BR122020000045B1 - Processo para obtenção de compostos farmacêuticos fitoterápicos a partir uma ou mais partes de plantas do gênero stachytarpheta - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se, de forma geral, a um processo para obtenção de um composto e um produto farmacêutico padronizado a partir uma ou mais partes de plantas do gênero stachytarpheta (família verbenaceae), assim como raízes, caules, cascas ou folhas das plantas em forma de extratos ou frações enriquecidas ou compostos puros isolados ou obtidos por síntese, usados isoladamente ou em mistura com outros produtos naturais ou sintéticos, em diferentes proporções, para integrar composições farmacêuticas a serem utilizadas por vias adequadas (tópica ou oral) em particular nas apresentações em forma de comprimidos, cápsulas, tinturas, emulsões, a/o e o/a (cremes e géis), lipossomas, microcápsulas, nanopartícuias, aerossóis, pastas e similares, assim como formulações para implantes de liberação lenta, utilizadas para o tratamento do vitiligo.

Description

[001] Dividido do PI0700767-1, depositado em 15/02/2007.

[002] A presente invenção refere-se, de forma geral, a obtenção de um composto e um produto farmacêutico padronizado a partir das raízes, caules, cascas, e folhas das plantas do gênero Stachytarpheta (Família Verbenaceae), em forma de extratos ou frações enriquecidas, ou compostos puros isolados ou obtidos por síntese ou semissíntese, usados isoladamente (extrato puro) ou em mistura com outros produtos naturais ou sintéticos, em diferentes proporções, para integrar composições farmacêuticas a serem utilizadas por vias adequadas (tópica ou oral) em particular nas apresentações em forma de comprimidos, cápsulas, tinturas, emulsões, A/O e O/A (cremes e géis), lipossomas, microcápsulas, nanopartículas, aerossóis, pastas e similares, assim como formulações para implantes de liberação lenta, utilizadas para o tratamento do vitiligo e suas manifestações - despigmentação da pele.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] O nome vitiligo foi utilizado pela primeira vez pelo médico romano Celsus (50 d.C.), originado do latim vitilus, que significa placa branca. As descrições dessa enfermidade foram registradas no papiro de Erbs (1500 a.C.), e no livro sagrado Hindu Anthe (1400 a.C.), recebendo a nomeação de Schwetakustha.

[004] O vitiligo é uma doença caracterizada por manchas na pele que podem ocorrer em diversas regiões do corpo, principalmente nos braços, pernas, boca e na região dos olhos. Em todos os casos, se observa o desaparecimento da melanina. O vitiligo ocorre com destruição de melanócitos, entretanto a causa não é totalmente esclarecida. Quatro teorias são propostas para o desencadeamento do vitiligo: autoimune/ auto destrutiva, neurogênica e compostas.

[005] O vitiligo é considerado uma doença autoimune, apresenta-se sob a forma de um distúrbio específico dos melanócitos de caráter imunológico e multifatorial de origem endógena: genética e oxidação melanocitária ou de origem exógena: fricções, lesões cutâneas (fenômeno de Koebner).

[006] Recentes pesquisas têm demonstrado a existência de falhas bioquímicas específicas na atividade da catalase e uma acumulação de peróxido hidrogenado na pele de pacientes com vitiligo. A catalase sugere que ceratinócitos no vitiligo são capazes de reciclar a 5,6,7,8-tetrahidrobioterina (6-BH4), um fator coadjuvante na hidroxilação da L-fenilalamina em L-tirosina. Isso pode romper o suprimento de L-tiroxina para a produção de melanina, aumentando a biossíntese de catecolamina pelos queratinócitos, resultando na acumulação de radicais livres tóxicos que danificariam os melanócitos. Morfologicamente, quanto às ocorrências das áreas despigmentadas, o vitiligo pode ocorrer através de oito formas:

[007] Os tratamentos disponíveis são:

[0081 Psicológico: Encarar o vitiligo com naturalidade e por se tratar de uma doença psicológica, não considera necessidade de tratamento, sem antes acreditar que é possível se curar.

[0091 O uso da melagenina: ajuda a diminuir as manchas em cerca de 75% dos pacientes.

[0010] O uso do Diprosalic: o Diprosalic na forma de solução, menos eficaz que a melagenina, é usado topicamente nas manchas.

[0011] O uso de fatores de proteção solar: usados em todas as variantes do tratamento. Queimaduras solares levam a possibilidade de fotocarcinogênesis e podem estender as áreas de despigmentação (Fenômeno de Koebner).

[0012] O uso de corticoesteróides tópicos: Usado para pequenas manchas de vitiligo com respostas em semanas a meses. Um dos mais potentes betametesona e o clobetasol propionato. O acompanhamento mensal ou bimestral assegura o controle dos efeitos colaterais de variculosidades aracnídeas, acne e atrofia-cutânea. Se ocorrer qualquer sinal destes efeitos, o uso intermitente deve ser evitado. Os resultados do tratamento devem ser observados dentro de três meses, considerando que essas drogas são imunossupressores.

[0013] PUVA: O tratamento para o vitiligo mais usual é a fotocromoterapia associado ao psoralen usualmente 8-methoxypsoralen (8-MOP) e exposição artificial de lâmpada fluorescente de 315-400nm por cerca de 10 minutos. A pigmentação pode ocorrer gradualmente de uma maneira perifolicular (ao redor do folículo piloso), embora em alguns casos sobre a área toda. Se não ocorrer resposta dentro de três meses o tratamento deve ser abandonado. Em caso de respostas de repigmentação pode ser dirigido por 1 ano a 1 ano e meio, sempre com intervalos de cerca de 2 meses de interrupção devido ao fato de que estes tipos de medicamentos são considerados hepatotóxicos, nefrotóxicos e ocasionam distúrbios gástricos e oculares. Para evitar riscos de fotocarcinogênese, o tratamento deve ser ministrado com 100 a 150 exposições. Apenas 30% dos pacientes que utilizaram a terapia PUVA alcançaram boa repigmentação, e destas, cerca de 75% reincidiram dentro de 2 a 3 anos.

[0014] Diante do exposto, foi demonstrado que os tratamentos existentes não são satisfatórios para combater as manifestações do vitiligo. É importante dispor de drogas eficazes e seguras para tratamento e profilaxia, principalmente de medicamentos de origem natural e de baixa toxicidade. Esses 5 produtos naturais devem compor formulações farmacêuticas para uso por vias adequadas.

[0015] Ainda do estado da técnica, o documento PI0406343-0 trata do uso de extratos aquosos, hidroalcoólico, alcoólico ou de solventes orgânicos das folhas e/ou das partes aéreas da espécie Stachytarpheta polyura, utilizado para tratamento do vitiligo. Esta espécie, Stachytarpheta polyura, é raramente encontrada na natureza e seu pequeno porte torna a produção era escala industrial do extrato inviável, custosa e desvantajosa.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

[0016] Para tanto e motivo desse invento, foi agora constatado cientificamente, através de testes pré-clínicos laboratoriais quanto a avaliações toxicológicas e farmacológicas - in vitro e in vivo,seguido de avaliações clínicas com um número significante de pacientes - dos extratos alcoólicos, hidroalcoólicos e aquosos de uma ou mais partes de plantas de uma das espécies ou mistura das espécies S. cayennensis, S. jamaicensis e S. eliotisse constituem de potentes agentes terapêuticos, isoladamente ou em mistura de diferentes proporções entre si ou junto com outros produtos, naturais ou sintéticos, para combater o vitiligo, conforme os dados e resultados descritos mais adiante.

[0017] As nossas pesquisas foram inicialmente realizadas a partir de dados obtidos por levantamentos etnofarmacológicos sobre plantas usadas na medicina popular brasileira, ditas empiricamente apresentarem propriedades repigmentantes para combate ao vitiligo. Em seguida foram realizados estudos fitoquímicos, farmacológicos e toxicológicos com extratos alcoólicos, hidroalcoólicos e aquosos das partes aéreas de mais de 30 plantas, entre as quais, várias espécies do gênero Stachytarpheta. Através desses screening constatou-se que o decocto e extrato hidroalcoólico das folhas de S. cayensensis, S. jamaicensis e de S. eliotis apresentam atividades farmacológicas cicatrizantes e anti-inflamatórias. Esses dados corroboram com o uso de gervão na medicina caseira. As análises dos resultados mostraram também que os referidos extratos não apresentam citotoxicidade quando avaliadas em micro-larvas de Artemia salina; nem toxicidade relevante, quando avaliados sobre alevinos de Poecilia reticulatae camundongos. Através da avaliação microbiológica - antibacteriana e antifúngica, in vitro,realizada em diferentes concentrações observaram-se discreta atividade antimicrobiana.

[0018] O novo produto desenvolvido poderá ser sintetizado, semi- sintetizado ou obtido a partir dos extratos alcoólicos ou aquosos ou hidroalcoólicos ou orgânicos de uma ou mais partes de plantas de uma das espécies ou mistura das espécies S. cayennensis, S. jamaicensis e S. eliotis.

[0019] As espécies utilizadas neste invento são encontradas com maior facilidade na natureza que a Stachytarpheta polyura, citada no estado da técnica, em quantidades mais abundantes, assim como em portes maiores o que aumenta a viabilidade da produção em escala industrial. Essas espécies, conhecidas popularmente como gervão, gerbão, overjão, chá-do-Brasil entre outros nomes populares, são utilizadas na medicina tradicional, como cicatrizante, para tratamento de problemas de estômago e antifebrífuga.

[0020] A nova invenção farmacêutica faz uso dos extratos puros, compostos sintetizados, semi-sintetizados ou isolados dos extratos das referidas plantas, isoladamente ou em misturas entre si ou associadas a extratos, óleos fixos, óleos essenciais, fragrâncias, pós ou excipientes provenientes de outras fontes naturais ou sintéticas.

[0021] Através de testes pré-clínico e clínico foi comprovado que os compostos identificados se prestam para integrar formulações de medicamentos, utilizados por via oral nas apresentações de comprimidos ou cápsulas usados no tratamento de vitiligo e por via tópica em forma de tinturas, cremes, géis, aerossóis ou similares usados como coadjuvante. Essa invenção estende-se, também, às composições farmacêuticas contendo, além dos referidos extratos, frações ou constituintes desses extratos (naturais ou sintéticos), empregados para fins de uso em formulação de medicamentos aplicados no tratamento ou profilaxia do vitiligo.

DESCRIÇÃO DO INVENTO

[0022] Em um primeiro aspecto, a presente invenção trata de um processo para produção de um produto farmacêutico a partir de extratos padronizados, frações ou moléculas isoladas de plantas do gênero Stachytarpheta, das espécies S. cayennensis, S. jamaicensise S. eliotis da família Verbenaceae, para utilização como medicamento no tratamento do vitiligo. O processo de produção de acordo com a presente invenção compreende as seguintes etapas: (a) A biomassa que compreende uma ou mais partes da planta, raizes, caules, cascas, e folhas de espécies do gênero Stachytarpheta, verde ou seco é pulverizado, ou moído, ou picado, ou esfarelado; sendo que, o material de partida pode compreender, sem qualquer limitação, as espécies S. cayennensis, S. jamaicensis ou S. eliotis ou suas misturas; (b) A biomassa obtida pelo processo (a) é extraída por percolação, ou maceração, ou soxlhet, ou utilizando gases em estado supercrítico, ou extração utilizando meio básico ou ácido ou um solvente orgânico ou extração por arraste a vapor; sendo que os solventes orgânicos são por exemplo compostos halogenados, álcoois, aldeídos, cetonas, cicloalcanos ou alcanos, compostos fenólicos, benzenos e derivados, dentre outros, sós ou suas misturas; e no caso de uma extração ácido/base, a extração poderá ser efetuada com ácidos fortes ou fracos, diluídos ou concentrados, sós ou em misturas, tais como ácido acético, ácido clorídrico, ácido fórmico; e a base utilizada no processo de extração compreende bases concentradas ou diluídas, sós ou em misturas como, por exemplo, o hidróxido de amónia (NH4OH) e 0 carbonato de sódio (Na2COs); (c) O extrato obtido poderá ser seco com spray-dryer, com temperatura de entrada entre cerca de 150-190°C, e temperatura de saída entre cerca de 60-90°C; ou a pressão reduzida, com temperatura compreendida entre 25-75°C; ou a temperatura ambiente;

[0023] O processo de acordo com a presente invenção permite a produção em escala industrial, uma vez que reduz 0 tempo de processo, apresenta rendimento adequado e resulta em um produto farmacêutico. O medicamento de acordo com a presente invenção contém cerca de 0,001 a 99% de pelo menos um dos compostos ou suas misturas em forma livre ou em forma de sais (como cloratos, sulfatos, boratos) de estrutura química (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) e (VII).

[0024] Em que R, são iguais ou diferentes e cada um é independentemente selecionado entre H, CH3, CH2CH3, CH2OH, COCH3, metais alcalinos, halogênios, monossacarídeos, dissacarídeos ou polissacarídeos, CO(CH2)nCH3, (CH2)nCH3, e que n varia de 2 a 16.

[0025] O extrato farmacêutico obtido de acordo com a presente invenção é útil tanto para ser administrado diretamente a um paciente, quanto para ser utilizado na preparação de composições farmacêuticas, em teores variando de cerca de 0,001 a cerca de 5000 mg/dia, particularmente cerca de 200 a 400 mg/dia, divididas em uma ou mais vezes ao dia.

[0026] Dentro de outro aspecto, a presente invenção trata de composições farmacêuticas contendo cerca de 0,001 a cerca de 5000 mg do extrato, assim como excipientes farmaceuticamente aceitáveis. O composto farmacêutico pode também ser utilizado sob a forma associada a fármacos, vitaminas, sais e açúcares.

[0027] Excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados à invenção são, por exemplo, e sem qualquer limitação, aqueles citados nas seguintes obras: Flemington's Pharmaceutical Sciences, da editora americana Mack Publishing, Europenan Pharmacopeia, Farmacopéia Brasileira, e novos excipientes que venham a ser desenvolvidos.

[0028] O produto farmacêutico e as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são comprovadamente eficazes no tratamento do vitiligo.

[0029] Para desenvolver as pesquisas pré-clínicas e clínicas dos extratos alcoólicos, hidroalcoólicos e aquosos das partes aéreas das três espécies de gervão, os extratos foram obtidos como descrito abaixo.

[0030] As espécies S. cayensensis, S. jamaicensis e S. eliotia, utilizadas para obtenção dos extratos alcoólicos, hidroalcoólicos e aquosos ou orgânicos, foram coletadas durante os anos de 1995 a 2002 nos Estados da Paraíba, Pernambuco e Bahia. As exsicatas floridas dos espécimes, separadamente, foram depositadas nos acervos do Herbário Lauro Pires Xavier, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa.

[0031] Os extratos alcoólicos das folhas e das partes aéreas das plantas, separadamente, foram realizados através de extração por percolação, usando como solvente etanol, durante 72 a 144 horas, consecutivas.

[0032] Após a extração e concentração em rotavapor, realizou-se em seguida determinação do peso do extrato seco e seu respectivo rendimento em relação aos pesos frescos dos materiais vegetais. Os rendimentos dos extratos etanólicos das folhas e partes aéreas por espécie foram os seguintes:

[0033] Os extratos aquosos das folhas e das partes aéreas das plantas, separadamente, foram realizados através de extração por decocção, usando como solvente água, durante 72 a 144 horas, consecutivas. Após a extração e concentração em rotavapor, realizou-se em seguida determinação do peso do extrato seco e seu respectivo rendimento em relação aos pesos frescos dos materiais vegetais. As médias dos rendimentos de três extratos aquoso das espécies estudadas (separadamente) apresentaram os seguintes rendimentos: S. cayensensis'. 12% (folhas) e 11% (partes aéreas); S. jamaicensis: 14% (folhas) e 12% (partes aéreas) e em S. eliotis: 11% (folhas) e 9% (partes aéreas). As partições (líquido-líquido) desses extratos foram realizadas por solventes, em ordem crescente de polaridade com hexano, clorofórmio, butanol e água, as quais foram evaporadas em rotavapor com pressão reduzida.

[0034] A purificação dos extratos aquosos das folhas e das partes aéreas das plantas, foi realizada com 10 g do extrato aquoso por CMP utilizando o sistema eluente uma mistura de MeOH e H2O com 0,05% de ácido trifluoro acético (TFA) em modo gradiente (5% a 100% em 3 dias). Os produtos foram detectados por UV a 254 nm. Quarenta frações foram obtidas a partir desta primeira etapa de purificação. A fração N°12 (400 mg) foi purificada por CLHP escala preparativa utilizando uma coluna Symmetry® (7 pm, 19x150 mm, Waters, MeOH/H2O 3:97 /TFA 0,05%, fluxo 10 mL/min, UV 254 nm conduzindo ao isolamento dos compostos I (300 mg, Rt=12 min). A fração N°15 conduziu ao isolamento do composto II (145 mg). A 15 fração N°18 conduziu ao isolamento do composto III (80 mg). O composto IV foi isolado diretamente a partir da fração N°19. Os compostos V (40 mg), VI (35 mg) e VII (5 mg) foram isolados da fração N°21.

[0035] As estruturas químicas dos compostos isolados foram elucidadas por métodos espectroscópicos incluindo, ultravioleta (UV), ressonância magnética nuclear (RMN 1D e 2D), espectrometria de massa a baixa e alta resolução (MS e HRMS), assim como, reações químicas e enzimáticas. Os compostos I e II foram identificados como sendo iridoides, sendo que o grupo R pode ser igual ou diferente dos grupos H, CH3, COCH3/ CO(CH2)nCH3 (em que n varia de 2 a 16), halogênio, monossacarídeos, dissacarídeos ou polissacarídeos. O composto III foi identificado como sendo um flavonóide em que 0 grupo R pode ser um grupo H, CH3/ CH2CH3, CH2OH, COCH3, CO(CH2)nCH3 (em que n varia de 2 a 16), halogênio, um monossacarídeo, dissacarídeo ou polissacarídeo. Os compostos IV, V, VI e VII foram identificados como sendo derivados glicosilados do etil e fenil-propano em que 0 grupo R pode ser um grupo H, CH3, CH2CH3, CH2OH, COCH3, CO(CH2)nCH3 (em que n varia de 2 a 16), halogênio, monossacarídeos, dissacarídeos ou polissacarídeos.

[0036] Para essas análises foram selecionados dois tipos de folhas de cada espécie vegetal: pequenas (jovens) e grandes (adultas). A partir desse material fez-se a determinação da umidade foliar em um balão de fundo redondo contendo 150ml_ de tolueno seco, previamente tratado e aquecido a uma temperatura de aproximadamente 120°C, mantida constante até a ebulição do sistema, seguido de leituras dos volumes de água do arraste de vapor. As médias de três análises de umidade foliar de cada espécies estudadas apresentaram os seguintes rendimentos: Stachytarpheta cayensensis: 69% (folhas jovens) e 67% (folhas adultas); Stachytarpheta jamaicensis 68% (folhas jovens) e 64% (folhas adultas) e Stachytarpheta eliotis: 66% (folhas jovens) e 64% (folhas adultas).

[0037] As análises dos percentuais das ceras foliares de cada espécie, separadamente, foram realizadas sobre os materiais botânicos coletados e identificados. Para cada análise foi utilizado um béquer com capacidade de 1000mL ao qual se adicionou 150g do vegetal e em seguida, 500mL de clorofórmio P.A. Após cinco minutos de extração, filtrou-se em papel de filtro qualitativo, obtendo-se o extrato clorofórmico que foi concentrado em rotavapor a pressão reduzida. As determinações dos percentuais das ceras foliares foram realizadas após secagem em dessecador a vácuo, pesado até peso constante. Esta análise quantitativa repetida três vezes, obedecendo à mesma metodologia, mostrou que as partes aéreas das espécies estudadas apresentam os seguintes rendimentos de ceras foliares: Stachytarpheta cayensensis: 0,21%; Stachytarpheta jamaicensis: 0,22% e Stachytarpheta eliotis: 0,19%.

[0038] As análises qualitativas das ceras foliares das três espécies foram realizadas a partir dos extratos das ceras obtidas conforme a metodologia discutida acima (0,1 g), após reação de esterificação com diazometano. As composições foram analisadas através de cromatógrafo a gás acoplado a um espectrômetro de massa conectado a um banco de dados. Para realizar as análises, cada material metilado foi dissolvido em 5mL de n-hexano (cromatográfico) e desta solução foram injetados 5 pL no sistema CG/EM modelo HP-5890-série 2, com coluna DB1 de 30m, empacotada com 100% dimetil polisiloxano. O gás de arraste utilizado foi o hélio a uma temperatura inicial de 60°C, num gradiente de 10°C/min até a temperatura de 240°C, acoplado a um espectrômetro de massa, conectado a um banco de dados.

[0039] A identificação dos constituintes químicos de ceras foliares foi realizada através do registro da fragmentação no espectro de massa e do seu peso molecular, fazendo-se uma comparação simultânea ao banco de dados de 135.000 compostos orgânicos presentes no sistema. As ceras foliares das três espécies apresentam os seguintes constituintes hidrocarbonetos: dodecano, tricosano e os ácidos hexadecanóico, dodedecanóico, tricosanóico e eicosanóico.

[0040] As avaliações das atividades biológicas do extrato alcoólico e das suas partições líquido-líquido (hexânica, clorofórmica e aquosa), todos obtidos a partir das partes aéreas de S. cayensensis, S. jamaicensis e de S. eliotis, assim como dos constituintes químicos isolados foram realizadas através de testes laboratoriais in vitro sobre as atividades de captação de radicais livres (ABTS-radical), SOD mimetic, síntese do oxido nítrico, e inibição da xantina oxidase.

[0041] Os extratos de S. cayensensis, S. jamaicensis e de S. eliotis apresentaram, uma potente atividade de captação do 02’ no sistema hipoxantina/xantina. Em concentrações em torno de 40 pg/ml os extratos apresentaram inibição da atividade da xantina oxidase e na produção de ácido nítrico nos macrófagos. Entre os compostos isolados os compostos II, III e IV apresentaram uma importante atividade antioxidante a concentrações de 10 pM. O composto IV apresentou por sua vez uma atividade significativa no ensaio com o óxido nítrico a concentração de 10 pM.

[0042] As avaliações das atividades biológicas do extrato alcoólico e das suas partições líquido-líquido (hexânica, clorofórmica e aquosa), todos obtidos a partir das partes aéreas de S. cayensensis, S. jamaicensis e de S. eliotis, assim como dos constituintes químicos isolados foram realizadas através de testes in vivo, da seguinte maneira: Os testes de citotoxicidade foram realizados sobre alevinos de Poecilia reticulata;toxicidade, sobre larvas de Artejmia salina e microbiológico frente a 7 bactérias, 5 fungos leveduriformes e 6 fungos filamentosos.

[0043] Os ensaios de avaliação ictiotóxicos ou piscicidas foram realizados com alevinos de Poecilia reticulata,coletados no rio Jaguaribe do Município de João Pessoa - PB, aclimatados em laboratório pelos períodos de 48 horas, alimentados com ração para peixes. Os alevinos utilizados nos ensaios biológicos apresentaram em média 17,1 mm de comprimento. Os extratos alcoólicos, hidroalcoólicos e aquosos (decocto) foram diluídos em água destilada nas concentrações de 1, 10 e 100 pg/mL.

[0044] As soluções dos produtos, nas três concentrações, foram empregadas nos testes de avaliação biológica em béquer de 1000 mL cobertos com telas de tule, contendo 400mL da solução de cada produto. Os ensaios foram feitos com grupos de 10 alevinos, separadamente, com tempo de exposição de 24 horas. Durante esse período as referidas soluções foram aeradas com aparelhagem apropriada na temperatura ambiente. Para cada ensaio biológico foi realizado em teste controle em água destilada e aerada com 10 alevinos coletados e tratados da mesma forma.

[0045] A avaliação da atividade dessas substâncias sobre 15 alevinos foi feita macroscopicamente através de alterações fisiológicas e comportamentais como: hiperatividade, movimentos convulsivos, perda de equilíbrio, tentativa de fuga dos recipientes e morte. Os resultados mostraram que os produtos não foram tóxicos em nenhuma das três concentrações testadas.

[0046] A avaliação da atividade citotóxica dos extratos alcoólicos, hidroalcoólicos e do decocto foram realizadas em meio salino com micro larvas recém eclodidas de Artemia salinaLeach, nas concentrações de 1, 10 e 100 pg/mL. Para a realização dos bioensaios utilizou-se a metodologia de Fontenele e colaboradores com adaptações. Cada solução foi avaliada nos testes tóxicos em triplicatas, utilizando 10 larvas de Artemia salina. Essa experiência foi mantida a temperatura ambiente (26- 28°C) sob iluminação artificial por um período de 24 horas consecutivas. Um teste controle foi preparado usando-se um volume de 5mL de solução salina com 10 larvas de A. salina, sob as mesmas condições experimentais dos testes descritos anteriormente. Os resultados desses bioensaios mostraram que nenhum dos extratos apresentou toxicidade nas concentrações de até 100 pg/mL.

[0047] Os testes microbiológicos foram realizados com os extratos alcoólicos, hidroalcoólicos e com os decoctos obtidos separadamente das partes aéreas das 3 espécies (S. cayensensis, S. jamaicensis.e S.eliotis), nas concentrações de 2.500, 1.250, 625, 313 e 156 mg/mL, solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO).

[0048] Os ensaios microbiológicos com os referidos extratos foram realizados em meio sólido pela técnica de diluição seriada à razão de 2, em Ágar Sabourand Dextrose (DIFCO) e Ágar Nutriente (Merck). Em tubos de ensaio 12 x 120mm foram colocados 3ml_ do meio no 1 ° tubo e 1,5 mL nos demais; adicionou-se 15mg do extrato no 1o tubo, fazendo-se as demais diluições. Em seguida, foram adicionados 10pL da suspensão dos microrganismos padronizados para 106 UFC, conforme tubo 0,5 da escala McFarland e ajustada para 90% T (530nm). Os extratos também foram testados pelas técnicas de Vicent & Vicent e de Allegrini; sobre o meio de cultura adicionado com a suspensão do microrganismo foram colocados discos de papel de filtro (CECO/SP) embebidos com 0,02 mL de cada extrato. Fez-se controle para cada microrganismo com antimicrobiano padrão (cloranfenicol a 30 pg/mL, tetraciclina a 30 pg/mL e cetoconasol a 1.000 pg/mL). Os ensaios foram incubados a 37°C durante 24-48 horas (bactérias e leveduras) e temperatura ambiente por 10-14 dias (fungos filamentosos). Os ensaios microbiológicos dos citados produtos foram realizados frente a bactérias gram-positivas e gram-negativas; fungos leveduriformes e fungos filamentosos frente aos seguintes microrganismos: Bactérias: Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus;Fungos leveduriformes: Candida albicans, Candida tropicali e Cryptococcus neoforman; Fungos filamentosos: Aspergillus parasiticus, Pen id Hum sp e Trichophyton rubrum. Os ensaios microbiológicos dos citados produtos não apresentaram atividade antimicrobiana frente a nenhum dos microrganismos testados.

[0049] As avaliações farmacológicas, pré-clínicas e clínicas do extrato alcoólico e dos extratos aquosos (decoctos) das partes aéreas de S. cayensensis, S. jamaicensis e S. eliotis,separadamente, foram realizadas in vitroe in vivo,para as atividades descritas abaixo.

[0050] As avaliações foram realizadas em camundongos Swiss-Webster (10/grupo) os quais receberam doses de 0,5 e de 1,0 mg/Kg de cada extrato por v.o. Os animais do grupo controle receberam apenas salina 0,9% (10mL/Kg; v.o). Do resultado não foi registrada nenhuma morte nos grupos tratados com os extratos alcoólicos, hidroalcoólicos e aquosos (decoctos) das 3 espécies de plantas. Apenas um grupo tratado com extrato alcoólico de S.eliotis apresentou índice de mortalidade de 10%. Não foi observado indício de toxicidade, no tocante a alteração significante em relação à evolução ponderai, peso dos órgãos (coração, baço, fígado, estomago, rins, pulmão, testículos, ovários e útero), parâmetros hematológicos e bioquímicos, entre os grupos tratados cronicamente e os controles. Os resultados dos testes de avaliações de toxicidade aguda em camundongos demonstraram que os extratos alcoólicos, hidroalcoólicos e aquosos (decocto) das partes aéreas de Stachytarpheta cayensensis, S. jamaicensis e S.eliotis, quando avaliados em diferentes concentrações, separadamente, não apresentaram efeitos tóxicos por via oral em doses de até 1,0 g/Kg.

[0051] A partir do extrato aquoso (decocto) concentrado das partes aéreas de cada espécie de planta foi desenvolvido um fitoterápico. A concentração do fitoterápico de cada planta foi de 60 e de 120mg do pó do extrato seco por cápsula. Também foi desenvolvido um creme de uso tópico a base de Lanete, usando parabenos como conservante e 3% de pó do extrato aquoso de cada planta. A posologia recomendada foi de 1 cápsula 3 vezes ao dia e quanto ao creme, 2 aplicações diárias. - Cada cápsula de 280 mg do fitoterápico contém:

[0052] A avaliação clínica dos 3 fitoterápicos foram realizadas em 36 pacientes voluntários, adultos (faixa etária de 22 a 53 anos), sendo 22 mulheres e 14 homens, portadores de vitiligo em diferentes estágios e extensão, a maioria com despigmentação simétrica e com diagnósticos baseados em análises clínicas. Os pacientes foram divididos em três grupos de indivíduos, de forma não controlada. Inicialmente os pacientes foram informados da pesquisa e na oportunidade foi solicitado de cada paciente, análises de urina e de sangue. No início do tratamento todos os pacientes tiveram as manchas fotografadas e mapeadas em papel transparente para registro das áreas despigmentadas e melhor acompanhamento da evolução do tratamento.

[0053] A posologia recomendada foi de 1 cápsula de 60mg de princípio ativo (extrato seco) 3 vezes ao dia e avaliação clínica 1 vez por mês. O tratamento clínico variou de 14 a 18 meses e para todos os casos foi recomendado um banho de sol pela manhã entre as 7 e 9 horas por 30 a 45 minutos. Nesse estudo não foi usado placebo e não ocorreu nenhuma evasão.

[0054] Foi registrado que todos os pacientes já tinham realizado pelo menos um tratamento contra o vitiligo e que mais de 60% já haviam participado de mais de 2 tratamentos. O medicamento Viticromim foi o mais usado.

[0055] As análises dos resultados mostraram que os 3 fitoterápicos apresentaram resultados positivos, registrando que mais de 50% dos pacientes tiveram suas manchas repigmentadas, após o uso das cápsulas por 18 meses consecutivos. O Grupo 1 tratado com cápsulas de Stachytarpheta eliotis obteve o melhor resultado relativo, quando comparado aos resultados dos demais grupos. O Grupo 2 tratado com cápsulas de S. jamaicensis apresentou resultado equivalente ao do Grupo 3, tratado com cápsulas de S. cayensensis. Esses resultados foram distribuídos da seguinte forma: 21 pacientes que tiveram suas manchas repigmentadas estavam compostos por 9 pacientes pertencentes ao Grupo 1; 6 pacientes ao Grupo 2 e o restante ao Grupo 3. Nesse contexto foi registrado também que em 6 pacientes do Grupo 1 (50% do grupo), os resultados de repigmentação perceptível através dos registros fotográficos e das áreas, foram observados logo após o 4o e 5o mês de uso do produto. Nos demais grupos, os resultados de repigmentação só foram registrados após o 6o e o 8o mês de uso do fitoterápico.

[0056] Não foi registrada nenhuma queixa de mal-estar, tontura, dor-de- cabeça, vômito, com o uso contínuo dos produtos fitoterápicos. Apesar dos resultados de repigmentação terem sido parciais em 10 pacientes (27,8%), eles declararam satisfeitos com os resultados e apenas 5 consideraram os resultados insatisfatórios. Os pacientes que obtiveram repigmentação completa das manchas se mostraram radiantes.

[0057] Descrevem-se abaixo alguns exemplos, de caráter não limitativo, de metodologias e de técnicas relacionadas as obtenções e preparações de frações, compostos puros a partir dos extratos alcoólicos, hidroalcoólicos e aquosos das folhas ou das partes aéreas de Stachytarpheta cayensensis, S. jamaicensis e de S. eliotis apropriados ao uso segundo a invenção apresentada neste instrumento.

Exemplo 1: Metodologia empregada para obtenção do extrato alcoólico.

[0058] Numa cuba de um extrator dotado de agitação mecânica adicionar 100Kg de folhas ou das partes aéreas da planta (de uma das 3 espécies citadas), secas em estufas com temperatura controlada a 60°C e triturada em moinho elétrico. Em seguida, adicionar 280 litros de etanol a 96°GL, com agitação frequente, pelo período de 72 a 144 horas (2 a 4 dias). Após esse processo, filtrar o extrato a vácuo através de filtros de 100pm. Através dessa metodologia obtém-se um rendimento de aproximadamente 240 litros de solução do extrato. Após evaporação do solvente em evaporador rotativo com pressão reduzida, obtém-se de extrato alcoólico concentrado, em média, os seguintes resultados por planta: 18% de Stachytarpheta cayensensis; 16,5% de Stachytarpheta jamaicensis e 19,7% de Stachytarpheta eliotis.

Exemplo 2: Metodologia empregada para obtenção do extrato hidroalcoólico.

[0059] Num percolador de aço Inox, adicionar 50Kg de folhas ou das partes aéreas da planta (de uma das 3 espécies citadas), desidratada à sombra sobre telas de aço inox, pelo período de 24 horas. Em seguida adicionar 80 litros de uma solução hidroalcoólica (etanokágua 1:1) e deixar percolar por 8 dias, com agitação diária e ocasional. No final do período filtrar o extrato em filtros de 10Oprn e concentrar em evaporador rotativo a pressão reduzida. Essa metodologia resulta num rendimento de extrato hidroalcoólico concentrado por planta da seguinte ordem: 15 a 21% de Stachytarpheta cayensensis; 17 a 20% de Stachytarpheta jamaicensis e 15 a 22% de Stachytarpheta eliotis.

Exemplo 3: Metodologia empregada para obtenção do extrato aquoso.

[0060] Para obter o extrato aquoso de uma das 3 espécies de Stachytarpheta, adicionar numa cuba de percolação com temperatura controlada, 50 Kg das folhas ou partes áreas previamente selecionadas, secas na temperatura de 65°C em estufa com aeração forçada e em seguida, moída em moinho elétrico. Em seguida adicionar 100 litros d'água destilada na cuba e aquecer a 90°C, pelo período de 4 horas consecutivas. Durante esse período realizar agitação ocasional. Em seguida, efetuar a filtração em filtros de 100pm e por último, concentrar o extrato (filtrado) em evaporador rotativo a pressão reduzida. Esse processo da extração resulta nos seguintes rendimentos: 7,4 a 11,2% de Stachytarpheta cayensensis; 6,5 a 8,9% de Stachytarpheta jamaicensis e 7,2 a 11,5% de Stachytarpheta eliotis em relação ao peso do material vegetal usado no processo de extração.

Claims (8)

1. Processo para obtenção de compostos farmacêuticos fitoterápicos CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) pulverizar, moer, picar ou esfarelar uma ou mais partes de plantas do gênero Stachytharpheta, assim como, raízes, caules, cascas, e folhas; verde ou seca, ou suas misturas; (b) extrair por percolação, maceração, soxlhet, ou utilizando gases em estado supercrítico, ou extração utilizando meio básico ou ácido ou solventes orgânicos, ou extração por arraste de vapor; (c) secar a solução orgânica por intermédio de um sistema a pressão reduzida, ou secagem em spray-dryer, ou a temperatura ambiente; (d) separar e purificar.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as temperaturas de entrada e saída do processo de concentração por spray- dryer na etapa (c) estão entre 150-190 °C e 80-90 °C, respectivamente.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a temperatura do sistema a pressão reduzida, na etapa (c), está entre 25-100 °C.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a extração no item (b) é efetuada em meio aquoso, acidificado ou basificado, ou utilizando solventes orgânicos, ou suas misturas.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a extração ácido/base pode ser efetuada com ácidos fortes ou fracos, diluídos ou concentrados, sós ou em misturas, tais como ácido acético, ácido clorídrico, ácido fórmico; e a base utilizada no processo de extração compreende bases concentradas ou diluídas, sós ou em misturas como, por exemplo, hidróxido de amónia (NH4OH) e carbonato de sódio (Na2COs).

6. Processo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a solução orgânica utilizada na etapa (b) compreende compostos halogenados, álcoois, éteres, ésteres, aldeídos, cetonas, alcanos, cicloalcanos, compostos fenólicos, benzenos e derivados, sós ou suas misturas.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a separação e purificação dos compostos, no item (d), são feitas por técnicas cromatográficas com ou sem pressão, como por exemplo, cromatografia a pressão atmosférica, cromatografia a baixa, média ou alta pressão, utilizando fase estacionária normal como a sílica gel ou fase inversa como C-8 ou C-18, ou a partição líquido/líquido como cromatografia contracorrente, ou a partição centrífuga, ou utilizando resinas de troca iônica ou membranas de filtração.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que resulta em pelo menos um dos compostos em forma livre ou em forma de sais, de estrutura química (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) e (VII),

em que R, são iguais ou diferentes e cada um é independentemente selecionado entre H, CH3, CH2CH3, CH2OH, COCH3, metais alcalinos, halogênios, monossacarídeos, dissacarídeos ou polissacarídeos, CO(CH2)nCH3, (CH2)nCH3, em que n varia de 2 a 16.