KR20130015645A - 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩 및 그 제조방법 - Google Patents

식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 금속이 코팅된 기판; 상기 금속에 결합될 수 있는 치환기가 디옥시티미딘(deoxythymidine, dT)의 5'말단에 위치한 링커; 및 3'말단에 위치한 폴리 아데닐산 꼬리(poly A tail)에 의해 상기 링커와 결합되는 식중독균 유래 RNA 앱타머를 포함함으로써 신속하고 정확하게 식품 병원균을 검출할 수 있는 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩 및 그 제조방법 {SLIDE CHIP FOR DETECTION SENSOR OF FOOD-BORNE PATHOGENS AND PREPARATION METHOD THEREOF}
본 발명은 식품 병원균에 특이적으로 결합하는 앱타머에 기반한, 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩 및 그 제조방법에 관한 것이다.
사람이 오염된 화학적 독소 혹은 자연적 독소를 섭취함으로써 발생하는 질병을 식중독이라 하는데 국내 식중독 사고는 1990년 대비 2006년에 환자 수 618명에서 10,833명으로 16년 사이 17배가 증가하였으며, 식중독 사고 1건 당 환자의 발생 비율도 41명으로 약 2.16배가 증가 하였다. 또한 단체 급식의 증가와 외식산업의 발달로 식중독 발생 건당 그 규모가 커지고 발생 건수에서도 증감을 반복하며 지속적으로 발생하고 있다. 이에 따라 먹거리에 대한 국민의 불안감이 고조되고 건강한 삶의 영위를 위해 식품으로부터 오는 위해를 사전에 예방 하거나 최소화하여 식품의 안전에 대한 확보의 중요성이 높아졌다.
식중독은 화학적 독소 또는 자연적 독소에 의해 발병되는 질병으로 식품에 오염된 병원성 세균들에 의한 것이 대부분이다. 이에 따라 식품으로부터 병원성 세균을 검출하고자하는 노력들이 시도되었으며, 식품의 병원성 세균 검출법은 생화학적 특성을 이용한 전통적 분석방법에서부터 최근에는 분자생물학적 방법까지 다양하게 개발 되어왔다. 전통적 분석방법은 노동집약적이며 검사를 위한 소요 시간이 많이 들어 최근의 식품으로부터 병원성 세균의 검출은 분자생물학적 방법이 각광받고 있다.
분자생물학 중심으로 연구된 병원성 세균 검출법을 살펴보면, 우선 항체를 이용하여 균주의 특이적 항원을 측정하는 면역학적 방법으로는 면역크로마토그래피, 면역리포좀 등이 개발되었다. 또한 유전학적 방법으로는 일반적으로 PCR을 이용하여 균주의 특정 DNA 서열을 증폭시켜 진단하는 것으로 대상 유전자들은 주로 병원균주의 독소유전자나 병원균에서 발현하는 고유 단백질 유전자, 원시핵 세포의 게놈 상에 간헐적으로 분산되어 있는 반복적인 DNA 서열, 16S rRNA 유전자 등을 사용한 연구도 있다. 그 외에도 김 등은 변패 원인균인 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 검출할 수 있는 비표지 면역센서 개발하여 병원균 검출에 있어 바이오센서의 적용도 시도하였다.
그러나 상기와 같이 개발된 검출법은 시장에 상용화가 활성화 되지 않은 상태이며, 시장에서는 검출 결과의 정확성 및 검출 비용의 절감과 같은 요구가 지속적으로 이루어지고 있다. 따라서 식품 병원균에 대한 신속하고 정확한 검출 시스템 및 방법의 개발이 시급하다.
본 발명은 식품 병원균에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용함으로써 정확하고 신속하게 식품 병원균을 검출할 수 있는 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 금속이 코팅된 기판; 상기 금속에 결합될 수 있는 치환기가 디옥시티미딘(deoxythymidine, dT)의 5'말단에 위치한 링커; 및 3'말단에 위치한 폴리 아데닐산에 의해 상기 링커와 결합되는 식중독균 유래 RNA 앱타머를 포함하는 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩 및 그 제조방법을 제공한다.
본 발명은 기판에 은을 25-35nm 두께로 스핀 코팅하여 은 나노 필름을 제조하는 단계; 대장균(E. coli O157:H7)의 세포벽 중합체인 리포폴리사카라이드 분자를 항원으로 하는 RNA 앱타머, 살모넬라 티피뮤리움 균주의 ｏｍｐＣ단백질에 대해 결합하는 ＲＮＡ 앱타머, 포도상구균의 테이코산에 대한 ＲＮＡ 앱타머와, 티올기가 디옥시티미딘(deoxythymidine, dT)의 5'말단에 위치한 링커를 결합시켜 RNA 앱타머-링커 결합체를 제조하는 단계; 및 상기 RNA 앱타머-링커 결합체의 티올기와 상기 기판 상에 코팅된 은을 결합시켜 상기 RNA 앱타머-링커 결합체를 상기 은 나노 필름에 고정시키는 단계를 포함하는 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩을 사용하면 식중독균의 신속하고 정확한 검출이 가능하다. 특히, 생균의 검출에 유용하다.
본 발명의 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩은 제조방법이 간단하다.
도 1은 본 발명의 RNA 앱타머의 이차 구조 및 앱타머의 피리미딘(시토신 및 우라실)의 불소화를 나타낸다.
도 2는 SELEX 과정의 모식도로서, (ⅰ) 결합, (ⅱ) 비결합 분자 제거, (ⅲ) 결합체 선별, (ⅳ) 선별된 결합체 증폭을 나타낸다.
도 3은 6-FAM 분자의 구조를 나타낸다.
도 4는 은 나노 박막 표면을 나타낸다.
도 5는 광학현미경용 슬라이드 글라스 위에 은 나노패턴 박막을 제조한 후 O157 앱타머를 나노박막 표면에 결합시킨 후 O157균을 포집한 결과를 나타낸다.
도 6은 티올기가 유도된 O157 앱타머가 O157 생균을 포집하고 형광 앱타머가 그 균의 존재를 발현하도록 고안한 칩에 의해 O157 생균을 효과적으로 관찰한 결과를 나타낸다.
본 발명은 금속이 코팅된 기판; 상기 금속에 결합될 수 있는 치환기가 디옥시티미딘(deoxythymidine, dT)의 5'말단에 위치한 링커; 및 3'말단에 위치한 폴리 아데닐산 꼬리(poly A tail)에 의해 상기 링커와 결합되는 식중독균 유래 RNA 앱타머를 포함함으로써 신속하고 정확하게 식품 병원균을 검출할 수 있는 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩 및 그 제조방법에 관한 것이다.
이하 본 발명의 슬라이드 칩 및 그 제조방법과 이 칩을 사용하여 식중독균을 검출하는 방법을 구체적인 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다.
이하에서는 E. coli O157:H7 균주를 중심으로 설명하였으나, 2010. 12. 17일에 각 출원번호 10-2010-0129763, 및 10-2010-0129767로 출원한 살모넬라 티피뮤리움 균주의 ｏｍｐＣ 단백질에 대해 결합하는 ＲＮＡ 앱타머 및 포도상구균의 테이코산에 대한 ＲＮＡ 앱타머를 포함하는 슬라이드 칩도 이하의 실시예에서 사용될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
(가) 앱타머(aptamer) 등의 제작
① 앱타머
식중독균인 E. coli O157:H7의 세포벽의 중합체인 리포폴리사카라이드(LPS) 분자를 항원으로 하여 RNA 앱타머를 제작하였다. 도 1과 같이, 이 앱타머는 RNA 피리미딘(C/U)의 2'탄소에 불소(F)를 붙여서 오염원의 RNase에 대한 저항성을 주어 RNA 분자의 안정성을 증가시켰다. 이 앱타머 분자와 결합하는 dT-리간드 분자와의 결합을 위해 3'말단에 A가 16개 반복된 폴리(A) 꼬리가 추가되었다.
본 앱타머는 E. coli O157:H7의 세포벽의 중합체인 리포폴리사카라이드(LPS) 분자를 항원 분자를 대상으로 도 2의 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)로 불리는 생체 외 리간드 선별 증폭법에 의해 제작되었다.
마찬가지로, 살모넬라 티피뮤리움 균주의 ｏｍｐＣ 단백질에 대해 결합하는 ＲＮＡ 앱타머, 포도상구균의 테이코산에 대한 ＲＮＡ 앱타머를 제작하는 방법도 상기의 E. coli O157:H7에 대한 앱타머를 제작하는 방법과 유사하다.
② 링커
위 앱타머를 고정화시키거나 표지 물질을 부착하는 목적으로 사용되는 링커로는 다음의 dT-리간드를 사용하였다.
- dT-SH: 앱타머의 3'끝에 폴리(A) 꼬리와의 결합을 위한 16개의 dT에 은이나 금 표면과의 결합을 위한 리간드로서 티올기(-SH)가 5'말단에 부착되어 있는 링커 분자이다.
- dT-FAM: 앱타머의 3'끝에 폴리(A) 꼬리와의 결합을 위한 16개의 dT의 5'말단에 형광을 띄는 6-FAM 분자가 존재하는 링커 분자이다. 도 3의 FAM은 495 nm 파장의 빛에 최대로 여기되어 520 nm 최대 파장의 빛을 발광하는 형광표지자이다.
(나) 은 나노 필름에 앱타머 적용 시스템 구축
광학 현미경이나 형광 현미경에 의한 관찰이 용이한 투명한 바이오링커용 슬라이드로서 은이 25-35nm 두께로 스핀 코팅된 은 나노 필름 상에 앱타머 적용 시스템을 구축하였다.
① 은 나노 필름의 제작
- 기판 준비: 유리(BK7)를 이소프로필알콜(IPA), 아세톤 및 증류수로 세척 및 건조하였다.
- 표면접착조촉매 아미노-트리메톡시 실란 회전 도포: 3000 rpm에서 30초 동안 스핀 코팅 후 핫 플레이트에서 110℃에서 2분간 경화시켰다.
- 은이온 용액을 IPA로 희석한 정도와 스핀 속도로 박막의 두께를 조절하면서 나노 박막을 제조하였다.
- 핫 플레이트에서 130-150ㅀC 에서 3분간 경화시켜 은 나노 필름을 완성하였다.
② 혼성화(Hybridization): RNA 앱타머와 dT-리간드의 결합(어닐링)
A) 혼합:
(a) dT-SH와의 결합을 위해서는 나노 필름 상의 모든 dT-SH이 앱타머 분자를 결합하도록 하기 위하여 RNA 앱타머 대 dT-SH 몰비율을 2:1로 하였고 농도는 [RNA]:[dT-SH]를 20μM : 10μM로 하였다. 티올기를 보존하는 목적으로 0.1 M DTT 용액 10%를 첨가하였다.
(b) 형광표지 앱타머를 만들기 위한 dT-FAM 링커와의 결합은 모든 앱타머를 형광표지자로 표지하기 위해 몰비율을 1:2, 농도 비율은 [RNA]: [dT-FAM]를 20μM : 40μM로 하였다.
농도비율을 맞추기 위해 희석에 사용한 버퍼는 50 mM 나트륨-포스페이트 버퍼(pH 7.4)를 사용하였다.
B) 혼성화: 65ㅀC에서 5분간 가열한 후 상온에서 10분 냉각시켜 어닐링하였다.
③ 고정화(Immobilization): RNA 앱타머를 은 나노 필름에 고정화
본 실험에서는 티올기에 의한 직접 고정화법을 사용하였고 앱타머의 농도는 10 μM로 수행하였다.
- 세척: 은 나노 필름을 세척하는 과정으로 재 사용시 수행하였으며 과정은 다음과 같다. 1.2 N NaOH 용액을 5분 반응시키고 증류수로 3번 세척 후, 1.2 N HCl 용액으로 5분 반응시킨 다음, 진한 HCl로 1분 반응 후 증류수로 3번 세척, 건조시켰다.
- 활성화(activation): 앱타머의 고정화에 필요한 -SH에 대한 환원 반응으로 은과 결합할 수 있는 티올기가 보존되도록 하기 위해 50 mM 나트륨-포스페이트 버퍼(pH 7.4)에 0.1 M DTT 용액을 혼성화 과정에서 10% 첨가하였다.
- 고정화(immobilization): 앱타머를 은 나노 필름에 고정시키는 과정으로 앱타머-dT-SH 혼합용액을 0.5 μL 스팟팅하고 상온에서 30분 반응시켰다. 그리고 증류수로 3번 세척 후, 50 mM 나트륨-포스페이트 버퍼(pH 7.4)로 다시 세척하였다.
④ 고정화된 앱타머에 세균 시료 처리
- 세균 준비: 식중독 세균인 E. coli O157:H7을 영양 브로쓰 배지에서 37ㅀC, 진탕배양 조건으로 12시간 배양하였다. 이 배양액을 3500 x g에서 10분 원심분리하여 수확하고 동일 부피의 PBS(pH 7.0)로 현탁하여 세균 이외의 분순물을 제거하였다. 이 세균-PBS 현탁액의 세균 농도를 A600에서 흡광도를 측정하여 1 x 108으로 세균시료를 제조하였다.
- 세균 시료 처리: E. coli O157:H7의 식중독 세균-PBS 현탁액을 은 나노 필름 위에 고정화된 O157의 스팟에 올리고 상온에서 30분 반응하여 결합을 유도한 후, 결합되지 않은 것을 PBS(pH 7.0) 용액으로 세척하여 제거하였다.
(다) 은 나노 필름을 이용한 앱타머 바이오링커 시스템의 현미경 관찰
각 앱타머에 결합된 특이적 식중독 세균을 광학 현미경으로 관찰하고 이렇게 결합된 세균을 다시 형광으로 확인하기 위하여 형광표지 앱타머를 처리한 후 형광현미경으로 관찰하였다.
① 광학현미경 관찰
위에서 만들어진 시료를 x40(Plan Fluor/0,75, DIC)와 x60(Plan Fluor/0,85, WD) 대물렌즈로 광학현미경(Eclipse 50i, Nikon)에서 관찰하였고 Visilog 6(Noesis) 프로그램으로 영상을 처리하였다.
② 형광현미경 관찰
- 형광표지 앱타머 처리: 위에서 만들어진 dT-FAM(Ex = 495 nm, Em = 520 nm)와 결합된 각 O157 앱타머로 이루어진 20 μM의 형광표지 앱타머 용액을 각 스팟 위에 떨어뜨리고 상온에서 1시간 반응시켜 결합을 유도하고 결합되지 않은 것을 PBS(pH 7.0) 용액으로 세척하여 제거하였다.
- 형광표지 앱타머 관찰: 위의 시료를 B2-A 필터(Ex; 450-490, DM; 505, BA; 520)와 x40, x60의 대물렌즈(Plan Fluor)로 형광현미경(Eclipse 80i, Nikon)에서 관찰하였고 각 앱타머에 결합된 세균을 형광표지 앱타머의 형광에 의한 영상으로 확인하였다.
(라) 결과
도 5 및 도 6은 O157 앱타머로 O157 균만을 선택적을 포집한 결과를 나타낸 것이다. 특히, 도 5는 라벨링없이 생균을 고정화하여 광학현미경을 관찰한 것이고, 도 6은 형광 테깅을 부착하여 형광현미경으로 관찰한 것이다.
도 5(a)는 광학현미경용 슬라이드 글래스 위에 은 나노패턴 박막을 제조한 후 O157 앱타머를 나노박막 표면에 링킹한 후 O157균을 포집한 결과를 나타낸 것이다. 그림에서 보는 바와 같이 O157균 포집이후 PBS 용액을 세척하여 O157균만을 포집할 수 있어 운동성이 있는 생균을 정확히 관찰할 수 있었다. 반면에 도5(b)는 O157균 용액을 단순히 슬라이드 글래스 위에 떨어뜨려 관찰한 결과를 나타낸 것으로서 생균의 존재를 육안을 확인을 할 수는 있었으나 다른 이물질의 존재로 인하여 생균을 구분하여 관찰하기가 어려웠다.
도 6에서 티올기가 유도된 O157 앱타머가 O157 생균을 포집하고 형광 앱타머가 그 균의 존재를 발현하도록 고안한 칩에 의해 O157 생균을 효과적으로 관찰할 수 있었다. 도 6(a)는 O157 배양액을 그대로 사용한 것이고, 도 6(b)는 PBS 용액으로 세척한 생균을 포집한 결과로서 두 경우의 차이는 거의 없는 것으로 나타났다.
마찬가지로, 다른 병원성 세균인 살모넬라 티피뮤리움, 포도상구균 등도 O157 균과 유사하게 균의 존재를 검출할 수 있었다. 이러한 방법으로 제작된 식중독균 검출용 슬라이드 칩을 이용하면 단 한 마리의 식중독균조차도 검출할 수 있었다.

Claims (8)

  1. 금속이 코팅된 기판; 상기 금속에 결합될 수 있는 치환기가 디옥시티미딘(deoxythymidine, dT)의 5'말단에 위치한 링커; 및 3'말단에 위치한 폴리 아데닐산 꼬리(poly A tail)에 의해 상기 링커와 결합되는 식중독균 유래 RNA 앱타머를 포함하는 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 대장균(E. coli O157:H7)의 세포벽 중합체인 리포폴리사카라이드 분자를 항원으로 하는 앱타머, 살모넬라 티피뮤리움 균주의 ｏｍｐＣ 단백질에 대해 결합하는 앱타머, 포도상구균의 테이코산에 대한 앱타머 등의 앱타머를 개별적으로 이용하는 단일 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩 또는 동시에 이용하는 다중검출 센서용 슬라이드 칩,
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 RNA 피리미딘(시토신 및 우라실)의 2'탄소가 불소(F)로 치환된 것인 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 금속은 은 또는 금인 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 금속에 결합될 수 있는 치환기는 티올기(-SH)인 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 RNA 앱타머에 결합된 식중독균에 형광 표지를 하기 위한 6-FAM 분자가 디옥시티미딘(deoxythymidine, dT)의 5'말단에 존재하는 형광표지자를 추가로 포함하는 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩.
  7. 기판에 은을 25-35nm 두께로 스핀 코팅하여 은 나노 필름을 제조하는 단계;
    대장균(E. coli O157:H7)의 세포벽 중합체인 리포폴리사카라이드 분자를 항원으로 하는 RNA 앱타머와, 티올기가 디옥시티미딘(deoxythymidine, dT)의 5'말단에 위치한 링커를 결합시켜 RNA 앱타머-링커 결합체를 제조하는 단계; 및
    상기 RNA 앱타머-링커 결합체의 티올기와 상기 기판 상에 코팅된 은을 결합시켜 상기 RNA 앱타머-링커 결합체를 상기 은 나노 필름에 고정시키는 단계를 포함하는 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩의 제조방법, 또는O157 균과 유사하게, 살모넬라 티피뮤리움, 포도상구균에 대한 검출 센서용 슬라이드 칩의 제조방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 RNA 피리미딘(시토신 및 우라실)의 2'탄소가 불소(F)로 치환된 것인 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩의 제조방법.

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