JP2010508528A - 等速電気泳動適用のための新規方法、キット、装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、区別された電気泳動移動度の粒子を分離及び／又は分画する、電気泳動の操作モードに関する。より詳細には、本発明は、フリーフロー及びキャピラリー等速電気泳動を含む、等速電気泳動（ＩＴＰ）に関し、並びに新規電気泳動法、更にはそのような方法を実行するためのキット及び装置を提供する。

Description

発明の分野
本発明は、区別された電気泳動移動度の粒子を分離及び/又は分画する、電気泳動の操作モードに関する。より詳細には、本発明は、フリーフロー及びキャピラリー等速電気泳動を含む、等速電気泳動（ＩＴＰ）に関し、並びに新規電気泳動法、更にはそのような方法を実行するためのキット及び装置を提供する。

発明の背景
電気泳動は、直流の影響下で帯電した粒子の移動を基に粒子を分離するためのよく確立された技術である。等電点電気泳動（ＩＥＦ）、ゾーン電気泳動（ＺＥ）及び等速電気泳動（ＩＴＰ）などのいくつかの異なる操作モードが、電気泳動分離原則の変形として開発されており、一般に当業者に公知である。

電気泳動技術の中で、ＦＦＥは、最も将来性のあるものである[Krivanova L.及びBocek P. (1998), "Continuous free-flow electrophoresis", Electrophoresis 19: 1064-1074]。ＦＦＥは、被検体の分離が、吸着による試料の喪失を最小化するために、固定相（又は固形支持材）の非存在下で、液体媒体において行われる技術である。ＦＦＥは、無担体デフレクション電気泳動又はマトリックス-フリーデフレクション電気泳動と称されることが多い。

ＦＦＥは、有機分子及び無機分子、生体粒子、生体高分子及び生体分子を、それらの電気泳動移動度を基に分離するために使用することができる。それに対応する原理は、例えばBondy B.らの論文「Sodium chloride in separation medium enhances cell compatibility of free-flow electrophoresis」、Electrophoresis 16: 92-97, 1995において既報である。

ＦＦＥのプロセスは、例えば安定化媒体及び向流媒体を手段として改善されている。これは、例えば米国特許第5,275,706号に開示されており、その特許の開示は全体が参照により本明細書に組み入れられる。この特許によると、向流媒体は、バルク分離媒体及び電極間を移動する試料の連続流方向に対抗して分離スペースに導入される。両媒体（分離媒体及び向流媒体）は、電極間の分離スペースから溶出され、分画流出口を通り、典型的にはマイクロタイタープレートへ排出され、低い空隙容量を有する分画プロセスを生じる。加えて分画流出口ゾーン内の媒体の層流は、維持される（すなわち乱流は非常に少ないかもしくは存在しない）。

インターバルＦＦＥと称される特定のＦＦＥ技術が、例えば米国特許第6,328,868号において開示されている。この特許において、試料媒体及び分離媒体は、電気泳動チャンバーへ導入され、試料中の被検体は、ＺＥ、ＩＥＦ又はＩＴＰなどの電気泳動モードを用い分離され、最終的に分画流出口を通りチャンバーから放出される。この第6,328,868号特許の実施態様は、チャンバーの注入口末端から流出口末端へと移動する一方向である分離媒体及び試料の移動を開示しており、印加された有効電圧が、電気泳動移動の発生を引き起こす一方で、試料及び媒体は、注入口末端から流出口末端へ流体的に駆動されない。これは、試料及び媒体が器具を通過する間に電界内で分離される（連続ＦＦＥ）、当該技術分野において通常使用される技術とは対照的である。

国際特許出願WO 02/50524は、それを通り分離媒体が流れかつ床面により規定された分離スペース又はチャンバーを提供する分離チャンバー、カバー、並びにこれらふたつを互いに分離するが該ＦＦＥ器具の上面プレートと底面プレートの間に本質的に一定のギャップを維持するスペーシング装置を備える器具を使用する電気泳動法を開示している。加えて、このＦＦＥ器具は、媒体供給ラインを介し分離チャンバーへ侵入しかつ流出口を介してチャンバーから離れる分離媒体を供給するためのポンプを包含している。このＦＦＥ器具は、分離媒体内に電界を印加するための電極、粒子又は被検体の混合物を添加するための試料注入ポイント、及び分離媒体においてＦＦＥにより分離される粒子を除去するための分画ポイントも備える。分離された粒子は、分析目的に又は更なる分取処理に使用することができる。

電気泳動技術に影響を及ぼす問題点は、とりわけ電極汚染により引き起こされる不安定性である。特にＦＦＥにおいては、この汚染は一般に、電極を分離チャンバーから隔離する半-多孔質メンブレンの使用により防止される。

この問題点の解決法は、米国特許出願第2004/050697号及び第2004/050698号、更には国際特許出願WO 03/060504に開示されている。とりわけこれらの特許出願は、電極近傍に緩衝液媒体を作製するために使用される、いわゆる焦点化緩衝液(focusing buffer)を開示しており、ここで焦点化緩衝液媒体は、分離媒体よりもより高い伝導度を有する。電極を分離チャンバーから分離するメンブレンが存在しない場合、粒子はそれら自身活発に電極へ結合し、その結果分離された粒子の著しい喪失及び電極の同時汚染の可能性がある。これらの出願によると、この作用は、焦点化緩衝液により防止することができる。しかし米国特許出願第2004/050697号及び第2004/050698号又は国際特許出願WO 03/060504には、分離媒体に関する焦点化緩衝液の成分、又はより高い伝導度を実現する方法に関する指針は開示されていない。

生体粒子及び生体高分子などの被検体の分離のための多くの分離媒体が、当該技術分野において公知である。例えば、K. Hannig及びK. H. Heidrichにより刊行された書籍「Free-flow Electrophoresis」(ISBN 3-921956-88-9)は、ＦＦＥ、特にフリーフローＺＥ（ＦＦ−ＺＥ）に適した分離媒体の一覧を報告している。

米国特許第5,447,612号(Bierら)は、フリー溶液(free solution)中に機能的に安定したプレキャストナローｐＨゾーン勾配を形成することによる、ＩＥＦにより被検体を分離するためのｐＨ緩衝化システムである別の分離媒体を開示している。これは、相補的緩衝液対中で緩衝化成分を使用する。この緩衝液の成分は、単純に化学的に規定された両性電解質及び弱酸及び弱塩基から選択され、これらは次にｐＨ単位０．４〜１．２５の間で比較的平坦なｐＨ勾配を提供するように、それらの解離特性を基に対を形成する。

同時係属中の米国特許仮出願第USSN 60/885,792号は、例えばゾーン電気泳動（ＺＥ）、等速電気泳動（ＩＴＰ）及び等電点電気泳動（ＩＥＦ）などの様々な電気泳動操作モードにおいて利用することができる媒体を開示している。更にこの出願は、一般に各々、電気泳動装置の陰極及び陽極の近傍（すなわち近く）で（すなわち、陰極と分離ゾーンの間、及び陽極と分離ゾーンの間で）電気泳動チャンバーへ導入される、いわゆる安定化媒体を開示している。

従って安定化媒体は、電気泳動装置の分離スペース内の条件（例えばｐＨ及び電気伝導度）を安定化することが可能であり、これにより電気化学的状態及び物理的状態の改善された安定性をもたらし、これは試料中の被検体の電気泳動分離／分画における増強された精度、感度及び再現性につながる。

好適なＦＦＥ装置は当該技術分野において公知であり、例えば商品名BD(商標)Free-flow Electrophoresis System (BD GmbH, 独国)で市販されている。加えて本発明の分離媒体及び安定化媒体と共に使用することができる好適なＦＦＥ装置は、多くの特許出願において開示されており、これは米国特許第5,275,706号、第6,328,868号、係属中の米国特許出願公開US 2004/050697、US 2004/050698、US 2004/045826、及びUS 2004/026251、並びに国際出願PCT/EP2007/059010(仮出願された出願USSN 60/863,834及びUSSN 60/883,260の優先権を主張)を含み、これらは全て参照により本明細書に組み入れられる。

米国特許出願第2004/050698号は、それを通り分離媒体が流れることができる少なくとも１個の分離チャンバーを包含している、フリーフロー電気泳動器具も開示している。更に該ＦＦＥ器具は、媒体供給ラインにより分離チャンバーへ侵入し、かつ流出口により該チャンバーを離れる分離媒体の運搬のための供与ポンプ(dosage pump)、分離媒体に電界を印加するための電極、並びに分離される粒子の混合物を添加するための試料注入ポイント及びＦＦＥにより分離された分離媒体中の粒子を除去するための分画ポイントを包含している。

前述のように、フリーフロー電気泳動は、様々な電気泳動モードで実行されてよい。これらのモードのひとつである等速電気泳動（「ＩＴＰ」）は、分離が不連続緩衝液システム中で実行される、より最新型の電気泳動である。分離される試料物質は、「リーディング電解質」と「ターミネーティング電解質」の間に挿入され、これらの緩衝液の特性は、リーダーは正味電気泳動移動度が試料イオンのそれよりも高いイオンを含むが、ターミネーターは正味電気泳動移動度が試料イオンのそれよりも低いイオンを含まなければならないことである。そのようなシステムにおいて、試料成分は、いわゆるコールラウシュ規定関数により支配される複雑なパターンでそれらの移動度の減少に従い、リーダーからターミネーターへそれら自身を選別する(sort)。このプロセスは、当該技術分野において、例えばBier及びAllgyerの「Electrokinetic Separation Methods」443-69 (Elsevier/North-Holland 1979)で説明されている。

被検体（類）及び任意にスペーサー化合物（Ｓ＆Ｓ）を含有する試料は、フリー溶液等速電気泳動へ、リーダーとターミネーター電解質ゾーンの間で導入され、同時に電界に供され、その後それらの相対電気泳動移動度における差に従い個々の物質の純粋なゾーンへと分離される。

従って、フリーフローゾーン電気泳動（ＺＥ）とは対照的に、ＩＴＰにおける分離は、固有の「焦点効果」のためにより良い分解をもたらす非-均質分離媒体において実現される。ITP時に単独の粒子が分離された粒子バンドの外へ拡散する場合、これらは、電界強度が変動する媒体へ侵入し、結果的にこれらの粒子は一般に複数の電極のひとつに向かい局所的に加速又は減速される。固有の焦点効果は、主要画分へ移動するための、より遅い又はより早い粒子の移動を引き起こす。一部の適用において、移動する電界(migrating field)内の公知の電気泳動移動度の粒子の分離又は単離は、単離されるべき粒子よりもわずかに大きい及びわずかに小さい電気泳動移動度を伴うスペーサーの追加により改善され得る。これは一般に「スタッキング」と称され、そのような「スペーサー」は、公知かつ個別の電気泳動移動度を持つ粒子（複数）を物理的に分離するために利用される。

ＩＴＰの基本の例は、例えばEveraertsの米国特許第3,705,845号「Method in counterflow isotachophoresis」に認められる。米国特許第3,705,845号の図１ａ及び１ｂは、図１ａ及び１ｂとして本明細書に組み入れられており、これらはゾーン間に境界を持つイオンゾーンが作製されている電気泳動チャンバーの断面を反映している。Everaertsは特許第3,705,845号において、例えば図１ａ及び１ｂにおいて、Ｃ１がＣ２よりもより高い移動度を有するように仮定された、２種の異なる陰イオンＣ１及びＣ２の陰イオン分離を開示している。陰イオンＡのリーディング電解質ゾーン及び陰イオンＢのターミネーティング電解質ゾーンは各々、Ｃ１及びＣ２を含む試料ゾーンＳの反対側に作製される。陰イオンＡを伴うリーディング電解質ゾーンＬは、試料ゾーンＳよりも陽極５に近いが、陰イオンＢを伴うターミネーティング電解質ゾーンＴは、試料ゾーンＳよりも陰極４に近い。Everaertsは更に、Ｔ、Ｌ、及びＳの各ゾーン内の対イオンＲ⁺を明らかにしている。

ゾーン電気泳動は、分取分離モードのようなある場合に許容し得る方法であるが、それにもかかわらず欠点がある。例えばこれは、分離を実行するために高い電界強度を必要とし、これは電気泳動分離の前に試料の濃度と比べ相対的に薄い試料を作製する。

フリーフロー等速電気泳動による細胞小器官又はタンパク質のような繊細な生体分子又は生体粒子の分離は、いくつかの利点を提供するが、そのような繊細な生体粒子を分離する場合に、フリー溶液中でＩＴＰをうまく実行する試みは、概してうまくいかない。数ある中でも関心対象の被検体（例えば細胞小器官）の濃度を改善するために、分取的分離技術として、ＦＦ ＩＴＰを利用することは原則的に有益であり、その理由は、例えば増強された分解は、比較的少量の付随する緩衝液内の関心対象の被検体を溶出する能力につながるからである。

一般に非分取的分離技術であるキャピラリー電気泳動において達成されるのと同じくらいうまくフリーフロー等速電気泳動を達成しようとする最新の更なる試みは、失敗した。従って当該技術分野において、分析的及び分取的フリー溶液電気泳動技術における等速電気泳動に関連したこれらの問題点及び他の問題点を解決する必要がある。

発明の概要
本発明の目的は、当該技術分野において公知のキャピラリー等速電気泳動分離技術を増強する方法及びキットを提供し、並びに先行技術の欠点を避けるフリーフロー等速電気泳動分離に適した方法、キット及び装置を提供することである。

本発明者らは、本明細書に提供された方法、キット及び装置は、被検体のフリーフロー等速電気泳動分離をうまく使用することができ、かつ利用可能な先行技術の方法と比べ多くの利点をもたらすことを認めた。キャピラリー等速電気泳動分離技術を含む、本発明により提供される更なる利点及び改善点を、以下の本発明の説明においてより詳細に例示する。

従って、本発明の一態様は：
少なくとも１種のＴ媒体により形成された、ターミネーター電解質（Ｔ）ゾーン；
少なくとも１種の希釈されたＴ媒体により形成された、希釈されたＴゾーン；
少なくとも１種のＬ媒体により形成された、リーダー電解質（Ｌ）ゾーン；及び
少なくとも１種のＬ安定化媒体により形成された、Ｌ安定化ゾーン；を備え、並びに
任意に少なくとも１種のＳ媒体により形成された、スペーサー（Ｓ）ゾーン：を更に備える、電気泳動チャンバー内の電極のセット間に分離ゾーンを形成し、ここで少なくとも１個の電極は陰極であり、及び少なくとも１個の電極は陽極であること；を含む、新規電気泳動法に関する。

好ましくは、本発明の新規電気泳動法は、等速電気泳動（ＩＴＰ）により、少なくとも１種の関心対象の被検体を、被検体組成物から分離するために有用であり、特にフリーフロー等速電気泳動（ＦＦ ＩＴＰ）のような、無担体電気泳動の適用における分離に有用である。

別の態様は、被検体を分離するための、キャピラリー等速電気泳動法に関し、これは：
２個の電極及び該２個の電極の間に介在された分離ゾーンを備える、キャピラリー電気泳動分離を実行するのに適した器具を提供することを含み、ここで該分離ゾーンは、少なくとも：
Ｌ’ゾーンを形成する、リーダー電解質（Ｌ）媒体；及び
Ｓゾーンを形成する、スペーサー（Ｓ）媒体；及び
Ｔ’ゾーンを形成する、修飾されたターミネーター電解質（Ｔ’）媒体：により形成される。

更に別の本発明の態様は、ＦＦ ＩＴＰ分離及びキャピラリーＩＴＰ分離における、各々、新規Ｔ媒体及び新規Ｔ’媒体の使用、並びにＦＦ ＩＴＰ分離における希釈されたＴ媒体の使用に関する。

更に別の本発明の態様は、本発明の新規方法を実行するための媒体成分の少なくとも一部又は全てを提供するキットに関する。特にフリーフローＩＴＰを実行するためのキットは、本明細書において更に規定される少なくとも１種のＴ媒体を含むが、任意にＬ媒体、Ｌ安定化媒体、希釈されたＴ媒体、及び／又は少なくとも１種のＳ媒体のような、その他の媒体又はそれらの成分を含んでもよい。

最後に、少なくとも１個の電極は陰極であり、及び少なくとも１個の電極は陽極である電極のセット、並びに該電極の間に介在された分離ゾーンを備える、電気泳動チャンバーを含む、新規器具であり、ここで分離ゾーンは、少なくとも１種のＴ媒体により形成されるターミネーター電解質（Ｔ）ゾーン、少なくとも１種の希釈されたＴ媒体により形成される希釈されたＴゾーン、少なくとも１種のＬ媒体により形成されるリーダー電解質（Ｌ）ゾーン、少なくとも１種のＬ安定化媒体により形成されるＬ安定化ゾーンを含むように構成される器具が、本明細書において提供される。任意にこの器具は、少なくとも１種のＳ媒体により形成されたスペーサー（Ｓ）ゾーンを更に備えるように、構成されてよい。

これらの器具は、フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ ＩＴＰ）により、少なくとも１種の関心対象の被検体を被検体組成物から分離するために構成される。

好ましい実施態様において、この器具は、それを通り媒体類がチャンバー内に導入される少なくとも５個の注入口を備える、電気泳動チャンバーを含み、ここで２個の隣接する「ａ」注入口は、「Ａ」注入口の内側口径Ｄと比べ、最大でも係数０．８の内側口径ｄを有する。更に、少なくとも１個の「Ａ」注入口は、該２個の「ａ」注入口と各電極の間に位置し；並びに、該２個の隣接する「ａ」注入口の間の距離は、最大でも「Ａ」注入口の対の間の距離の係数０．８である。加えて、該２個の隣接する「ａ」注入口の間の距離は、最大でも「ａ」注入口と「Ａ」注入口の間の距離の係数０．８である。

図１ａ及び１ｂは、米国特許第3,705,845号：ITP separation of anions in a capillary (free-solution capillary) electrophoresisに開示された、等速電気泳動（ＩＴＰ）実施態様の、出発状態（図１ａ）、及び電気泳動分離の開始後の時点（図１ｂ）である。米国特許第3,705,845号において、リーディング電解質（Ｌ）、ターミネーティング電解質（Ｔ）、試料ゾーン（Ｓ）、及び対イオンＲが、一般に規定されている。 図２ａ及び２ｂは、前記先行技術において実施される、ＩＴＰ出発状態（図２ａ）及び分離時（図２ｂ）の概略図である。試料及びスペーサー（Ｓ＆Ｓ）は混合され、この混合物は、リーダー電解質ゾーンとターミネーター電解質ゾーンの間に導入された。 図３は、例示的ＦＦＥ分離チャンバーにおいて実行される、概略的ＦＦ ＩＴＰ分離である。 図４ａから４ｃは、図３に示された区域Ａ、Ｂ及びＣの状態の概略図である。区域Ａ（図４ａ）：導入された電解質及びスペーサー電解質を示す、最初の出発状態。本明細書に説明されたように、第一の（右側）電極と第二の（左側）電極の間の分離スペースは、Ｌ安定化ゾーン（ｃｏｎｃ．Ｌ）、リーダー電解質（Ｌ）ゾーン、スペーサー電解質（Ｓ）ゾーン（スペーサーＳ１、Ｓ２、及びＳ３を含む）、濃縮されたターミネーター電解質Ｔゾーン（Ｔ_conc.）及び係数Ｘだけ希釈されている希釈されたＴゾーン（Ｔ_conc.／Ｘ）を含む。区域Ｂ（図４ｂ）：一旦試料が図４ａに示されたような電解質の流れに添加された、分離スペースを示す状態。この時点で、試料導入ポート（１４）は、第一電極と第二の電極の間に位置し、並びに試料イオンＳ１及びＳ２を含む試料は、分離媒体へ導入される。一部の実施態様においては、区域Ｂで、電界は既に確立されているが、別の実施態様においては、電界は、試料が区域ＢとＣの間に位置した直後に確立される。区域Ｃ（図４ｃ）：第一電極と第二電極の間に印加された電界から生じた等速電気泳動の移動及びスタッキング作用を表す状態。この状態は、先に定義されたような、Ｌ、試料イオン（Ａ１及びＡ２）、スペーサーイオン（Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３）、Ｔ_conc.、Ｔ_conc.／Ｘ、及びＴ_{s dil}（強力に希釈された）の適切な選択及び配置により形成される。本発明のある実施態様において、ターミネーター電解質Ｔ_{s dil}ゾーンは、Ｔ_{s dil}ゾーン内のターミネーターＴの濃度が、Ｔ_conc.／Ｘゾーン内のＴ_conc.／Ｘの濃度よりも更に低いように形成される。ターミネーター電解質ゾーンＴの濃度は、コールラウシュ式により、リーダー及び試料電解質ゾーンの濃度により決定される。 図５は、フリーフロー等電点電気泳動（ＦＦ ＩＥＦ）、フリーフローゾーン電気泳動（ＦＦ ＺＥ）又はフリーフロー等速電気泳動（ＦＦ ＩＴＰ）を実行するために、当該技術分野において使用される器具の概略図である。 図６は、ＦＦＥ器具内で媒体注入口を分離するために、当該技術分野において使用される分離装置である。 図７は、本発明のＦＦ ＩＴＰ法を実行するのに適した新規分離装置の概略図である。 図８は、連続モードで実行された本発明の最適化されたＦＦ ＩＴＰ分離における各ｐＩ−マーカーの分布を可視化する、λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ、及び５９５ｎｍでの、ＦＦＥ画分の吸光度により表されたＦＦＥ溶出プロファイルである。ｐＩマーカーは、試料として導入した。 図９は、典型的ＩＴＰプロトコールで実行されたＦＦ ＩＴＰ分離（本発明の最適化されたＦＦ ＩＴＰ法において使用されたものと同じｐＩマーカー、リーダーイオン、スペーサーイオン、及びターミネーターイオンを使用）における各ｐＩ−マーカーの分布を可視化する、λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ、及び５９５ｎｍでの、ＦＦＥ画分の吸光度により表されたＦＦＥ溶出プロファイルである。 図１０は、ペルオキシソームを含有する試料のＦＦ ＩＴＰ溶出プロファイルである。ペルオキシソームを含有する画分は、λ＝４２０ｎｍでＦＦ ＩＴＰ画分の吸光度を測定することにより同定した。 図１１は、実施例２に従いＦＦ ＩＴＰ分離した後の、ペルオキシソームの電子顕微鏡写真（×４６４６）である。

発明の詳細な説明
本発明は、例えば、フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ ＩＴＰ）及びキャピラリー等速電気泳動を含む等速電気泳動（ＩＴＰ）による、粒子の分離又は分画に有用である有利な方法を提供する。この改善された電気泳動法は、当該技術分野において公知の先行するＩＴＰ法では分離することができなかった粒子をうまく分離することを可能にする。本発明のＩＴＰ分離法は概して、任意の電気泳動適用で実行することができるが、新規方法は、キャピラリー電気泳動及びフリーフロー電気泳動に特に適していると考えられる。

従って本発明の一態様は：
少なくとも１種のＴ媒体により形成された、ターミネーター電解質（Ｔ）ゾーン；
少なくとも１種の希釈されたＴ媒体により形成された、希釈されたＴゾーン；
少なくとも１種のＬ媒体により形成された、リーダー電解質（Ｌ）ゾーン；及び
少なくとも１種のＬ安定化媒体により形成された、Ｌ安定化ゾーン；を備え、並びに
任意に少なくとも１種のＳ媒体により形成された、スペーサー（Ｓ）ゾーン：を更に備える、
電気泳動チャンバー内の電極のセット間に分離ゾーンを形成し、ここで少なくとも１個の電極は陰極であり、及び少なくとも１個の電極は陽極であること；を含む、新規電気泳動法に関する。

任意に本方法は、試料又は少なくとも１種の関心対象の被検体が電気泳動チャンバーへ導入されることを更に含んでよい。

好ましい実施態様において、本方法は、等速電気泳動（ＩＴＰ）により、少なくとも１種の関心対象の被検体を、被検体組成物から分離することである。

本発明に従い、分離されるべき被検体（類）を含有する試料は、異なる媒体間に平衡状態が確立される前に、スペーサー媒体と一緒に電気泳動チャンバーへ導入されてよい。しかし好ましい実施態様において、例えば、新規方法がＦＦ ＩＴＰ分離として実行される場合、試料は、異なる媒体の平衡状態が既に確立された後などに、様々な媒体の導入ポイントの下流で分離チャンバーへ導入されてよい。別の言い方をすると、試料は、スペーサー又は更なる分離媒体と一緒には導入されないが、むしろ異なる媒体の平衡状態が既に確立された後で導入される。ある実施態様において、試料は、実際の分離領域（すなわち、電極間に電界が存在する場所）へ導入される。

これに関して、試料は一般に、媒体注入口と実際の分離領域（すなわち、電極間に電界が存在する場所）の間の位置に導入されてよいか、又は該電界内に直接配置することができることは理解されるであろう。

加えて、ＦＦ ＩＴＰについて好ましくは、試料は、本発明の分離ゾーン内の異なるゾーンの配列に応じて、バルク流れ方向に対し垂直に異なる位置に導入することができることが注目される。従って、試料は、Ｓゾーンへ導入されるか、又は代わりにＳゾーンと希釈されたＴ電解質ゾーンの間に導入されてよい。試料は、希釈されたＴゾーンへ、ＳゾーンとＬゾーンの間へ、又はＬゾーンへ導入されてもよい。

しかし試料は、ＦＦ ＩＴＰ分離を実行するのに適した器具の２個の電極の間の、媒体注入口と実際の分離ゾーンの間に位置に導入されることが好ましい。

本発明のＩＴＰ法は、分離ゾーン内で、又は分離ゾーンから被検体が溶出した後、及び任意に少なくとも１種の画分が分離チャンバーから排出した後のいずれかで、少なくとも１種の関心対象の被検体を引き続き分析するために、並びに任意に１つ又は複数の画分中の関心対象の被検体の少なくとも一部分を回収するために適している。

フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ ＩＴＰ）に関する本発明の一般的実施態様は、図３及び４に示されている。

図３は、ＦＦＥ分離チャンバーにおいて実行されるＦＦ ＩＴＰ分離の概略図である。該分離チャンバー（２）は、第一電極（６）及び第二電極（８）の側方に位置した分離ゾーン（４）を備える。分離媒体注入口ポート（１０）は、チャンバー（２）の第一端に位置し、及び流出口ポート（１２）は、例えば反対側の端に位置する。試料注入口（１４）は、２個の電極の間の分離ゾーンとの流体連絡路内に配置され、加えて媒体注入口ポート（１０）と流出口ポート（１２）の間に縦方向に（電極に対し平行に）、好ましくは流出口ポート（１２）よりも媒体注入口ポート（１０）により近く配置される。試料注入口（１４）が試料を、電極（６及び８）の間に形成された電界の前方又は電界内のチャンバー（２）へ導入することができるように、該試料注入口が配置されてよいことは理解されるであろう。面Ａ、Ｂ及びＣを通る断面は、図４ａから４ｃに概略的に説明されている。

図３に示された面Ａ、Ｂ及びＣを通る断面は、図４ａ、４ｂ及び４ｃに示されている。本質的に、図４ａは、試料を導入する前にチャンバーへ導入される分離媒体の最初の出発状態を示している。図４ｂは、スペーサー（Ｓ）ゾーンへの試料導入ポート１４（図３参照）のすぐ下流での分離状態を示す。この試料導入ポートは、試料を分離媒体へ導入するように、個別のポンプにより独立して制御されることが好ましい。図４ｃは、電界の印加後の状況を示し、図４ｂに示された状態と比べた場合に、ＦＦ ＩＴＰ電気泳動状態の進展を明らかにしている。図４ｃに示されるように、試料「スタッキング」は既に起こっている。

本発明の実施態様を使用する陰イオン分離に関して、図３の電極（８）は陽極であり、及び電極（６）は陰極であり、各々電位を持つ。本発明の実施態様を使用する陽イオン分離に関して、図３の電極（８）は陰極であり、及び電極（６）は陽極である。従って本発明の様々な実施態様を用い、以下により詳細に説明されるように、関心対象の被検体の電荷に応じ、陰イオン及び陽イオンの両方の分離を行うことができる。

本発明のＩＴＰ法における新規緩衝されかつイオン化されたターミネーター電解質（Ｔ）媒体、希釈され緩衝されかつイオン化されたＴ媒体、及び緩衝されたリーダー電解質（Ｌ）媒体の使用は、当該技術分野において公知のＩＴＰ法と比べいくつかの利点を提供する。

例えば、ＦＦ ＩＴＰ分離時の異なるゾーンのより良い分解、従ってより良い分離は、ここで本発明の内容を利用し実現することができる。更に本発明の少なくとも１種のＴ媒体、少なくとも１種の希釈されたＴ媒体及び少なくとも１種のＬ媒体の使用は、ＩＴＰ分離を実行するのに適した器具の電極間の分離ゾーンの幅全てにわたり本質的に一定のｐＨを提供する。同じく本発明に従い、緩衝されかつイオン化されたＴ媒体の使用は、当該技術分野において公知の方法と比べた場合、ターミネーターゾーンのより高い伝導度の利点に繋がり、希釈されたＴ媒体の導入は、Ｔゾーンとスペーサー又は試料ゾーンの界面での電気伝導度の不連続性を著しく低下する。これらの有利な媒体の使用、並びに異なる媒体内のリーダーＬ化合物、ターミネーターＴ化合物及び緩衝化合物の濃度の調節は、当業者が、全分離ゾーンにわたる希釈されたＴゾーン、Ｓゾーン及びＬゾーンを通じて、本質的に一定の伝導度及び／又はｐＨを実現すること、従って本出願において明らかにされたように被検体の増強された分離を実現することを可能にする。

本発明のＩＴＰ法は、電気泳動移動度比（Ｖ_L：Ｖ_T）＜１７を有するリーダーイオン及びターミネーターイオンの使用を可能にする。本発明の別の利点は、５％未満、更には３％未満のそれらの電気泳動移動度の差を有する被検体であっても、本明細書に説明されたＩＴＰ法によりうまく分離することができることである。

本出願の文脈において用語「分離する」及び「分離」は、２種又はそれよりも多い被検体の混合物の、それらの電界内での異なる挙動を基にした、何らかの空間的区分を意味することが意図される。従って分離は、試料に含まれるある画分又は被検体の分画、特異的及び選択的豊富化又は枯渇、並びに濃縮及び／又は単離を含むが、これらに限定されるものではない。しかし本発明の文脈において、分画は一般に、他の被検体が電気泳動工程時に更に分離されるかどうかに関わりなく、試料内のある被検体が残りの被検体から区分又は豊富化されることを意味すると理解されることは明らかであろう。用語「分画」と「分離」の間に明確な区別はないが、「分離」は試料中の様々な被検体のより細かい又はより詳細な空間的区分を意味することは、容易に明らかであろう。従って本出願が用語「分離する」又は「分離」に言及する場合、これらは分離、分画、単離、豊富化、又は枯渇を含む前述の意味の少なくともひとつを含むことが意図される。しかし好ましい実施態様においては、関心対象の被検体が試料中の他の粒子又は種から単離される。

本発明の文脈において用語「溶出する」は、等速電気泳動分離が実行される電気泳動チャンバーの電極間の分離ゾーンからの被検体の除去又は廃棄に関するのに対し、用語「排出する」は、電気泳動チャンバーからの被検体の除去を意味する。

分離は原則として、分取的方法で実行され、その結果ある画分は引き続き収集もしくは回収されるか、又はある画分中の関心対象の被検体もしくはその存在が、好適な手段により単に検出されるが例えば更なる使用のために収集されない場合には、単に分析的に実行されてよい。

本出願において使用される用語「ある（ａ）」は、「ひとつ」、「少なくとも１る」又は「１つ又は複数」を意味すると理解されるべきである。

本明細書において使用される用語「試料」は、少なくともその一部は本発明の電気泳動分離に供される任意の組成物をいう。典型的には、試料は、少なくとも１種の関心対象の被検体を含むか又は含むことが疑われる。

用語「関心対象の被検体」、「関心対象の分子」及び「分離されるべき被検体」は、本明細書において区別なく使用され、分離、単離、検出、定量、又はそうでなければ試験、研究もしくは分析されるべき、分子又は粒子を示す。「関心対象の被検体」は、分離、単離、検出、定量、試験、分析などの前に同定されることを常に必要とはしないことは明らかであろう。本発明に従い分離することができる関心対象の被検体の非限定的例は、細胞、ウイルス、ウイルス粒子、細胞小器官、リポソーム、ホルモン、セルロース誘導体、抗体、抗体複合体、タンパク質凝集体、タンパク質複合体、タンパク質、親油性タンパク質、酸性タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡ、膜、膜断片、脂質、ナノ粒子、糖質及びそれらの誘導体、多糖及びそれらの誘導体、並びにそれらの混合物などの、生体粒子、生体高分子及び生体分子である。

一部の好ましい実施態様において、関心対象の被検体は、細胞、細胞小器官、酸性タンパク質、親油性タンパク質、又はナノ粒子である。

更に本発明のある実施態様に従い分離することができる無機分子又は有機分子は、帯電したポリマー又は錯体、ポリ酸、調合薬、プロドラッグ、薬物の代謝産物、毒素、発癌物質、毒物、アレルゲン、感染性物質などであってよい。

本明細書において使用される用語「細胞小器官」は、細胞内に位置したインビボにおいて特定されたサブユニットを意味する。ある実施態様において、そのような細胞小器官は、特異的機能を有することができ、及び／又はそれら自身の脂質膜内に個別に封入されてよい。用語「細胞小器官」は、「細胞コンパートメント」と同義であると理解されるべきである。本発明の細胞小器官の非限定的例は、ミトコンドリア、葉緑体、小胞体、ゴルジ装置、核、液胞、リボソーム、小胞、ペルオキシソーム、核小体、ペアレンソソーム、マイトソーム、メラノソーム、グリコソーム、グリオキシソームなどである。

本明細書において使用される用語「親油性タンパク質」は、少なくとも１つの親油性部分を有するタンパク質をいう。インビボにおいてファンデルワース力により膜と相互作用することが可能である膜会合したタンパク質は、親油性タンパク質の典型であるが非限定的な例である。任意に親油性タンパク質は、例えば膜の極性ヘッド基と相互作用する、極性基又はイオン基を含むタンパク質を包含してよい。非限定的例は、Ｋ−セグメントを含むデヒドリン又は受容体である。受容体分子は、当該技術分野において認められており、かつ一般に細胞外ドメイン、細胞内ドメイン及び／又は膜貫通ドメインを含む。

本明細書において使用される用語「ナノ粒子」は、用語「ナノ粉末」、「ナノクラスター」又は「ナノ結晶」も含む。用語「ナノ粒子」は、少なくとも１つの寸法が約１２０ｎｍ未満である顕微鏡粒子をいう。当業者は、ナノ粒子はバルク材料(bulk material)と原子又は分子構造の間の効果的な橋であることを理解するであろう。該ナノ粒子は、バルク材料に対し多くの特別な特性を示す。例えば、バルク銅の曲げ（ワイヤ、リボンなど）は、約５０ｎｍスケールでの銅原子／クラスターの運動で生じる。５０ｎｍよりも小さい銅ナノ粒子は、バルク銅と同じ鍛造性及び延性を示さない超硬質材料と考えられる。このサイズ範囲の下限では、ナノ粒子は、クラスターと称されることが多い。ナノスフェア、ナノロッド及びナノカップは、当該技術分野において作製された極いくつかの形状である。金属、誘電体、及び半導体のナノ粒子、更にはハイブリッド構造（例えばコア−シェル型ナノ粒子）、半−固形及び軟質ナノ粒子は、本発明に従い分離することができる。半−固形の性質のプロトタイプ的ナノ粒子は、例えばリポソームである。そのようなナノ粒子は、薬物担体として、又は造影剤として生体医学適用において使用されてよい。例えば様々な種類のリポソームナノ粒子が、抗癌剤及びワクチンのための送達システムとして、現在臨床で使用され、かつ本発明の方法に従い分離されてよい。

本明細書において使用される用語「ターミネーター電解質」又は「ターミネーター」は、分子及び／又はそれらに由来した帯電した化学種をいう。明白に、ターミネーター分子又はそれらに由来した帯電した化学種は両方とも、関心対象の被検体の電気泳動移動度（ＥＭ）よりも低いように規定されているＥＭを有する。

本発明の好ましい実施態様において、該ターミネーターＴの少なくとも一部は帯電され、すなわち帯電した化学種（イオン）は、例えば、帯電した化学種及びその対イオンへの解離によるか、プロトン化によるか、又は脱プロトン化により、該ターミネーターに由来してよい。分離の問題点及び被検体が正又は負帯電したかどうかに応じて、これらの化学種が陰極へと移動する陽イオンＩＴＰと、溶液中の化学種が陽極へ移動する陰イオンＩＴＰの間で区別されなければならない。従って、陽イオンＩＴＰにおいて、ターミネーターＴの少なくとも一部は陽イオン性（正帯電した）化学種であり、後者の陰イオンＩＴＰの場合、ターミネーターＴの少なくとも一部は陰イオン性（負帯電した）化学種である。

本発明のある実施態様において、ターミネーターＴは、酸、塩基、塩、又は任意の化合物であってよく、これらは本発明のＩＴＰ分離の実行に適した条件下で、少なくとも部分的に帯電されている。より好ましい実施態様において、ターミネーターＴは緩衝化合物である。ターミネーターＴは一般に、リーダーＬ、スペーサー化合物、又は被検体と比べ、ＩＴＰを実行するのに適したシステム内の全て（部分的に）帯電した化学種の最低の電気泳動移動度（ＥＭ）を有することは理解されなければならない。明白に、前述の化合物のひとつのＥＭを最低又は最高のＥＭとして規定する場合に、Ｈ⁺及びＯＨ^-のＥＭは考慮されない。電気泳動移動度ＥＭ（又はμ_e）は、以下：
μ_e＝Ｖ／Ｅ
の粒子速度（Ｖ）と電界強度（Ｅ）の間の係数として定義される。

フリーフロー等速電気泳動の文脈において、本明細書において使用される用語「Ｔ媒体」は、ターミネーターＴ及び各々、少なくとも１種の強酸又は強塩基を含む媒体に関する。古典的（例えばキャピラリー）ＩＴＰにおいて使用されるターミネーター化合物は、それらの低い電気伝導度及び低い緩衝能のために、フリーフローＩＴＰには適していないことは理解されなければならない。

従って本発明の陰イオンＩＴＰ分離を実行するのに適したＴ媒体は、ターミネーターＴのＥＭは関心対象の被検体のＥＭよりも低いという条件で、ターミネーターＴを含み、並びに加えて強塩基（例えばＮａＯＨ）を含む。任意にこの媒体は更に、添加剤を含んでよい。ターミネーターＴは通常、緩衝酸から選択され、ここで該緩衝酸のｐＫａは、陽極のリーダー媒体の緩衝塩基のｐＫａよりも高いことが好ましい。Ｔ媒体へ添加された強塩基の濃度は、好ましくは、同じ媒体内の緩衝酸の濃度よりも低いが、望ましい高伝導度を実現するために高度のイオン化を確実にするのに十分な程高い。好ましくは、強塩基は、アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物である。より好ましい実施態様において、強塩基は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）又は水酸化カリウム（ＫＯＨ）である。

当業者は、ターミネーターＴは、好ましい分離条件に従い選択されることを理解するであろう。好ましい実施態様において、Ｔ媒体のｐＨは、ＴのｐＫａとほぼ等しく、すなわちターミネーターＴは好ましくは、そのｐＫａ値が、Ｔ媒体の好適な緩衝能を実現するために、意図されたＴ媒体のｐＨと合致するように選択される。従って、該強塩基の濃度は、Ｔ媒体内のＴの濃度よりも係数約１．０〜４．０、好ましくは係数約１．２〜３．０、より好ましくは係数約１．８〜２．２だけより小さいことが好ましい。更により好ましい実施態様において、該強塩基の濃度は、該ターミネーターＴの最大緩衝能を実現するために、Ｔ媒体内のＴの濃度よりも係数約２だけより小さい。

ＨＥＰＥＳ及びモルホリノエタノールのような、ＩＴＰを実行するのに適したＴ化合物は一般に当業者に公知である。本明細書に示された技術と一緒に、当業者は、本発明のＩＴＰ分離を実行するのに好適なターミネーターＴを選択することができるであろう。

本発明の陽イオンＩＴＰを実行するのに適したＴ媒体は、ターミネーターＴ、及びギ酸、塩酸又は硫酸などの強酸を含むであろう。任意にＴ媒体は、添加剤を更に含んでよい。好ましい実施態様において、Ｔ媒体のｐＨは、ＴのｐＫａとほぼ等しく、すなわちターミネーターＴは、そのｐＫａが、Ｔ媒体の好適な緩衝能を実現するために意図されたＴ媒体のｐＨと合致するように選択されることが好ましい。酸性Ｔ媒体に添加される強酸の濃度は、同じ媒体中の緩衝塩基の濃度よりも低いが、所望の高伝導度を実現するために高度のイオン化を確実にするのに十分な程高いことが好ましい。Ｔ媒体の良好な緩衝能を実現するために、該強酸の濃度は、Ｔ媒体内のＴの濃度よりも係数約１．０〜４．０、好ましくは係数約１．２〜３．０、より好ましくは係数約１．８〜２．２だけより小さいことが最も好ましい。更により好ましい実施態様において、該強酸の濃度は、該ターミネーターＴの最大緩衝能を実現するために、Ｔ媒体内のＴの濃度よりも係数約２だけより小さい。

再度当業者は、本発明のＩＴＰ分離を実行するのに適したターミネーターＴを選択する方法を理解するであろう。本発明のＴ媒体及び希釈されたＴ媒体の各々の有利な特徴のために、これらは特にＦＦ ＩＴＰ分離に有用である。

本明細書において使用される用語「希釈されたＴ媒体」は、媒体全体が希釈されている「Ｔ媒体」に関連しているか、又はターミネーターＴ及び強塩基もしくは強酸が各々、「Ｔ媒体」の緩衝液システムの濃度と比べ希釈されている媒体に関連してよいが、抗酸化剤、増粘剤などの更なる添加剤が、対応するＴ媒体中と同じ濃度で希釈されたＴ媒体中に存在してもよく、又は任意に別の比で希釈されてもよい。

好ましい実施態様において、希釈されたＴ媒体中のＴの濃度は、隣接するＴ媒体中のＴの濃度よりも係数約２〜係数２０、好ましくは係数約３〜係数１０、より好ましくは係数約５〜係数８だけより小さい。

希釈されたＴ媒体の使用は、本明細書において規定されたような有効な分離ゾーンと隣接する境界を提供し、これは隣接する媒体類の電気伝導度の突然の増加を避けるという利点を提供する。従って例えば先行技術の方法において認められるような異なる媒体類又は異なる電界強度により引き起こされる熱作用などの、異なるゾーン間の攪乱は、本明細書に説明されたような希釈されたＴ媒体を使用することにより最小化することができる。

用語「スペーサーＳ媒体」は、化合物が、関心対象の被検体（類）のＥＭにほぼ相当するＥＭを有するような化合物又は化合物の組成物に関する。そのようなスペーサー化合物及びそれらの電気泳動移動度は一般に、当該技術分野において公知であり、かつ当業者は、分離の問題点に応じて好適なスペーサー化合物を選択する方法を知っているであろう。スペーサーとして使用することができるいくつかの例証的化合物は、ＡＣＥＳ、酢酸、アスパラギン酸、α−ヒドロキシ−酪酸、ＥＰＰＳ、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、ＨＥＰＥＳ、乳酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ピコリン酸、ピバル酸、ＰＯＰＳＯ、プロピオン酸、ピリジンスルホン酸などである。一般に分離される被検体と相溶性がある任意の化学物質が、ＥＭ値が典型的には約５〜４０×１０^-9×ｍ²×Ｖ^-1×ｓｅｃ^-1の範囲内である場合に使用されるが、スペーサーのＥＭ値は常に実際の関心対象の被検体（類）のＥＭに左右されることは理解されるであろう。

分離の問題点の必要要件に、ｐＨ及び／又は電気伝導度のようなＳ媒体のある化学種の特性を適合させることが一般に好ましい。従って一部の好ましい実施態様において、（強）酸又は（強）塩基を添加し、Ｓ媒体を意図された分離条件に適合させることができる。任意にＳ媒体は、更なる添加剤を含有してよい。

本明細書において使用される用語「リーダー電解質」又は「リーダー」は、帯電した化学種（イオン）、並びに該帯電した化学種が、例えば該化合物の帯電した化学種及びその対イオンへの解離によるか又はプロトン化／脱プロトン化に由来する化合物をいう。定義によりリーダーＬは、ＩＴＰを行うのに適したシステム内の全ての帯電した化学種で最高のＥＭを有し、すなわちそのＥＭは、ターミネーター化学種、任意のスペーサー化合物、及び関心対象の被検体のＥＭよりもより高いであろう。明白に先に言及されているように、Ｈ⁺及びＯＨ^-のＥＭは、分離チャンバー内の最低又は最高のＥＭとして前述の化合物のひとつのＥＭを規定する場合には、考慮されない。

ターミネーターＴの場合のように、関心対象の被検体に加え、リーダーイオン、スペーサーイオン及びターミネーターイオンが陰極に向かって移動する陽イオンＩＴＰと、溶液中の化学種が陽極に向かって移動する陰イオンＩＴＰの間は区別されなければならない。従って陽イオンＩＴＰにおいて、リーダーＬは陽イオンであり、陰イオンＩＴＰにおいて、リーダーＬは陰イオンである。好ましくはリーダーＬは、強塩基又は強酸に由来するが、高いＥＭを持つイオンを提供する塩のような他の給源も、本発明の状況において可能である。

本明細書において使用される用語「Ｌ媒体」は、一般に、リーダーＬ（但しリーダーＬのＥＭは、関心対象の被検体及びスペーサーのＥＭよりも高いことを条件とする）及び該リーダーＬの対イオンを含む媒体に関する。

陰イオンＩＴＰ分離のひとつの好ましい実施態様において、リーダーＬは、ＨＣｌ又はＨ₂ＳＯ₄などの強酸に由来し、すなわちリーダーＬは、塩化物イオン又は硫酸イオンである。一般に、各強酸又は本発明のＩＴＰ分離の作業条件下で負帯電したイオンを生じる化合物は、陰イオンリーダー電解質として作用するのに適している。

陽イオンＩＴＰ分離の好ましい実施態様において、リーダーＬは、アルカリ水酸化物又はアルカリ土類水酸化物などの強塩基に由来する。リーダーＬが由来する給源に関わりなく、陽イオンＩＴＰ分離のリーダーＬは、アルカリ金属又はアルカリ土類金属のイオンであることが好ましい。最も好ましくは、例えば生物学的試料に関して、リーダーＬは、ナトリウム（Ｎａ⁺）又はカリウム（Ｋ⁺）である。

前述の強酸又は強塩基に加え、本発明のＬ媒体は加えて、緩衝化合物を含有することが最も好ましい。この緩衝化合物は、リーダー電解質が強塩基である（すなわち陽イオンＩＴＰ分離）場合は、緩衝酸であってよく、もしくはリーダー電解質が強酸である（すなわち陰イオンＩＴＰ分離）である場合は、緩衝塩基であってよい。該緩衝化合物は、必要ならば、リーダーゾーンのｐＨを、本質的にＳゾーンのｐＨ値に調節するために適している。この緩衝化合物は、好ましいｐＨ及び／又は関心対象の被検体の生物活性を保存する能力のような好ましい分離条件に従い選択されることは理解されなければならない。任意にリーダー媒体は、更なる添加剤を含有してもよい。

本発明のある好ましい実施態様において、緩衝化合物の濃度は、該強酸のプロトン又はＬが由来する該強塩基から誘導された水酸化物イオンの濃度よりも、係数約１．０〜４．０、好ましくは係数約１．２〜３．０、及びより好ましくは係数約１．８〜２．２だけより高い。特に好ましい実施態様において、緩衝化合物の濃度は、各々、該強酸のプロトン又は該塩基の水酸化物イオンの濃度よりも、係数約２だけより高い。例えば、緩衝塩基の濃度は、塩化物イオンがＬである場合は、ＨＣｌの濃度の２倍であるか、又は緩衝塩基の濃度は、Ｈ₂ＳＯ₄の濃度（硫酸イオンがＬである場合）の４倍である。

リーダー電解質（リーダーＬ及びその対イオン）の濃度は、本発明のＩＴＰ分離を実行するために必要な好適とされる高い電気伝導度を確実にするように選択されることが好ましいことは、更に理解されなければならない。

本明細書において使用される用語「緩衝化合物」は、各々、本発明のＩＴＰ分離を実行するのに適しているｐＨとほぼ等しいｐＫａを有する弱酸又は弱塩基などの化合物として理解される。従って、用語「緩衝酸」及び「緩衝塩基」は、好ましくは、各々、弱酸又は弱塩基を含み、ここでｐＫａ値は、ＩＴＰ分離の試料及び分離媒体のｐＨとほぼ等しい。

従って本発明のひとつの好ましい実施態様において、Ｌ媒体のｐＨは、ＩＴＰ分離が陰イオンＩＴＰ分離である場合、緩衝塩基のｐＫａ値とほぼ等しいか、又はＩＴＰ分離が陽イオンＩＴＰ分離である場合、緩衝酸のｐＫａ値とほぼ等しい。

本発明のＬ媒体内のＬの好ましい濃度は、最大でも約５０ｍＭ、最大でも約１０ｍＭ、最大でも約５ｍＭ、最大でも約３ｍＭ、最大でも約２ｍＭ、及び最大でも約１ｍＭからなる群より選択されるが、これらに限定されるものではない。Ｌの濃度、従ってリーダー電解質の濃度の上限は、事実上、リーダー媒体内の緩衝化合物の有限の溶解度の観点から制限されることが多く、その理由は該緩衝化合物は好ましくは、リーダー電解質の濃度と比べＬ媒体のより高い濃度を有し、並びに以下に説明されるようにＬ安定化媒体において増加さえすることがあるからである。

本発明の新規方法は、少なくとも１種のＬ安定化媒体の使用を含む。従って用語「Ｌ安定化媒体」は、ＦＦ ＩＴＰ分離を実行するのに適した器具内に、Ｌ安定化ゾーンを形成することが可能な媒体をいう。その高い電気伝導度により、Ｌ安定化媒体は本質的に、被検体及びリーダーＬが、ＦＦ ＩＴＰ分離時に移動し電極と接触することを防ぐ。

Ｌ媒体と比較してＬ安定化媒体内の増大した伝導度は、例えば帯電した化学種Ｉの添加により実現される（ここでＩは、Ｌが負帯電されている場合には、負帯電し、その逆もまた同様である）。帯電した化学種Ｉは、典型的にはＬに使用されるものと同じ対イオンであるべきその対イオンと一緒に提供され、すなわちこの対イオンは典型的には緩衝化合物に由来する。あるいは、Ｌ安定化媒体内の伝導度の増加は、緩衝化合物の濃度の増加によるか、又は隣接するＬ媒体内のＬの濃度と比べＬ安定化媒体内の各々それからＬが由来する強酸もしくは強塩基の濃度の増加により、達成される。

本発明の状況において理解される帯電した化学種Ｉは、ＬのＥＭとほぼ等しいＥＭを有さなければならない。しかしＩのＥＭは、関心対象の被検体のＥＭよりも依然より高いことを条件として、ＬのＥＭよりも低いことができることは理解されるであろう。従って本発明の一部の実施態様において、ＩのＥＭは、ＬのＥＭの少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％であり、最も好ましくはＬのＥＭとほぼ等しい。Ｌ／Ｉシステムの非限定的例は、Ｌ媒体内のリーダーＬが塩化物イオンであり、及びＬ安定化媒体内の帯電した化学種Ｉがギ酸イオン(formiate)である。

Ｌ及び少なくとも第二の帯電した化学種Ｉの組み合わせが、Ｌ安定化媒体の伝導度の増加に適していることも理解される。

本発明の好ましい一実施態様において、Ｌ安定化媒体は、リーダーＬを含まない。このような媒体において、Ｌは、完全にＩと置き換えられており、更にＩの濃度は、隣接するＬ媒体内のＬの濃度に関して増加する。

先に説明したように、Ｌ安定化媒体内の増加する伝導度は、例えばＬの濃度の増加及び／又は帯電した化学種Ｉの添加により達成されてよい。

従って本発明の好ましい実施態様において、Ｌ安定化媒体内のＬの濃度、Ｉの濃度、又はＬ及びＩの組み合わせの濃度は、隣接するＬ媒体内のＬの濃度よりも、少なくとも係数２、少なくとも係数３、好ましくは少なくとも係数５、より好ましくは少なくとも係数１０、又は少なくとも係数１５、又は更には少なくとも係数２０だけより高い。

Ｌ安定化媒体の典型的伝導度は、電気泳動チャンバーの分離ゾーン内のＬゾーンを形成する隣接するＬ媒体の伝導度と比べ、少なくとも係数２、３、５、１０、１５、２０、３０だけ又は更にはそれよりも高く増加され得る。一部の実施態様において、Ｌ安定化媒体の伝導度は、隣接するＬ媒体の伝導度よりも係数約１５、又は更には係数２０だけより高いことは利点である。

Ｌ安定化媒体の伝導度は一般に、Ｌ媒体の伝導度よりも高いが、Ｌ安定化媒体のｐＨは、隣のＬ媒体のｐＨよりも高いか、ほぼ等しいか、又はより低くてよい。典型的には、Ｌ安定化媒体のｐＨは、Ｌ媒体のｐＨと本質的に同じであるように適合される。任意にＬ安定化媒体は、更に添加剤を含んでよい。

特にＦＦ ＩＴＰについて、１種又は複数の本質的に同じ媒体は、本発明の「ゾーン」を形成することができ、すなわち電気泳動チャンバー内のゾーンは、１個の媒体注入口を通り該器具へ導入される１種の媒体によるか、もしくは１個よりも多い媒体注入口を通り該器具へ導入される媒体により、形成することができるか、又はこれは、複数の本質的に同様の媒体により形成することができる。本明細書において使用される用語「本質的に同様の媒体」とは、複数の媒体の状況において、各媒体内の全ての化合物の濃度が、単に測定誤差又は希釈誤差により異なっていると理解されるべきである。従ってＩＴＰ実験の開始時の（すなわち電気泳動分離の開始時の）ゾーンは、分離チャンバー内のゾーンを通じて本質的に同じ濃度で本質的に同じ化合物を含むことにより規定される。

２種の異なるゾーンが接触した後、各ゾーンの化合物の「配合」又は混合が、該ゾーンの境界で生じることは理解されるであろう。本発明に従い、Ｔゾーン及び希釈されたＴゾーンは各々、従って少なくとも主にターミネーターＴを含み、Ｓゾーンは、少なくとも主にスペーサーＳを含み、Ｌゾーンは、少なくとも主にリーダーＬを含み、及びＬ安定化ゾーンは、少なくとも主にリーダーＬ、帯電した化学種Ｉもしくはそれらの任意の組み合わせを含むであろう。この文脈で使用される「主に」とは、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、又は更には９５％も意味し、媒体（すなわち媒体に使用される溶媒、典型的には水に加え）中に存在する化合物Ｌ、Ｔ及びＳの重量百分率を意味する。

ゾーンの規定及び境界は、ＩＴＰ−関連成分Ｔ、Ｓ及びＬを意味することは理解されるであろう。緩衝化合物、増粘剤などの更なる化合物は、任意の好適な濃度で各ゾーンに独立して存在してよい。

更に本発明のゾーンは、該ゾーンの化合物が電界に供される場合、すなわち新規ゾーンが確立される場合、いくつかのサブ−ゾーンに分割されてよい。例えばフリーフローＩＴＰにおけるそのようなゾーンの断片化は、図２に図示されている。図２ａは、Ｓ＆Ｓゾーン内に均一に分布されている３種の異なるスペーサーＳ１、Ｓ２及びＳ３並びに２種の被検体Ａ１及びＡ２を含むスペーサー及び試料媒体からなるＳ＆Ｓゾーンを示している。電界に供される場合、５つの新たなゾーンが形成され、ここで各ゾーンは独立して、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ａ１及びＡ２の各ＥＭに応じて、各々、主にＳ１、主にＡ１、主にＳ２、主にＡ２及び主にＳ３を含む。

用語「分離チャンバー」及び「電気泳動チャンバー」は、本明細書において区別なく使用され、典型的には２個の電極を含むチャンバーに関し、ここでこれらの電極間のゾーンは、「分離ゾーン」と称される。フリーフロー電気泳動に関して、媒体流れ方向は、例えば図３、５及び７に例示されたように、典型的には一般に平行な電極に対し垂直である。例えばキャピラリー電気泳動に関連するもののような別の実施態様において、分離チャンバーは、媒体流れ方向を一般に２つの電極の一方へ向けることができる。任意に、別の企図された実施態様における電極は、他方に対し平行である必要はない。

本明細書において使用される用語「分離ゾーン」は、本発明に従いＩＴＰ分離を実行するのに適した器具の電極間のゾーンをいう。このような器具は、例えばフリーフロー電気泳動操作、手順又は方法を、各々、連続フリーフロー電気泳動に類似したもしくは同等の配置で、又は任意にキャピラリー電気泳動に類似したもしくは同等の配置で、連続又は非連続様式で、実行するのに適している。典型的には、分離ゾーンは、Ｔゾーン、希釈されたＴゾーン、Ｓゾーン、Ｌゾーン及びＬ安定化ゾーンを備える。

本明細書において使用される用語「有効な分離ゾーン」は、Ｓゾーン及びＬゾーンにより形成された本発明に従いＩＴＰ法を実行するのに適した器具の電極間のゾーンをいう。スペーサーイオン、被検体イオン及びリーダーイオンは、ＩＴＰ分離の間に陽極又は陰極に向かい移動するので、有効な分離ゾーンは、図４に図示されたように、その位置及び幅を変化することは理解されるであろう。

本明細書において使用される用語「分離媒体」は、分離ゾーンの一部、すなわちＴ媒体、希釈されたＴ媒体、Ｓ媒体、Ｌ媒体及び／又はＬ安定化媒体を形成する、任意の媒体を意味する。

本明細書に説明された実施態様は概して任意の等速電気泳動技術に関連しているが、ある特に好ましい実施態様において、本発明の方法は、フリーフロー等速電気泳動として実行されることは理解されるであろう。従ってフリーフロー等速電気泳動（ＦＦ ＩＴＰ）に具体的に関連している更なる本発明の実施態様が、以下により詳細に説明される。

ＦＦ ＩＴＰ分離
本発明のひとつの態様は、例えばフリーフロー等速電気泳動（ＦＦ ＩＴＰ）による、少なくとも１種の関心対象の被検体の被検体組成物からの分離のための新規方法に関し、この方法は：
少なくとも１種のＴ媒体により形成された、ターミネーター電解質（Ｔ）ゾーン；及び
少なくとも１種の希釈されたＴ媒体により形成された、希釈されたＴゾーン；及び
少なくとも１種のＬ媒体により形成された、リーダー電解質（Ｌ）ゾーン；及び
少なくとも１種のＬ安定化媒体により形成された、Ｌ安定化ゾーン：を備え、
並びに、任意に少なくとも１種のＳ媒体により形成されたスペーサー（Ｓ）ゾーンを更に備え、
少なくとも１個の電極が陰極であり、及び少なくとも１個の電極が陽極である電極のセット間に分離ゾーンを、電気泳動チャンバー内に形成することを含む。

被検体の混合物から分離されるべき関心対象の被検体の電気泳動移動度（ＥＭ）は、実験が成功するために一般にわかっていなければならない。従って本発明の方法を実行する前に、被検体（又は分離媒体において使用される任意の他の化合物）のＥＭを決定することが必要であることがある。当業者は概して、当該技術分野において利用可能な十分確立された方法により、該被検体又は関心対象の化合物のＥＭを確定する方法を知っているであろう。あるいは、そのＥＭは、本明細書に説明された方法により実験的に決定することもできる。

一般にＩＴＰ分離に供される試料は、異なる媒体間で平衡状態が確立される前に、スペーサー媒体と一緒に導入される。しかし新規方法がＦＦ ＩＴＰとして実行される場合、試料は、例えば、異なる媒体の平衡状態が既に確立された後で、様々な媒体の導入ポイントの下流で分離チャンバーへ導入されることがある。これに関して、試料は一般に、媒体注入口と実際の分離領域（すなわち、電界が電極間に存在する所）の間の位置で導入されるか、又は該電界内に直接配置することができることは理解されるであろう。

加えて、好ましくはＦＦ ＩＴＰに関して、試料は、本発明の分離ゾーン内の異なるゾーンの配列に応じ、バルク流れ方向に垂直な異なる位置で導入することができることが注目される。従って試料は、Ｓゾーンへ導入されてよいか、又は代わりにＳゾーンと希釈されたＴ電解質ゾーンの間に導入されてもよい。試料は、希釈されたＴゾーンへ、ＳゾーンとＬゾーンの間へ、又はＬゾーンへ導入されてもよい。

更に、本発明の好ましい一実施態様において、関心対象の被検体を含有する試料は、ＦＦＥチャンバーへ、分離チャンバー内の分離媒体の導入ポイントの下流にある距離をおいて導入される。別の表現をすると、試料は、スペーサーと一緒には導入されず、むしろ異なる媒体の平衡状態が既に確立された後に導入される。ある実施態様において、試料は、実際の分離領域（すなわち電界が電極間に存在する場所）に導入される。

しかし好ましくは、試料は、ＦＦ ＩＴＰ分離を実行するのに適した器具の、媒体の注入口と、電極間の実際の分離領域の間の位置に導入される。

被検体
本発明のＩＴＰ法は、分離ゾーン内で、又は分離ゾーンからの被検体の溶出後、並びに任意に少なくとも１種の被検体の分離チャンバーからの排出、及び任意に１つ又は複数の画分中の少なくとも１種の関心対象の被検体の回収後のいずれかで、少なくとも１種の関心対象の被検体を分析するために適している。

本明細書において使用される用語「分析する」は、関心対象の被検体の検出、定量、試験又はいずれか他の好適な検査を含むことが意図されている。

一部の実施態様において、少なくとも関心対象の被検体は、例えばＵＶ／ＶＩＳ−又は蛍光法、伝導度検出、ラマン分光法、放射能測定、パルスアンペロメトリック法、円偏光二色法、屈折率測定、ＩＲ−分光法又はそれらの任意の組み合わせにより、分離ゾーン内で検出され／分析され得ることが好ましい。別の実施態様において、少なくとも１種の関心対象の被検体は、分離ゾーンから溶出された後に、同じ技術により分析することができる。

本発明の状況において、試料は、ＦＦ ＩＴＰを含む等速電気泳動により、分画されてよい。分画された試料とは、試料中の様々な被検体がＩＴＰ分離の間に分離され、かつその結果試料がＩＴＰ分離後いくつかの画分に分割され得るような試料を意味する。例えば、ＦＦ ＩＴＰに関する実施態様において、当業者は、複数の収集流出口を通り、ＦＦ ＩＴＰに適した器具の分離チャンバーを出、かつ一般に任意の好適な型の個別の収集容器（例えば、９６ウェルプレート、及び時には異なるサイズのプレート、例えば１４４、２８８、５７６又はそれよりも多いウェルなど）の個々のチューブを通り導かれる、個々の画分を収集又は回収する方法を理解するであろう。ＩＴＰ分離に供される試料の少なくとも一部は、該電気泳動分離の後、１つ又は２つ以上の画分で収集されることが理解される。

ある実施態様において、関心対象の被検体／被検体類のみではなく、関心対象の被検体（類）に加え少なくとも１種の更なるもしくは複数の更なる被検体をも収集することは適しているであろう。従って、該被検体／被検体類は分析されるかもしくはそうでなければ下流の適用において使用されるかどうかに関わりなく、これ／これらは、１つ又は複数の画分でＩＴＰ分離実験から回収される。

これに関して、可能性のある下流の分析は、（更なる）フリーフロー電気泳動、ゲル電気泳動、１Ｄ−及び２Ｄ−ＰＡＧＥ、ＭＳ、ＭＡＬＤＩ ＭＳ、ＥＳＩ ＭＳ、ＳＥＬＤＩ ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ（／ＭＳ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（／ＭＳ）、ＥＬＩＳＡ、ＩＲ−分光法、ＵＶ−分光法、ラマン分光法、ＨＰＬＣ、エドマン分解配列決定、ＮＭＲ分光法、表面プラスモン共鳴、放射能測定、パルスアンペロメトリック法、屈折率測定、Ｘ−線回折、核酸配列決定、電気ブロット法、アミノ酸配列決定、フローサイトメトリー、伝導度検出、円偏光二色法、活性試験及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるが、これらに限定されるものではない。

できる限り少ない分離緩衝液を含むただ１つの画分で関心対象の被検体を回収することが、一般に最も好ましく、すなわち、関心対象の被検体は、本発明の方法を実行するのに適した器具のただひとつの流出口を通り溶出することが最も好ましい。例えば、本発明の方法を実行するのに適したＦＦＥ器具が標準の９６流出口を有する場合、関心対象の被検体は、単に１個の流出口を通り溶出することが最も好ましいが、関心対象の被検体は、分離ゾーンから溶出され、かつ２、３個もしくはそれよりも多い流出口を通り排出される、すなわち、これは２個以上の画分中に存在してもよい。別の本発明の実施態様において、関心対象の被検体は、分離ゾーンから溶出し、かつ単独の画分内に収集されることなく、直ちに引き続き分析されることが好ましい。

ＩＴＰにおいて、電極間の分離ゾーン内の（任意の）Ｓゾーン及びＬゾーンにより形成される有効分離ゾーンは、最適な分離を可能にするために、できる限り幅広（ＦＦ ＩＴＰ分離の場合）又は長い（キャピラリーＩＴＰの場合）であることが一般に好ましい。それにもかかわらず、特にＦＦ ＩＴＰにおいて、本発明に従い少なくとも本発明のＴ及び希釈されたＴゾーンが存在しなければならないので、分離ゾーンの全体の幅／長さを超えて有効分離ゾーンが広がることはできない。

本明細書において使用されるように、例えばＦＦ ＩＴＰにおける特定のゾーン幅とは、典型的には、図３及び４に図示されたように、バルク媒体流れ方向に対し９０°の角度のゾーン幅を意味する。同様に、キャピラリーＩＴＰのような分離法におけるゾーン長は、例えばキャピラリー又は他の好適な２個の電極間の容器におけるゾーンの長さである。従って本発明のゾーンの幅／長に言及する場合に、用語「幅」及び「長さ」は、本明細書において区別なく使用される。

好ましい一実施態様において、電気泳動分離の開始時の有効分離ゾーンの幅は、（電極？）間の分離ゾーン全体の幅の４５％と等しいか又はそれよりも大きい、６０％よりも大きい、７５％よりも大きい、８０％よりも大きい、もしくは９０％よりも大きい。

別の本発明の好ましい実施態様において、Ｓゾーン及びＬゾーンは、分離ゾーン内に有効分離ゾーンを形成し、並びに電気泳動分離開始時の該Ｌゾーンの幅は、該隣接するＳゾーンの幅よりも少なくとも係数５、少なくとも係数８、少なくとも係数９、少なくとも係数１０、少なくとも係数１５、又は更に少なくとも係数２０だけより広い。

更に別の好ましい実施態様において、Ｓゾーンの幅は、電気泳動分離開始時の希釈されたＴゾーンの幅と本質的に類似している。最適な分離結果を得るためには、ＩＴＰ分離を実行するのに適した器具へ、小さい幅を有するＳゾーンを導入することが好ましい。

各々できる限り小さい幅を有する、その結果本質的に等しい、希釈されたＴゾーン及び（任意の）Ｓゾーンを作製することが好ましいが、これらのゾーンの幅は、互いに、係数０．１〜１０、より好ましくは係数０．２〜５、又は更には係数０．３〜３だけ変動することができる。

一部の実施態様、特にＦＦ ＩＴＰにおいて、電気泳動分離の開始時の電極と希釈されたＴゾーンの間のＴゾーンの幅が、希釈されたＴゾーンと隣接するＳゾーンの一緒にした幅と少なくともほぼ同じであるか、又は該一緒にした幅よりも少なくとも係数約１．１、少なくとも係数約１．５、もしくは少なくとも係数２だけより広いことが更に好ましい。

被検体、例えば細胞小器官のような繊細な被検体を分離する場合、本発明の異なるゾーンを形成する様々な媒体は、例えば被検体の完全性について必要とされる明確なｐＨ値とされることが推奨される。従って好ましい本発明の一実施態様において、希釈されたＴ媒体のｐＨは、Ｔ媒体のｐＨとほぼ等しい。

溶液のｐＨは、緩衝液システムの希釈時にわずかに変化してよいか、又はそのｐＨは、２種の類似した緩衝媒体が平行して作製される場合にわずかに変動してよいことは理解されるであろう。更に、Ｔ媒体中及び希釈されたＴ媒体中に同じ濃度で存在する添加剤（その緩衝液システムは希釈されたＴ媒体中ではより低い濃度で存在するにもかかわらず）も、希釈されないＴ媒体と比べ、希釈された媒体のｐＨに影響を及ぼし得る。

可能性のある様々なｐＨ値の理由とは関わりなく、そのｐＨ差は、１ｐＨ単位を超えないことが一般に好ましい。好ましくはこの差は、０．５ｐＨ単位を超えず、より好ましくはこれは０．２ｐＨ単位を超えず、最も好ましくは、これは本質的に全く変化しない、すなわちその差は、最大で０．１ｐＨ単位でなければならない。

分離ゾーンの様々なゾーンを通じて本質的に一定のｐＨが好ましいが、このｐＨ値は更に、Ｔ媒体からＬ媒体へわずかに変化してよい。

従って別の好ましい実施態様において、任意のＳ媒体のｐＨは、隣接する希釈されたＴ媒体のｐＨと隣接するＬ媒体のｐＨの間である。このｐＨは、ＩＴＰ分離が陰イオン性ＩＴＰ分離である場合は、希釈されたＴ媒体からＬ媒体へ低下し、並びにＩＴＰ分離が陽イオンＩＴＰ分離である場合は、その逆に上昇することは注目される。一般に希釈されたＴゾーンを形成する希釈されたＴ媒体のｐＨと、Ｌゾーンを形成するＬ媒体のｐＨの間の最大ｐＨ差（ここで、Ｓゾーンを形成し、かつ希釈されたＴとＬゾーンの間に配置されたＳ媒体のｐＨは、これら２つのｐＨ値の間である）は、２ｐＨ単位未満、好ましくは１ｐＨ単位未満、より好ましくは０．５ｐＨ単位未満、最も好ましくは０．２ｐＨ単位未満でなければならない。Ｌ安定化ゾーンを形成するＬ安定化媒体のｐＨも、Ｌゾーンを形成するＬ媒体のｐＨと本質的に同じであることが好ましいが、それにもかかわらずこれら２つのｐＨ値は、実際には異なることがある。希釈されたＴ媒体のｐＨは、Ｔ媒体のｐＨとほぼ等しいが、ここでも、これら２つの媒体間でそのｐＨが異なる場合であっても、良好な結果が達成され得ることも好ましい。

更に別の好ましい実施態様において、分離ゾーン内の異なるゾーンの伝導度は、その分離の高い分解を確実にするために、互いに明確な関係を有さなければならない。

従って別の実施態様において、希釈されたＴ媒体の伝導度は、隣接するＳ媒体の伝導度とほぼ等しい。有効な分離ゾーンを形成する２つのゾーン間の境界に明確な伝導度段階が存在しないことは、例えば、電界の攪乱、又は示差的加熱により引き起こされる作用を低下するので、ほぼ等しい伝導度は有利である。

ほぼ等しい伝導度を実現するためには、いくつかの方法があることは理解されるであろう。例えば、緩衝化合物に由来するリーダーＬ及びその対イオンの濃度、並びに緩衝化合物の濃度は、Ｌゾーンの伝導度が、任意に存在するＳゾーンの伝導度と本質的に同等であるように、適合される。あるいは、異なるスペーサーの濃度は、Ｓゾーンを形成するＳ媒体の伝導度が、隣接するＬゾーンと同じ伝導度を有するように調節されるか、又は隣接するＬゾーンの伝導度とほぼ等しい伝導度を実現するために、強塩基もしくは強酸をＳ媒体へ導入することができる。

異なる媒体又はゾーンの伝導度と組み合わせて使用される用語「ほぼ等しい」は、各々、最大でも１０％、又はより好ましくは最大でも５％の、２つの隣接するゾーン間の伝導度の差を意味することが好ましい（より高い伝導度を基本とする）。

更に別の実施態様において、Ｓ媒体の伝導度は、先に説明されたものと同じ原理を用い、隣接するＬ媒体の伝導度とほぼ等しいように調節される。

従ってある特に好ましい実施態様は、希釈されたＴ媒体、Ｓ媒体及びＬ媒体の伝導度が、全てほぼ等しいような本発明のＩＴＰ法に関する。

フリーフロー電気泳動に関して、多くの操作モードが、当業者に公知であり、かつ本発明の状況において企図されている。従って本発明の新規方法は、以下により詳細に説明される全て公知のＦＦＥ操作モードに従い実行されてよい。

例えば、ＦＦＥ器具の陽極と陰極の間に電界が印加されながら、試料及び分離媒体は、連続して流出口へ駆動される（「連続モード」ＦＦＥ）。ＦＦＥの状況における連続モードは、注入工程に加え分離工程が、連続しかつ同時に起こることを意味すると理解されるべきである。本発明の分離法では、媒体及び被検体が、そこで異なる化学種がそれらの電気泳動移動度（ＩＴＰ）に従い分離される電気泳動チャンバーを通過する間に、電気泳動分離が起こる。連続モードＦＦＥは、いくつかの独立した「試行」を実行することを必要とせずに、被検体の連続注入及び回収が可能である（１回の試行は、試料の注入、分離及び引き続きの収集及び／又は検出の配列として理解される）。連続モードＦＦＥは、分離時間を延長するために、被検体が電極間の分離スペースを通過する間に、バルク流量が初期バルク流量と比べ低下される（しかし停止しない）ような分離技術を含むことは理解されるであろう。しかしこの場合、バルク流量の低下は、限定量の試料を使用する場合にのみ、意味をなすので、真の連続モードと称することはできない。

ＦＦＥ適用と結びつけていわゆる「インターバルモード」として公知である別のＦＦＥ操作モードも、当該技術分野において説明されており、本明細書において同様に企図されている。例えば非連続（すなわちインターバル）デフレクション電気泳動のプロセスが、米国特許US 6,328,868に開示されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。この特許において、試料及び分離媒体の両方が電気泳動チャンバーへ導入され、その後ゾーン電気泳動、等速電気泳動、又は等電点電気泳動などの電気泳動モードを用いて、分離され、その後最終的に分画流出口を通ってチャンバーから放出される。US 6,328,868の実施態様は、チャンバーの注入口末端から流出口末端へ向かい移動する、単方向である分離媒体及び試料の動きを説明している。この方向は、従来のキャピラリー電気泳動とは異なり、縦長の電極の方向と同じである。例えば特許US 6,328,868に開示された静的インターバルモードにおいて、ポンプ又はいくつかの他の流体移動(displacement)要素により引き起こされた電極間の試料の加速は、電界がオフの場合又は少なくとも電圧が電気泳動的移動に無効である場合、すなわち試料のどの部分にも有効な電界が供されない場合にのみ生じる。

別の表現をすると、このインターバルプロセスは、試料及び媒体が電気泳動器具の分離チャンバーへ導入される負荷相、それに続く分離を実現するために電界を印加しながら、試料を含有する媒体のバルク流れが保持される分離プロセスにより特徴付けられる。試料の分離／分画後、電界は停止されるか、又は無効であるように低下され、かつバルク流れは、分画された試料が流出口末端へ駆動され、引き続き例えばマイクロタイタープレートなどの好適な容器内で収集／検出されるように、再度作動される。

本明細書において使用されるＦＦＥの状況におけるいわゆる周期的モード又は周期的インターバルモードは、国際出願PCT/EP2007/059010(米国特許仮出願第USSN 60/823,833号及び第USSN 60/883,260号の優先権を主張するものである）に開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。要約すると、この周期的インターバルモードは、少なくとも１つの、かつ可能なら複数のバルク流れ方向の逆転により特徴付けられ、この間試料は、縦長の電極の間の電気泳動の電界内に保持される。静的インターバルモードとは対照的に、試料は、常に動き、これによりより高い電界強度が可能になり、その結果より良い（又はより迅速な）分離が可能になる。加えて、縦長の電極間の試料のバルク流れが逆転することにより、電界内の被検体の滞留時間がかなり増大し、これにより増大した分離時間及び／又はより高い分離効率及びより良い分解がもたらされる。縦長の電極と平行のいずれかの方向へのバルク流れの逆転（サイクルと称される）は、特定の状況において必要な限り頻繁に繰り返すことができるが、実践上の理由及び短時間のうちに分離を得るための要望は、典型的にはこのモードで実行されるサイクルの数を制限するであろう。

従って好ましい実施態様において、本発明のＦＦ ＩＴＰ分離は、連続モード、静的インターバルモード、又は周期的インターバルモードで操作されてよい。

加えて、同時係属の国際出願WO 2006/119001に更に詳細に開示されているように、向流媒体を使用し、ＦＦ ＩＴＰの分離条件を最適化することができ、この出願はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

キャピラリーＩＴＰ分離
本発明の別の態様は、少なくとも１種の関心対象の被検体を、被検体組成物から分離するための、キャピラリーＩＴＰ法に関し、これは：
２個の電極及びそれらの間に介在された分離ゾーンを備え、ここで該分離ゾーンは、少なくとも：
Ｌ’ゾーンを形成する、リーダー電解質（Ｌ）媒体；及び
Ｓゾーンを形成する、スペーサー（Ｓ）媒体；及び
Ｔ’ゾーンを形成する、修飾されたターミネーター電解質（Ｔ’）媒体：により形成される、キャピラリー電気泳動分離を実行するのに適した器具を提供することを含む。

前記方法は、好ましくはキャピラリーＩＴＰに適しているが、他のＩＴＰ法も、本明細書に説明された新規ＩＴＰ分離法から恩恵があることは理解されるであろう。

典型的には、分離されるべき試料は、Ｓ媒体に沿って導入される。あるいは、該試料は、Ｌ媒体とＳ媒体の間、Ｓ媒体とＴ’媒体の間、又はＴ’媒体に沿って、キャピラリーへ導入することもできるが、後者の場合は好ましくない。

Ｌ’ゾーンを形成するリーダー電解質（Ｌ）媒体は、ＦＦ ＩＴＰ分離に関して説明されたように、Ｌゾーンを形成するＬ媒体と同等である。キャピラリー内のＬ’ゾーンが、ただ１種のＬ媒体により形成されることを条件として、このＬ’ゾーンは、ＦＦ ＩＴＰ分離時に形成されるＬゾーンと本質的に等しいことは理解されるであろう。

キャピラリーＩＴＰの状況で使用されるスペーサー（Ｓ）媒体は一般に、本発明のＦＦ ＩＴＰ法に関して説明されたスペーサー（Ｓ）媒体と同等である。

修飾されたターミネーター電解質（Ｔ’）媒体は、Ｔ’媒体の伝導度は、キャピラリーＩＴＰのＳ媒体の伝導度と本質的に適合されることを条件として、ＦＦ ＩＴＰ分離に関して先に説明されたようにＴ媒体と本質的に同等である。別の表現をすると、Ｔ及び強酸又は強塩基の濃度は各々、フリーフローＩＴＰ分離の状況において説明された状態と比べ、希釈されたＴ媒体により類似しているであろう。

従って、本明細書において使用される用語「Ｔ’媒体」は、先に規定されたようなターミネーターＴ及び強酸又は強塩基を各々含有する媒体に関する。従って陰イオンキャピラリーＩＴＰ分離を実行するのに適したＴ’媒体は、ターミネーターＴ及び強塩基（例えばＮａＯＨ）を含有する。任意にこの媒体は更に、添加剤を含有してもよい。

当業者は、ターミネーターＴは、好ましい分離条件に従い選択されなければならないことを理解するであろう。ターミネーターＴは、酸、塩基、塩、又は任意の化合物であってよく、ここで該化合物の少なくともある画分は、本発明のＩＴＰ分離を実行するのに適した条件下で正味の電荷を保持する。

より好ましい実施態様において、ターミネーターＴは、緩衝化合物である。Ｔ’媒体のｐＨは有利なことに、ＴのｐＫａ値とほぼ等しいように選択され、すなわちターミネーターＴは、該Ｔ媒体の最適緩衝能が実現されるように、ターミネーターＴのｐＫａがほぼ意図されたＴ’媒体のｐＨであるように選択されることが好ましい。

陰イオンキャピラリーＩＴＰ分離のためのターミネーターＴは通常、緩衝酸から選択され、ここで該緩衝酸のｐＫａは、陽極リーダー媒体内の緩衝塩基のｐＫａよりも高いことが好ましい。陰極Ｔ’媒体へ添加される強塩基の濃度は、同じ媒体中の緩衝酸の濃度よりも低いが、所望の高伝導度を達成するために、高度のイオン化を確実にするのに十分な程高いことが好ましい。好ましくはこの強塩基は、アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物である。本発明の態様のある特に好ましい実施態様において、強塩基は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）又は水酸化カリウム（ＫＯＨ）である。

前記強塩基の濃度は、Ｔ’媒体内のＴの濃度よりも、係数約１．０〜４．０、好ましくは係数約１．２〜３．０、より好ましくは係数約１．８〜２．２だけより小さいことが、一般に好ましい。該Ｔの最適緩衝能を実現するためには、該強塩基の濃度が、Ｔ’媒体内のＴの濃度よりも、係数約２だけより小さいことが更により好ましい。

一般にＨＥＰＥＳ及びモルホリノエタノールなどのＩＴＰを実行するのに適したＴ化合物が、当業者に公知である。本明細書に提供された内容と共に、当業者は、本発明のキャピラリーＩＴＰ分離を実行するのに好適なターミネーターＴを選択することができるであろう。

従って、本発明の陽イオンＩＴＰを実行するのに適したＴ’媒体は、ターミネーターＴ、及びギ酸、塩酸又は硫酸などの強酸を含む。任意に、この媒体は更に添加剤を含んでよい。

好ましい実施態様において、Ｔ’媒体のｐＨは、ＴのｐＫａとほぼ等しい、すなわちターミネーターＴは、そのｐＫａが、Ｔ’媒体の最適緩衝能を実現するためにほぼ意図されたＴ’媒体のｐＨであるように選択されることが好ましい。

陽極Ｔ’媒体に添加される強酸の濃度は、同じ媒体中の緩衝塩基の濃度よりも低いが、所望の高伝導度を達成するために、高度のイオン化を確実にするのに十分な程高いことが好ましい。Ｔ’媒体の良好な緩衝能を実現するために、該強酸の濃度は、Ｔ’媒体内のＴの濃度よりも、係数約１．０〜４．０、好ましくは係数約１．２〜３．０、又はより好ましくは係数約１．８〜２．２だけより小さいことが最も好ましい。更により好ましい実施態様において、該ターミネーターＴの最大緩衝能を実現するためには、該強酸の濃度は、Ｔ媒体内のＴの濃度よりも、係数約２だけより小さい。

再度当業者は、本発明のＩＴＰ分離を実行するのに好適なターミネーターＴを選択する方法を理解するであろう。本発明のＴ’媒体の有利な特性のために、該媒体は、キャピラリーＩＴＰ法に特に有用であることが理解されるであろう。

キャピラリーＩＴＰ分離において、関心対象の被検体は、例えば、ＵＶ／ＶＩＳ−又は蛍光法により、分離キャピラリー内での「カラム上での」検出／分析により、検出／分析されてよいか、又はキャピラリーの末端での「カラム後」検出／分析が可能である。「カラム後」検出は、ＵＶ／ＶＩＳ−又は蛍光法、伝導度検出、ＭＳ分析、ラマン分光法、放射能測定、パルスアンペロメトリック、円偏光二色法、及び屈折率測定からなる群より選択されるが、これらに限定されるものではない。更に、関心対象の被検体（類）は、任意に溶出され、少なくとも１種の関心対象の被検体は、１つ又は複数の画分に回収されてよい。下流の分析は、ＦＦ ＩＴＰ分離に由来した画分に関して先に考察したもののように、少なくとも１種の画分と同等に行われてよい。

一般にキャピラリー電気泳動を実行するのに適したキャピラリーは、給源及び目的のバイアルに各々浸漬される。一部の好ましい実施態様において、給源チャンバーの電解質媒体は、その濃度が、Ｔ’媒体の濃度よりも少なくとも係数２、少なくとも係数３、好ましくは少なくとも係数５、より好ましくは少なくとも係数１０、又は更には少なくとも係数１５だけより高い濃縮されたＴ’媒体であり、及び／又は目的電解質媒体は、ＦＦ ＩＴＰ分離の状況において本明細書に規定されたＬ安定化媒体である。

本明細書において言及されたキャピラリー電気泳動は、無担体（すなわちフリー溶液）、及び担体−ベースの（例えばゲル）の両方のキャピラリー電気泳動、特にキャピラリー等速電気泳動を含むことは理解されるであろう。

添加剤
本発明のＩＴＰ法に適した分離媒体は、１種又は複数の添加剤を含んでよい。一般に、添加剤の数及び濃度は、最小に維持されなければならないが、しかしある種の被検体又は分離の問題点は、被検体の完全性を維持するか又は媒体の所望の特性（例えば、様々な分離媒体間の粘度の適合など）を実現するかのいずれかのための、追加の化合物の存在を必要とすることは理解されるであろう。

可能な添加剤は、他の酸及び／又は塩基、いわゆる「必須」の一価及び二価の陰イオン及び陽イオン、増粘剤、親和性リガンドなどから選択されることが好ましい。

本出願の意味において必須の一価及び二価の陰イオン及び陽イオンは、試料中の被検体の構造的及び／又は機能的完全性を維持するために必要とされ得るイオンである。そのような必須陰イオン及び陽イオンの例は、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、Ｆｅ（ＩＩ）イオン、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、又はＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡなどの錯化剤、又はアジドイオン（例えば、細菌汚染を避けるため）などを含むが、これらに限定されるものではない。

可能性のある酸及び塩基の例は、例えばＳ媒体の伝導度を増強するために、溶液中で完全に解離する、少量の強酸又は強塩基（例えば、ＮａＯＨ、ＨＣｌなど）を含む。

分離媒体中で通常使用される増粘剤は、ポリアルコール、例えばグリセロール又は様々なＰＥＧ類、親水性ポリマー、例えばＨＰＭＣなど、炭水化物、例えばショ糖、ヒアルロン酸などを含む。増粘剤は、試料と媒体の間もしくは異なる隣接する媒体の間の密度又は粘度の差異により作出される乱流を避けるために、分離媒体の粘度を、分離スペースへ導入される試料の粘度へ、又は分離チャンバー内の他の分離及び／もしくは安定化媒体類の粘度へ、適合するために必要とされることもある。

存在し得る追加の添加剤は、シクロデキストリンを含むある種のデキストリンなどのキラル選択剤、又はレクチンなどの親和性リガンドを含む。

場合によっては、溶液中の被検体の酸化を防止するために、還元剤を添加することが必要とされることがある。試料及び／又は分離媒体に添加することができる好適な還元剤は、メルカプトエタノール、メルカプトプロパノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム又はカリウムなどである。

任意の事象において、多くの前述の添加剤は電気的に帯電しているので、それらの濃度は、必要なだけ高く維持されるが、これらはＩＴＰ実験時に電気泳動的に操作される分離スペース内で追加の化学種をもたらすので、同時に可能な限り低くなければならない。

キット
本明細書において企図されたターミネーター（Ｔ）媒体／希釈されたターミネーター（Ｔ）媒体及びリーダー（Ｌ）媒体は、単独で、又は代わりに、好適なＬ安定化媒体及びスペーサーＳ媒体と、各々一緒に選択され、調製されかつ使用されることは、当業者には明らかであろう。

従って、本発明の別の態様は、本明細書において説明される少なくとも１種の新規Ｔ媒体を含む、等速電気泳動（ＩＴＰ）法を実行するためのキットに関する。好ましくは、このキットは、フリーフロー等速電気泳動により分離を実行するためのものである。

ＩＴＰ分離を実行するためのキットは更に、該Ｔ媒体に加え、少なくとも１種の希釈されたＴ媒体を含んでよい。先に説明されたように、希釈されたＴ媒体は、単純な希釈によりＴ媒体に由来するか、又はこれは個別に調製されてもよく、かつ任意に様々な濃度の添加剤を更に含んでもよい。

本発明のこの態様の一実施態様において、キットは更に、個別の被検体の分離のために適合された、スペーサー混合物／スペーサー媒体を得るために組み合わされる、スペーサー（Ｓ）媒体、又は各種のスペーサーを備えてよい。当業者は、該被検体の他の被検体からの分離を補助するスペーサー混合物を得るために、関心対象の被検体の電気泳動移動度（ＥＭ）を考慮し、スペーサーを選択及び混合する方法を理解するであろう。

別の実施態様において、キットは更に、少なくとも１種のＬ媒体を含んでよい。本発明のＬ媒体が、好ましい。本発明のキットに含まれるＬ媒体は、Ｓ、Ｔ、希釈されたＴ又はＬ安定化ゾーンよりもはるかに広いＬゾーンを形成するために使用されてよく、すなわち、Ｌゾーンは、複数の注入口を通じたＬ媒体の添加により形成されることが好ましいことは理解されるはずである。従って、Ｌ媒体は、送達されるＴ媒体の容積／量の少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、又は少なくとも１４倍である容積／量で送達されることが好ましいことは理解されるであろう。

更に別の実施態様において、キットは更に、少なくとも１種のＬ安定化媒体を含んでよい。本発明において規定されたＬ安定化媒体が好ましい。Ｌ安定化媒体は、分離される被検体の電荷に応じて、陽極又は陰極Ｌ安定化媒体であることができることは理解されるであろう。

別の態様は、キャピラリーＩＴＰ分離法の状況において先に規定されたような少なくともＴ’媒体を含む、本発明のキャピラリーＩＴＰ分離を実行するためのキットに関する。

好ましい実施態様において、このようなキットは更に、Ｌ媒体、好ましくは本発明において規定されたようなＬ媒体を含む。

別の実施態様において、そのようなキットは、個別の被検体の分離のために適合された、スペーサー混合物／スペーサー媒体を得るために組み合わされる、スペーサーＳ媒体又は各種のスペーサーを更に含んでよい。当業者は、該被検体の他の被検体からの分離を補助するスペーサー混合物を得るために、関心対象の被検体のＥＭを考慮し、スペーサーを選択及び混合する方法を理解するであろう。

特に好ましい実施態様において、本発明のキットは更に、少なくとも１種又は複数の実験ＦＦ ＩＴＰプロトコール又はキャピラリーＩＴＰプロトコールの各々、及び任意にキット成分の貯蔵条件を説明する製品マニュアルを含むであろう。

別の好ましい実施態様において、キットは、少なくとも本発明のＦＦ ＩＴＰ分離に必要な全ての媒体、すなわち、Ｔ媒体、希釈されたＴ媒体、Ｓ媒体、Ｌ媒体及びＬ安定化媒体を、又は本発明のキャピラリーＩＴＰに必要なそのような媒体、すなわちＴ’媒体、Ｓ媒体及びＬ媒体を含むであろう。

前述の実施態様のいずれかにおいて、キットは、１種又は複数の本発明の媒体、更には向流媒体のような任意の追加媒体を、直ぐ使用される１種又は複数の水溶液の形で含んでよいか（すなわち、全ての成分は、ＦＦ ＩＴＰ実験に望ましい濃度で存在する）、又はこれらは、それらの使用前に予め決められた量の溶媒で希釈される濃縮液（ストック溶液）の形で、１種又は複数の媒体を含んでよい。後者の場合、濃縮液は、そのまま使用する各溶液と比べ、１．５×、２×、２．５×、５×、１０×、２０×、２５×、５０×、７５×、１００×、１５０×、２００×又は１０００×より高い濃度を有してよい。

あるいは、本キットは、複数個、しかし好ましくは１個の容器内に、媒体の様々な成分を含有する、乾燥形又は凍結乾燥形で、１種又は複数の媒体を含んでよく、これはその後電気泳動分離プロセスにおいてそれを使用する前に、予め決められた量の溶媒により再構成される。

好ましくは、各媒体（Ｔ媒体、希釈されたＴ媒体、Ｓ媒体、Ｌ媒体及びＬ安定化媒体）は、個別の容器内に存在するが、ある状況においては、その他の組み合わせ及び包装が可能でありかつ有用であることは当業者には明らかであろう。例えば、Ｔ媒体及び希釈されたＴ媒体は、異なる濃度の成分を有することのみが異なることが先に言及されている。希釈されたＴ媒体の場合、これは、該Ｔ媒体の一部を希釈するために、Ｔ媒体及び空の容器を配送することが有益である。

本明細書において説明されている分離媒体及び安定化媒体の全ては、好ましいかどうかに関わらず、本発明のキットのいずれかの可能でかつ好適な組み合わせで含まれてよいことが、企図されている。

任意に、本発明のキットは更に、本発明の等速電気泳動の適用におけるキット成分の使用に関する説明書を含んでよい。

本発明のＩＴＰ法を実行する器具
本発明の別の態様は、本発明の電気泳動法を実行するのに適した器具に関する。そのような器具は：
少なくとも１個の電極は陰極であり、及び少なくとも１個の電極は陽極である電極のセット、それらの間に介在された分離ゾーンを備える、電気泳動チャンバー：を備え、ここでこの器具は更に：
少なくとも１種のＴ媒体を含む、ターミネーター電解質（Ｔ）ゾーン；
少なくとも１種の希釈されたＴ媒体を含む、希釈されたＴゾーン；
少なくとも１種のＬ媒体を含む、リーダー電解質（Ｌ）ゾーン；及び
少なくとも１種のＬ安定化媒体の、Ｌ安定化ゾーン：を形成するための手段を備える。

好ましい実施態様において、本器具は更に、少なくとも１種のＳ媒体により形成されるスペーサー（Ｓ）ゾーンを形成するための手段を備える。このスペーサー（Ｓ）ゾーンは好ましくは、希釈されたＴゾーンとリーダー電解質（Ｌ）ゾーンの間に配置される。

このような器具は、例えばキャピラリー又はフリーフロー等速電気泳動分離などの、本発明の方法を実行するために特に適合されていることは理解されるであろう。

好ましい実施態様において、本器具は、ＩＴＰにより、少なくとも１種の関心対象の被検体の被検体組成物からの分離を実行するのに適している。この態様のある実施態様において、本器具は、フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ ＩＴＰ）による被検体の分離に適した、ＦＦＥ器具である。

ＦＦ ＩＴＰ法を行うために適合された器具の実施態様は、以下により詳細に説明される。

ＦＦ ＩＴＰを実行するための器具及びその構成要素
「古典的」ＦＦＥに適した器具は、図５に示されている。図５の試料注入口の位置は、Ｓ４であり、これは媒体注入口４の近傍に配置されている。従って、試料注入口Ｓ２は、媒体注入口２に配置されるであろう。

ＦＦＥ適用において、本器具は典型的には、いくつかの媒体注入口を備え（例えば、Ｎ＝７、８又は９個の注入口）、その結果電極間に分離ゾーンを形成するこれらの媒体は、最大Ｎ個の注入口を通じて導入することができる。ＦＦＥに適した器具に挿入することができる分離媒体の数は、典型的には２〜１５種、好ましくは３〜１２種、及び最も好ましくは４〜９種である。

「古典的」ＦＦＥ器具の各媒体注入口の内側口径は、等しい。これらの媒体注入口は、電極間に位置づけられ、かつ互いに等距離を有する。更に図６に示されたような分離装置は、媒体注入口を互いに分離する分離アームを備える。

当該技術分野において公知の器具とは対照的に、本発明のＦＦ ＩＴＰ分離を実行するのに適した器具は、それを通り多数の媒体が流れることができる少なくとも１個の分離チャンバーを備え、かつそこで該チャンバー（類）は、それを通り例えば媒体がチャンバーへ導入される注入口を備え、そこで該媒体注入口は、互いに異なる内側口径及び距離を有する。

更に、本発明のＦＦ ＩＴＰ分離を実行するのに適した器具は、媒体注入口を互いに分離するための修飾された分離装置を備えてもよい。ＦＦ ＩＴＰ分離を実行するのに適したそのような新規器具の非限定的概略図を、図７に示している。

本発明のある好ましい実施態様において、本発明のＦＦ ＩＴＰ分離を実行するのに適したＦＦＥ器具は、少なくとも５個の媒体注入口を有する。明白に、２個の隣接する媒体注入口の内側口径「ｄ」（「ａ」注入口、図７の注入口２及び３を参照）は、その他の媒体注入口の内側口径「Ｄ」（「Ａ」注入口）よりも小さい。一般に２個よりも多い「ａ」注入口が、ＦＦ ＩＴＰ分離を実行するのに適した器具の電極間に存在してよいが、わずかに２個の隣接する「ａ」注入口が存在することが好ましい。非限定的例として、該２個の隣接する媒体注入口は、狭い希釈されたＴゾーン及びＳゾーンを形成することが好ましい、希釈されたＴ媒体及びＳ媒体を導入するために適している。この作用は更に、例えばいくつかの媒体注入口の間の距離を変動することにより、及び以下に考察されるような特別な分離装置を使用することにより、最適化することができる。

好ましくは、各「Ａ」注入口の内側口径Ｄは、等しい。少なくとも１個の「Ａ」注入口が、「ａ」注入口と各電極の間に位置することは更に好ましい。本発明の「ａ」注入口の内側口径ｄは、「Ａ」注入口の内側口径Ｄと比べ、最大でも係数０．８、好ましくは最大でも係数０．６５、及びより好ましくは最大でも係数０．５であってよい。非限定的例として、電極と「ａ」注入口の間のそのような「Ａ」注入口を、分離チャンバーへのＴ媒体の導入に使用することができる。

この注入口の数は、器具に応じて変動してよいが、「Ａ」注入口の数は、少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、又は最も好ましくは少なくとも６個である。１個の電極と「ａ」注入口の間の「Ａ」注入口の数は、３個未満、好ましくは２個未満、最も好ましくは１個であることも、好ましい。

従って、特に好ましい実施態様において、１個の「Ａ」注入口は、電極と２個の「ａ」注入口の間に位置づけられ、並びに２個の「ａ」注入口と他方の電極の間の「Ａ」注入口の数は、少なくとも２個であるが、可能な限り多いことが好ましい。このような配列は、例えばＴ媒体（「Ａ」注入口）、希釈されたＴ媒体（「ａ」注入口）、Ｓ媒体（「ａ」注入口）、少なくとも１種のＬ媒体（「Ａ」注入口（複数））及びＬ安定化媒体（「Ａ」注入口）を、分離チャンバーへ導入するのに適している。

更に、互いの「ａ」注入口間の距離は、「Ａ」注入口対の間の距離と比べて、最大でも係数０．８、好ましくは最大でも係数０．６５、より好ましくは最大でも係数０．５である。好ましくは、「ａ」注入口間の距離と「Ａ」注入口間の距離の間の差は、該「ａ」及び「Ａ」注入口の内側口径の差と相関しており、すなわち、「ａ」注入口間の距離は、「Ａ」注入口間の距離と比べ、「Ａ」注入口のＤと比べた「ａ」注入口のｄよりも、本質的に同じ係数だけ小さいことが好ましい。

別の実施態様において、本発明のＦＦ ＩＴＰ分離を実行するのに適した器具は、注入口を互いに分離する分離アームを備える。図７に図示したように、「ａ」注入口を互いに及び隣接する「Ａ」注入口から分離する分離アームは、「Ａ」注入口を互いに分離する分離アームよりも明白により長い。

好ましくは、「ａ」注入口を互いに及び隣接する「Ａ」注入口から分離する分離アームは、「Ａ」注入口を分離する分離アームよりも、独立して少なくとも係数１．５、好ましくは少なくとも係数１．８、及びより好ましくは少なくとも係数２だけより長い長さを有する。

好ましい実施態様において、「ａ」注入口を互いに及び隣接する「Ａ」注入口から分離する分離アームは、本質的に等しい長さを有する。この状況において使用される「本質的に等しい長さ」とは、互いに独立して３個の分離アームの１個の長さが、残りの２個の分離アームの長さから最大でも係数０．１だけ異なることを意味する。

特に好ましい本発明の実施態様は、少なくとも１個の電極が陰極であり、及び少なくとも１個の電極が陽極である電極のセット、並びにそれらの間に介在した分離ゾーンを備える、電気泳動チャンバーを有する、ＦＦ ＩＴＰ分離を実行するために適合されたＦＦＥ器具に関し、ここでこの器具は、それを通り媒体がチャンバーへ導入される少なくとも５個の注入口を備え、かつ更に該分離ゾーン内に：
少なくとも１種のＴ媒体を含む、ターミネーター電解質（Ｔ）ゾーン；
少なくとも１種の希釈されたＴ媒体を含む、希釈されたＴゾーン；
任意に、少なくとも１種のＳ媒体を含む、安定化（Ｓ）ゾーン；
少なくとも１種のＬ媒体を含む、リーダー電解質（Ｌ）ゾーン；及び
少なくとも１種のＬ安定化媒体のＬ安定化ゾーン：
を形成する手段を備え、
ここで２個の隣接する「ａ」注入口は、「Ａ」注入口の内側口径Ｄと比べ、最大でも係数０．８の内側口径ｄを有し、及びここで少なくとも１個の「Ａ」注入口は、該２個の「ａ」注入口と各電極の間に位置し；並びに、更にここで、該２個の隣接する「ａ」注入口の間の距離は、「Ａ」注入口対の間の距離の最大でも係数０．８であり；並びに、該２個の隣接する「ａ」注入口の間の距離は、「ａ」注入口と「Ａ」注入口の間の距離の最大でも係数０．８である。

別の好ましい実施態様において、本発明の器具は、該２個の「ａ」注入口を備え、ここで該「ａ」注入口の内側口径ｄは、「Ａ」注入口の内側口径Ｄと比べ、該「Ａ」注入口Ｄに対し最大でも係数０．６５、好ましくは最大でも係数０．５である。

更に、本発明の器具は、注入口を互いに分離する分離アームを備える、分離装置を更に備えてよく、ここで該２個の隣接する「ａ」注入口を互いに及び隣接する「Ａ」注入口から分離する分離アームは、該器具の「Ａ」注入口を互いに分離する分離アームよりも、少なくとも係数１．５、好ましくは少なくとも係数１．８、より好ましくは少なくとも係数２だけより長い長さを独立して有する。

更に別の好ましい実施態様において、本発明の器具は、多数の「Ａ」注入口を備えてよく、ここで該器具の１個の電極と該「ａ」注入口の間の「Ａ」注入口の数は、少なくとも２個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、及び最も好ましくは少なくとも１０個であり、並びに該器具の他方の電極と該２個の隣接する注入口の間の注入口の数は、４個以下、好ましくは２個以下、最も好ましくは１個である。

少なくとも１種の関心対象の被検体の被検体組成物からの分離を実現するために、本発明の器具を使用することにより、等速電気泳動法、特に本発明のフリーフロー等速電気泳動（ＦＦ ＩＴＰ）法を行うことが、好ましい。

更に別の実施態様は：
少なくとも１個の電極が陰極であり、及び少なくとも１個の電極が陽極である電極のセット、並びにそれらの間に介在した分離ゾーンを備える、電気泳動チャンバーであり、ここで分離ゾーンは：
ターミネーター電解質（Ｔ）ゾーン；
希釈されたＴゾーン；
リーダー電解質（Ｌ）ゾーン；及び
Ｌ安定化ゾーン：を備えるように構成されるものを含む、器具に関する。

好ましい実施態様において、該器具は加えて、スペーサーＳゾーンを備える。前記スペーサーＳゾーンは、最も好ましくは、希釈されたＴゾーンとＬゾーンの間に位置づけられる。

本発明のこの態様の好ましい実施態様において、該器具は、フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ ＩＴＰ）により、少なくとも１種の関心対象の被検体を、被検体組成物から分離するために、構成される。

別の好ましい実施態様において、該器具は、「Ａ」注入口の内側口径Ｄと比べ、最大でも係数０．８である内側口径ｄを有する２個の隣接する「ａ」注入口を備えてよい。

更に別の好ましい実施態様において、少なくとも１個の「Ａ」注入口は、該２個の「ａ」注入口と各電極の間に配置される。

この器具は更に、注入口を互いに分離する分離アームを含む、分離装置を備えてよく、ここで２個の隣接する「ａ」注入口を互いに及び隣接する「Ａ」注入口から分離する分離アームは、「Ａ」注入口を互いに分離する分離アームよりも少なくとも係数１．５だけ長い長さを独立して有する。

先に既に言及したように、本発明の電気泳動法に従い分離される試料は、分離チャンバーへ、その媒体注入口のひとつを通り該チャンバーへ導入される任意の分離媒体と一緒に導入されてよい。加えて、電気泳動法がフリーフロー電気泳動法である場合、該フリーフロー電気泳動法は、試料は、個別の専用の試料注入口を通り、該方法を実行するのに適したＦＦＥ器具へ導入されてよいという利点をもたらす。

例えば前述の器具のいずれかの電気泳動チャンバーへ導入された後、次に分離媒体内の試料中の様々な被検体が、電界の印加により分離されると同時に、ＦＦＥ器具の流出口末端へ流体的に駆動される。個々の被検体は、複数の収集流出口を通り、分離チャンバーを出、かつ一般には個別のチューブを通り、いずれか好適な型の個別の収集容器へ導かれる。収集容器中で、被検体は、分離媒体及び向流媒体と一緒に収集される（使用される器具に応じて）。好適な分画／分離を提供するために、収集流出口のアレイの個別の収集流出口の間の距離は、一般に可能な限り小さくなければならない。個々の収集流出口間の距離は、収集流出口の中心から測定して、約０．１ｍｍ〜約２ｍｍ、より典型的には約０．３ｍｍ〜約１．５ｍｍであることができる。

様々な実施態様において、分離媒体注入口の数は、器具のデザインにより限定され、かつ選択された媒体注入口の数に応じて、特に例えば１〜７個、１〜９個、１〜１５個、１〜４０個又はそれよりも大きい範囲である。試料注入口の数は、例えば１〜３６個、１〜１１個、１〜５個、１〜４個、又は更には１〜３個の範囲であるのに対し、収集流出口の数は、例えば３〜３８４個、又は３〜９６個の範囲であるが、しかし任意の都合の良い数を、分離装置に応じて選択することができる。向流媒体注入口の数は、典型的には例えば２〜９個、又は３〜７個の範囲である。提供された注入口及び流出口の数は一般に、分離装置及び分離スペースの形状及び寸法に応じて決まる。従って様々な数の分離媒体注入口及び流出口が可能であることも理解されるであろう。

図５において、分離媒体は、両電極間を及び長手方向に沿って（大きい矢印）、層流様式で流れる（好ましくは傾いた又は平らな分離チャンバー内を底から上向きに）。一部の実施態様において、分離媒体は、流出口の近傍で、分離媒体の向流（小さい矢印）により減速され、その結果流出口を介して、画分で分離チャンバーを出、すなわち一部の実施態様において、向流媒体は、電極間を移動するバルク分離媒体及び試料の連続流れ方向に逆らって分離スペースへ導入される。両媒体（分離媒体及び向流媒体）は、分画流出口を通り、排出又は溶出される。

分離される試料、例えばタンパク質は、試料注入口を介して分離媒体へ導入され、分離媒体の層流により輸送される。連続操作条件下で操作される場合、このタンパク質混合物は、電極間の電界の影響下での電気泳動移動により、連続して分離され、かつ分離媒体中の電極間に生じた電界の結果、分離緩衝液及び試料の特性に従い、個別の画分中に収集される。バッチ又は非連続の操作モードで操作される場合、試料は、その電気泳動プロセスの特徴及び必要性に応じて調整され得る可変のチャンバーサイズで、個別の画分へ収集することができる。

先に言及された実施態様は全て、具体的に好ましいとされるかどうかに関わらず、任意の好適な方法で組み合わせられることが意図されることは理解されるであろう。更に、本発明の範囲及び精神から逸脱しない限りは、本明細書に説明された実施態様の多くの修飾が可能であることは、当業者には明らかである。本発明はここで、いくつかの非限定的実施例により更に例示される。

実施例
実施例１：本発明のＦＦ ＩＴＰ法を使用するｐＩマーカーの分離及び先行技術の方法との比較
内側口径が変動する８個の媒体注入口（Ｅ１−Ｅ８）を備える、フリーフロー電気泳動器具を、据え付けた。注入口Ｅ１−Ｅ５及びＥ８は０．６４ｍｍであるのに対し、Ｅ６及びＥ７は０．３８ｍｍであった。ＨＣｌ（１００ｍＭ）及びモルホリノエタノール（２００ｍＭ）を含有する安定化したリーダーを、注入口Ｅ１に導入した。より低い濃度のＨＣｌ（１０ｍＭ）及びモルホリノエタノール（２０ｍＭ）のリーダーを、注入口Ｅ２からＥ５へと導入した。ＭＥＳ（１ｍＭ）、ＭＯＰＳ（１．１ｍＭ）及びＭＯＰＳＯ（０．８ｍＭ）、並びに伝導度を増大するためにＢＩＳＴＲＩＳ ２０ｍＭを含有するスペーサー組成物を、注入口Ｅ６へ導入した。ＮａＯＨ（１０ｍＭ）及びＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）を含有する希釈されたターミネーターを、注入口Ｅ７へ導入し、ＮａＯＨ（５０ｍＭ）及びＨＥＰＥＳ（１００ｍＭ）を含有する無−希釈ターミネーターを、注入口Ｅ８へ導入した。フリーフロー連続等速電気泳動を、電圧７００Ｖで、ｐＩマーカーの混合試料について行った。電流は、３４ｍＡであった。電気泳動分離後、試料及び媒体は、画分収集器へ溶出し、これらの画分を分析した。

着色したｐＩ−マーカーを分離し、本システムの分離能について評価した。画分のλ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ、及び５９５ｎｍでの吸光度は、各ｐＩ−マーカーの吸光度を表すが、これを図８に報告した。

同じ実験を、標準ＩＰＴプロトコールに従い行った。ＨＣｌ（１０ｍＭ）及びモルホリノエタノール（２０ｍＭ）のリーダーを、注入口Ｅ１からＥ５へ導入した。ＭＥＳ（１ｍＭ）、ＭＯＰＳ（１．１ｍＭ）及びＭＯＰＳＯ（０．８ｍＭ）、並びにＢＩＳＴＲＩＳ ２０ｍＭを含有するスペーサー組成物は、注入口Ｅ６へ導入した。ターミネーターとして、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）を、注入口Ｅ７及びＥ８へ導入した。フリーフロー連続等速電気泳動を、電圧１０００Ｖで、ｐＩマーカーの混合試料について行った。電流は、１３ｍＡであった。電気泳動分離後、試料及び媒体は、画分収集器へ溶出し、これらの画分を分析した。

着色したｐＩ−マーカーを分離し、本システムの分離能について評価した。画分のλ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ、及び５９５ｎｍでの吸光度は、各ｐＩ−マーカーの吸光度を表すが、これを図９に報告した。

図８及び９に図示したように、本発明の新規ＦＦ ＩＴＰ法を使用する分離は、一般に新規ＦＦ ＩＴＰ法と同じリーダー、スペーサー、試料及びターミネーターを使用する先行技術の分離法と比べ、はるかに良好な分解を示した。図９に認められるように、先行技術の方法は、ｐＩマーカーの貧弱な分離のみを生じた。全てのｐＩマーカーは、画分６３から画分８２の間で検出され、実際ほとんどのｐＩマーカーは、画分６３から６８で検出された。対照的に、本発明のＦＦ ＩＴＰ法を用い分離された同じｐＩマーカー混合物は、画分２２から９２の間で溶出した。更に、様々なｐＩマーカー（各々異なる最大吸光度を有する）は、本質的に異なる画分中に単離されたことは注目される。

実施例２：ペルオキシソームのインターバルＦＦ ＩＴＰによる分離
第二の実施例において、内側口径が変動する８個の媒体注入口（Ｅ１−Ｅ８）を備えるＦＦＥ器具を、据え付けた。注入口Ｅ１−Ｅ５及びＥ８は０．６４ｍｍであるのに対し、Ｅ６及びＥ７は０．３８ｍｍであった。ＨＣｌ（１００ｍＭ）及びＢＩＳＴＲＩＳ（２００ｍＭ）を含有する安定化したリーダーを、注入口Ｅ１に導入した。より低い濃度のＨＣｌ（１０ｍＭ）及びＢＩＳＴＲＩＳ（２０ｍＭ）のリーダーを、注入口Ｅ２からＥ５へと導入した。ＨＡｃ（１．３ｍＭ）、乳酸（１．０ｍＭ）、グルクロン酸（３．２５ｍＭ）、ＡＣＥＳ（２．０ｍＭ）、ＭＯＰＳＯ（１．６）、及びＢＩＳＴＲＩＳ （１７ｍＭ）を含有するスペーサー組成物を、注入口Ｅ６へ導入した。ＮａＯＨ（１０ｍＭ）及びＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）を含有する希釈されたターミネーターを、注入口Ｅ７へ導入し、ＮａＯＨ（５０ｍＭ）及びＨＥＰＥＳ（１００ｍＭ）を含有する無−希釈ターミネーターを、注入口Ｅ８へ導入した。混合試料への添加剤として、ショ糖（２５０ｍＭ）を含んだ。フリーフロー連続等速電気泳動を、電圧８００Ｖで、遠心分離により予め精製した細胞小器官（ペルオキシソーム）を含有する試料について行った。試料及び媒体は、流量１８０ｍＬ／時で、チャンバーへ導入した。電気泳動時に、電極間の媒体及び試料のバルク流量は、導入された流量と比べ低下した。例えば、電極間の分離時の試料及び媒体のバルク流量は、８０ｍｌ／時であった。分離後、試料及び媒体は、８０ｍＬ／時よりも大きい増大した流量で、マイクロタイタープレートのような画分収集器へ溶出した。この流量は、溶出時に層流状態を維持するチャンバーの流出口部分の能力に応じて、少なくとも１８０ｍｌ／時まで増大することができる。全体の分離時間は、約５分５０秒であった。

各分画の吸光度を、λ＝４２０ｎｍで測定した。ある画分の吸光度ピークは、試料中のペルオキシソームの存在により生じる（図１０参照）。分離されたペルオキシソームの同一性及び完全性を、電子顕微鏡により（図１１）、引き続き通常のゲル電気泳動により（データは示さず）、確認した。

Claims (121)

1. 電気泳動法であって、電気泳動チャンバー内の１組の電極間に分離ゾーンを形成すること、ここで該電極の少なくとも１個は陰極であり、及び該電極の少なくとも１個は陽極であり、該分離ゾーンは、以下：
   少なくとも１種のＴ媒体により形成された、ターミネーター電解質（Ｔ）ゾーン；
   少なくとも１種の希釈されたＴ媒体により形成された、希釈されたＴゾーン；
   少なくとも１種のＬ媒体により形成された、リーダー電解質（Ｌ）ゾーン；及び
   少なくとも１種のＬ安定化媒体により形成された、Ｌ安定化ゾーン
   を含み；並びに
   場合により、少なくとも１種のＳ媒体により形成された、スペーサー（Ｓ）ゾーン
   を更に含む、
   を含む、前記電気泳動法。
2. 等速電気泳動（ＩＴＰ）により、少なくとも１種の関心対象の被検体を被検体組成物から分離することを更に含む、請求項１記載の方法。
3. 前記Ｓゾーン及び該Ｌゾーンが、分離ゾーン内に有効分離ゾーンを形成し、並びに電気泳動分離開始時の該Ｌゾーンの幅は、該隣接するＳゾーンの幅よりも少なくとも係数８、好ましくは少なくとも係数９、より好ましくは少なくとも係数１０、及び最も好ましくは少なくとも係数１５だけより広い、請求項１又は２記載の方法。
4. 前記の電気泳動分離の開始時の有効分離ゾーンの幅が、該電極間の分離ゾーンの幅の４５％と等しいか又はより大きい、好ましくは６０％よりも大きい、より好ましくは７５％よりも大きい、又は最も好ましくは８０％よりも大きい、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 前記Ｓゾーンの幅が、電気泳動分離開始時の希釈されたＴゾーンの幅と本質的に類似している、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 前記の電気泳動分離の開始時の電極と希釈されたＴゾーンの間のＴゾーンの幅が、希釈されたＴゾーンと隣接するＳゾーンの一緒にした幅と少なくとも本質的に同じであるか、又は該一緒にした幅よりも少なくとも係数約１．１、少なくとも係数約１．５、もしくは更に少なくとも係数２だけより広い、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 試料が、Ｓゾーンへ、Ｓゾーンと希釈されたＴ電解質ゾーンの間、希釈されたＴゾーンへ、ＳゾーンとＬゾーンの間、又はＬゾーンへ導入される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 前記ＩＴＰが、陰イオンＩＴＰであり、Ｌが強酸に由来する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
9. Ｌが、塩化物イオン又は硫酸イオンである、請求項８記載の方法。
10. 前記ＩＴＰが、陽イオンＩＴＰであり、Ｌが強塩基に由来する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
11. Ｌが、アルカリ金属又はアルカリ土類金属である、請求項１０記載の方法。
12. Ｌが、ナトリウム又はカリウムである、請求項１１記載の方法。
13. Ｌ媒体が、緩衝化合物をさらに含む、請求項８〜１２のいずれか１項記載の方法。
14. ＩＴＰが、陰イオンＩＴＰであり、緩衝化合物が、緩衝塩基である、請求項１３記載の方法。
15. ＩＴＰが、陽イオンＩＴＰであり、緩衝化合物が、緩衝酸である、請求項１３記載の方法。
16. 緩衝化合物の濃度が、該強酸のプロトン又はＬが由来する該強塩基の水酸化物イオンの濃度よりも、係数約１．０〜４．０、好ましくは係数約１．２〜３．０、及びより好ましくは係数約１．８〜２．２だけより高い、請求項８〜１５のいずれか１項記載の方法。
17. Ｌ媒体のｐＨが、ＩＴＰ分離が陰イオンＩＴＰ分離である場合、緩衝塩基のｐＫａ値とほぼ等しいか、又はＩＴＰ分離が陽イオンＩＴＰ分離である場合、緩衝酸のｐＫａ値とほぼ等しい、請求項８〜１６のいずれか１項記載の方法。
18. Ｌ媒体内のＬの濃度が、約５０ｍＭ以下、約１０ｍＭ以下、約５ｍＭ以下、約３ｍＭ以下、約２ｍＭ以下、又は約１ｍＭ以下である、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
19. Ｌ安定化媒体の伝導度が、隣接するＬ媒体の伝導度よりも、少なくとも係数２、少なくとも係数３、好ましくは少なくとも係数５、より好ましくは少なくとも係数１０、又は更には少なくとも係数１５だけより高い、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
20. Ｌ安定化媒体のより高い伝導度が、隣接するＬ媒体内のＬの濃度と比べＬ安定化媒体内の、各々それからＬが由来する強酸又は強塩基の濃度の増加により実現される、請求項１９記載の方法。
21. より高い伝導度が、帯電した化学種Ｉ及びその対イオンにより実現され、ここでＩは、Ｌが負帯電されている場合には、負帯電し、及びＩは、Ｌが正帯電されている場合には、正帯電する、請求項１９又は２０記載の方法。
22. Ｌ安定化媒体が、Ｌを含まない、請求項２１記載の方法。
23. Ｉの電気泳動移動度（ＥＭ）が、ＬのＥＭ値の約５０％以上、又は好ましくは約７０％以上、より好ましくは約９０％以上の値を有し、最も好ましくはＬのＥＭと等しい、請求項２１又は２２記載の方法。
24. Ｌ安定化媒体内のＬの濃度、Ｉの濃度、又はＬ及びＩの組み合わせの濃度が、隣接するＬ媒体内のＬの濃度よりも、少なくとも係数２、少なくとも係数３、好ましくは少なくとも係数５、より好ましくは少なくとも係数１０、又は更には少なくとも係数１５だけより高い、請求項２１〜２３のいずれか１項記載の方法。
25. Ｔ媒体が、Ｔ及び強酸又は強塩基を含む、請求項１〜２４のいずれか１項記載の方法。
26. Ｔが、緩衝化合物である、請求項２５記載の方法。
27. ＩＴＰが、陰イオンＩＴＰであり、及びＴ媒体が強塩基を含む、請求項２５又は２６記載の方法。
28. 前記強塩基が、アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物である、請求項２７記載の方法。
29. 前記強塩基が、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである、請求項２５〜２８記載の方法。
30. 前記強塩基の濃度が、Ｔの濃度よりも係数約１．０〜４．０、好ましくは係数約１．２〜３．０、及び更により好ましくは係数約１．８〜２．２だけより小さい、請求項２５〜２９のいずれか１項記載の方法。
31. ＩＴＰが、陽イオンＩＴＰであり、Ｔ媒体が、強酸を含む、請求項２５又は２６記載の方法。
32. 前記強酸が、塩酸である、請求項３１記載の方法。
33. 前記強酸の濃度が、Ｔの濃度よりも係数約１．０〜４．０、好ましくは係数約１．２〜３．０、及びより好ましくは係数約１．８〜２．２だけより小さい、請求項３１又は３２記載の方法。
34. Ｔ媒体のｐＨが、ＴのｐＫａとほぼ等しい、請求項１〜３３のいずれか１項記載の方法。
35. 希釈されたＴ媒体中のＴの濃度が、隣接するＴ媒体中のＴの濃度よりも係数約２〜係数２０、好ましくは係数約３〜係数１０、より好ましくは係数約５〜係数８だけより小さい、請求項１〜３４のいずれか１項記載の方法。
36. 希釈されたＴ媒体のｐＨが、Ｔ媒体のｐＨとほぼ等しい、請求項１〜３５のいずれか１項記載の方法。
37. Ｓ媒体のｐＨが、隣接する希釈されたＴ媒体のｐＨと隣接するＬ媒体のｐＨの間である、請求項１〜３６のいずれか１項記載の方法。
38. ＩＴＰが、陰イオンＩＴＰであり、そのｐＨが、Ｔ媒体からＬ媒体へ低下する、請求項３７記載の方法。
39. ＩＴＰが、陽イオンＩＴＰであり、そのｐＨが、Ｔ媒体からＬ媒体へ増大する、請求項３７記載の方法。
40. 希釈されたＴ媒体の伝導度が、隣接するＳ媒体の伝導度とほぼ等しい、請求項１〜３９のいずれか１項記載の方法。
41. Ｓ媒体の伝導度が、隣接するＬ媒体の伝導度と本質的に同一である、請求項１〜４０のいずれか１項記載の方法。
42. 希釈されたＴ媒体、Ｓ媒体及びＬ媒体の伝導度が、ほぼ等しい、請求項４０又は４１記載の方法。
43. 電界を生じるための有効電圧が、少なくとも１種の関心対象の被検体を、電気泳動の移動を通じて、被検体組成物から分離するために印加される、請求項１〜４２のいずれか１項記載の方法。
44. 分離が、フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ ＩＴＰ）により実行される、請求項４３記載の方法。
45. 少なくとも１種の関心対象の被検体が、分離ゾーンから溶出される、請求項２〜４４のいずれか１項記載の方法。
46. 少なくとも該被検体の１画分が、電気泳動チャンバーから回収される、請求項４５記載の方法。
47. ＦＦ ＩＴＰ分離が、連続モードで操作される、請求項１〜４６のいずれか１項記載の方法。
48. ＦＦ ＩＴＰ分離が、静的インターバルモードで操作される、請求項１〜４６のいずれか１項記載の方法。
49. ＦＦ ＩＴＰ分離が、周期的インターバルモードで操作される、請求項１〜４６のいずれか１項記載の方法。
50. 関心対象の被検体が、生体粒子、生体高分子、及び生体分子からなる群より選択される、請求項１〜４９のいずれか１項記載の方法。
51. 関心対象の被検体が、細胞、ウイルス、ウイルス粒子、細胞小器官、リポソーム、ホルモン、セルロース誘導体、抗体、抗体複合体、タンパク質凝集体、タンパク質複合体、タンパク質、親油性タンパク質、酸性タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡ、膜、膜断片、脂質、ナノ粒子、糖質及びそれらの誘導体、多糖及びそれらの誘導体、並びにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項５０記載の方法。
52. 関心対象の被検体が、細胞小器官である、請求項５１記載の方法。
53. 関心対象の被検体が、親油性タンパク質である、請求項５１記載の方法。
54. 関心対象の被検体が、ナノ粒子である、請求項５１記載の方法。
55. 関心対象の被検体が、無機分子及び有機分子からなる群より選択される、請求項１〜４９のいずれか１項記載の方法。
56. 関心対象の被検体が、帯電したポリマー、帯電した錯体、ポリ酸、調合薬、プロドラッグ、薬物の代謝産物、爆発物、毒素、発癌物質、毒物、アレルゲン、感染性物質及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項５５記載の方法。
57. 少なくとも１種の関心対象の被検体を被検体組成物から分離するための、キャピラリーＩＴＰ法であって、２個の電極及びそれらの間に介在された分離ゾーンを含むキャピラリー電気泳動分離を実行するのに適した器具を提供すること、ここで、該分離ゾーンは、少なくとも：
    Ｌ’ゾーンを形成する、リーダー電解質（Ｌ）媒体；
    Ｓゾーンを形成する、スペーサー（Ｓ）媒体；及び
    Ｔ’ゾーンを形成する、修飾されたターミネーター電解質（Ｔ’）媒体
    により形成される、
    を含む、前記キャピラリーＩＴＰ法。
58. Ｔ媒体が、Ｔ及び強酸又は強塩基を含む、請求項５７記載の方法。
59. Ｔが、緩衝化合物である、請求項５８記載の方法。
60. キャピラリーＩＴＰが、陰イオンキャピラリーＩＴＰ分離であり、該Ｔ媒体が、強塩基を含む、請求項５８又は５９記載の方法。
61. 前記強塩基が、アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物である、請求項６０記載の方法。
62. 前記強塩基が、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである、請求項６０又は６１記載の方法。
63. 前記強塩基の濃度が、Ｔの濃度よりも、係数約１．０〜４．０、好ましくは係数約１．２〜３．０、又はより好ましくは係数約１．８〜２．２だけより小さい、請求項６０〜６２のいずれか１項記載の方法。
64. キャピラリーＩＴＰが、陽イオンキャピラリーＩＴＰであり、Ｔ媒体が、強酸を更に含む、請求項５８記載の方法。
65. 前記強酸が、塩酸である、請求項６４記載の方法。
66. 前記強酸の濃度が、Ｔの濃度よりも係数約１．０〜４．０、好ましくは係数約１．２〜３．０、又はより好ましくは係数約１．８〜２．２だけより小さい、請求項６４又は６５のいずれか１項記載の方法。
67. Ｔ媒体のｐＨが、ＴのｐＫａとほぼ等しい、請求項５７〜６６のいずれか１項記載の方法。
68. ＦＦ ＩＴＰ分離における、請求項２５〜３４のいずれか１項記載のＴ媒体の使用。
69. キャピラリーＩＴＰ分離における、請求項５８〜６７のいずれか１項記載のＴ’媒体の使用。
70. ＩＴＰ分離における、請求項２５〜３４のいずれか１項記載のＴ媒体から入手可能な希釈されたＴ媒体の使用。
71. 請求項２５〜３４のいずれか１項記載のＴ媒体を少なくとも含む、請求項１〜５６のいずれか１項記載のＩＴＰ分離を実行するためのキット。
72. １種又は複数の実験ＩＴＰプロトコール、及び任意に成分の貯蔵条件を説明する製品マニュアルを更に含む、請求項７１記載のキット。
73. 希釈されたＴ媒体を更に含む、請求項７１又は７２記載のキット。
74. 個別の被検体の分離のために適合された、スペーサー混合物／Ｓ媒体を得るために組み合わされる、Ｓ媒体又は各種スペーサーの組み合わせを更に含む、請求項７１〜７３のいずれか１項記載のキット。
75. Ｌ媒体を更に含む、請求項７１〜７４のいずれか１項記載のキット。
76. Ｌ媒体が、請求項８〜１８のいずれか１項記載のものである、請求項７５記載のキット。
77. Ｌ安定化媒体を更に含む、請求項７１〜７６のいずれか１項記載のキット。
78. Ｌ安定化媒体が、請求項１９〜２４のいずれか１項記載のものである、請求項７７記載のキット。
79. 請求項２５〜３４のいずれか１項記載のＴ媒体を少なくとも含む、請求項５７〜６７のいずれか１項記載のキャピラリー電気泳動ＩＴＰ分離を実行するためのキット。
80. １種又は複数の実験キャピラリーＩＴＰプロトコール、及び任意に成分の貯蔵条件を説明する製品マニュアルを更に含む、請求項７８又は７９記載のキット。
81. Ｌ媒体を更に含む、請求項７８〜８０のいずれか１項記載のキット。
82. Ｌ媒体が、請求項８〜１８のいずれか１項記載のものである、請求項８１記載のキット。
83. 個別の被検体の分離のために適合された、スペーサー混合物／Ｓ媒体を得るために組み合わされる、Ｓ媒体又は各種スペーサーを更に含む、請求項７８〜８２のいずれか１項記載のキット。
84. キットの成分が、各々、請求項１〜５６のいずれか１項記載のＩＴＰ分離、又は請求項５７〜６７のいずれか１項記載のキャピラリーＩＴＰ分離において直ぐ使用される水溶液として存在する、請求項７１〜８３のいずれか１項記載のキット。
85. キットの成分が、各々、請求項１〜５６のいずれか１項記載のＩＴＰ分離、又は請求項５７〜６７のいずれか１項記載のキャピラリーＩＴＰ分離において使用するのに適した濃度に希釈される、濃縮された水性ストック溶液として存在する、請求項７１〜８３のいずれか１項記載のキット。
86. 各ストック溶液が、互いに独立して、１．５×、２×、２．５×、５×、１０×、２０×、２５×、５０×、７５×、１００×、１５０×、２００×、及び１０００×からなる群より選択される濃度を有する、請求項８５記載のキット。
87. キットの成分が、各々、請求項１〜５１のいずれか１項記載のＦＦ ＩＴＰ分離、又は請求項５２〜６２のいずれか１項記載のキャピラリーＩＴＰ分離において使用するのに適した濃度に、溶媒、好ましくは水で溶解される乾燥形又は凍結乾燥形で存在する、請求項７１〜８３のいずれか１項記載のキット。
88. 前記キットの各成分、各乾燥成分及び／又は各ストック溶液が、密閉容器内に個別に配置されている、請求項７１〜８７のいずれか１項記載のキット。
89. １組の電極、ここで該電極の少なくとも１個は陰極であり及び該電極の少なくとも１個は陽極であり、及びその間に介在された分離ゾーン、を含む電気泳動チャンバーを含む器具であって、
    少なくとも１種のＴ媒体を含む、ターミネーター電解質（Ｔ）ゾーン；
    少なくとも１種の希釈されたＴ媒体を含む、希釈されたＴゾーン；
    少なくとも１種のＬ媒体を含む、リーダー電解質（Ｌ）ゾーン；
    少なくとも１種のＬ安定化媒体の、Ｌ安定化ゾーン；及び、
    場合により、該分離ゾーン内の、少なくとも１種のＳ媒体により形成された、スペーサー（Ｓ）ゾーン
    を形成するための手段を更に含む、前記器具。
90. 前記器具が、請求項１〜５６のいずれか１項記載の方法を実行するために適合されている、請求項８９記載の器具。
91. ＦＦ ＩＴＰによる、少なくとも１種の関心対象の被検体の被検体組成物からの分離を実行するための、請求項９０記載の器具。
92. それを通って媒体類がチャンバー内に導入される少なくとも５個の注入口を含み；更に
    ここで、２個の隣接する「ａ」注入口が、「Ａ」注入口の内側口径Ｄと比べ、最大でも係数０．８の内側口径ｄを有し、
    少なくとも１個の「Ａ」注入口は、該２個の隣接する「ａ」注入口及び各電極の間に位置し；並びに、更にここで、
    ａ）該２個の隣接する「ａ」注入口の間の距離は、最大でも「Ａ」注入口の対の間の距離の係数０．８であり；及び
    ｂ）該２個の隣接する「ａ」注入口の間の距離は、最大でも「ａ」注入口と「Ａ」注入口の間の距離の係数０．８である、請求項９１記載の器具。
93. 前記２つの隣接する「ａ」注入口のｄが、電極と該２つの隣接する注入口の間に位置する該「Ａ」注入口のＤと比べ、最大でも係数０．６５、好ましくは最大でも係数０．５である、請求項９２記載の器具。
94. 注入口を互いに分離する分離アームを備える分離装置を更に含み、ここで該２つの隣接する「ａ」注入口を互いに及び隣接する「Ａ」注入口から独立して分離する分離アームが、「Ａ」注入口を互いに分離する分離アームよりも、少なくとも係数１．５、好ましくは少なくとも係数１．８、より好ましくは少なくとも係数２だけより長い長さを有する、請求項９２又は９３記載の器具。
95. １個の電極と該「ａ」注入口の間の「Ａ」注入口の数が、少なくとも２個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、及び最も好ましくは少なくとも１０個であり、並びに他方の電極と該２個の隣接する注入口の間の注入口の数が、４個以下、好ましくは２個以下、及び最も好ましくは１個である、請求項９２〜９４のいずれか１項記載の器具。
96. フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ ＩＴＰ）による、少なくとも１種の関心対象の被検体の被検体組成物からの分離のための、請求項８９〜９５のいずれか１項記載の器具の使用。
97. 電気泳動法であって、以下のステップ：
    １組の電極、ここで該電極の少なくとも１個は陰極であり及び該電極の少なくとも１個は陽極であり、及び該電極の間に介在した分離ゾーン、を含む電気泳動チャンバーを提供すること、並びに
    該分離ゾーンを以下：
    少なくとも１種のＴ媒体により形成された、ターミネーター電解質（Ｔ）ゾーン；
    少なくとも１種の希釈されたＴ媒体により形成された、希釈されたＴゾーン；
    少なくとも１種のＬ媒体により形成された、リーダー電解質（Ｌ）ゾーン；及び
    少なくとも１種のＬ安定化媒体により形成された、Ｌ安定化ゾーン
    を含むように構成すること、
    を含む、前記電気泳動法。
98. 前記分離ゾーンが、少なくとも１種のＳ媒体により形成されたスペーサー（Ｓ）ゾーンを更に含むように構成される、請求項９７記載の電気泳動法。
99. 電気泳動チャンバーが、少なくとも１種の関心対象の被検体を受け取るように更に構成される、請求項９７記載の方法。
100. 前記方法が、ＩＴＰにより、少なくとも１種の関心対象の被検体を、被検体組成物から分離するためである、請求項９７記載の方法。
101. Ｓゾーン及びＬゾーンが、分離ゾーン内に有効分離ゾーンを形成し、ここで電気泳動分離開始時の該Ｌゾーンの幅が、該隣接するＳゾーンの幅よりも、少なくとも係数８だけより広い、請求項９８記載の方法。
102. 電気泳動分離の開始時の有効分離ゾーンの幅が、該電極間の分離ゾーンの幅の４５％と等しいか又はより大きい、請求項９８記載の方法。
103. Ｓゾーンの幅が、電気泳動分離開始時の希釈されたＴゾーンの幅とほぼ等しく、更にここで電極と希釈されたＴゾーンの間のＴゾーンの幅が、電気泳動分離の開始時の希釈されたＴゾーンと隣接するＳゾーンの一緒にした幅とほぼ等しいか又はより大きい、請求項９８記載の方法。
104. 前記方法が、陰イオンＩＴＰであり、Ｌが強酸に由来するか、又はここで該方法が、陽イオンＩＴＰであり、Ｌが強塩基に由来する、請求項９７記載の方法。
105. 前記Ｔ媒体が、Ｔ、及びＩＴＰが陽イオンＩＴＰである場合には強酸を含むか、又はＩＴＰが陰イオンＩＴＰである場合には強塩基を含み；
     Ｔが、緩衝化合物であり；並びに
     更にここで該強酸又は強塩基の濃度が、Ｔの濃度よりも、係数約１．２〜３．０だけより小さい、請求項９７記載の方法。
106. Ｔ媒体のｐＨが、ＴのｐＫａとほぼ等しい、請求項９７記載の方法。
107. 希釈されたＴ媒体中のＴの濃度が、隣接するＴ媒体中のＴの濃度よりも、係数約２〜係数２０だけより小さい、請求項９７記載の方法。
108. Ｓ媒体が、隣接する希釈されたＴ媒体のｐＨと隣接するＬ媒体のｐＨの間のｐＨを有する、請求項９８記載の方法。
109. 前記方法が陰イオン被検体の分離に関する場合は、ｐＨが、Ｔ媒体からＬ媒体へと低下するか、又は該方法が陽イオン被検体の分離に関する場合は、ｐＨが、Ｔ媒体からＬ媒体へと増大する、請求項９７記載の方法。
110. 希釈されたＴ媒体、Ｓ媒体及びＬ媒体の伝導度が、互いにほぼ等しい、請求項９８記載の方法。
111. 前記方法が、ＩＴＰにより、少なくとも１種の関心対象の被検体を、被検体組成物から分離するためであり、ここで該関心対象の被検体が、細胞、ウイルス、ウイルス粒子、細胞小器官、リポソーム、ホルモン、セルロース誘導体、抗体、抗体複合体、タンパク質凝集体、タンパク質複合体、タンパク質、親油性タンパク質、酸性タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡ、膜、膜断片、脂質、糖質及びそれらの誘導体、多糖及びそれらの誘導体、帯電した高分子、帯電した錯体、ポリ酸、調合薬、プロドラッグ、薬物の代謝産物、爆発物、毒素、発癌物質、毒物、アレルゲン、感染性物質のナノ粒子、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項９７記載の方法。
112. 前記方法が、フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ ＩＴＰ）法であり、ここで該ＦＦ ＩＴＰ分離の操作モードが、連続モード、静的インターバルモード及び周期的インターバルモードからなる群より選択される、請求項９７記載の方法。
113. 少なくとも１種の関心対象の被検体を被検体組成物から分離するための、キャピラリーＩＴＰ法であって、
     ２個の電極及び該２個の電極間の分離ゾーンを含むキャピラリー電気泳動分離を実行するのに適している器具を提供すること；並びに
     該分離ゾーンを以下：
     Ｌ’ゾーンを形成するリーダー電解質（Ｌ）媒体；
     Ｓゾーンを形成するスペーサー（Ｓ）媒体；及び
     Ｔ’ゾーンを形成する修飾されたターミネーター電解質（Ｔ’）媒体
     を含むよう構成すること、
     を含む、前記方法。
114. Ｔ’媒体が、Ｔ、キャピラリーＩＴＰが陽イオンキャピラリーＩＴＰである場合には、強酸、又はキャピラリーＩＴＰが陰イオンキャピラリーＩＴＰである場合には、強塩基
     を含み、及び更にＴは、緩衝化合物である、請求項１１３記載の方法。
115. Ｔ’媒体が、ＴのｐＫａ値とほぼ等しいｐＨを有する、請求項１１３記載の方法。
116. 少なくとも被検体の被検体組成物からのＩＴＰ分離を実行するためのキットであって、以下：
     緩衝化合物であるターミネーターＴを含むＴ媒体、及び
     強塩基（陰イオンＩＴＰ）、又は強酸（陽イオンＩＴＰ）
     を含む、前記キット。
117. １種又は複数の実験ＩＴＰプロトコール、及び任意に成分の貯蔵条件を説明する製品マニュアルを更に含む、請求項１１６記載のキット。
118. １組の電極、ここで該電極の少なくとも１個は陰極であり及び該電極の少なくとも１個の電極は陽極であり、及びそれらの間に介在された分離ゾーン、を含む電気泳動チャンバーを含む器具であって、ここで該分離ゾーンは、以下：
     ターミネーター電解質（Ｔ）ゾーン；
     希釈されたＴゾーン；
     リーダー電解質（Ｌ）ゾーン；及び
     Ｌ安定化ゾーン
     を含むように構成される、前記器具。
119. フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ ＩＴＰ）により、少なくとも１種の関心対象の被検体を被検体組成物から分離するように構成されている、請求項１１８記載の器具。
120. 前記分離ゾーンが、少なくとも１種のＳ媒体により形成されるスペーサーＳゾーンを更に備えるように構成され、
     それを通り該媒体類がチャンバーへ導入される少なくとも５個の注入口を備え；並びに
     ２個の隣接する「ａ」注入口が、「Ａ」注入口の内側口径Ｄと比べ、最大でも係数０．８の内側口径ｄを有し、ここで少なくとも１個の「Ａ」注入口が、該２個の「ａ」注入口と各電極の間に配置されている、請求項１１８記載の器具。
121. 注入口を互いに分離する、分離アームを備える分離装置を更に含み、ここで２個の隣接する「ａ」注入口を互いに及び隣接する「Ａ」注入口から独立して分離する分離アームは、「Ａ」注入口を互いに分離する分離アームよりも少なくとも係数１５だけより長い長さを有する、請求項１１８記載の器具。

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