96度ＧＬエタノール添加し、72〜144時間（２〜４日間）頻繁に攪拌する。この処理の後、抽出物を100 μmフィルターを通して真空下で濾過する。この方法を用いることで、約240リットルの抽出溶液収量を得る。減圧下での回転式エバポレーターで溶媒を蒸発させた後、濃縮したアルコール抽出物を獲得し、植物当たり平均して以下の結果となる。スタキタルフェタ・カエンセンシスが18％、スタキタルフェタ・ジャマイセンシスが16.5％及びスタキタルフェタ・エリオチスが19.7％である。

含水アルコール抽出物取得のために使用される方法
ステンレス鋼のパーコレーターに、ステンレス鋼ネットで覆った影の下で24時間脱水させた、50 kgの（上記３種のうちの１種の）植物の葉又は地上部分を添加する。その後、80 リットルの含水アルコール溶液（エタノール：水１：１）を添加し、毎日及び時折攪拌しながら、８日間浸透させる。当該期間の終わりまでに、100μmフィルターで抽出物を濾過し、減圧下での回転式エバポレーターでそれを濃縮する。この方法により、植物当たり濃縮した含水アルコール抽出物の収率は、以下の通りに得られる：スタキタルフェタ・カエンセンシスが15〜21％、スタキタルフェタ・ジャマイセンシスが17〜20％及びスタキタルフェタ・エリオチスが15〜22％である。

水抽出物取得のために使用される方法
３種のスタキタルフェタの１種の水抽出物取得のために、温度制御した浸出ボウルに、事前に選択した地上部分で、強制通気状態のオーブン中65℃で乾燥させた、50 kgの葉を添加し、その後、電気ミルで粉砕した。その後100リットルの蒸留水をボウルに添加し、90℃で４時間連続的に加熱する。その間に、時折それを攪拌した。その後100μmフィルターを用いて濾過し、最後に減圧下での回転式エバポレーターで抽出物（濾液）を濃縮する。この抽出工程により、以下の収率が得られた。抽出工程で使用された植物質の質量に対して、スタキタルフェタ・カエンセンシスは7.4〜11.2％、スタキタルフェタ・ジャマイセンシスは6.5〜8.9％、及びスタキタルフェタ・エリオチスは7.2〜11.5％である。

Claims

イリドイド、フラボノイド及びエチルフェニルプロパングリコシレート誘導体からなる群から選択される１又は複数の化合物を有する医薬組成物であって、遊離形態又は医薬的に許容可能な塩の状態で、前記化合物が合成により、半合成により、又はスタキタルフェタ（Stachytarpheta）種の１又は複数からの、アルコール抽出物、含水アルコール抽出物、水抽出物もしくは有機抽出物からの単離により得られる、医薬組成物。
前記化合物が、イリドイド基の化学構造式I及びII

（式中、Ｒは、同一であるか又は異なっており、且つ各々は、Ｈ、ＣＨ₃、ＣＯＣＨ₃、アルカリ金属、ハロゲン、単糖、二糖又は多糖、ＣＯ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃、（ＣＨ₂）_nＣＨ₃からなる群から独立に選択され、ここでｎは２〜16である）
の両方を有することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
前記化合物が、フラボノイド基の化学構造式III

（式中、Ｒは、同一であるか又は異なっており、且つ各々はＨ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＯＣＨ₃、アルカリ金属、ハロゲン、単糖、二糖又は多糖、ＣＯ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃、（ＣＨ₂）_nＣＨ₃からなる群から独立に選択され、ここでｎは２〜16である）
を有することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
前記化合物が、エチルフェニルプロパングリコシレート誘導体基の化学構造式IV、V、VI及びVII

（式中、Ｒは、同一であるか又は異なっており、且つ各々はＨ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＯＣＨ₃、アルカリ金属、ハロゲン、単糖、二糖又は多糖、ＣＯ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃、（ＣＨ₂）_nＣＨ₃からなる群から独立に選択され、ここでｎは２〜16である）
を有することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
前記抽出物が、スタキタルフェタ・カエンセンシス（Stachytarpheta cayensensis）、スタキタルフェタ・ジャマイセンシス（Stachytarpheta jamaicensis）及びスタキタルフェタ・エリオチス（Stachytarpheta eliotis）種から、単独で又は混合物として得られることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
前記スタキタルフェタ属の植物の部分が、茎、根、皮及び葉であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
化学構造式（I）、（II）、（III）、（IV）、（V）、（VI）、及び（VII）である１又は複数の化合物を、遊離形態又は医薬的に許容可能な塩の状態で、0.001〜90％有することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
前記化合物が、医薬的に許容可能な塩の状態、例えば塩素酸塩、硫酸塩又はホウ酸塩であることを特徴とする、請求項１及び７に記載の医薬組成物。
成分の総質量中、抽出物を0.001〜99質量％含有することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
投与が、１日に１回又は複数回に分けられた、0.001〜約5000 mg/kg/日の範囲であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
投与含量が、１日に１回又は複数回に分けられた、好ましくは約200〜約400 mg/kg/日の範囲であることを特徴とする、請求項１０に記載の医薬組成物。
１又は複数の化合物を含有する、約0.001 mg〜5000 mgの抽出物を含有することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
前記化合物が、単独で、又は互いに混合して、又は抽出物、固定油、精油、香料、粉末又は他の天然もしくは合成原料由来の賦形剤と組み合わせて使用され、又は経口、局所、注入可能もしくは吸入可能適用に適した、（１又は複数の）薬物、（１又は複数の）ビタミン、（１又は複数の）塩、単糖、二糖もしくは多糖、又は他の医薬的に許容可能な賦形剤と組み合わせて使用される、請求項１に記載の医薬組成物。
１又は複数の化合物を0.001％〜99％含有することを特徴とする、請求項１３に記載の医薬組成物。
硬ゼラチンカプセル又は軟ゼラチンカプセルに封入されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬的組成物。
純粋な抽出物、又は錠剤、カプセル、色素、シロップ及び他の類似物として組み合わされた抽出物の状態か、又はアジュバント及びその他の合成又は天然の医薬的に許容可能な媒体として使用されるｗ／ｏ及びｏ／ｗエマルション（クリーム及びゲル）、リポソーム、微小カプセル、ナノ粒子、エアロゾル、スプレー、軟膏等、注入可能液体、粉末、凍結乾燥物、パッチ、及び徐放性移植物又は他の類似物のための製剤の状態で提示されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
植物性薬物（phytodrug）、植物性治療（phytotherapic）医薬品又は合成薬物であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物を含有する医薬物質。
植物性治療医薬化合物を得るための方法であって、以下の段階、
（ａ）生又は乾燥状態の、スタキタルフェタ属の植物の１又は複数の部分、及びその根、茎、皮及び葉、又はその混合物を、微粉砕（pulverize）、又は粉砕（grind）、又は切断（chop）、又は粉化（crumb）すること、
（ｂ）浸透、又は浸漬、又はソックスレー（soxlhet）、又は超臨界状態でのガス使用により抽出すること、又は塩基もしくは酸の媒体又は有機溶媒を用いて抽出すること、又は蒸気蒸留により抽出すること、
（ｃ）減圧下、又は噴霧乾燥機、又は室温の系を用いることにより、有機溶液を乾燥させること、
（ｄ）分離及び精製すること、
を含んでなることを特徴とする方法。
前記濃縮方法における段階（ｃ）の噴霧乾燥機の吸気温度及び排気温度が、それぞれ150〜190℃及び80〜90℃の範囲であることを特徴とする、請求項１８に記載の医薬化合物を得るための方法。
前記段階（ｃ）の減圧下の系の温度が、25〜100℃の範囲であることを特徴とする、請求項１８に記載の医薬化合物を得るための方法。
前記項目（ｂ）の抽出が、水媒体中で、又は酸性化もしくは塩基性化して、又は有機溶媒を使用して、又はその混合形態で実施されることを特徴とする、請求項１８に記載の医薬化合物を得るための方法。
前記酸／塩基の抽出が、希釈又は濃縮した、単独又は混合状態の、強酸又は弱酸、例えば酢酸、塩酸、ギ酸を用いて行われ；及び抽出方法において使用される塩基が、単独又は混合状態の、濃縮又は希釈した塩基、例えば水酸化アンモニウム（ＮＨ₄ＯＨ）及び炭酸ナトリウム（Ｎａ₂ＣＯ₃）により形成されることを特徴とする、請求項２１に記載の医薬化合物を得るための方法。
前記段階（ｂ）で使用される有機溶液が、ハロゲン化化合物、アルコール、エーテル、エステル、アルデヒド、ケトン、アルカン、シクロアルカン、フェノール化合物、ベンゼン及び誘導体を、単独又はその混合物の状態で含んでなることを特徴とする、請求項２１に記載の医薬化合物を得るための方法。
前記項目（ｄ）の化合物の分離及び精製を、圧力の存在下又は不存在下のクロマトグラフィ法、例えば大気圧でのクロマトグラフィ、低圧、中圧もしくは高圧でのクロマトグラフィを使用して、通常のシリカゲルでの固定相又はＣ−８もしくはＣ−18での逆相を使用して、又は流れに逆らうクロマトグラフィでの液／液分離、又は遠心分離、又はイオン交換樹脂もしくは濾過膜を使用して実施することを特徴とする、請求項１８に記載の医薬化合物を得るための方法。
前記化合物が、化学構造式（I）、（II）、（III)、（IV)、（V)、（VI)及び（VII)の、式中Ｒが、同一であるか又は異なっており、且つ各々はＨ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＯＣＨ₃、アルカリ金属、ハロゲン、単糖、二糖又は多糖、ＣＯ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃、（ＣＨ₂）_nＣＨ₃（ここでｎは２〜16である）からなる群から独立に選択される、遊離形態又は塩の状態である化合物であり、少なくとも１のその化合物又はその混合物を得ることを特徴とする、請求項２４に記載の医薬化合物を得るための方法。
白斑症の処置又は予防のために使用されることを特徴とする医薬組成物であって、請求項１８の方法から得られた１又は複数の化合物を、遊離形態又は医薬的に許容可能な塩の状態で含んでなる医薬組成物。
医薬化合物の使用であって、前記化合物が、白斑症の処置又は予防のため、錠剤、カプセル、色素、シロップ、及び類似物の状態、又はエマルションｗ／ｏ及びｏ／ｗ（クリーム及びゲル）、リポソーム、微小カプセル、ナノ粒子、エアロゾル、スプレー、軟膏等、並びに徐放性移植物のための製剤の状態で、経口、局所、注入可能又は吸入可能な経路で使用される医薬の医薬組成物において使用されるよう、単独で又は互いに異なる比率で混合されて使用されることを特徴とする医薬化合物の使用。