JP2010507371A - 病原体を同定するためのアッセイ及び装置 - Google Patents

病原体を同定するためのアッセイ及び装置 Download PDF

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Abstract

病原体から単離されるリボソームからのタンパク質翻訳に基づく、病原体を同定するための方法及び装置を提供する。

Description

代謝産物、核酸及びそのタンパク質を含む、対象に感染した細菌の検出は、医学的障害の診断及び治療ならびに研究における基本要素である。現在、多くの方法が検出のために使用されている。
これらの方法は、通常、タンパク質に対する抗体に基づく診断アッセイ(細菌の成分又は疾患の副産物の何れか)及び細菌の成分をコードする遺伝物質などの核酸に対する診断アッセイに分けることができる。
核酸検出に対する既存の方法には、反応条件が複雑であるため、信頼性を得るために高い技術的能力が必要とされ(例えば、PCRには熱サイクリングが必要である。)、混入に対する感受性が非常に高くなる可能性があり(結果として偽陽性となる。);これらは、定性的ではなく定量的に使用することは困難であり、従って、これらの感度は低下する。さらに、これらは、完了するのに時間を要することが多い。タンパク質検出のための方法は、一般に、シグナル生成及び増幅を上昇させるために、(通常はさらなるアッセイ成分に対する)酵素の結合に依存する。これらのさらなるリガンドの使用によって、その系のノイズが増加し、バックグラウンドが高くなり、偽陽性が増え、いくつかのレベルの対照反応の必要性が高まる。
例えば、診断又は治療目的に対して、病原体を同定するために病原体からのリボソームを用いる方法を提供する。リボソームは、特定の病原体に特異的であり、従って、病原体のリボソームに対して特異的な結合剤を用いて単離されたリボソームとともに核酸鋳型を用いてポリペプチドを産生することができるか否かを調べることに基づき、試料中の病原体の同定又は有無を調べ得る。本方法は、複雑な反応条件を回避して、1つの温度で行われ得る。さらに、リボソームによる鋳型の増幅は迅速であり、10秒毎に少なくとも約20,000の標的分子が産生され、非常に感度が高い。さらにまた、増幅反応そのものは一般的であり、検出しようとする病原体に基づき、試験ごとに異なるリボソームを固定化するために使用するのは核酸鋳型及び結合剤のみである。このようにして、試験キットの製造及び本方法の実施のための装置が劇的に簡素化され得る。
本方法は、本方法の実施に適切なあらゆる試験方式又は装置に組み込まれ得る。また、本方法の実施のための、キット、試薬なども提供される。
本方法のさらなる目的及び長所は、説明が進むに従い明らかとなろう。本発明の範囲を完全に理解するために、本発明の様々な態様を組み合わせて、本発明の所望の実施形態を得ることができることが認められよう。
発明の詳細な説明
上記で別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。用語が単数で与えられる場合、発明者らはまた、その用語の複数も意図する。本明細書中で使用される命名法及び下記に記載の手段は、当技術分野において周知であり一般的に使用されるものである。
「アミノ酸」という用語は、天然であれ合成であれ、全ての分子を包含するものとし、これらは、アミノ官能基及び酸性官能基の両方を含み、天然アミノ酸のポリマー中に含まれ得る。代表的なアミノ酸は、天然アミノ酸;その類似体、誘導体及びコンジナー;種々の側鎖を有するアミノ酸類似体;及び前記の何れかの全ての立体異性体を含む。天然アミノ酸の名称は、IUPAC−IUBの推奨に従い、本明細書中で略記する。
「抗体」という用語は、免疫グロブリン、特異的結合能を維持するその誘導体及び免疫グロブリン結合ドメインと相同であるか又は相同性が高い結合ドメインを有するタンパク質を指す。これらのタンパク質は、天然のソース由来又は部分的もしくは全体的に合成産生されたものであり得る。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得る。抗体は、ヒトクラス:IgG、IgM、IgA、IgD及びIgEの何れかを含む、あらゆる免疫グロブリンクラスのメンバーであり得る。代表的な実施形態において、本明細書中に記載の方法及び組成物とともに使用される抗体は、IgGクラスの誘導体である。
「抗体断片」という用語は、全長より短い抗体の何らかの誘導体を指す。代表的な実施形態において、抗体断片は、少なくとも全長抗体の特異的結合能のかなりの部分を保持する。抗体断片の例には、以下に限定されないが、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、dsFvダイアボディ及びFd断片が含まれる。抗体断片は、何らかの手段で作製され得る。例えば、抗体断片は、完全な抗体の断片化によって、酵素的又は化学的に作製され得るか、部分的抗体配列をコードする遺伝子から組み換えにより作製され得るか、又はこれは、完全又は部分的に合成によって作製され得る。抗体断片は、場合によっては、1本鎖抗体断片であり得る。あるいは、この断片は、例えばジスルフィド結合により1つに連結される複数の鎖を含み得る。この断片はまた、場合によっては、複数分子の複合体でもあり得る。機能的抗体断片は、通常、少なくとも約50アミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約200アミノ酸を含む。
「含む(Ccomprise及びcomprising)」という用語は、包含的で、オープンセンスで、さらなる要素が含まれ得る意味において、使用される。
「含む(including)」という用語は、本明細書中で、「含むが限定されない」という意味で使用される。「含む」及び「含むが限定されない」は、交換可能に使用される。
「mRNA」という用語は、メッセンジャーRNA又は、細胞におけるタンパク質合成に対する鋳型となるRNAを指す。mRNAの鎖の配列は、合成されるべきタンパク質をコードする配列を含むDNAの相補的鎖の配列に基づく。
「核酸」は、デオキシリボ核酸(DNA)及び、場合によってはリボ核酸(RNA)などのポリヌクレオチドを指す。この用語は、また、同等物として、ヌクレオチド類似体から作製された、RNA又はDNAの何れかの類似体、及び、記載される実施形態に適用可能な場合は、1本鎖(センス又はアンチセンス)及び2本鎖ポリヌクレオチドも含むものと理解されたい。EST、染色体、cDNA、mRNAs及びrRNAは、核酸と呼ばれ得る分子の代表例である。
「病原体」という用語は、細菌、菌類、寄生生物、ウイルスなど、対象において疾患を引き起こし得る何らかの生物を指す。
「タンパク質(1本鎖の場合)」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、遺伝子産物を指す場合(例えば、コード配列によりコードされ得る場合)、本明細書中で交換可能に使用される。本明細書中で「ポリペプチド」を指す場合、当業者にとって当然のことながら、文脈において別段の指定が明確にない限り、代わりにタンパク質を使用することができる。「タンパク質」はまた、1以上のポリペプチドの会合も指し得る。
「試料」という用語は、リボソームを含有する病原体を含有する可能性がある何らかの試料を指す。
「リボソームRNA」又は「rRNA」という用語は、リボソームサブユニットのRNA成分を指す。リボソーム及びそれらのサブユニットを下記でさらに説明する。
ある態様において、
(a)リボソームを結合させるとができる結合剤を含む支持体を、リボソームを含む試料と接触させること;
(b)試料との接触後に支持体を洗浄すること;
(c)溶液中でmRNAをポリペプチドに翻訳するために、リボソームを結合剤に結合させられるようにするのに適切な条件下で、mRNA及びアミノ酸を含む溶液の存在下で支持体を温置すること;
(d)ポリペプチドの存在を調べること、
を含む方法が提供される。
ある種の実施形態において、リボソームは病原体に特異的であり、本方法は、ポリペプチドの存在に基づき試料中の病原体の存在を調べることをさらに含む。
別の態様において、
(a)リボソームを結合させることができる結合剤を使用して支持体上でリボソームを捕捉すること;
(b)mRNA及びアミノ酸を含む溶液とともに捕捉されたリボソームを温置すること;
(c)温置され、捕捉されたリボソームにより産生されるポリペプチドを検出すること、を含む方法が提供される。
リボソームは、原核及び真核生物の両方に存在するリボヌクレオタンパク質である。これらは、約3分の2のRNA及び3分の1のタンパク質を含む。リボソームは、タンパク質合成に関与する細胞器官である。遺伝子発現中、リボソームは、メッセンジャーRNA中にコードされる遺伝情報をタンパク質に翻訳する(Garrettら(2000)「The ribosome:Structure,Function,Antibiotics and Cellular Interactions」、American Society for Microbiology、Washington、D.C.)。
リボソームは、2つの同等ではないリボヌクレオタンパク質サブユニットを含む。大きいサブユニット(「リボソーム大サブユニット」としても知られる。)は、小さいサブユニット(「リボソーム小サブユニット」としても知られる。)の約2倍の大きさである。リボソーム小サブユニットは、メッセンジャーRNA(mRNA)に結合し、mRNAと転移RNA(tRNA)アンチコドン間の相互作用(翻訳の忠実度はこれに依存する。)に介在する。リボソーム大サブユニットは、ペプチド結合形成を触媒し(−タンパク質合成のペプチジルトランスフェラーゼ反応)、(少なくとも)2つの異なるtRNA結合部位:入ってくるアミノアシル−tRNAを受け入れるA−部位(これは、伸長するペプチド鎖にそのアミノ酸を導こうとすることである。)及びペプチジル−tRNA複合体(即ち、これまでのところペプチド鎖に付加されてきた全てのアミノ酸に連結したtRNA)を受け入れるP−部位を含む。リボソーム大サブユニットはまた、タンパク質合成の開始、伸長及び停止期に関与するG−タンパク質因子に対する1以上の結合部位も含む。リボソーム大及び小サブユニットは、タンパク質合成の開始期には独立して振舞うが、これらは、伸長が開始される頃には完全なリボソームの構造になる。
従って、本明細書中で使用される場合、「リボソーム」という用語は、リボソーム大サブユニット及びリボソーム小サブユニットを含む複合体を指す。リボソーム大サブユニット及びリボソーム小サブユニットは、細菌においてはそれぞれ50S及び30Sサブユニットであり、真核生物においてはそれぞれ60S及び40Sサブユニットである。
リボソームを含む試料の調製を説明するプロトコールは文献において入手可能であり、当業者により必要とされる場合、適合させることができる。例えば、基本的にYoumans及びYoumans、1965により記載のように、細菌からのリボソームの調製を行うことができ、Gregoryら、1983により記載のように適合させることができる。一般に、しかし、特に毒性微生物(病原性)を使用する場合、例えば、Michalek及びMcGhee、1977により記載されるようにホルマリンでの処理によって、さらなる使用の前に細胞を死滅させ、10細菌又は菌類細胞/mL又は10個原生動物/mLに濃度を調整することが推奨される。ヒツジ血液及びミティス・サリバリウス(Mitis Salivarius)寒天(DIFCO)又はその他の適合富栄養培地上での接種時に複製が起こらない場合、この調製物が滅菌状態であり得ることが証明される。−80℃でアリコートを保存する。次に、これらを37℃で急速に凍結融解し、3μg/mL Dnase(SIGMA)が添加されたPMB 1mL中の微小ガラスビーズ1g(0.17−0.18mm)とともに全細胞の1gを再懸濁する。2分間のサイクルを3回、Braunホモジェナイザー中で振ることにより細胞を破壊する。2回遠心(27.000.time.gの後、47.000.time.g;各10分間)を行うことにより、無傷の細胞及び細胞の破片を除去する。
菌類及び原生動物からのリボソームの調製は、基本的に、同じ手順に従うが、培養条件及び溶解法の改変が必要である。培養可能な病原性微生物の培養条件が公開文献で広く入手可能である場合、このような微生物からのリボソーム調製は、当業者にとって十分に可能である。
リボソームサブユニットが完全な状態であることは重要である。特に、MgClによって与えられるものなどの二価陽イオンにより囲まれた大きなリボソームRNAの安定化に対して、微生物及び使用される抽出プロトコールによって濃度を調整することが必要であり得る。180.000から250.000.time.gで2から3時間の遠心によって、上清中のリボソームを回収し、次いで各2から3時間、180.000から250.000.time.gでPMB中で5回連続洗浄を行うことができる。次に、リボソーム調製物を47.000time.gで20分間、2回遠心することによって2回透明化し、滅菌0.45ミクロンMilliporeフィルター(Millipore Filter Corp.)を通じて上清をろ過する。M.M.Yusupov及びA.S.Spirin、1988に記載のように改変してStaehilinら、1969の方法に従い、大腸菌(Escherichia coli)MRE600などのグラム陰性のRnaseマイナス突然変異細菌から非解離(=無傷)リボソームを調製することができる。次に、例えば標準物質としてウシ血清アルブミンを用いて、標準的タンパク質定量法によるタンパク質含量に基づき、例えば20mg/mLに調製物を調整し、使用まで−80℃で維持することができる。リボソームタンパク質及び潜在的な混入タンパク質の有無を評価することを可能にするDNAポリアクリルアミドゲル電気泳動によってリボソームRNAの混入を調べるために、235、280及び260nmでのスペクトル分析により、リボソーム分画の特徴及び純度を調べることができる。MgClの適切な濃度を含有する10%から40%のショ糖勾配に元のホモジェネートの試料を添加すること及び遠心によって、無傷の程度を評価することができる。ショ糖勾配の溶出プロファイルは、様々な分画を示す:100S=70Sリボソームの二量体、70S=無傷のリボソーム、60S=相互作用する50S及び30Sリボソームサブユニット、50S=リボソーム大サブユニット、30S=リボソーム小サブユニット、30S未満の物質=分解産物及び夾雑物。非解離リボソームを標的とする良好な調製において、70Sピークは、全ての物質の80%を超えるものを含有する。場合によっては、標的の非解離リボソームを含有する70Sピークは、全物質の少なくとも50%、60%、70%又は90%を構成し得る。
上記方法を用いて検出し得る病原体には、リボソームを含むあらゆる生物が含まれる。リボソームが単離され得る生物には、以下に限定されないが、次のものが含まれる:
アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)、A.ヘモリチクス(A.haemolyticus)、エアロモナス・ヒドロフィリア(Aeromonas hydrophilia)、バクテロイド・フラジリス(Bacteroides fragilis)、B.ディスタスノシス(B.distasonis)、バクテロイド(Bacteroides)3452Aホモロジー群、B.ブルガツス(B.vulgatus)、B.オバルス(B.ovalus)、B.テタイオタオミクロン(B.thetaiotaomicron)、B.ユニホルミス(B.uniformis)、B.エガーシイ(B.eggerthii)、B.スプランキニクス(B.splanchnicus)、ブラナメラ・カタラリス(Branhamella catarrhalis)、カンピロバクターフェトゥス(Campylobacterfetus)、C.ジェジュニ(C.jejuni)、C.コリ(C.coli)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacterfreundii)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、C.ジフテリエ(C.diphtheriae)、C.ウルセランス(C.ulcerans)、C.アコレンス(C.accolens)、C.アフェルメンタンス(C.afermentans)、C.アミコラトゥム(C.amycolatum)、C.アルゲントレンス(C.argentorense)、C.アウリス(C.auris)、C.ボビス(C.bovis)、C.コンフスム(C.confusum)、C.コイレア(C.coyleae)、C.ドゥルム(C.durum)、C.ファルセニ(C.falsenii)、C.グルクロノリチクム(C.glucuronolyticum)、C.イミタンス(C.imitans)、C.ジェイケイウム(C.jeikeium)、C.クツシェリ(C.kutscheri)、C.クロッペンステッティイ(C.kroppenstedtii)、C.リポフィルム(C.lipophilum)、C.マクギンレイ(C.macginleyi)、C.マトルコティ(C.matruchoti)、C.ムシファシエンス(C.mucifaciens)、C.ピロスム(C.pilosum)、C.プロピンクーム(C.propinquum)、C.レナーレ(C.renale)、C.リエゲリ(C.riegelii)、C.サンギニス(C.sanguinis)、C.シングラレ(C.singulare)、C.ストリアトゥム(C.striatum)、C.スンズバレンス(C.sundsvallense)、C.トムセニ(C.thomssenii)、C.ウレアリティクム(C.urealyticum)、C.キセロシス(C.xerosis)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、E.エアロゲネス(E.aerogenes)、エンテロコッカス・アビウム(Enterococcus avium)、E.カッセリフラブス(E.casseliflavus)、E.セコルム(E.cecorum)、E.ディスパー(E.dispar)、E.ドゥランス(E.durans)、E.フェカリス(E.faecalis)、E.フェシウム(E.faecium)、E.フラベセンス(E.flavescens)、E.ガリナルム(E.gallinarum)、E.ヒラエ(E.hirae)、E.マロドラトゥス(E.malodoratus)、E.マンティ(E.mundtii)、E.シュードアビウム(E.pseudoavium)、E.ラフィノサス(E.raffinosus)、E.ソリタリウス(E.solitarius)、フランシセラ・トゥラレンシス(Francisella tularensis)、ガルドネレラ・バギナリス(Gardnerella vaginalis)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、キンゲラ・デントリフィカンス(Kingella dentrificans)、K.キンガエ(K.kingae)、K.オラリス(K.oralis)、クレブシエラ・ニューモニア(Klebsiella pneumoniae)、K.オキシトカ(K.oxytoca)、モラクセラ・カタラリス(Moraxella catarrhalis)、M.アトランタエ(M.atlantae)、M.ラクナタ(M.lacunata)、M.ノンリケファシエンス(M.nonliquefaciens)、M.オスロエンシス(M.osloensis)、M.フェニルピルビカ(M.phenylpyruvica)、モルガネラ・モルガニイ(Morganela morganii)、パラクラミジアアミジア・アカントアメーバ(Parachlamydia acanthamoebae)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、P.ヘモリチカ(P.haemolytica)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、P.レトゲリ(P.rettgeri)、P.ストゥアルティ(P.stuartii)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シムカニア・ネゲベンシス(Simkania negevensis)、ストレプトコッカス・ニューモニア(Streptococcus pneumoniae)、S.アガラクチエ(S.agalactiae)、S.ピロゲネス(S.pyrogenes)、トレポネマ・パリドゥム(Treponema pallidum)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)及びV.パラヘモリチクス(V.parahaemolyticus)などの細菌由来のリボソーム。
ボルデテラ・ペルトゥシス(Bordetella pertussis)、B.パラペルトゥシス(B.parapertussis)、B.ブロンキセプチカ(B.bronchiseptica)、ブルコルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、エスケリキア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・アクチノミセトコミタンス(Haemophilus actinomycetemcomitans)、H.エギプチクス(H.aegyptius)、H.アフロフィルス(H.aphrophilus)、H.ドゥクレイ(H.ducreyi)、H.フェリス(H.felis)、H.ヘモグロビノフィルス(H.haemoglobinophilus)、H.ヘモリチクス(H.haemolyticus)、H.インフルエンザ(H.influenzae)、H.パラガリナルム(H.paragallinarum)、H.パラヘモリチクス(H.parahaemolyticus)、H.パラインフルエンザ(H.parainfluenzae)、H.パラフロヘモリチクス(H.paraphrohaemolyticus)、H.パラフロフィルス(H.paraphrophilus)、H.パラスイス(H.parasuis)、H.ピシウム(H.piscium)、H.セグニス(H.segnis)、H.ソムヌス(H.somnus)、H.バギナリス(H.vaginalis)、レジオネラ・アデライデンシス(Legionella adelaidensis)、L.アニサ(L.anisa)、L.ベリアルデンシス(L.beliardensis)、L.ビルミンガメンシス(L.birminghamensis)、L.ボゼマニイ(L.bozemanii)、L.ブルネンシス(L.brunensis)、L.ケリイ(L.cherrii)、L.シンシナチエンシス(L.cincinnatiensis)、レジオネラ・ドロザンスキイ(Legionella drozanskii)、L.ドゥモフリ(L.dumoffli)、L.エリスラ(L.erythra)、L.ファイルフィエルデンシス(L.fairfieldensis)、L.ファロニイ(L.fallonii)、L.フェエレイ(L.feeleii)、L.ゲエスチアナ(L.geestiana)、L.ゴルマニイ(L.gormanii)、L.グラチアナ(L.gratiana)、L.グレシレンシス(L.gresilensis)、L.ハッケリエ(L.hackeliae)、L.イスラレンシス(L.israelensis)、L.ジョルダニス(L.jordanis)、L.ランシンゲンシス(L.lansingensis)、レジオネラ・ロンディニエンシス(Legionella londiniensis)、L.ロングビーカエ(L.longbeachae)、レジオネラ・リチカ(Legionella lytica)、L.マセケルニイ(L.maceachernii)、L.ミクダデイ(L.micdadei)、L.モラビカ(L.moravica)、L.ナウタルム(L.nautarum)、L.オアクリドゲンシス(L.oakridgensis)、L.パリシエンシス(L.parisiensis)、L.ピッツブルゲンシス(L.pittsburghensis)、L.ニューモフィラ(L.pneumophila)、L.クアテイレンシス(L.quateirensis)、L.キンリバニイ(L.quinlivanii)、L.ロウボサミイ(L.rowbothamii)、L.ルブリルセンス(L.rubrilucens)、L.セインセレンシ(L.sainthelensi)、L.サンチクルシス(L.santicrucis)、L.シャケスペレイ(L.shakespearei)、L.スピリテンシス(L.spiritensis)、L.ステイガワルチ(L.steigerwaltii)、L.タウリネンシス(L.taurinensis)、L.タクソネンシス(L.tucsonensis)、L.ワズワーチ(L.wadsworthii)、L.ワルテルシ(L.waltersii)、L.ウォルスレイエンシス(L.worsleiensis)、リステリア・デントリフィカンス(Listeria dentrificans)、L.グライ(L.grayi)、L.イノキュア(L.innocua)、L.イバノビ(L.ivanovii)、L.モノシトゲネス(L.monocytogenes)、L.シーリンゲリ(L.seeligeri)、L.ウェルシメリ(L.welshimeri)、ミコバクテリウム・アブセサス(Mycobacterium abscessus)、M.アフリカヌム(M.africanum)、M.アグリ(M.agri)、M.アイチエンス(M.aichiense)、M.アルベイ(M.alvei)、M.アジアティクム(M.asiaticum)、M.アウルム(M.aurum)、M.アウストロアフリカヌム(M.austroafricanum)、M.アビウム(M.avium)、M.ボヘミクム(M.bohemicum)、M.ボビス(M.bovis)、M.ブランデリ(M.branderi)、M.ブルメ(M.brumae)、M.セラトゥム(M.celatum)、M.ケロナエ(M.chelonae)、M.チタエ(M.chitae)、M.クロロフェノリクム(M.chlorophenolicum)、M.チュブエンス(M.chubuense)、M.コンフルエンチス(M.confluentis)、M.コンスピクム(M.conspicuum)、M.コッキイ(M.cookii)、M.ディエルノフェリ(M.diernhoferi)、M.ドリクム(M.doricum)、M.ドゥバリイ(M.duvalii)、M.エレファンチス(M.elephantis)、M.ファラックス(M.fallax)、M.ファルシノゲネス(M.farcinogenes)、M.フラベセンス(M.flavescens)、M.ホルトゥイトゥム(M.fortuitum)、M.フレデリクスベルゲンス(M.frederiksbergense)、M.ガディウム(M.gadium)、M.ガストリ(M.gastri)、M.ゲナベンス(M.genavense)、M.ギルブム(M.gilvum)、M.グッディイ(M.goodii)、M.ゴルドネ(M.gordonae)、M.ヘモフィルム(M.haemophilum)、M.ハッシアクム(M.hassiacum)、M.ヘッケスホルネンス(M.heckeshornense)、M.ハイデルベルゲンス(M.heidelbergense)、M.ヒベルニエ(M.hiberniae)、M.イムノゲヌム(M.immunogenum)、M.イントラセルラレ(M.intracellulare)、M.インテルゲクトゥム(M.interjectum)、M.インテルメディウム(M.intermedium)、M.カンサシイ(M.kansasii)、M.コモセンス(M.komossense)、M.クビカエ(M.kubicae)、M.レンチフラブム(M.lentiflavum)、M.レプラエ(M.leprae)、M.レプレムリウム(M.lepraemurium)、M.ルテウム(M.luteum)、M.マダガスカリエンス(M.madagascariense)、M.マゲリテンス(M.mageritense)、M.マルモエンス(M.malmoense)、M.マリヌム(M.marinum)、M.ミクロチ(M.microti)、M.モリオカエンス(M.moriokaense)、M.ムコゲニクム(M.mucogenicum)、M.ムラレ(M.murale)、M.ネオアウルム(M.neoaurum)、M.ノンクロモゲニクム(M.nonchromogenicum)、M.ノボカストレンス(M.novocastrense)、M.オブエンス(M.obuense)、M.パルクホルトゥイトゥム(M.parqfortuitum)、M.パラツベルクロシス(M.paratuberculosis)、M.ペレグリヌム(M.peregrinum)、M.ファージ(M.phage)、M.フェレイ(M.Phlei)、M.ポルシヌム(M.porcinum)、M.ポリフェラエ(M.poriferae)、M.プルベリス(M.pulveris)、M.ロデシアエ(M.rhodesiae)、M.スクロフラセウム(M.scrofulaceum)、M.セネガレンス(M.senegalense)、M.セプチクム(M.septicum)、M.セプチクム(M.septicum)、M.シモイデイ(M.shimoidei)、M.シミアエ(M.simiae)、M.スメグマチス(M.smegmatis)、M.スファグニ(M.sphagni)、M.スズルガイ(M.szulgai)、M.テラエ(M.terrae)、M.テルモレシスチビレ(M.thermoresistibile)、M.トカイエンス(M.tokaiense)、M.トリプレックス(M.triplex)、M.トリビアレ(M.triviale)、M.ツベルクロシス(M.tuberculosis)、M.ツシアエ(M.tusciae)、M.ウルセランス(M.ulcerans)、M.バッカエ(M.vaccae)、M.ウォリンスキイ(M.wolinskyi)、M.キセノピ(M.xenopi)、ネイセリア・アニマリス(Neisseria animalis)、N.カニス(N.canis)、N.シネレア(N.cinerea)、N.デニトリフィカンス(N.denitrificans)、N.デンチアエ(N.dentiae)、N.エロンガタ(N.elongata)、N.フラバ(N.flava)、N.フラベセンス(N.flavescens)、N.ゴノロエ(N.gonorrhoeae)、N.イグアナエ(N.iguanae)、N.ラクタミカ(N.lactamica)、N.マカカ(N.macacae)、N.メニンギチジス(N.meningitidis)、N.ムコサ(N.mucosa)、N.オビス(N.ovis)、N.ペルフラバ(N.perflava)、N.ファリンギス・バー・フラバ(N.pharyngis var.flava)、N.ポリサッカレア(N.polysaccharea)、N.シッカ(N.sicca)、N.サブフラバ(N.subflava)、N.ウェアベリ(N.weaveri)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、P.アルカリゲネス(P.alcaligenes)、P.クロロラフィス(P.chlororaphis)、P.フルオレセンス(P.fluorescens)、P.ルテオラ(P.luteola)、P.メンドシナ(P.mendocina)、P.モンテイリ(P.monteilii)、P.オリジハビタンス(P.oryzihabitans)、P.ペルトシノゲナ(P.pertocinogena)、P.シュードアルカリゲネス(P.pseudalcaligenes)、P.プチダ(P.putida)、P.スツェリ(P.stutzeri)、サルモネラ・バクテリオファージ(Salmonella bacteriophage)、S.ボンゴリ(S.bongori)、S.コレレスイス(S.choleraesuis)、S.エンテリカ(S.enterica)、S.エンテリチジス(S.enteritidis)、S.パラチフィ(S.paratyphi)、S.チフィ(S.typhi)、S.チフィムリウム(S.typhimurium)、S.チフィムリウム(S.typhimurium)、S.チフィムリウム(S.typhimurium)、S.チフィムリウム(S.typhimurium)バクテリオファージ、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、S.ディセンテリエ(S.dysenteriae)、S.フレクスネリ(S.flexneri)、S.ソネイ(S.sonnei
)、スタフィロコッカス・アーレッタエ(Staphylococcus arlettae)、S.アウレウス(S.aureus)、S.アウリクラリス(S.auricularis)、S.バクテリオファージ(S.bacteriophage)、S.カピチス(S.capitis)、S.カプレ(S.caprae)、S.カルノサス(S.carnosus)、S.カセオリチクス(S.caseolyticus)、S.クロモゲネス(S.chromogenes)、S.コーニイ(S.cohnii)、S.デルフィニ(S.delphini)、S.エピデルミジス(S.epidermidis)、S.エクオルム(S.equorum)、S.フェリス(S.felis)、S.フレウレッティイ(S.fleurettii)、S.ガリナルム(S.gallinarum)、S.ヘモリチクス(S.haemolyticus)、S.ホミニス(S.hominis)、S.ヒクス(S.hyicus)、S.インテルメディウス(S.intermedius)、S.クルーシイ(S.kloosii)、S.レントゥス(S.lentus)、S.ルグドゥネンシス(S.lugdunensis)、S.ルトレ(S.lutrae)、S.ムスカエ(S.muscae)、S.ミュータンス(S.mutans)、S.パスツーリ(S.pasteuri)、S.ファージ(S.phage)、S.ピシフェルメンタンス(S.piscifermentans)、S.プルベレリ(S.pulvereri)、S.サッカロリチクス(S.saccharolyticus)、S.サプロフィチクス(S.saprophyticus)、S.シュレイフェリ(S.schleiferi)、S.スシウリ(S.sciuri)、S.シミュランス(S.simulans)、S.スクシヌス(S.succinus)、S.ビトゥリヌス(S.vitulinus)、S.ワルネリ(S.warneri)、S.キシロサス(S.xylosus)、ウレアプラズマ・ウレアリチクム(Ureaplasma urealyticum)、エルシニア・アルドバーエ(Yersinia aldovae)、Y.ベルコビエリ(Y.bercovieri)、Y.エンテロコリチカ(Y.enterocolitica)、Y.フレデリクセニイ(Y.frederiksenii)、Y.インテルメディア(Y.intermedia)、Y.クリステンセニイ(Y.kristensenii)、Y.モラレティイ(Y.mollaretii)、Y.ペスチス(Y.pestis)、Y.フィロミラジア(Y.philomiragia)、Y.シュードツベルクロシス(Y.pseudotuberculosis)、Y.ローデイ(Y.rohdei)及びY.ルケリ(Y.ruckeri)などの通性細胞内細菌由来のリボソーム。
アナプラズマ・ボビス(Anaplasma bovis)、A.カウダーツム(A.caudatum)、A.セントラレ(A.centrale)、A.マルギナレ(A.marginale)、A.オビス(A.ovis)、A.ファゴサイトフィラ(A.phagocytophila)、A.プラチス(A.platys)、バルトネラ・バチリフォルミス(Bartonella bacilliformis)、B.クラリゲイエ(B.clarridgeiae)、B.エリザベサエ(B.elizabethae)、B.ヘンセラ(B.henselae)、B.ヘンセラ(B.henselae)ファージ、B.クインタナ(B.quintana)、B.タイロリ(B.taylorii)、B.ビンソニイ(B.vinsonii)、ボレリア・アフゼリイ(Borrelia afzelii)、B.アンデルソニイ(B.andersonii)、B.アンセリナ(B.anserina)、B.ビッセティイ(B.bissettii)、B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)、B.クロキデュレ(B.crocidurae)、B.ガリニイ(B.garinii)、B.ヘルムシイ(B.hermsii)、B.ジャポニカ(B.japonica)、B.ミヤモトイ(B.miyamotoi)、B.パルケリ(B.parkeri)、B.レクレンチス(B.recurrentis)、B.ツルディ(B.turdi)、B.ツリカテ(B.turicatae)、B.バライシアナ(B.valaisiana)、ブルセラ・アボルツス(Brucella abortus)、B.メリテンシス(B.melitensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、C.シタッシ(C.psittaci)、C.トラコマチス(C.trachomatis)、コウドリア・ルミナンチウム(Cowdria ruminantium)、コキシエラ・ブルネティイ(Coxiella burnetii)、エーリキア・カニス(Ehrlichia canis)、E.シャフェンシス(E.chaffeensis)、E.エクイ(E.equi)、E.エウィンギイ(E.ewingii)、E.ムリス(E.muris)、E.ファゴシトフィラ(E.phagocytophila)、E.プラティス(E.platys)、E.リスチシイ(E.risticii)、E.ルミナンチウム(E.ruminantium)、E.センネツ(E.sennetsu)、ヘモバルトネラ・カニス(Haemobartonella canis)、H.フェリス(H.felis)、H.ムリス(H.muris)、マイコプラズマ・アルツリディティス(Mycoplasma arthriditis)、M.ブッカレ(M.buccale)、M.ファウシウム(M.faucium)、M.フェルメンタンス(M.fermentans)、M.ゲニタリウム(M.genitalium)、M.ホミニス(M.hominis)、M.ライドラウィイ(M.laidlawii)、M.リポフィルム(M.lipophilum)、M.オラレ(M.orale)、M.ペネトランス(M.penetrans)、M.ピルム(M.pirum)、M.ニューモニエ(M.pneumoniae)、M.サリバリウム(M.salivarium)、M.スペルマトフィルム(M.spermatophilum)、リケッチア・オーストラリス(Rickettsia australis)、R.コノリイ(R.conorii)、R.フェリス(R.felis)、R.ヘルベチカ(R.helvetica)、R.ジャポニカ(R.japonica)、R.マッシリエ(R.massiliae)、R.モンタネンシス(R.montanensis)、R.ピーコキイ(R.peacockii)、R.プロワゼキイ(R.prowazekii)、R.リピセファリ(R.rhipicephali)、R.リケッチイ(R.rickettsii)、R.シビリカ(R.sibirica)及びR.チフィ(R.typhi)などの偏性細胞内細菌由来のリボソーム。
カンジダ・カンジダ・アーセリ(Candida Candida aaseri)、C.アシドサーモフィルム(C.acidothermophilum)、C.アクツス(C.acutus)、C.アルビカンス(C.albicans)、C.アナトミエ(C.anatomiae)、C.アピス(C.apis)、C.アピス・バー・ガラクタ(C.apis var.galacta)、C.アトランチカ(C.atlantica)、C.アトモスフェリカ(C.atmospherica)、C.アウリンギエンシス(C.auringiensis)、C.ベルテ(C.bertae)、C.ベルツテ・バー・キロエンシス(C.berthtae var.chiloensis)、C.ベルテティイ(C.berthetii)、C.ブランキイ(C.blankii)、C.ボイディニイ(C.boidinii)、C.ボレチコラ(C.boleticola)、C.ボンビ(C.bombi)、C.ボンビコラ(C.bombicola)、C.ブイネンシス(C.buinensis)、C.ブチリ(C.butyri)、C.カカオイ(C.cacaoi)、C.カンタレリイ(C.cantarellii)、C.カリオシリグニコラ(C.cariosilignicola)、C.カステリイ(C.castellii)、C.カストレンシス(C.castrensis)、C.カテヌラタ(C.catenulata)、C.キレンシス(C.chilensis)、C.キロプテロルム(C.chiropterorum)、C.コイポメンシス(C.coipomensis)、C.デンドロネマ(C.dendronema)、C.デセルチコラ(C.deserticola)、C.ディッデンシエ(C.diddensiae)、C.ジベルサ(C.diversa)、C.エントマエ(C.entomaea)、C.エントモフィラ(C.entomophila)、C.エルガテンシス(C.ergatensis)、C.エルノビイ(C.ernobii)、C.エタノリカ(C.ethanolica)、C.エタノサーモフィルム(C.ethanothermophilum)、C.ファマタ(C.famata)、C.フルビオチリス(C.fluviotilis)、C.フラガリオルム(C.fragariorum)、C.フラギコラ(C.fragicola)、C.フリードリッヒ(C.friedrichii)、C.フルクトゥス(C.fructus)、C.ゲオカレス(C.geochares)、C.グラブラタ(C.glabrata)、C.グレボサ(C.glaebosa)、C.グロペンギエッセリ(C.gropengiesseri)、C.グイリエルモンディイ(C.guilliermondii)、C.グイリエルモンディ・バー・ガラクトサ(C.guilliermondii var.galactosa)、C.グイリエルモンディイ・バー・ソヤ(C.guilliermondii var.soya)、C.ヘムロニイ(C.haemulonii)、C.ハロフィラ(C.halophila)/C.ベルサチリス(C.versatilis)、C.ホルミイ(C.holmii)、C.フミリス(C.humilis)、C.ヒドロカルボフマリカ(C.hydrocarbofumarica)、C.インコンスピキュア(C.inconspicua)、C.インセクタレンス(C.insectalens)、C.インセクタマンス(C.insectamans)、C.インテルメディア(C.intermedia)、C.ジャバニカ(C.javanica)、C.ケフィル(C.kefyr)、C.クリシイ(C.krissii)、C.クルセイ(C.krusei)、C.クルソイデス(C.krusoides)、C.ラムビカ(C.lambica)、C.ルシタニエ(C.lusitaniae)、C.マグノリエ(C.magnoliae)、C.マルトサ(C.maltosa)、C.マミレ(C.mamillae)、C.マリス(C.maris)、C.マリチマ(C.maritima)、C.メリビオシカ(C.melibiosica)、C.メリニイ(C.melinii)、C.メチリカ(C.methylica)、C.ミレリ(C.milleri)、C.モギイ(C.mogii)、C.モリシアナ(C.molischiana)、C.モンタナ(C.montana)、C.ムルチス−ゲミス(C.multis−gemmis)、C.ムセ(C.musae)、C.ネオデンドラ(C.naeodendra)、C.ネモデンドラ(C.nemodendra)、C.ニトラトフィラ(C.nitratophila)、C.ノルベゲンシス(C.norvegensis)、C.ノルベジカ(C.norvegia)、C.オレオフィラ(C.oleophila)、C.オレゴネンシス(C.oregonensis)、C.オソルネンシス(C.osornensis)、C.パルディゲナ(C.paludigena)、C.パラシロシス(C.parapsilosis)、C.パラルゴサ(C.pararugosa)、C.ペリフェロスム(C.periphelosum)、C.ペトロフエンシス(C.petrohuensis)、C.ペトロフィルム(C.petrophilum)、C.フィリラ(C.philyla)、C.ピグナリエ(C.pignaliae)、C.ピントロペシイ バー・ピントロペシイ(C.pintolopesii var.pintolopesii)、C.ピントロペシイ バー.スルーフィエ(C.pintolopesii var.slooffiae)、C.ピヌス(C.pinus)、C.ポリモルファ(C.polymorpha)、C.ポプリ(C.populi)、C.シュードインテルメディア(C.pseudointermedia)、C.クエルシトラサ(C.quercitrasa)、C.ライレネンシス(C.railenensis)、C.ラギイ(C.rhagii)、C.ルゴペリキュローサ(C.rugopelliculosa)、C.ルゴサ(C.rugosa)、C.サケ(C.sake)、C.サルマンチセンシス(C.salmanticensis)、C.サボニカ(C.savonica)、C.セクアネンシス(C.sequanensis)、C.シェハテ(C.shehatae)、C.シルベ(C.silvae)、C.シルビキュルトリクス(C.silvicultrix)、C.ソラニ(C.solani)、C.ソノレンシス(C.sonorensis)、C.ソルボフィラ(C.sorbophila)、C.スパンドベンシス(C.spandovensis)、C.スフェリカ(C.sphaerica)、C.ステラタ(C.stellata)、C.スッキフィラ(C.succiphila)、C.テヌイス(C.tenuis)、C.テレブラ(C.terebra)、C.トロピカリス(C.tropicalis)、C.ウチリス(C.utilis)、C.バリダ(C.valida)、C.バンデルワルティイ(C.vanderwaltii)、C.バルチオバアライ(C.vartiovaarai)、C.ベロネ(C.veronae)、C.ビニ(C.vini)、C.ウィケラミイ(C.wickerhamii)、C.キセトビイ(C.xestobii)、C.ゼイラノイデス(C.zeylanoides)及びヒストプラズマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)などの通性細胞内菌類由来のリボソーム。
ブラキオラ・ベシキュラルム(Brachiola vesicularum)、B.コノリ(B.connori)、エンセファリトゾーン・クニクリ(Encephalitozoon cuniculi)、E.ヘレム(E.hellem)、E.インテスチナリス(E.intestinalis)、エンテロシトゾーン・ビエヌーシ(Enterocytozoon bieneusi)、リーシュマニア・エチオピカ(Leishmania aethiopica)、L.アマゾネシス(L.amazonensis)、L.ブラジリエンシス(L.braziliensis)、L.チャガシ(L.chagasi)、L.ドノバニ(L.donovani)、L.ドノバニ チャガシ(L.donovani chagasi)、L.ドノバニ ドノバニ(L.donovani donovani)、L.ドノバニ インファンツム(L.donovani infantum)、L.エンリエッティイ(L.enriettii)、L.ギアネンシス(L.guyanensis)、L.インファンツム(L.infantum)、L.メジャー(L.major)、L.メキシカーナ(L.mexicana)、L.パナメンシス(L.panamensis)、L.ペルビアナ(L.peruviana)、L.ピファノイ(L.pifanoi)、L.タレントレ(L.tarentolae)、L.トロピカ(L.tropica)、マイクロスポリジウム・セイロネンシス(Microsporidium ceylonensis)、M.アフリカヌム(M.africanum)、ノセマ・コンノリ(Nosema connori)、N.オクラルム(N.ocularum)、N.アルゲレ(N.algerae)、プラスモディウム・ベルゲイ(Plasmodium berghei)、P.ブラシリアヌム(P.brasilianum)P.チャバウディ(P.chabaudi)、P.チャバウディ アダミ(P.chabaudi adami)、P.チャバウディ チャバウディ(P.chabaudi chabaudi)、P.シノモルジ(P.cynomolgi)、P.ファルシパルム(P.falciparum)、P.フラギレ(P.fragile)、P.ガリナセウム(P.gallinaceum)、P.ノウレシ(P.knowlesi)、P.ロフレ(P.lophurae)、P.マラリエ(P.malariae)、P.オバレ(P.ovale)、P.レイケノウィ(P.reichenowi)、P.シミオバレ(P.simiovale)、P.シミウム(P.simium)、P.ビンケイペッテリ(P.vinckeipetteri)、P.ビンケイ ビンケイ(P.vinckei vinckei)、P.ビバックス(P.vivax)、P.ヨエリイ(P.yoelii)、P.ヨエリイ ニゲリエンシス(P.yoelii nigeriensis)、P.ヨエリイ ヨエリイ(P.yoelii yoelii)、プレイストフォラ・アンギラルム(Pleistophora anguillarum)、P.ヒッポグロッソイデオス(P.hippoglossoideos)、P.ミランデレ(P.mirandellae)、P.オバリエ(P.ovariae)、P.ティピカリス(P.typicalis)、セプタータ・インテスティナリス(Septata intestinalis)、トキソプラズマ・ゴンディイ(Toxoplasma gondii)、トランキプレイストフォラ・ホミニス(Tranchipleistophora hominis)、T.アンスロポフテラ(T.anthropophthera)、ビッタフォルマ・コルネエ(Vittaforma corneae)、トリパノソーマ・アビウム(Trypanosoma avium)、T.ブルセイ(T.brucei)、T.ブルセイ ブルセイ(T.brucei brucei)、T.ブルセイ ガンビエンス(T.brucei gambiense)、T.ブルセイ ロデシエンス(T.brucei rhodesiense)、T.コビチス(T.cobitis)、T.コンゴレンス(T.congolense)、T.クルジ(T.cruzi)、T.シクロプス(T.cyclops)、T.エクイペルドゥム(T.equiperdum)、T.エバンシ(T.evansi)、T.ディオニシイ(T.dionisii)、T.ゴドフレイ(T.godfreyi)、T.グライ(T.grayi)、T.レウィシ(T.lewisi)、T.メガ(T.mega)、T.ミクロティ(T.microti)、T.ペスタナイ(T.pestanai)、T.ランゲリ(T.rangeli)、T.ロタトリウム(T.rotatorium)、T.シミエ(T.simiae)、T.テイレリ(T.theileri)、T.バラニ(T.varani)、T.ベスペルチリオニス(T.vespertilionis)及びT.ビバクス(T.vivax)などの偏性細胞内原生動物由来のリボソーム。
病原体由来のリボソームは、結合剤を介して支持体に結合し得る(即ち固定化される。)。支持体に対してリボソームなどの複合体を固定化することは、当技術分野における技術内である。ある種の実施形態において、結合剤は、リボソームに特異的に結合し得、例えば、特定の病原体由来のリボソームに特異的である。例えば、結合剤は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体又は、例えば捕捉されるべきリボソームに特異的な抗体断片であり得る。例えば、この抗体又は抗体断片は、リボソームを含むリボソームタンパク質に特異的であり得る。その他の実施形態において、結合剤は、捕捉されるべきリボソームに特異的なリボソーム結合タンパク質である。その他の実施形態において、結合剤は、リボソームRNAに結合することができ、核酸、即ち、捕捉されるべきリボソームのリボソームRNAに相補的又は特異的な核酸であり得る。さらにその他の実施形態において、結合剤は、リボソームRNAに結合するタンパク質、例えばRNA結合タンパク質、である。
支持体は、上述の結合剤の何れかを介してリボソームを固定化するための何らかの適切な物質であり得る。ある種の実施形態において、支持体は、多孔質材、例えばニトロセルロースである。その他の実施形態において、支持体は、粒子、例えば磁性粒子である。ある種の実施形態において、支持体は複数の粒子からなる。
ある種の実施形態において、支持体は、テストストリップ又はテストチャンバーの一部である。ある実施形態において、支持体はテストストリップである。その他の実施形態において、支持体は、側方流動機器の一部である。さらにその他の実施形態において、支持体は、レジン又はカラム中に充填するのに適切なその他の物質である。さらにその他の実施形態において、支持体は、ウェル又は試験管つきのプレートである。
支持体は、未結合リボソーム及びその他の物質を除去するのに十分でありながらリボソームの生物学的機能を維持するのに適切な何らかの緩衝液で洗浄され得る。残ったリボソームがmRNAを翻訳しないようにするために、洗浄緩衝液は、リボソーム活性の適切な阻害剤を含有しなければならない。あるいは、又は阻害剤の添加に加えて、リボソーム活性を破壊するために、洗浄緩衝液をオートクレーブにかけ得る。従って、適切なpH、グリセロール又はその他の安定化分子、例えばリガンド、ポリエチレングリコールなど及び還元剤、キレート剤、補因子、界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、リボソーム活性阻害剤の有無は、全て、重要な検討材料である。例えば、支持体が、カラム、側方流動又は洗浄液が支持体全体に流れるその他の方式中に含まれる実施形態において、未結合リボソームを支持体から除去するために、各洗浄緩衝液の約5から20体積の何れかで、支持体を洗浄し得る。支持体が粒子であるある種の実施形態において、洗浄液は、ある液体、例えば試料から別の液体、例えば洗浄液に、粒子を動かすことを含み得る。ある種の実施形態において、ウイルスを検出するために上述の方法を改変し得る。RNAウイルスの場合、ウイルス及びリボソームに対する抗体を含む表面にRNAウイルスを含む可能性がある試料を流し得る。試料を表面に流す場合、存在するならばウイルスを抗体により捕捉し得る。未結合物質を除去するための上述のような洗浄段階後、結合ウイルスを含む表面に溶解溶液を流すことによってウイルスを溶解し得る。溶解によって、RNAが放出されるが、これは、次のようなリボソームによる翻訳に対して利用可能である。
洗浄後、溶液中のmRNAをポリペプチドへと翻訳するために、結合剤へのリボソームの結合を可能とするのに適切な条件下で、mRNA及びアミノ酸を含む溶液存在下で支持体を温置する。ある種の実施形態において、温置中、一定温度を維持する。
その溶液は、タンパク質合成のための化学的エネルギーを提供する1以上のエネルギー源を含み得る。さらに、この溶液は、少なくとも1つの核酸鋳型、例えばmRNA、を含む。この溶液は、酵素、翻訳因子又は補因子を含み得る。ある種の実施形態において、この溶液は、アミノ酸、アルギニン、プロリン、グリシン、ロイシン又はイソロイシンに対するtRNAから選択される、E.コリのrare t−RNAを含み得る。さらに、この溶液は、脂質、コレステロール又は膜を含み得る。
この溶液はまた、鋳型又はホスファターゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ又はリボヌクレアーゼなどの翻訳反応に必要なその他の酵素を分解する酵素の阻害剤も含み得る。さらに、これは、加水分解又はホスホジエステル結合の形成を触媒するための酵素を含み得る。
またさらに、この溶液は、少なくとも1つの分子シャペロン又はフォールダーゼを含み得る。分子シャペロン又はフォールダーゼには、以下に限定されないが、GroEL/ES、GroEL、GroES、TF、DnaK、DnaJ、GrpE、ClpB、FkpA、Skp、DsbA、DsbC、ペプチジルプロリル・シス/トランスイソメラーゼ(PPI)、シャペロニン60、シャペロニン10、TCP1、TF55、熱ショックタンパク質60、Cpn60、熱ショックタンパク質10、Cpn10、Limタンパク質又はシグナル認識粒子が含まれる。
特異的酵素活性、UV又は可視光吸収又は蛍光など様々な手段によって、翻訳反応において産生されたタンパク質の量を測定することができる。タンパク質合成の産物はまた、抗体に基づくアッセイを用いることによって検出し得る。インビトロ転写翻訳反応を組み合わせて産生されるタンパク質の量を定量するための別の方法は、3SS−メチオニン又はH−ロイシンなどの既知の量の放射性標識アミノ酸を用いて反応を行い、続いて新たに合成されたタンパク質に取り込まれた放射性標識アミノ酸の量を測定することである。取り込みアッセイは、短縮型タンパク質産物を含むインビトロ翻訳反応で産生される全タンパク質中の放射性標識アミノ酸の量を測定する。
新生タンパク質を検出するためのその他の方法は、米国公開特許出願20050032078に記載されている。
診断及び上記で示唆されるその他の適用における使用に対して、上述の方法の実施のためのキット及び装置もまた提供される。本方法の実施のための装置には、側方流動装置(ここで、この反応に使用される試薬は、装置中に含有されるクロマトグラフィー支持体上で乾燥させられ得る。)、テストストリップ又は本方法の実施のためのその他の支持体が含まれる。キットには、核酸鋳型、関心のある病原体のリボソームに特異的な結合剤、支持体及び洗浄及び温置イオン緩衝液が含まれ得る。このようなキット及び装置は、試薬又は構成成分のあらゆる数又は組み合わせを含有し得る。このキットは、個別の容器、試験管、バイアルなどのあらゆる数の中の上記の構成成分の1以上を含み得るか又は、このような構成成分は、このような容器において様々な組み合わせで組み合わされ得る。キットの構成成分は、先述の方法の手動での実施又は部分的もしくは完全に自動化された実施の何れかのために包装され得る。さらに、装置又はキットとともにその装置又はキットの使用のための説明書が含まれ得る。このようなキット及び装置は、例えば、診断、治療又はその他の適用を含む様々な用途を有し得る。
図1は、ストレプトコッカスA(Streptococcus A)細菌を検出するための、リボソーム増幅の使用の、代表的な実施形態の概略を示す。
本発明を全般的に説明してきたが、単に本発明のある一定の態様及び実施形態の説明目的のために含まれるものであり、何ら本発明を限定するものではない、次の実施例を参照することにより、より容易に理解できよう。全ての表題は読者の便宜のためであり、断りがない限り、表題に続く文章の意味を限定するために使用されるものではない。
図1は、ストレプトコッカス A(Streptococcus A)細菌を検出するためのリボソーム増幅の使用を示す。簡潔に述べると、ストレプトコッカス Aの特異的なリボソームタンパク質に対する抗体を支持体に結合させる。試験されるべき試料を抽出し、試料中に含有される細菌を溶解し、リボソームを放出させる(細菌細胞1個あたりおよそ20,000個のリボソーム)。次に、放出されたリボソームが抗体に結合できるように、支持体に試料を流す。支持体から未結合リボソーム及びその他の物質を除去するために、この試料を洗浄し、酵素、アミノ酸及び基質をコードするmRNAの包括的溶液を支持体に流す。抗体に結合したリボソームは、PCRとは異なり、一貫した温度で、連続的にmRNAを酵素に翻訳するはずである。翻訳時の酵素は、基質を分解し、この変化は光学的に検出され得る。
同等性
当業者は、本明細書中に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認めるか、又は通常の実験以外のものを使用せずに確認できよう。本発明の具体的な実施形態を考察してきたが、上記の明細書は例証であり、限定的なものではない。この明細書を検討すれば、本発明の多くの変化が当業者にとって明らかとなろう。本発明の全範囲は、同等物のその完全範囲及び明細書とともに、かかる変化とともに、特許請求の範囲を参照して決定されるものである。かかる同等物は、次の特許請求の範囲により包含されるものとする。

Claims (21)

  1. (a)リボソームを結合させることができる結合剤を含む支持体を、リボソームを含む試料と接触すること;
    (b)試料との接触後に支持体を洗浄すること;
    (c)溶液中でmRNAをポリペプチドに翻訳するために、リボソームを結合剤に結合させられるようにするのに適切な条件下で、mRNA及びアミノ酸を含む溶液の存在下で支持体を温置すること;
    (d)ポリペプチドの存在を調べること、
    を含む方法。
  2. リボソームが病原体に特異的であり、さらに、ポリペプチドの存在に基づき試料中の病原体の存在を調べることを含む、請求項1に記載の方法。
  3. 病原体が細菌である、請求項2に記載の方法。
  4. 結合剤が、リボソームに特異的に結合できる、請求項1に記載の方法。
  5. リボソームが細菌性リボソームであり、少なくとも1つの細菌からリボソームを放出させることをさらに含む、請求項3に記載の方法。
  6. 支持体が多孔質材である、請求項1に記載の方法。
  7. 多孔質材がニトロセルロースである、請求項3に記載の方法。
  8. 結合剤が抗体である、請求項1に記載の方法。
  9. 結合剤が、リボソームRNAに結合することができる、請求項1に記載の方法。
  10. リボソームRNAに結合することができる物質が核酸である、請求項9に記載の方法。
  11. mRNA及びアミノ酸を含む溶液が基質をさらに含む、請求項1に記載の方法。
  12. ポリペプチドが酵素である、請求項11に記載の方法。
  13. ポリペプチドを調べることが、酵素に対する基質との酵素の反応の結果得られる反応産物の存在を調べることを含む、請求項12に記載の方法。
  14. ポリペプチドを調べることが、反応産物の存在を光学的に検出することを含む、請求項13に記載の方法。
  15. (a)リボソームに結合することができる結合剤を使用して支持体上でリボソームを捕捉すること;
    (b)mRNA及びアミノ酸を含む溶液を用いて捕捉されたリボソームを温置すること;
    (c)温置され、捕捉されたリボソームにより産生されるポリペプチドを検出すること、
    を含む方法。
  16. リボソームに結合することができる結合剤を含む支持体を含む、装置。
  17. 支持体が多孔質材である、請求項16に記載の装置。
  18. 多孔質材がニトロセルロースである、請求項17に記載の装置。
  19. 結合剤が抗体である、請求項16に記載の装置。
  20. 結合剤が、リボソームRNAに結合することができる物質である、請求項16に記載の装置。
  21. リボソームRNAに結合できる試薬が核酸である、請求項20に記載の装置。
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