JP2010500381A

JP2010500381A - （ｒ，ｒ）−フェノテロールおよび（ｒ，ｒ）−または（ｒ，ｓ）−フェノテロール類似体の調製物ならびにうっ血性心不全の治療におけるそれらの使用

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Publication number: JP2010500381A
Application number: JP2009524015A
Authority: JP
Inventors: アービングダブリュ．ウェイナー; ルイピンシャオ; ウェイチョンチュー; ハーリドチャキル; ファリードエム．ベイジ; ダレルアール．アバネシー
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Current assignee: US Government
Priority date: 2006-08-10
Filing date: 2007-08-10
Publication date: 2010-01-07
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Abstract

本開示は、β2アドレナリン作動性受容体に結合することにおいて非常に有効である(R,R)-および(R,S)-フェノテロール類似体の発見に関する。これらの類似体についての例示的な化学構造を提供する。また、開示される(R,R)-フェノテロールおよびフェノテロール類似体を含む薬学的組成物、ならびにうっ血性心不全などの心臓障害および喘息または慢性閉塞性肺疾患などの肺障害の治療のためにこのような化合物および組成物を使用する方法も提供する。

Description

分野
本開示は、薬学的組成物の分野、特に、(R,R)-フェノテロールおよび(R,R)-または(R,S)-フェノテロール類似体の調製物ならびにうっ血性心不全の治療におけるそれらの使用に関する。

背景
フェノテロール、5-[1-ヒドロキシ-2[[2-(4-ヒドロキシフェニル)-1-メチルエチル]-アミノ]エチル] 1,2-ベンゼンジオールは、喘息などの肺障害の治療に伝統的に使用されているβ2アドレナリン作動性受容体アゴニストである。この薬物は、各々独立してRまたはS立体配置に配置され得る2つのキラル（不斉）炭素を有し、従って、該薬物は、立体異性体として公知の異なる(R,R)、(R,S)、(S,R)および(S,S)形態で存在する。フェノテロールは、(R,R)-および(S,S)-化合物のラセミ混合物として市販されている。

フェノテロールは、β2アドレナリン作動性受容体へ結合し、かつこれを活性化するアゴニストとして作用することが公知である。このアゴニストの活性は収縮した気道を拡張するので、この活性のためにそれは喘息の治療において臨床的に使用されるようになった。フェノテロールについてのさらなる治療用途は、まだ徹底的に探究されていない。フェノテロールを包含する薬物のクラスの薬理学的研究によって、エナンチオマーの1つのみが、気管支拡張を生じさせる原因であることが示された。例えば、研究によって、ラセミ(±)-フェノテロールについての主な気管支拡張活性は、フェノテロールの(R,R)-異性体にあることが実証された。さらに、不活性エナンチオマーが副作用に関連している可能性があることが、最近明らかとなった。例えば、ジアステレオマー(S,S)-フェノテロールは、β2アドレナリン作動性受容体アゴニスト治療としばしば関連する副作用または耐性発生を生じさせることが実証された。

従って、喘息、慢性閉塞性肺疾患、またはうっ血性心不全などの障害を治療することにおいて有効であるが、過敏症および薬剤耐性（耐性）などの副作用が低減された、フェノテロール組成物を提供することは都合がよい。

概要
本開示は、β2アドレナリン作動性受容体に結合することにおいて非常に有効であるフェノテロール類似体の発見に関する。これらの類似体についての例示的な化学構造を、本開示を通じて提供する。例えば、このような化合物は、以下の一般式によって表される。

式中、R₁〜R₃は、独立して、水素、アシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル（カルバモイル）またはそれらの組み合わせであり；
R₄は、Hまたは低級アルキルであり；
R₅は、低級アルキル、

であり、式中、X、Y¹、Y²およびY³は、独立して、水素、-OR₆および-NR₇R₈であり；
R₆は、独立して、水素、低級アルキル、アシル、アルコキシカルボニルまたはアミノカルボニルであり；かつ
R₇およびR₈は、独立して、水素、低級アルキル、アルコキシカルボニル、アシルまたはアミノカルボニルである。

(R,R)-フェノテロールおよびフェノテロール類似体を含有する薬学的組成物、ならびにこれらを使用する方法もまた提供する。例えば、開示される(R,R)-フェノテロールおよび(R,R)-または(R,S)-フェノテロール類似体（例えば、(R,R)-メトキシフェノテロール、(R,R)-ナフチルフェノテロール、および(R,S)-ナフチルフェノテロール）は、心臓障害または肺障害を治療することにおいて有効である。

前述および他の特徴および利点は、添付の図面を参照して進められる、下記のいくつかの態様の詳細な説明からより明らかとなる。

(S,S)-および(R,R)-フェノテロールのクロマトグラフィーによる分離を示す。 (R,R)-および(S,S)-フェノテロールの紫外線スペクトルを提供する。 (R,R)-および(S,S)-フェノテロールの円二色性スペクトルを示す。ランニングバッファーへの(R,R)-フェノテロールの添加によって作成された[⁺H]-(±)-フェノテロールの先端（frontal）クロマトグラフィー溶離プロファイルを提供する。図4Aは、新たに単離したラット心室筋細胞を(±)-フェノテロール、(R,R)-フェノテロールまたは(S,S)-フェノテロールで処理することによって作成された用量反応曲線を含むグラフである。図4Bは、(±)-フェノテロール、(R,R)-フェノテロールまたは(S,S)-フェノテロールでの処理によって作成された、新たに単離したラット心室筋細胞におけるT_50%緩和の用量反応曲線を含むグラフである。フェノテロールおよびフェノテロール類似体（化合物2〜7）の立体異性体の化学構造を示す。化合物47〜51の化学構造を示す。単一心室筋細胞における細胞収縮に対するフェノテロールおよびフェノテロール類似体の効果を示す。投与（5 mg／mL）後の(R,R)-フェノテロール、(R,R)-メトキシフェノテロールおよび(R,S)-ナフチルフェノテロールの時間依存性平均血漿濃度を示すグラフである。

いくつかの態様の詳細な説明
I．導入
本開示は、フェノテロールと比べて同等であるかまたはより高い活性でβ2アドレナリン作動性受容体に結合するフェノテロール類似体を提供する。1つの態様において、光学的に活性であるフェノテロール類似体は、ラセミ混合物から実質的に精製される。例えば、光学的に活性であるフェノテロール類似体は、精製され、組成物の90％超、しばしば95％超を示す。これらの類似体は、以前(±)-フェノテロールで治療された喘息および慢性閉塞性肺疾患などの肺障害を治療するために使用され得る。(±)-フェノテロールと比べて等しい〜より高い効能を有する開示のフェノテロール類似体の使用によって、以前(±)-フェノテロールで観察された副作用が恐らく低減され得る。例えば、治療的に有効な反応を得るためのより低い濃度のフェノテロール類似体の使用によって、市販の(±)-フェノテロールで観察された過敏症および薬剤耐性（耐性）などの副作用が低減されると予想される。また、前記類似体の精製によって、これらの副作用の原因であり得る不活性エナンチオマーなどの不純物が除去される。

本開示はまた、(R,R)-フェノテロールが、市販の(±)-フェノテロールの活性成分であることを実証する。具体的には、(R,R)-フェノテロールならびに開示される(R,R)-および(R,S)-フェノテロール類似体が、うっ血性心不全などの心臓障害を治療するために使用され得ることが意図される。うっ血性心不全を治療するための実質的に光学的に純粋な(R,R)-フェノテロールまたは(R,R)-もしくは(R,S)-フェノテロール類似体の使用は、該薬物の生理学的により活性が低い形態によって引き起こされる副作用の発生を低減すると予想される。

II．略語および用語
AR：アドレナリン作動性受容体
CD：円二色性
CoMFA：比較分子場解析（comparative molecular field analysis）
HPLC：高速液体クロマトグラフィー
IAM-PC：固定化人工膜クロマトグラフィー支持体
ICYP：[¹²⁵I]シアノピンドロール
UV：紫外線

特に説明されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、開示される事項が属する分野における当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。化学用語における一般的な用語の定義は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, 1985、およびThe Condensed Chemical Dictionary, 1981に見られ得る。本明細書において使用される場合、「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」という単数形の用語は、文脈が特に明確に示さない限り、複数の指示物を包含する。同様に、「または（or）」という単語は、文脈が特に明確に示さない限り、「および（and）」を包含することを意図される。さらに、本明細書において使用される場合、「含む（comprise）」という用語は「包含する（include）」を意味する。従って、「AまたはBを含む」は、A、B、またはAおよびBを包含することを意味する。

特に注記される場合を除いて、いずれの量的値も、「約（about）」または「およそ（approximately）」という単語などが記載されているかまたは記載されていないかに関わらず、近似である。本明細書に記載される材料、方法、および例は、例示に過ぎず、限定的であることを意図されない。いずれの分子重量値また分子質量値も、近似であり、かつ、説明のためにのみ提供される。特に注記される場合を除いて、本発明の方法および技術は、当技術分野において周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書にわたって引用および議論されている種々の一般的およびより具体的な参考文献において記載されているように、一般的に行われる。例えば、Loudon, Organic Chemistry, Fourth Edition, New York: Oxford University Press, 2002, pp. 360-361, 1084-1085；Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley- Interscience, 2001；またはVogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Fourth Edition, New York: Longman, 1978を参照のこと。

本明細書に開示される種々の態様の再考を容易にするために、特定の用語についての以下の説明を提供する。

アシル：
式中、Rが有機基である、式RC(O)-の基。

アシルオキシ：
Rが任意で置換されたアルキルまたは任意で置換されたアリールであり得る、構造-OC(O)Rを有する基。「低級アシルオキシ」基は、Rが1〜10個（例えば、1〜6個）の炭素原子を含むものである。

アルコキシ：
Rが置換または非置換アルキルである、構造-O-Rを有する基（または置換基）。メトキシ（-OCH₃）は、例示的なアルコキシ基である。置換アルコキシにおいて、Rは、非干渉置換基で置換されたアルキルである。「チオアルコキシ」は、-S-Rを指し、式中、Rは、置換または非置換アルキルである。「ハロアルキルオキシ」は、基-ORを意味し、式中、Rはハロアルキルである。

アルコキシカルボニル：
式中、Rが任意で置換されたアルキルまたは任意で置換されたアリールであり得る、式-C(O)ORの基。「低級アルコキシカルボニル」基は、Rが1〜10個（例えば、1〜6個）の炭素原子を含むものである。

アルキル：
特に明確に記載されない限り、1〜15個の炭素原子；例えば、1〜10個、1〜6個、または1〜4個の炭素原子を含む、非環式、飽和、分岐鎖もしくは直鎖炭化水素基。この用語は、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、イソブチル、t-ブチル、ペンチル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、またはドデシルなどの基を包含する。「低級アルキル」という用語は、1〜10個の炭素原始を含むアルキル基を指す。明確に「非置換アルキル」と呼ばない限り、アルキル基は、非置換であり得るかまたは置換され得る。アルキル基は、1つまたは複数の置換基（例えば、アルキル鎖中の各メチレン炭素について2個までの置換基）で置換され得る。例示的なアルキル置換基としては、例えば、アミノ基、アミド、スルホンアミド、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、ヒドロキシ、メルカプト、トリフルオロメチル、アルキル、アルコキシ（例えば、メトキシ）、アルキルチオ、チオアルコキシ、アリールアルキル、ヘテロアリール、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルファノ（alkylsulfano）、ケト、または他の官能基が挙げられる。

アミノカルボニル（カルバモイル）：
式中、RおよびR'は、互いに独立して、水素または低級アルキル基である、式-OCN(R)R'-の基。

喘息：
喘息は、環境刺激物（またはアレルゲン）への曝露、冷気、運動、または感情的ストレスなどの1つまたは複数の「刺激」にしばしば反応して、気道が、収縮し、炎症を起こし、かつ過剰量の粘液で覆われる、呼吸器系の疾患である。この気道狭窄は、喘鳴、息切れ、胸苦しさ、および咳等の症状を引き起こす。前記障害は、慢性または再発性炎症状態であり、ここで、気道は、気管支過敏性、炎症、増加された粘液産生、および断続的な気道閉塞を特徴とする、種々の刺激に対する増加された反応性を生じさせる。

カルバメート：
式中、Rは、H、または脂肪族基、例えば、低級アルキル基、またはアラルキル基である、式-OC(O)N(R)-の基。

心臓障害または疾患：
一般的に、心臓障害／疾患は、心臓および／または血管（動脈および静脈）が関与する障害／疾患のクラスである。特定の例において、心臓障害／疾患は、うっ血性心不全を包含する。

慢性閉塞性肺疾患：
完全には可逆性でない気流の閉塞または制限を特徴とする、慢性気管支炎、気腫および気管支拡張症を包含する気道疾患のグループ。気流制限は、通常、進行性であり、有害粒子またはガスに対する肺の異常な炎症反応に関連する。

うっ血性心不全：
心臓が、体組織における適切な血液循環を維持することができないか、または静脈によってそこへ戻された静脈血を汲み出すことができない、心不全。

誘導体：
1つまたは複数の官能基という点で別の化学物質とは異なる化学物質。好ましくは、誘導体（例えば、フェノテロール類似体）は、それが誘導された分子（例えば、フェノテロール）の生物学的活性（例えば、β2アドレナリン作動性受容体刺激）を保持する。

異性体：
同一の分子式を有するがそれらの原子の結合の順序もしくは性質または空間におけるそれらの原子の配置が異なる化合物は、「異性体」と呼ばれる。空間におけるそれらの原子の配置が異なる化合物は、「立体異性体」と呼ばれる。互いの鏡像でない立体異性体は、「ジアステレオマー」と呼ばれ、互いの重ね合わせることができない鏡像であるものは、「エナンチオマー」と呼ばれる。化合物が不斉中心を有する場合、例えば、炭素原子が4個の異なる基へ結合されている場合、一対のエナンチオマーが可能である。エナンチオマーは、その不斉中心の絶対立体配置によって特徴付けられ得、CahnおよびPrelogのRおよびS順位則によって記載されるか、または分子が偏光面を回転させる様式によって右旋性もしくは左旋性（即ち、それぞれ、(+)もしくは(-)異性体）と呼ばれる。キラル化合物は、個々のエナンチオマーとしてまたはそれらの混合物として存在し得る。等しい割合のエナンチオマーを含有する混合物は、「ラセミ混合物」と呼ばれる。

本明細書に記載される化合物は、1つまたは複数の不斉中心を有し得；従って、このような化合物は、個々の(R)-もしくは(S)-立体異性体またはそれらの混合物として生成され得る。特に記載されない限り、本明細書および特許請求の範囲における特定の化合物の記載または命名は、個々のエナンチオマーおよびそれらの混合物（ラセミまたはその他）の両方を包含することを意図される。立体化学の測定方法および立体異性体の分離方法は、当技術分野において周知である（例えば、March, Advanced Organic Chemistry, 4th edition, New York: John Wiley and Sons, 1992, Chapter 4を参照のこと）。

任意の：
「任意の」または「任意で」は、引き続いて記載される事象または状況が起こり得るが起こる必要がないこと、ならびに該記載が該事象または状況が起こる場合と起こらない場合とを包含することを意味する。

薬学的に許容される担体：
本開示において有用である薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、従来のものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition (1995)に、1つまたは複数の治療化合物または分子、例えば、1つまたは複数の核酸分子、タンパク質、またはこれらのタンパク質に結合する抗体、およびさらなる薬剤の薬学的送達に好適である組成物および製剤が記載されている。

一般的に、担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、薬学的および生理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどを包含する注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤形態）について、従来の無毒性固体担体は、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを包含し得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、少量の無毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびpH緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有し得る。

フェニル：
フェニル基は、非置換であってもまたは1、2もしくは3個の置換基で置換されていてもよく、置換基は、独立して、アルキル、ヘテロアルキル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、チオアルコキシ、ハロ、ハロアルキル（例えば、-CF₃）、ニトロ、シアノ、-OR（式中、Rは、水素またはアルキルである）、-N(R)R'（式中、RおよびR'は、互いに独立して、水素またはアルキルである）、-COOR（式中、Rは、水素またはアルキルである）、または-C(O)N(R')R''（式中、R'およびR''は、独立して、水素またはアルキルより選択される）より選択される。

肺の障害または疾患：
一般的に、肺の障害／疾患は、肺に関する任意の障害／疾患を包含する。特定の例において、肺の障害／疾患は、喘息および慢性閉塞性肺疾患を包含する。

精製された：
「精製された」という用語は、絶対的な純度を必要とせず；むしろ、それは、相対的な用語として意図される。従って、例えば、精製された調製物は、所望の成分、例えば、フェノテロールの(R,R)-エナンチオマーが、前の環境におけるよりも、例えば、(±)-フェノテロール混合物におけるよりも、より富んでいるものである。所望の成分、例えば、フェノテロールの(R,R)-エナンチオマーは、例えば、試料の少なくとも約70重量％、80重量％、85重量％、90重量％、92重量％、95重量％、97重量％、98重量％、または99重量％が所望の成分から構成されている場合、精製されていると考えられる。化合物の純度は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）または他の従来の方法によって測定され得る。1つの例において、特定のフェノテロール類似体エナンチオマーが精製され、精製された調製物中に存在する他のエナンチオマーの90％超、しばしば95％超を示す。他の場合、精製された調製物は、本質的に均一であり得、ここで、他の立体異性体は1％未満である。

本明細書に記載される化合物は、精製された形態で得られてもよく、または、シリカゲルおよび／またはアルミナクロマトグラフィーを包含する当技術分野において公知のいずれかの手段によって精製されてもよい。例えば、Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2nd Edition, SnyderおよびKirkland編, New York: John Wiley and Sons, 1979；およびThin Layer Chromatography, ed. Stahl編, New York: Springer Verlag, 1969を参照のこと。1つの例において、化合物は、他の不純物と比べて試料の少なくとも約70重量％、80重量％、85重量％、90重量％、92重量％、95重量％、97重量％、98重量％、または99重量％の純度を有する精製されたフェノテロールまたはフェノテロール類似体を包含する。さらなる例において、化合物は、他の不純物と比べて試料の少なくとも約70重量％、80重量％、85重量％、90重量％、92重量％、95重量％、97重量％、98重量％、または99重量％の純度を各々が有する少なくとも2つの精製された立体異性体を包含する。例えば、化合物は、実質的に精製された(R,R)-フェノテロール類似体および実質的に精製された(R,S)-フェノテロール類似体を包含し得る。

被験体：
「被験体」という用語は、ヒト被験体および家畜被験体の両方、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウス、およびウシを包含する。同様に、用語、哺乳動物は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を包含する。

治療することまたは治療：
疾患に関して、いずれの用語も、（1）疾患を予防すること、例えば、疾患に曝される可能性があるまたは疾患に罹りやすい可能性があるが疾患の症状を未だ経験していないまたは示していない被験体において疾患の臨床症状が現れないようにすること、（2）疾患を抑制すること、例えば、疾患またはその臨床症状が現れるのを抑止すること、または（3）疾患を軽減すること、例えば、疾患またはその臨床症状を後退させることを包含する。

治療有効量：
その薬剤で治療される被験体において所望の効果を達成するに十分な特定の薬剤の量。例えば、これは、うっ血性心不全などの心臓障害を予防、緩和、および／または抑制、および／または治療することにおいて有用である(R,R)-フェノテロールまたは(R,R)-もしくは(R,S)-フェノテロール類似体の量であり得る。理想的には、薬剤の治療有効量は、被験体において実質的な細胞傷害効果を生じさせることなしに、被験体において障害を予防、緩和、および／または抑制、および／または治療するのに十分な量である。被験体において障害を予防、緩和、および／または抑制、および／または治療するに有用な薬剤の有効量は、治療される被験体、障害の重篤度、および治療組成物の投与様式に依存する。

III．(R,R)-フェノテロールおよびフェノテロール類似体
A．化学構造
本明細書に開示されるいくつかの例示的なフェノテロール類似体は、以下の式：

を有し、
式中、R₁〜R₃は、独立して、水素、アシル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニルまたはそれらの組み合わせであり；
R₄は、Hまたは低級アルキルであり；
R₅は、低級アルキル、

であり、式中、XおよびYは、独立して、水素、低級-OR₆および-NR₇R₈より選択され；
R₆は、低級アルキルまたはアシルであり；かつ
R₇およびR₈は、独立して、水素、低級アルキル、アルコキシカルボニル、アシルまたはアミノカルボニルである。

上記のフェノテロール類似体についての一般式を続いて参照して、Yは、-OHであってもよい。

1つの態様において、R₅は、1、2または3個の置換基を任意で有する1-または2-ナフチル誘導体である。このようなR₅基の例は、以下の式：

によって表され、式中、Y¹、Y²およびY³は、独立して、水素、低級-OR₆および-NR₇R₈であり；
R₆は、各出現について独立して、低級アルキルおよびアシルより選択され；かつ
R₇およびR₈は、独立して、水素、低級アルキル、アルコキシカルボニル、アシルまたはアミノカルボニル（カルバモイル）である。特定の化合物において、Y¹、Y²およびY³の少なくとも1つは、-OCH₃である。

特定のR₅基は、以下の式：

によって表されるものを包含し、式中、R₆は、低級アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピルもしくはイソプロピル、またはアシル、例えば、アセチルである。

例示的なR₅基としては、

が挙げられる。

1つの例において、R₄は低級アルキルであり、R₅は、

であり、式中、XおよびYは、独立して、H、低級アルキル -OR₆または-NR₇R₈より選択され；
R₆は低級アルキルであり；かつ
R₇およびR₈は、独立して、水素または低級アルキルである。

さらなる例において、R₄は、エチル、n-プロピル、およびイソプロピルより選択され、R₅は、以下の式：

を有し、式中、Xは、H、-OR₆または-NR₇R₈である。例えば、R₆はメチルであり得、またはR₇およびR₈は水素である。

さらなる例において、R₅は、以下の式：

を有する。

さらなる態様において、R₄は、メチル、エチル、n-プロピル、およびイソプロピルより選択され、R₅は、

を示す。

インビボで切断されヒドロキシ基を提供し得るR₁〜R₃についての好適な基の例としては、非限定的に、アシル、アシルオキシおよびアルコキシカルボニル基が挙げられる。このような切断可能な基を有する化合物は、「プロドラッグ」と呼ばれる。「プロドラッグ」という用語は、本明細書において使用される場合、インビボで（例えば、加水分解によって）ヒドロキシル基へ変換可能である置換基を含む化合物を意味する。種々の形態のプロドラッグが、例えば、Bundgaard, (ed.), Design of Prodrugs, Elsevier (1985)；Widder, et al. (ed.), Methods in Enzymology, Vol. 4, Academic Press (1985)；Krogsgaard-Larsen, et al., (ed), Design and Application of Prodrugs, Textbook of Drug Design and Development, Chapter 5, 113 191 (1991)；Bundgaard, et al., Journal of Drug Delivery Reviews, 8:1 38(1992)；Bundgaard, Pharmaceutical Sciences, 77:285 et seq. (1988)；およびHiguchi and Stella (eds.) Prodrugs as Novel Drug Delivery Systems, American Chemical Society (1975)において議論されるように、当技術分野において公知である。

例示的な(R,R)-化合物は、以下の化学構造：

を有する。

XおよびR₁〜R₃は、上述される通りである。

さらなる例示的な(R,R)-化合物は、以下の化学構造を有する。

例示的な(R,S)-化合物は、以下の化学構造を有し：

式中、XおよびR₁〜R₃は、上述される通りである。

さらなる例示的な(R,S)-化合物は、以下の化学構造を有する。

例示的な(S,R)-化合物は、以下の化学構造を有し：

式中、XおよびR₁〜R₃は、上述される通りである。

例示的な(S,S)-化合物は、以下の化学構造を有し：

式中、XおよびR₁〜R₃は、上述される通りである。

フェノテロールの種々の立体異性体を示す化学構造の例を以下に提供する。

特定の方法の態様は、(R,R)-フェノテロールのまたは本明細書に記載されるフェノテロール類似体のいずれかの、溶媒和物（例えば、水和物）、薬学的に許容される塩および／または種々の物理的形態の使用を意図する。

1．溶媒和物、塩および物理的形態
「溶媒和物」は、化合物と1つまたは複数の溶媒分子との物理的会合を意味する。この物理的会合は、種々の程度のイオン結合および共有結合を包含し、例えば、共有結合付加物および水素結合された溶媒和物が含まれる。ある場合において、溶媒和物は、例えば1つまたは複数の溶媒分子が結晶固体の結晶格子に組み入れられている場合、単離可能である。「溶媒和物」は、溶液相の溶媒和物および単離可能な溶媒和物の両方を包含する。代表的な溶媒和物としては、エタノール会合化合物、メタノール会合化合物などが挙げられる。「水和物」は、溶媒分子がH₂Oである溶媒和物である。

開示される化合物はまた、いくつかの塩形成基が存在する場合、混合塩および／または内部塩を含む、塩を包含する。塩は、一般的に、無毒性である薬学的に許容される塩である。塩は、任意のタイプのもの（有機および無機の両方）、例えば、フマル酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩およびリン酸塩であり得る。1つの例において、塩は、元素周期表のVII族を形成する非金属（例えば、ハロゲン）を含む。例えば、化合物は、臭化水素酸塩として提供され得る。

塩形成基のさらなる例としては、好適な塩基と塩を形成し得る、カルボキシル基、ホスホン酸基またはボロン酸基が挙げられるが、これらに限定されない。これらの塩は、例えば、元素周期表のIA、IB、IIAおよびIIB族の金属由来である無毒性金属カチオンを含み得る。1つの態様において、アルカリ金属カチオン、例えば、リチウム、ナトリウムもしくはカリウムイオン、またはアルカリ土類金属カチオン、例えば、マグネシウムもしくはカルシウムイオンが使用され得る。塩はまた、亜鉛またはアンモニウムカチオンであり得る。塩はまた、好適な有機アミン、例えば、非置換またはヒドロキシル置換されたモノ-、ジ-もしくはトリ-アルキルアミン、特に、モノ-、ジ-もしくはトリ-アルキルアミンで、または第4級アンモニウム化合物で、例えば、N-メチル-N-エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、モノ-、ビス-もしくはトリス-(2-ヒドロキシ-低級アルキル)アミン、例えば、モノ-、ビス-もしくはトリス-(2-ヒドロキシエチル)アミン、2-ヒドロキシ-tert-ブチルアミンまたはトリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン、N,N-ジ-低級アルキル-N-(ヒドロキシ-低級アルキル)アミン、例えば、N,N-ジメチル-N-(2-ヒドロキシエチル)アミンまたはトリ-(2-ヒドロキシエチル)アミン、またはN-メチル-D-グルカミン、または第4級アンモニウム化合物、例えば、テトラブチルアンモニウム塩で形成され得る。

本明細書に開示される例示的な化合物は、無機酸との酸塩基塩を形成し得る少なくとも1つの塩基性基を有する。塩基性基の例としては、アミノ基またはイミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。このような塩基性基と塩を形成し得る無機酸の例としては、鉱酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸が挙げられるが、これらに限定されない。塩基性基はまた、有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ酸（sulfo acid）またはホスホ酸（phospho acid）またはN置換スルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸またはイソニコチン酸と、ならびに、さらに、アミノ酸と、例えば、α-アミノ酸と、ならびにまた、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシメタンスルホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンジスルホン酸、4-メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、2-もしくは3-ホスホグリセレート、グルコース-6-ホスフェートまたはN-シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成を伴う）と、または他の酸性有機化合物、例えばアスコルビン酸と塩を形成し得る。現在の好ましい態様において、フェノテロールは、臭化水素酸塩として提供され、例示的なフェノテロール類似体は、それらのフマレートとして提供される。

薬学的に許容される塩を形成するためのさらなる対イオンは、Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995に見られる。1局面において、薬学的に許容される塩を使用することは、組成物の浸透圧を調節するためにも役立ち得る。

ある態様において、本方法において使用される化合物は、多形で提供される。従って、化合物は、2つまたはそれ以上の物理的形態、例えば、異なる結晶形態、結晶、液晶または非晶質（アモルファス）形態で提供され得る。

2．医薬の製造のための使用
上述の化合物のいずれか（例えば、(R,R)-フェノテロールもしくはフェノテロール類似体またはそれらの水和物もしくは薬学的に許容される塩）またはそれらの組み合わせは、被験体のβ2アドレナリン作動性受容体刺激のためまたは肺および心臓障害（例えば、喘息およびうっ血性心不全）の治療のための医薬の製造における使用に意図される。このような医薬に好適な製剤、これから利益を得ることができる被験体、および他の関連する特徴は、本明細書の他の箇所に記載される。

B．合成方法
開示されるフェノテロール類似体は、当技術分野において公知の任意の方法によって合成され得る。開示される化合物を合成するために有用な一般的に知られている化学合成スキームおよび条件を提供する多くの一般的な参考文献が、入手可能である（例えば、Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley-Interscience, 2001；またはVogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Fourth Edition, New York: Longman, 1978を参照のこと）。

本明細書に記載される化合物は、クロマトグラフィーの手段、例えば、HPLC、分取薄層クロマトグラフィー、フラッシュカラムクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを含む、当技術分野において公知である手段のいずれかによって精製され得る。順相および逆相ならびにイオン性樹脂を含む、任意の好適な固定相が使用され得る。最も典型的には、開示される化合物は、オープンカラムクロマトグラフィーまたは分取（prep）クロマトグラフィーによって精製される。

フェノテロール類似体の好適な例示的な合成を以下に提供する。

スキームI：
(R)-もしくは(S)-3',5'-ジベンジルオキシフェニルブロモヒドリンから形成されたエポキシドと、適切なベンジル保護された2-アミノ-3-ベンジルプロパン（1〜5）の(R)もしくは(S)-エナンチオマーまたはN-ベンジル-2-アミノヘプタン（6）の(R)もしくは(S)-エナンチオマーとのカップリングを含む、1〜6の4個の立体異性体の例示的な合成。

スキームII：
2-フェネチルアミンを使用する(R)-7および(S)-7の例示的な合成。得られた化合物は、Pd/Cにおける水素化によって脱保護され、かつフマレートとして精製され得る。

スキームIIIは、スキームIIに使用されるキラル構築ブロックについての例示的な合成を記載する。(R)-および(S)-3',5'-ジベンジルオキシフェニル-ブロモヒドリンエナンチオマーを、ホウ素-メチルスルフィド錯体（BH₃SCH₃）および(1R,2S)-または(1S,2R)-cis-1-アミノ-2-インダノールを使用した3,5-ジベンジルオキシ-α-ブロモアセトフェノンのエナンチオ特異的還元によって得た。要求される(R)-および(S)-2-ベンジルアミノプロパンを、対イオンとして(R)-または(S)-マンデル酸を使用したrac-2-ベンジルアミノプロパンのエナンチオ選択的結晶化によって作製した。

IV．薬学的組成物
開示される(R,R)-フェノテロールおよびフェノテロール類似体は、少なくとも、肺障害、例えば、喘息および慢性閉塞性肺疾患（COPD）ならびに心臓障害、例えば、うっ血性心不全の治療に有用であり得る。従って、少なくとも1つの開示されるフェノテロール化合物または類似体を含む薬学的組成物もまた、本明細書に記載する。

薬学的組成物についての製剤は、当技術分野において周知である。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition, 1995には、(R,R)-フェノテロールおよび開示するフェノテロール類似体の薬学的送達に好適である例示的な製剤（およびそれらの成分）が記載されている。これらの化合物の少なくとも1つを含む薬学的組成物は、ヒトまたは獣医学における使用のために製剤化され得る。開示される薬学的組成物の特定の製剤は、例えば、投与様式（例えば、経口または非経口）および／または治療される障害（例えば、肺障害、または心臓障害、例えばうっ血性心不全）に依存し得る。ある態様において、製剤は、少なくとも1つの有効成分、例えば、フェノテロール化合物に加えて、薬学的に許容される担体を含む。

開示される方法および組成物に有用である薬学的に許容される担体は、当技術分野において従来のものである。薬学的担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、薬学的および生理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどを包含する注射可能な流体を含む。固体組成物、例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤形態について、従来の無毒性固体担体は、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを包含し得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、任意で、少量の無毒性補助物質または賦形剤、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびpH緩衝剤など；例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有し得る。他の非限定的な賦形剤としては、非イオン性可溶化剤、例えば、クレモフォール、またはタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物が挙げられる。

開示される薬学的組成物は、薬学的に許容される塩として製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、遊離塩基の所望の薬理学的活性を有する化合物の遊離塩基形態の無毒性塩である。これらの塩は、無機酸または有機酸から誘導され得る。好適な無機酸の非限定的な例は、塩酸、硝酸、臭化水素酸、硫酸、ヨウ化水素酸およびリン酸である。好適な有機酸の非限定的な例は、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、メチルスルホン酸、サリチル酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、アスパラギン酸（asparagic acid）、アスパラギン酸（aspartic acid）、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などである。他の好適な薬学的に許容される塩のリストは、Remington 's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995に見られる。薬学的に許容される塩はまた、組成物の浸透圧を調節するために役立ち得る。

開示される薬学的組成物の剤形は、選択される投与様式によって決定される。例えば、注射可能な流体に加えて、経口剤形が使用され得る。経口製剤は、液体、例えば、シロップ剤、液剤もしくは懸濁剤、または固体、例えば、散剤、丸剤、錠剤もしくはカプセル剤であり得る。このような剤形を作製する方法は、当業者に公知であるか、または明らかである。

開示される化合物を含む薬学的組成物のある態様は、正確な投薬量の個々の投与に好適な単位剤形で製剤化され得る。投与される(R,R)-フェノテロールなどの有効成分の量は、治療される被験体、障害の重篤度、および投与様式に依存し、当業者に公知である。これらの範囲内で、投与される製剤は、治療される被験体において所望の効果を達成するに有効な量で本明細書に開示される抽出物または化合物を含有する。特定の例において、経口投与のために、組成物は、治療される被験体への投薬量の症状調節のために、有効成分を約1.0〜約50 mg、特に有効成分を約2.0 mg、約2.5 mg、5 mg、約10 mg、または約50 mg含有する錠剤の形態で提供される。1つの例示的な経口投薬計画において、有効成分を約1 mg〜約50 mg（例えば、約2 mg〜約10 mg）含有する錠剤が、1日2〜4回、例えば、2回、3回または4回、投与される。

V．使用方法
本開示は、肺および心臓障害を含む障害を治療する方法を含む。いくつかの例において、肺障害は、喘息または慢性閉塞性肺疾患である。他の例において、心臓障害は、うっ血性心不全である。

開示される方法は、薬学的に許容される担体中において、肺および／または心臓障害を治療するに有効な量で、被験体へ(R,R)-フェノテロールまたは開示されるフェノテロール類似体（および、任意で、1つまたは複数の他の薬剤）を投与する段階を含む。開示される方法において有用な投与経路としては、経口および非経口経路、例えば、静脈内（iv）、腹腔内（ip）、経直腸、局所、経眼、経鼻腔、および経皮が挙げられるが、これらに限定されない。これらの剤形についての製剤は、上記に記載されている。

(R,R)-フェノテロールまたは開示されるフェノテロール類似体の有効量は、少なくとも、特定の使用方法、治療される被験体、障害の重篤度、および治療組成物の投与様式に依存する。組成物の「治療有効量」は、治療される被験体において所望の効果を達成するに十分な特定の化合物の量である。例えば、これは、被験体において肺および／もしくは心臓障害ならびに／または障害の1つもしくは複数の症状を予防、抑制、緩和または軽減するために必要な(R,R)-フェノテロールの量であり得る。理想的には、(R,R)-フェノテロールまたは開示されるフェノテロール類似体の治療有効量は、ホスト細胞において実質的な細胞傷害効果を生じさせることなしに、肺および／もしくは心臓障害ならびに／または障害の1つもしくは複数の症状を予防、抑制、緩和または軽減するために十分な量である。

開示されるフェノテロール化合物または薬学的組成物の治療有効量は、本明細書の実施例において開示される適用可能な化合物のEC₅₀程と少なくとも同じぐらい高い濃度を達成することを目標にして、当業者によって決定され得る。投薬量範囲の例は、単回または分割用量で経口的に約0.001〜約10 mg／kg体重である。特定の例において、投薬量範囲は、単回または分割用量で経口的に約0.005〜約5 mg／kg体重である（およそ70 kgの平均体重を想定；平均を超えるかまたは平均未満の体重の個人については、値は適宜調節される）。経口投与のために、組成物は、治療される被験体への投薬量の症状調節のために、例えば、有効成分を約1.0〜約50 mg、特に有効成分を約2.5 mg、約5 mg、約10 mg、または約50 mg含有する錠剤の形態で提供される。1つの例示的な経口投薬計画において、有効成分を約1 mg〜約50 mg含有する錠剤が、1日2〜4回、例えば、2回、3回または4回、投与される。

任意の特定の被験体についての投薬の具体的な用量レベルおよび頻度は、変化され得、具体的な化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、被験体の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事、投与の様式および時間、排出速度、薬物併用、ならびに治療を受ける被験体の状態の重篤度を含む種々の因子に依存する。

本開示の事項を、下記の非限定的な実施例によってさらに説明する。

実施例
実施例1
材料および方法
試薬
フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、ベンズアミジン、ロイペプチン、ペプスタチンA、MgCl₂、EDTA、トリズマ塩酸塩（Trizma-Hydrochloride）（Tris-HCl）、(±)-プロプラノロールおよび最小必須培地（MEM）を、Sigma Aldrich (St. Louis, MO)から得た。卵ホスファチジルコリン脂質（PC）をAvanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から得た。(±)-フェノテロールをSigma Aldrichから購入し、[³H]-(±)-フェノテロールをAmersham Biosciences (Boston, MA)から得た。有機溶媒n-ヘキサン、2-プロパノールおよびトリエチルアミンを、超純粋HPCL等級溶媒としてCarlo Erba（Milan, Italy）から得た。ウシ胎仔血清およびペニシリン-ストレプトマイシンを、Life Technologies (Gaithersburg, MD)から購入し、[¹²⁵I]-(±)-ヨードシアノピンドロール（ICYP）をNEN Life Science Products, Inc. (Boston, MA)から購入した。

(R,R)-フェノテロールおよび(S,S)-フェノテロールの作製および同定
(R,R)-フェノテロールおよび(S,S)-フェノテロールを、アミローストリス-(3,5-ジメチルフェニルカルバメート)キラル固定相（CHIRALPAK（登録商標）AD CSP, Chiral Technologies, West Chester, PA；CHIRALPAKは、Daicel Chemical Industries Ltd., Exton, PAの登録商標である）を含有するHPLCカラム（25 cm×0.46 cm i.d.）を用いるキラルHPLC技術を使用して(±)-フェノテロールから作製した。クロマトグラフィーシステムは、コンピュータワークステーションへ接続された、JASCO（登録商標）PU-980溶媒送達システムおよびλ＝230 nmに設定されたJASCO（登録商標）MD-910多波長検出器からなった。JASCOは、JASCO, Inc., Tokyo, Japanの登録商標である。20μl試料ループを有するRheodyneモデル7125インジェクターを、前記クロマトグラフィーシステムへ0.2〜0.3 mg (±)-フェノテロールを注入するために使用した。移動相は、0.1％トリエチルアミンを含むn-ヘキサン／2-プロパノール（88／12 v／v）であり、流速は、1 mL／分であり、前記システムの温度はカラムヒーター／チラー（Model 7955, Jones Chromatography Ltd., UK）を使用して25℃に維持した。分離された(R,R)-フェノテロールおよび(S,S)-フェノテロールを、クロマトグラフィーカラムから溶離されたそれぞれのピークとして10mL画分回収した。2mL中間画分を回収し、回収された異性体のエナンチオマー純度を改善するために廃棄した。

分割された(R,R)-フェノテロールおよび(S,S)-フェノテロールの立体化学的立体配置を、JASCO（登録商標）J-800分光偏光計で得られた円二色性（CD）測定値を使用して確認した。(R,R)-フェノテロールおよび(S,S)-フェノテロールを2-プロパノールに溶解し、かつ測定値を、室温で1 cm路長を使用して得た。

固定化β2-AR先端クロマトグラフィー
固定化されたβ2-ARを含有する液体クロマトグラフィーカラムを、以前に記載された技術（Beigi et al., Anal. Chem., 76: 7187-7193, 2004）を使用して作製した。手短には、ヒトβ2-ARをコードするcDNAがトランスフェクトされているHEK 293細胞から、細胞膜を得た。micro BCA法によって測定した場合、5〜7 mg総タンパク質に対応する細胞ペレット懸濁液を、カラムを作製するために使用した。MgCl₂（2 mM）、ベンズアミジン（1 mM）、ロイペプチン（0.03 mM）、ペプスタチンA（0.005 mM）およびEDTA（1 mM）を含有するTris-HCl［50 mM, pH 7.4］から構成された10 mL緩衝液において、前記膜を作製した。

180 mgアリコートの固定化人工膜クロマトグラフィー支持体（IAM-PC、12μm粒径、300Å細孔径、Regis Chemical Co., Morton Grove, IL製）および80μM PCを、前記膜調製物へ添加し、かつ得られた混合物を室温で3時間撹拌し、（5 cm長）ニトロセルロース透析膜（MWカットオフ10,000 Da、Pierce Chemical, Rockford, IL）へ移し、かつ4℃で24時間、EDTA（1 mM）、MgCl₂（2mM）、NaCl（300 mM）およびPMSF（0.2 mM）を含有するTris-HCl［50 mM, pH 7.4］から構成された1 Lの透析緩衝液中に配置した。透析工程を、新鮮な緩衝液を使用して2回繰り返した。

透析後、混合物を、120×gで3分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、かつ固定化された受容体を保持する膜を含有するIAM支持体のペレットを回収した。EDTA（1 mM）およびMgCl₂（2 mM）を含有するTris-HCl［10 mM, pH 7.4］から構成された2 mLクロマトグラフィーランニングバッファーに前記ペレットを再懸濁し、かつ該懸濁液を、蠕動ポンプを使用して0.3 mL／分の流速でHR 5/2クロマトグラフィーガラスカラム（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）に注入した。エンドアダプター（end adaptor）を構築し、0.4 mLのゲル総容積を作製した。使用しない場合、カラムを4℃で保存した。

固定化β2-AR固定相を含有するカラムを、全て連続的に接続された、HPLCポンプ（10-AD, Shimadzu Inc., Columbia, MD）、50μL試料ループを有する手動制御化FPLCインジェクター（Amersham Biotechnology, Uppsala, Sweden）、充填された固定化受容体カラムおよびオンライン放射性フロー検出器（IN/US, Tampa, FL）から構成されたクロマトグラフィーシステム中に配置した。先端クロマトグラフィー研究において、溶離プロファイルがプラトー領域を示すまで、5〜7 mLの試料量を継続的に適用した。ランニングバッファーは、EDTA（1 mM）とMgCl₂（2 mM）とマーカーリガンドである0.05 nM [³H]-(±)-フェノテロールとを含有するTris-HCl[10 mM, pH 7.4]から構成された。(R,R)-フェノテロールまたは(S,S)-フェノテロールを、0.1 nM、80.0 nM、240 nMおよび700 nMの連続濃度で前記ランニングバッファーへ添加し、かつ前記カラムへ適用した。固定化受容体カラムを、各試料注入間に、それぞれ、添加された(R,R)-フェノテロールまたは(S,S)-フェノテロール無しで、約80 mLのランニングバッファーで平衡化した。全てのクロマトグラフィー研究を、0.2 mL／分の流速で室温において行った。

データを分析し、非線形等式（1）を使用して結合部位数および解離定数を決定した。

式中、V₁は溶質溶離体積であり、V_minは飽和点での溶離体積であり、Pは利用可能な結合部位数であり、Mはマーカーリガンドの濃度であり、K_dはリガンドの解離定数である。

リガンド置換結合
ヒトβ2-ARのアデノウイルス感染の24時間後、HEK293細胞を、溶解緩衝液、EGTA［5 mM］を含有するTris-HCl［5 mM, pH 7.4］に収穫し、かつ氷上において15ストロークでホモジナイズした。試料を30,000×gで15分間遠心分離し、膜をペレット化した。膜を、結合緩衝液、NaCl（120 mM）、KCl（5.4 mM）、CaCl₂（1.8 mM）、MgCl₂（0.8 mM）、およびグルコース（5 mM）を含有するTris-HCl［20 mM, pH 7.4］に再懸濁し、かつ-80℃においてアリコートで保存した。結合アッセイ法を、飽和量（1〜300 pM）のβ-AR特異的リガンド[¹²⁵I]シアノピンドロール（ICYP）を使用して、5〜10μgの膜タンパク質において行った。競合結合について、5〜10μgの膜タンパク質を、50μMのGTP_γs（非加水分解性グアノシン三リン酸）で前処理し、次いで¹²⁵ICYP（50 pM）および種々の濃度のフェノテロールまたはその異性体と共に総量250 μLでインキュベートした。非特異的結合を、20μMプロプラノロールの存在下で測定した。反応を、37℃で1時間、250μLの結合緩衝液中において行った。膜懸濁液へ氷冷したTris-HCl［10 mM, pH 7.4］を添加し、続いてガラス繊維フィルター（Whatman GF/C）を通して迅速に真空濾過することによって、結合反応を終了させた。各フィルターを、追加の7 mLの氷冷したTris- HCl［10 mM, pH 7.4］で3回洗浄した。湿ったフィルターの放射能をガンマカウンターにおいて測定した。全てのアッセイ法を2回通り行い、受容体密度を何ミリグラムかの膜タンパク質まで標準化した。ICYPについての最大結合部位数（B_max）およびK_dを、飽和結合等温線のScatchard分析によって測定した。競合研究からのデータを、GRAPHPAD PRISM（登録商標）ソフトウェア（GRAPHPAD PRISMは、GraphPad Software, Inc., San Diego, CAの登録商標である）を用いて、1-または2-部位競合結合曲線を使用して分析した。

実施例2
(R,R)-フェノテロールおよび(S,S)-フェノテロールの精製および同定
この実施例は、高度のエナンチオマー純度への(±)-フェノテロールからの(R,R)-フェノテロールおよび(S,S)-フェノテロールの分割を実証する。

実施例1に記載のクロマトグラフィー条件を使用して、(±)-フェノテロールを、AD-CSPにおいて、その成分エナンチオマー、(R,R)-フェノテロールおよび(S,S)-フェノテロールへ分離した。図1に示すように、2つの立体異性体が、1.21のエナンチオ選択性因子（α）および1.06の分割因子（R_s）で分割された。クロマトグラフィーピークの観察されたテーリングのために、2mLの中間画分を回収し、かつ廃棄した。回収されたピークを、同一のクロマトグラフィー条件を使用して分析し、かつデータによって、両方のエナンチオマーが＞97％立体化学純度で作製されたことが実証された。

単離された画分の絶対立体配置の割当（assignment）を、それらのキロプティカル（chiroptical）特性を使用して行った。両方の画分の紫外線（UV）スペクトルは、約280および230で同一の最大値を含み、2つのエナンチオマーについて同一のUV発色団を示している。円二色性（CD）スペクトルは、より保持されなかったエナンチオマー画分について、約280および215 nmで負のCDバンドを示し、一方、スペクトルは230および200 nmで正である。CDバンドのサインは、最も保持されたフェノテロール画分について逆転され、これによって前記2つの画分のエナンチオマー性質が確認される。2つのエナンチオマー画分の最も低いエネルギーUVおよびCDスペクトルを、それぞれ、図2Aおよび2Bに示す。より保持されなかったクロマトグラフィー画分は、約280 nmで負のCDバンドを示し、一方、最も保持されたクロマトグラフィー画分のCDスペクトルは、同一の波長で正のCDバンドを含んだ（図2B）。これらの結果は、画分の各々がフェノテロールエナンチオマーの1つを含有したことを示している。

最も低いエネルギーCDバンドのサインは、キラルベンジル誘導体についてのBrewster-Buta／Smith-Fontanaセクター則（Brewster and Buta, J. Am. Chem. Soc, 88: 2233-2240, 1996）を適用することによって、分離されたフェノテロールエナンチオマーの絶対立体配置を割り当てるために使用され得る。このセクター則は、ヒドロキシル部分またはアミン部分のいずれかを有する、ベンジル化合物の¹L_b電子遷移に関連するCDバンドのサインを予想するために使用され、単一の立体中心を含む立体配座的に可動な芳香族化合物へ主に適用された。フェノテロールの場合、2つの立体中心が存在する。しかし、観察された光学活性は、芳香族環と立体中心との距離のため、主にアリールカルビノール部分によって決定されると考えられる。この規則の適用によって、280 nmで負のCDバンドを示したより保持されなかった画分中に含有されたフェノテロールエナンチオマーを(S,S)絶対立体配置と割り当て、280 nmで正のCDバンドを示した最も保持された画分中に含有されたフェノテロールエナンチオマーを(R,R)絶対立体配置と割り当てることができた。この割当を(S,S)-フェノテロールおよび(R,R)-フェノテロールの独立合成によって確認した。

これらの研究は、(R,R)-フェノテロールおよび(S,S)-フェノテロールが、高度のエナンチオマー純度へ(±)-フェノテロールから分離され得ることを示している。

実施例3
固定されたβ2-ARへの(R,R)-フェノテロールおよび(S,S)-フェノテロールの結合のクロマトグラフィーによる測定
この実施例は、(R,R)-フェノテロールが、臨床的に使用される薬物(±)-フェノテロールのβ2-AR結合の原因であることを実証する。

β2-AR HEK-293細胞系から得られた固定化膜を含有する液体クロマトグラフィー固定相の作製、特徴づけおよび適用は、以前に報告された（Beigi et al., Anal. Chem., 76: 7187-7193, 2004）。例えば、Beigiら（Anal. Chem., 76: 7187-7193, 2004）は、先端置換クロマトグラフィーが、固定化されたβ2-ARへの2つのβ2-ARアンタゴニスト、(S)-プロプラノロールおよびCGP 12177 Aの結合についての解離定数（K_d）を測定するために使用され得ることを実証した。マーカーリガンドとしてCGP 12177Aを使用するゾーン（zonal）置換クロマトグラフィーは、移動相への(S)-プロプラノロールの添加が(R)-プロプラノロールの添加よりも大きな置換を生じさせたので、固定化されたβ2-ARがそのエナンチオ選択性を保持することを実証した（同文献）。移動相への(±)-フェノテロールの添加もまた、固定化されたβ2-ARの立体配座変化を生じさせることが示された（同文献）。静止状態から活性状態へのβ2-ARならびに大抵のGタンパク質共役受容体のアゴニスト誘発性立体配座変化が記載された（Ghanoui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98: 5997-6002, 2001）。

今回、固定化されたβ2-ARカラムを、置換研究の開始前に、マーカーリガンドである[³H]-フェノテロールを含有するランニングバッファーで平衡化した。先端置換クロマトグラフィーを使用して算出された結合データは、受容体の活性状態への(R,R)-フェノテロールおよび(S,S)-フェノテロールの結合を反映すると考えた。先端クロマトグラフィーにおいて、クロマトグラフィートレースの初期フラット部分は、固定化された標的（この研究においては、β2-AR）について特異的であるマーカーリガンドの結合、ならびに固定化された膜フラグメントにおける他の部位への非特異的結合を示す。特定結合部位の飽和によってブレークスルーフロント（breakthrough front）が生じ、続いて、新たな平衡の構築を示すプラトーが生じる。移動相への第2の化合物の添加は、該化合物がβ2-ARへの結合について前記マーカーと競合する場合、クロマトグラフィートレースを左へシフトさせる。このシフトの大きさとマーカーリンガンドの濃度との関係は、標的についての前記置換物の結合親和性および活性結合部位数を算出するために使用され得る。このアプローチは、最近、概説された（Moaddel and Wainer, Anal. Chem. Acata, 546: 97-105, 2006）。

図3（曲線1）に示されるように、ランニングバッファーへの[³H]-フェノテロールの添加によって、予想された先端クロマトグラフィートレースを生じた。ランニングバッファーへの増加する濃度の(R,R)-フェノテロールの連続添加によって、より少ない保持容量へのクロマトグラフィートレースの対応するシフトが生じた（図3、曲線2〜4）。大きさおよびシフトならびに(R,R)-フェノテロールの対応する濃度を、Eqn 1を使用して分析し、かつ算出された解離定数K_dは472 nMであり、利用可能な結合部位の量［P］は1カラム当たり176 pmolであった；r²＝0.9999（n＝2）。

ランニングバッファーへの増加する濃度の(S,S)-フェノテロールの連続添加によって、より短い保持時間へのクロマトグラフィートレースの対応するシフトが生じなかった。従って、(S,S)-フェノテロールは、固定化されたβ2-ARについて顕著な親和性を有しなかった。

クロマトグラフィー結果を実証するために、標準膜結合研究を、前記固定化β2-ARカラムを作製するために使用したのと同一のHEK-293細胞系から得られた膜を使用して行った。データは単一の結合部位の存在を反映し、（平均値±SD）K_dは、(R,R)-フェノテロールについて457±55 nM（n＝4）、(S,S)-フェノテロールについて109,000±10,400 nM（n＝4）であった。これらのデータは、固定化細胞膜カラムにおける先端アフィニティークロマトグラフィーが、標的受容体へのリガンド結合の大きさおよびエナンチオ選択性を測定するために使用され得ることを示している。さらに、先端アフィニティークロマトグラフィーおよびリガンド競合結合研究からの結果は両方とも、(R,R)-フェノテロールが、臨床的に使用される薬物(±)-フェノテロールのβ2-AR結合の原因であることを実証している。

実施例4
心筋細胞収縮性に対する(R,R)-フェノテロールおよび(S,S)-フェノテロールの効果
この実施例は、(R,R)-フェノテロールおよび(S,S)-フェノテロールが、細胞収縮性に関するβ2アドレナリン作動性受容体／刺激ヘテロ三量体Gタンパク質（AR/G_S）シグナル伝達を差次的に活性化することを実証する。

(R,R)-フェノテロールおよび(S,S)-フェノテロールが細胞収縮性の調節においてβ2-AR/G_Sシグナル伝達を差次的に活性化するかどうかを測定するために、新たに単離した成体ラット心筋細胞に、種々の濃度の(R,R)-フェノテロールまたは(S,S)-フェノテロールを灌流した。これらの研究を、以前記載されたアプローチ（Zhou et al., Mol. Pharmacol., 200, 58: 887-894）を使用して行った。手短には、単一心室筋細胞を、標準的な酵素技術によって2〜4ヶ月齢のラット心臓から単離した。単離された細胞を、NaCl（137 mM）、KCl（5.4 mM）、MgCl₂（1.2 mM）、NaH₂PO₄（1.0 mM）、CaCl₂（1.0 mM）、およびグルコース（20 mM）を含有するHEPES緩衝液［20 mM, pH 7.4］に再懸濁した。全ての研究を細胞単離の8時間以内に行った。

前記細胞を、倒立顕微鏡（ZeissモデルIM-35, Zeiss, Thornwood, NY）のステージに配置し、1.8 mL／分の流速で前記HEPES緩衝化溶液を灌流し、かつ23℃において0.5 Hzで電気により刺激した。細胞長を、3 ms時間分解能で光ダイオードアレイ（Model 1024 SAQ, Reticon, Boston, MA）を使用してオプティカルエッジトラッキング法によってモニタリングした。細胞収縮を、電気刺激に続く細胞長のパーセント短縮によって測定した。

(R,R)-フェノテロール（10^-8〜10^-5 M）の添加によって、(±)-フェノテロールと比較して、顕著に上昇された正の変力効果および用量反応曲線の顕著な上方シフトが生じた（図4A）。これは、265±11.6％から306±11.8％静止細胞長（p＜0.05）への最大収縮反応の増加、および-7.0±0.2から-7.1±0.2 log [M]（p＜0.05）へのEC₅₀の減少によって実証された。対照的に、(S,S)-フェノテロールは、ほんの僅かな正の変力効果を有した（図4B）。

心筋細胞収縮性研究は、(R,R)-フェノテロールが、心筋細胞における観察されるβ2-ARアゴニスト活性の原因であることを示している。

実施例5
合成
一般的手順：
全ての反応を、市販等級の試薬および溶媒を使用して行った。テトラヒドロフラン（THF）をナトリウムおよびベンゾフェノンにおいて還流することによって乾燥した。ジクロロメタンを水素化カルシウムにおいて還流することによって乾燥した。紫外線スペクトルをCary 50 Concentration分光光度計において記録した。旋光度をRudolph Research Autopol IVにおいて行った。NMRスペクトルを、内部標準としてテトラメチルシランを使用してVarian Mercury VMX 300MHz分光光度計で記録した。NMR多重度は、以下の略語を使用して報告された：s、一重線；d、二重線；t、三重線；q、四重線；p、五重線；m、多重線；apt.、見掛け上；およびbr、ブロード。低分解能質量スペクトルを、エレクトロスプレー（ESI）および大気圧化学イオン化（APCI）プローブの両方を備えたFinnigan LCQ^Duo LC MS/MS大気圧化学イオン化（API）四重極イオントラップMSシステムにおいて得た。分析HPLCデータは、PDA検出を備えたWaters 2690 Separations Moduleを使用して得た。方法（a）：ThermoHypersil BDS 100 x 4.6 mm C18カラム、H₂O／CH₃CN／TFA。方法（b）：Brownlee Phenyl Spheri-5 100 x 4.6 mm、水／アセトニトリル／TFA。方法（c）：Vydac 150 x 4 mm C18カラム、H₂O／イソプロパノール／TFA。方法（d）：CHIRALPAK（登録商標）AD-H 250 x 10 mm、95／5／0.05 CH₃CN／イソプロパノール／ジエチルアミン。Merckシリカゲル（230-400メッシュ）をオープンカラムクロマトグラフィーに使用した。

3',5'-ジベンジルオキシ-α-ブロモアセトフェノン（46）
45 mLのCHCl₃中の2.4 mL（46 mmol）のBr₂の溶液を、40 mLのCHCl₃中の9.66 g（29 mmol）の3',5'-ジベンジルオキシアセトフェノン（45）の冷却された撹拌溶液へ1時間にわたって滴下した。得られた溶液を、十分に撹拌しながら1時間にわたって室温へ加温し、次いで100 mLの冷H₂Oへ注ぎ、かつ分液漏斗へ移し、ここでCHCl₃画分を単離し、鹹水溶液で洗浄し、乾燥し（Na₂SO₄）、濾過し、かつ10.8 gまで濃縮した。この物質を、500 gのシリカゲルへ適用し、CHCl₃で溶離し、2.65 g（22％）の化合物46が白色固体として得られた。

化合物46の3',5'-ジベンジルオキシフェニルブロモヒドリン［(R)-8、(S)-8］へのエナンチオ選択的還元についての一般的手順
アルゴン雰囲気下で、ジエチルエーテル中の5.0 Mホウ素-メチルスルフィド錯体（BH₃SCH₃）約0.06 mL（0.316 mmol, 10 mol％）を、3 mLの乾燥THF中の25 mg（0.16 mmol, 5 mol％）の適切なcis-1-アミノ-2-インダノールの溶液へ一度に添加した。この物質をアルゴン下で30分にわたって20 mLの乾燥THF中の1.3 g（3.16 mmol）の3',5'-ジベンジルオキシ-α-ブロモアセトフェノンの溶液へ添加し、同時に、約0.05 mL パルスで、0.45 mLの5.0 Mホウ素-メチルスルフィド錯体を添加した。得られた溶液をアルゴン下で2時間撹拌し、次いで、ガス発生を制御しながら、3 mLのメタノールで反応停止した。溶媒を真空中で除去し、得られた残渣を、30 mLのCHCl₃に溶解し、かつ25 mLの0.2 M硫酸、続いて20 mLの鹹水で洗浄し、次いで乾燥し（Na₂SO₄）、濾過し、かつ蒸発させた。

(R)-(-)-3',5'-ジベンジルオキシフェニルブロモヒドリン［(R)-8］
エナンチオ選択的還元触媒として(1R,2S)-(+)-cis-1-アミノ-2-インダノールを用いて作製し、1.02 g（78％）の(R)-8が微細な白色粉末として得られた。

(S)-(+)-3',5'-ジベンジルオキシフェニルブロモヒドリン［(S)-8］
エナンチオ選択的還元触媒として(1S,2R)-(-)-cis-1-アミノ-2-インダノールを用いて作製し、1.07 g（82％）の(S)-8が微細な白色粉末として得られた。

4-ベンジルオキシフェニルアセトン（34）
10.0 g（41.3 mmol）の4-ベンジルオキシフェニル酢酸（31）へ、20 mLの無水酢酸および20 mLのピリジンを添加し、これを撹拌しながらアルゴン雰囲気下で6時間加熱還流した。溶媒を蒸発させ、かつ残渣をCHCl₃（50 mL）に溶解し、かつ1N NaOH（2×50 mL）で洗浄した。有機層を乾燥し（MgSO₄）、濾過し、かつ蒸発させ、11.8 gの琥珀色オイルが得られた。170℃へ設定されたオイルバス中において0.1 mm Hgで真空蒸留し、続いて、8／2 CH₂Cl₂-ヘキサンで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによって、2.68 g（27％）が得られた。

フェニルアセトン（35）
20.4 g（0.15 mol）のフェニル酢酸、無水酢酸（70 mL）およびピリジン（70 mL）の溶液を、撹拌しながらアルゴン雰囲気下で6時間加熱還流した。溶媒を蒸発させ、かつ残渣を、CHCl₃（100 mL）に溶解し、1N NaOH（2×100 mL）で洗浄し、かつ有機層を乾燥し（MgSO₄）、濾過し、かつ蒸発させ、20.4 gが得られた。160℃へ設定されたオイルバス中において0.1 mm Hgで真空蒸留し、続いて、1／1 ヘキサン／CH₂Cl₂で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによって、5.5 g（27％）が得られた。

1-ナフタレン-1-イル-プロパン-2-オン（36）
37.2 g（20 mmol）のナフトエ酸（33）、無水酢酸（100 mL）およびピリジン（100 mL）の溶液を、撹拌しながらアルゴン雰囲気下で6時間加熱還流した。溶媒を蒸発させ、残渣をCHCl₃（200 mL）に溶解し、かつ1N NaOH（2×150 mL）で洗浄し、有機層を乾燥し（MgSO₄）、濾過し、かつ蒸発させ、34.6 gが得られた。170℃へ設定されたオイルバス中において0.5 mm Hgで蒸留し、続いて、1／1 ヘキサン／CH₂Cl₂で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによって、9.7 g（26％）が得られた。

2-ベンジルアミノプロパン類（37〜39、42、43）の作製についての一般的手順
0℃へ冷却したCH₂Cl₂（c＝0.5 M）中の適切なケトン（1 eq）へ、氷HOAc（1 eq）続いてベンジルアミン（1 eq）およびNaBH(AcO)₃（1.4 eq）を添加した。反応混合物を、室温へ加温し、かつアルゴン下で20時間撹拌した。反応混合物を冷却し（氷浴）、10％NaOH（5 eq）を滴下し、次いでCH₂Cl₂へ抽出し、鹹水で洗浄した。次いで、生成物を、乾燥し（Na₂SO₄）、濾過し、かつ蒸発させた。

1-(4-ベンジルオキシ)-2-ベンジルアミノプロパン（37）
4-ベンジルオキシ-フェニルアセトン（34；2.0 g, 8.3 mmol）から作製し、2.61 g（95％）が黄褐色固体として得られた。

1-フェニル-2-ベンジルアミノプロパン（38）
フェニルアセトン（35；5.5 g, 41 mmol）から作製し、8.4 g（91％）が黄褐色固体として得られた。

1-(1'-ナフチル)-2-ベンジルアミノプロパン（39）
1-ナフタレン-1-イル-プロパン-2-オン（36；5.0 g, 27.1 mmol）から作製し、7.0 g（94％）が黄褐色固体として得られた。

1-(4'-メトキシフェニル)-2-ベンジルアミノプロパン（42）
4-メトキシフェニル-アセトン（40；2.75 g, 13.1 mmol）から作製し、2.31 g（97％）が得られた。

1-(4'-ニトロフェニル)-2-ベンジルアミノプロパン（43）
4-ニトロフェニル-アセトン（41；4.95 g, 28 mmol）から作製し、7.32 g（98％）が琥珀色オイルとして得られた。

2-ベンジルアミノプロパン類［(R)-10〜14、(S)-10〜14］のエナンチオマー分離についての一般的手順
適切なラセミ2-ベンジルアミノプロパン（1 eq）を、メタノール（c＝0.5 M）中の適切な光学的に活性であるマンデル酸（1 eq）と混合し、かつ溶液が均質化されるまで還流し、次いでRTまで冷却した。結晶を濾過し、回収し、かつメタノール（c＝0.3 M）から2回再結晶し、光学的に活性である2-ベンジルアミノプロパン・マンデル酸塩が得られた。NMRおよび回転データを回収するために、マンデル酸塩を10％K₂CO₃およびCHCl₃に分配し、有機抽出物を乾燥し（Na₂SO₄）、かつ蒸発させることによって、前記塩を遊離アミンへ変換した。

(R)-(-)-1-(4'-ベンジルオキシ)-2-ベンジルアミノプロパン［(R)-10］
2.13 g（6.42 mmol）の1-(4-ベンジルオキシ)-2-ベンジルアミノプロパン（37）の試料を、972 mg（6.42 mmol）の(R)-(-)-マンデル酸と反応させ、後処理後、295 mg（エナンチオマー存在量に基づいて28％）の遊離アミンが得られた。

(S)-(+)-1-(4'-ベンジルオキシ)-2-ベンジルアミノプロパン［(S)-10］
(R)-10の分離からの洗浄物を、濃縮し、かつクロロホルム50 mLおよび10％K₂CO₃水溶液50 mLに分配した。有機物を鹹水で洗浄し、乾燥し（Na₂SO₄）、濾過し、かつ蒸発させ、1.70 g（5.1 mmol）が得られた。有機物を782 mg（5.1 mmol）の(S)-(+)-マンデル酸（前述）と共に還流し、かつ3回結晶化し、670 mgの(S)-アミン・(S)-マンデル酸塩が得られた。(S)-アミン・(S)-マンデル酸塩をエーテル中において粉砕し、次いでクロロホルム30 mLおよび10％K₂CO₃水溶液20 mLに分配した。有機分配物を鹹水で洗浄し、次いで乾燥し（Na₂SO₄）、濾過し、かつ蒸発させ、366 mgの遊離アミン（エナンチオマー存在量に基づいて33％）が得られた。

(R)-(-)-1-(4'-メトキシフェニル)-2-ベンジルアミノプロパン［(R)-11］
3.02 g（11.8 mmol）の1-(4'-メトキシフェニル)-2-ベンジルアミノプロパン（42）の試料を、1.8 g（11.8 mmol）(S)-(+)-マンデル酸と反応させ、後処理後、530 mg（エナンチオマー存在量に基づいて35％）の遊離アミンが得られた。

(S)-(+)-1-(4'-メトキシフェニル)-2-ベンジルアミノプロパン［(S)-11］
3.36 g（13.2 mmol）のラセミ体1-(4'-メトキシフェニル)-2-ベンジルアミノプロパン（42）の試料を、2.0 g（13.2 mmol）の(R)-(-)-マンデル酸と反応させ、後処理後、740 mg（エナンチオマー存在量に基づいて44％）の遊離アミンが得られた。

(R)-(-)-1-(4'-ニトロフェニル)-2-ベンジルアミノプロパン［(R)-12］
2.0 g（7.3 mmol）の1-(4'-ニトロフェニル)-2-ベンジルアミノプロパン（43）の試料を、1.13 g（7.3 mmol）の(S)-(-)-マンデル酸と反応させ、後処理後、486 mg（エナンチオマー存在量に基づいて49％）の遊離アミンが得られた。

(S)-(+)-1-(4'-ニトロフェニル)-2-ベンジルアミノプロパン［(S)-12］
2.0 g（7.3 mmol）の1-(4'-ニトロフェニル)-2-ベンジルアミノプロパン（43）の試料を、1.13 g（7.3 mmol）の(R)-(-)-マンデル酸と反応させ、後処理後、640 mg（エナンチオマー存在量に基づいて65％）の遊離アミンが得られた。

(R)-(-)-1-フェニル-2-ベンジルアミノプロパン［(R)-13］
2.62 g（11.6 mmol）の1-フェニル-2-ベンジルアミノプロパン（38）の試料を、1.77 g（11.6 mmol）の(S)-(+)-マンデル酸と反応させ、後処理後、747 mg（エナンチオマー存在量に基づいて57％）の遊離アミンが得られた。

(S)-(+)-1-フェニル-2-ベンジルアミノプロパン［(S)-13］
5.0 g（22.2 mmol）のラセミ1-フェニル-2-ベンジルアミノプロパン（38）の試料を、3.4 g（22.2 mmol）の(R)-(-)-マンデル酸と反応させ、後処理後、2.15 g（エナンチオマー存在量に基づいて86％）の遊離アミンが得られた。

(R)-(-)-1-(1'-ナフチル)-2-ベンジルアミノプロパン［(R)-14］
(S)-14の分離から回収した洗浄物を濃縮し、かつクロロホルム40 mLおよび10％K₂CO₃水溶液40 mLに分配した。有機分配物を20 mLの鹹水で洗浄し、次いで乾燥し（Na₂SO₄）、1.16 g（4.2 mmol）の遊離アミンが得られ、これを640 mg（4.2 mmol）の(S)-(+)-マンデル酸と反応させた。588 mg（エナンチオマー存在量に基づいて46％）の遊離アミンが得られた。

(S)-(+)-1-(1'-ナフチル)-2-ベンジルアミノプロパン［(S)-14］
2.6 g（9.4 mmol）の1-(1'-ナフチル)-2-ベンジルアミノプロパン（39）の試料を、1.44 g（9.4 mmol）の(R)-(-)-マンデル酸と反応させ、後処理後、420 mg（エナンチオマー存在量に基づいて21％）の遊離アミンが得られた。

(R)-(-)-2-ベンジルアミノヘプタン［(R)-15］。0.65 mL（4.4 mmol）の(R)-(-)-2-アミノヘプタン（R-44）の試料、0.44 mL（4.4 mmol）のベンズアルデヒドおよび0.1 mLのHOAcを40 mLのCH₂Cl₂中において混合し、次いで0℃へ冷却した。反応混合物へ2.75 mg（13 mmol）のナトリウムトリアセトキシボロヒドリドを一度に添加し、これをアルゴン下において室温で28時間撹拌した。反応混合物を30 mLのCH₂Cl₂で希釈し、氷浴中において冷却し、かつ80 mLの5％NaOH（水溶液）を添加した。画分を分離し、有機物を乾燥し（Na₂SO₄）、かつ蒸発させ、638 mg（71％）の(R)-15が得られた。

(S)-(+)-2-ベンジルアミノヘプタン［(S)-15］
0.15 mL（1 mmol）の(S)-(+)-2-アミノヘプタン（(S)-44）の試料、0.1 mL（1 mmol）のベンズアルデヒドおよび0.1 mLのHOAcを10 mLのCH₂Cl₂中において混合し、かつ0℃へ冷却し、次いで650 mg（3 mmol）のナトリウムトリアセトキシボロヒドリドを一度に添加した。反応混合物をアルゴン下において室温で28時間撹拌した。混合物を、10 mLのジクロロメタンで希釈し、氷浴中において冷却し、かつ20 mLの5％NaOH（水溶液）を添加した。画分を分離し、有機物を乾燥し（Na₂SO₄）、かつ蒸発させ、154 mg（70％）が得られた。

フェノテロール類似体の作製、手順A
エポキシドを形成するために、適切な3',5'-ジベンジルオキシフェニルブロモヒドリン（(R)-8）または(S)-8（1 eq）を、1：1 THF／MeOH（c＝0.3 M）中においてK₂CO₃（1.4 eq）と混合し、かつアルゴン下において室温で2時間撹拌した。溶媒を除去し、かつ残渣をトルエンおよびH₂Oに分配した。トルエン画分を単離し、乾燥し（Na₂SO₄）、濾過し、かつ蒸発させた。残渣を適切な遊離ベンジルアミン(R)-または(S)-10〜15、28（0.95 eq）と共に十分な量のトルエンに溶解し、かつ高真空下で再度蒸発させ、微量のH₂Oを除去した。得られた無色残渣をアルゴン下で20時間120℃へ加熱し、冷却し、かつ¹H NMRおよび質量分析によって調べ、カップリングを確認した。残渣を加熱しながらEtOH（c＝0.07 M）に溶解し、かつParrフラスコに移し、ここで、それを24時間10％（wt）Pd/C（10 mg cat／65 mg ブロモヒドリン）において50 psiの水素で水素化した。完全な脱ベンジル化を、質量分析によって確認した。混合物をセライトで濾過し、濾過ケーキをイソプロパノールでリンスし、かつ濾液を濃縮した。残渣を1：1 イソプロパノール／EtOH（c＝0.2 M）に溶解し、かつ0.5 eqのフマル酸と共に30分間還流した。反応物を冷却し、かつ溶媒を除去した。粗物質をオープンカラムクロマトグラフまたは分取クロマトグラフによって精製した。

(R,R)-1および(S,S)-1のカラム分離、手順B
75 mgのフェノテロールHBrの試料を、1.5 mLの95／5／0.05 CH₃CN／イソプロパノール／HNEt₂に溶解し、かつWaters 2690 Separations Module, PDA（280 nmに設定）を使用するCHIRALPAK（登録商標）AD-H 10 x 250 mm 5μm半分取カラムへ100μL注入で適用した。溶離溶媒は、95／5／0.05 CH₃CN／イソプロパノール／HNEt₂、5 mL／分であった。(S,S)および(R,R)異性体についての保持時間は、それぞれ、4.8分および7.8分であった。

(R,R)-(-)-フェノテロール［(R,R)-1］
手順Bに従って得られ、蒸発後に回収した40 mgが得られた。

；HPLC：（a）H₂O中0.1％ジエチルアミン、0.50 mL／分、254 nm、t_R 2.90分、99％純粋；（d）t_R 7.8分、＞99％純粋。

(S,S)-(+)-フェノテロール［(S,S)-1］
手順Bに従って得られ、蒸発後に35 mgが得られた。

；HPLC：（a）H₂O 中0.1％ジエチルアミン、0.50 mL／分、254 nm、t_R 2.72分、＞99％純粋；（d）t_R 4.8分、＞99％純粋。

(R,S)-(-)-フェノテロールフマレート［(R,S)-1］
手順Aに従って(R)-8および(S)-10から作製し、168 mg（64％）が得られた。

；HPLC：（a）70/30/0.05. 1.00 mL／分、282 nm、t_R 1.35分、＞99％純粋；（b）50/50/0.05. 1.0 ml、0.50 mL／分、254 nm、t_R 2.72分、＞99％純粋；（d）t_R 4.8分、1.00 mL／分、280 nm、t_R 2.10分、97.5％純粋。

(S,R)-(+)-フェノテロールフマレート［(S,R)-1］
手順Aに従って(S)-8および(R)-10から作製し、104 mg（39％）が得られた。

；HPLC：（a）70/30/0.05、1.00 mL／分、282 nm、t_R 1.35分、95.9％純粋；（b）50/50/0.05、1.0 mL／分、280 nm、t_R 2.06分、99％純粋。

(R,R)-(-)-1-p-メトキシフェニル-2-(β-3',5'-ジヒドロキシ-フェニル-β-オキシ)エチルアミノ-プロパンフマレート［(R,R)-2］
手順Aに従って(R)-8および(R)-11から作製し、172 mg（38％）が得られた。

；HPLC：（a）70/30/0.05、1.0 mL／分、282 nm、t_R 1.54分、96.5％純粋；（b）50/50/0.05、2.0 mL／分、276 nm、t_R 1.51分、95.9％純粋。

(S,S)-(+)-1-p-メトキシフェニル-2-(β-3',5'-ジヒドロキシ-フェニル-β-オキシ)エチルアミノ-プロパンフマレート［(S,S)-2］
手順Aに従って(S)-8および(S)-11から作製し、318 mg（53％）が得られた。

；HPLC：（a）70/30/0.05、1.0 mL／分、282 nm、t_R 1.67分、96.0％純粋；（b）50/50/0.05、2.0 mL／分、276 nm、t_R 1.51分、97.1％純粋。

(R,S)-(-)-1-p-メトキシフェニル-2-(β-3',5'-ジヒドロキシ-フェニル-β-オキシ)エチルアミノプロパンフマレート［(R,S)-2］
手順Aに従って(R)-8および(S)-11から作製し、160 mg（38％）が得られた。

；HPLC：（a）70/30/0.05、1.00 mL／分、282 nm、t_R 1.40分、99％純粋；（b）50/50/0.05、2.0 mL／分、276 nm、t_R 1.51分、96.1％純粋。

(S,R)-(+)-1-p-メトキシフェニル-2-(β-3',5'-ジヒドロキシフェニル-β-オキシ)エチルアミノプロパンフマレート［(S,R)-2］
手順Aに従って(S)-8および(R)-11から作製し、200 mg（51％）が得られた。

；HPLC：（a）70/30/0.05、1.00 mL／分、282 nm、t_R 1.42分、97.7％純粋；（b）50/50/0.05、2.0 mL／分、276 nm、t_R 1.52分、97.8％純粋。

(R,R)-(-)-5-{2-[2-(4-アミノフェニル)-1-メチルエチルアミノ]-1-ヒドロキシエチル}-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(R,R)-3］
手順Aに従って(R)-8および(R)-12から作製し、88 mg（42％）が得られた。

；HPLC：（a）80/20/0.05、0.70 mL／分、276 nm、t_R 2.07分、95.5％純粋；（b）50/50/0.05、1.0 mL／分、282 nm、t_R 2.60、97.16％純粋。

(S,S)-(+)-5-{2-[2-(4-アミノフェニル)-1-メチルエチルアミノ]-1-ヒドロキシエチル}-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(S,S)-3］
手順Aに従って(S)-8および(S)-12から作製し、56 mg（25％）が得られた。

；HPLC：（a）80/20/0.05、0.7 mL／分、276 nm、t_R 2.01分、＜99％純粋；（b）50/50/0.05、1.0 mL／分、282 nm、t_R 2.50分、99.4％純粋。

(R,S)-(-)-5-{2-[2-(4-アミノフェニル)-1-メチルエチルアミノ]-1-ヒドロキシエチル}-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(R,S)-3］
手順Aに従って(R)-8および(S)-12から作製し、72 mg（35％）が得られた。

；HPLC：（a）80/20/0.05、0.7 mL／分、276 nm、t_R 2.08分、95.0％純粋；（b）50/50/0.05、1.0 mL／分、282 nm、t_R 2.51分、97.4％純粋。

(S,R)-(+)-5-{2-[2-(4-アミノフェニル)-1-メチルエチルアミノ]-1-ヒドロキシエチル}-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(S,R)-3］
手順Aに従って(S)-8および(R)-12から作製し、93 mg（42％）が得られた。

；HPLC：（a）70/30/0.05、1.00 mL／分、280 nm、t_R 1.45分、99％純粋；（b）50/50/0.05、1.0 mL／分、282 nm、t_R 2.63分、95.33％純粋。

(R,R)-(-)-5-[1-ヒドロキシ-2-(1-メチル-2-フェニルエチルアミノ)エチル]-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(R,R)-4］
手順Aに従って(R)-8および(R)-13から作製し、92 mg（26％）が得られた。

；HPLC：（a）50/50/0.05、1.00 mL／分、282 nm；t_R 1.73分；99％純粋；（b）50/50/0.05、2.0 mL／分、276 nm、t_R 1.46分、97.5％純粋。

(S,S)-(+)-5-[1-ヒドロキシ-2-(1-メチル-2-フェニルエチルアミノ)エチル]-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(S,S)-4］
手順Aに従って(S)-8および(S)-13から作製し、184 mg（51％）が得られた。

；HPLC：（a）50/50/0.05、1.00 mL／分、282 nm、t_R 1.49分；98.4％純粋；（b）50/50/0.05、2.0 mL／分、276 nm、t_R 1.35分、99％純粋。

(R,S)-(-)-5-[1-ヒドロキシ-2-(1-メチル-2-フェニルエチルアミノ)エチル]-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(R,S)-4］
手順Aに従って(R)-8および(S)-13から作製し、170 mg（45％）が得られた。

；HPLC：（a）50/50/0.05、1.00 mL／分、282 nm、t_R 1.53分、99％純粋；（b）50/50/0.05、2.0 mL／分、276 nm、t_R 1.46分、98.5％純粋。

(S,R)-(+)-5-[1-ヒドロキシ-2-(1-メチル-2-フェニルエチルアミノ)エチル]-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(S,R)-4］
手順Aに従って(S)-8および(R)-13から作製し、212 mg（59％）が得られた。

；HPLC：（a）50/50/0.05、1.00 mL／分、282 nm、t_R 1.51分、99％純粋；（b）50/50/0.05、2.0 mL／分、276 nm、t_R 1.43分、99％純粋。

(R,R)-(-)-5-{1-ヒドロキシ-2-[1-メチル-2-(1-ナフチル)エチルアミノ]エチル}-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(R,R)-5］
手順Aに従って(R)-8および(R)-14から作製し、135 mg（46％）が得られた。

；HPLC：（a）60/40/0.05、1.00 mL／分、282 nm、t_R 2.08分、95.7％純粋；（b）50/50/0.05、1.5 mL／分、282 nm、t_R 2.20分、99％純粋。

(S,S)-(+)-5-{1-ヒドロキシ-2-[1-メチル-2-(1-ナフチル)エチルアミノ]エチル}-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(S,S)-5］
手順Aに従って(S)-8および(S)-14から作製し、118 mg（40％）が得られた。

；HPLC：（a）60/40/0.05、1.00 mL／分、282 nm、t_R 2.35分、98.9％純粋；（b）50/50/0.05、1.5 mL／分、282 nm、t_R 2.26分、97.2％純粋。

(R,S)-(-)-5-{1-ヒドロキシ-2-[1-メチル-2-(1-ナフチル)エチルアミノ]エチル}-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(R,S)-5］
手順Aに従って(R)-8および(S)-14から作製し、114 mg（39％）が得られた。

；HPLC：（a）60/40/0.05、1.00 mL／分、282 nm、t_r 2.30分、98.6％純粋；（b）50/50/0.05、1.5 mL／分、282 nm、t_R 2.36分、99％純粋。

(S,R)-(+)-5-{1-ヒドロキシ-2-[1-メチル-2-(1-ナフチル)エチルアミノ]エチル}-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(S,R)-5］
手順Aに従って(S)-8および(R)-14から作製し、123 mg（42％）が得られた。

HPLC：（a）60/40/0.05、1.0 mL／分、282 nm、t_R 1.95、95.7％純粋；（b）50/50/0.05、1.5 mL／分、282 nm、t_R 2.29分、95.7％純粋。

(R,R)-(-)-5-[1-ヒドロキシ-2-(1-メチルヘキシルアミノ)エチル]-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(R,R)-6］
手順Aに従って(R)-8および(R)-15から作製し、45 mg（29％）が得られた。

；HPLC：（c）70/30/0.1、1.0 mL／分、276 nm、t_R 2.18分、96.6％純粋；（b）50/50/0.05、1.0 mL／分、279 nm、t_R 2.06分、98.9％純粋。

(S,S)-(+)-5-[1-ヒドロキシ-2-(1-メチルヘキシルアミノ)エチル]-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(S,S)-6］
手順Aに従って(S)-8および(S)-15から作製し、96 mg（43％）が得られた。

；HPLC：（c）70/30/0.1、1.0 mL／分、276 nm、t_R 2.16分、97.0％純粋；（b）50/50/0.05、1.0 mL／分、279 nm、t_R 2.11分、99％純粋。

(R,S)-(-)-5-[1-ヒドロキシ-2-(1-メチルヘキシルアミノ)エチル]-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(R,S)-6］
手順Aに従って(R)-8および(S)-15から作製し、83 mg（38％）が得られた。

；HPLC：（c）70/30/0.1、1.0 mL／分、276 nm、t_R 2.16分、97.0％純粋；（b）50/50/0.05、1.0 mL／分、279 nm、t_R 2.07分、96.2％純粋。

(S,R)-(+)-5-[1-ヒドロキシ-2-(1-メチルヘキシルアミノ)エチル]-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(S,R)-6］
手順Aに従って(S)-8および(R)-15から作製し、81 mg（38％）が得られた。

；HPLC：（c）70/30/0.1、1.0 mL／分、276 nm、t_R 2.16分、99％純粋；（b）50/50/0.05、1.0 mL／分、279 nm、t_R 2.02分、95.7％純粋。

(R)-(-)-5-(1-ヒドロキシ-2-フェネチルアミノエチル)-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(R)-7］
(R)-8および28から作製し、37 mg（15％）が得られた。

；HPLC：（a）80/20/0.05、1.00 mL／分、282 nm、t_R 1.47分、96.7％純粋；（b）50/50/0.05、1.0 mL／分、272 nm、t_R 2.78分、95.1％純粋。

(S)-(+)-5-(1-ヒドロキシ-2-フェネチルアミノエチル)-1,3-ベンゼンジオールフマレート［(S)-7］
(S)-8および28から作製し、51 mg（17％）が得られた。

；HPLC：（a）80/20/0.05、1.00 mL／分、282 nm、t_R 1.47分、98.6％純粋；（b）50/50/0.05、1.0 mL／分、272 nm、t_R 2.74分、98.8％純粋。

(R,R)-(-)-エチルフェノテロール

MS：（LCQ DUO ESI陽イオン質量スペクトル）M/z (rel)：318 (100, M+H)。HPLC 1：カラム：Varian Sunfire C18 100x4.6；70/30/0.1 水/アセトニトリル/TFA；1.0 mL/分；Det：278 nm；2.76分（フマレート、6.99％）、3.57分（90.11％）；純度：97.1％。HPLC 2：カラム：Chiralpak IA 250x10；90/10/0.05 アセトニトリル/メタノール/TFA；2.0 mL/分；Det：278 nm；5.26（RR異性体、92.37％）、7.11分（フマレート、5.02％）；純度97.5％。比旋光度：[α]_D＝-15.6（遊離アミン、0.5％MeOH）。

(R,S)-(-)-エチルフェノテロール

MS：(LCQ DUO ESI陽イオン質量スペクトル）M/z (rel)：318 (100, M+H)。HPLC 1：カラム：Varian Sunfire C18 100x4.6；70/30/0.1 水/アセトニトリル/TFA；1.0 mL/分；Det：278 nm；2.79分（フマレート、3.34％）、3.56分（96.11％）；純度：99.5％ HPLC 2：カラム：Chiralpak IA 250x10；90/10/0.05 アセトニトリル/メタノール/TFA；2.0 mL/分；Det：278 nm；5.88（RS異性体、97.08％）、7.12分（フマレート、2.92％）；純度＞99％。比旋光度：[α]_D＝-7.2（遊離アミン、0.5％MeOH）。

C₂₂H₂₅NO₄O・0.5C₄H₄O₄

UV：(メタノール), λ_max (ε)：298 nm (4,970), 286 (9,920), 234 (22,600), 210 (42,500)。MS：(LCQ DUO ESI陽イオン質量スペクトル）M/z (rel): 368 (100, M+H)。比旋光度：[α]_D＝-28.8 (遊離アミン；0.5％MeOH)。

C₂₂H₂₅NO₄・0.5C₄H₄O₄

UV：(メタノール), λ_max (ε)：298 nm (5,430), 286 (5,710), 233 (25,100), 210 (43,200)。MS：(LCQ DUO ESI陽イオン質量スペクトル）M/z (rel): 368 (100, M+H)。比旋光度：[α]_D＝-15.8 (遊離アミン；0.5％MeOH)。

1〜6の4つの立体異性体の合成における工程は、(R)-もしくは(S)-3',5'-ジベンジルオキシフェニルブロモヒドリンから形成されたエポキシドと適切なベンジル保護された2-アミノ-3-ベンジルプロパンの(R)-もしくは(S)-エナンチオマー（1〜5）またはN-ベンジル-2-アミノヘプタンの(R)-もしくは(S)-エナンチオマー（6）とのカップリングであった（スキームI）。

スキームI

(R)-7および(S)-7の合成を、2-フェネチルアミンを使用して行った（スキームII）。このアプローチは、ホルモテロールの立体異性体（化合物47、図6）の合成についてTrofastら（Chirality 3: 443-450, 1991）によって開発されたものと類似していた。次いで、得られた化合物をPd/C上での水素化によって脱保護し、かつフマレートとして精製した。

スキームII

合成において使用したキラル構築ブロックは、スキームIIIを使用して作製した。(R)-および(S)-3',5'-ジベンジルオキシフェニル-ブロモヒドリンエナンチオマーは、ホウ素-メチルスルフィド錯体（BH₃SCH₃）および(1R,2S)-または(1S,2R)-cis-1-アミノ-2-インダノールのいずれかを使用した3,5-ジベンジルオキシα-ブロモアセトフェノンのエナンチオ特異的還元によって得た。必要とされた(R)-および(S)-2-ベンジルアミノプロパン類は、対イオンとして(R)-または(S)-マンデル酸のいずれかを使用したrac-2-ベンジルアミノプロパン類のエナンチオ選択的結晶化によって作製した。

スキームIII

実施例6
β1およびβ2アドレナリン作動性受容体についての例示的なフェノテロール類似体の結合親和性
この実施例は、フェノテロール類似体が、フェノテロールと比べてβ2アドレナリン作動性受容体について同等かそうでなければより大きな結合親和性を有することを実証する。

化合物を、β₁およびβ₂アドレナリン作動性受容体でのそれらの結合親和性を測定するために、各々3回まで試験した。標準化合物および未知化合物での競合曲線に、少なくとも6つの濃度を含めた（3回通り）。各化合物について、その試験化合物について得られた個々の競合曲線を含むグラフを作成した。IC₅₀値およびHill係数を、GraphPad Prism（登録商標）ソフトウェアを使用して算出した。K_i値を、Cheng-Prusoff変換（Biochem Pharmacol 22: 3099-3108, 1973）を使用して算出した。各実験において、標準化合物を96ウエルプレートにおいて同時に実行した。標準化合物がその化合物についての確立された平均値に近いIC₅₀値を有さなかった場合、全体の実験を廃棄し、かつ再び繰り返した。

β₁-アドレナリン作動性受容体結合を、以前に記載された手順（Beer et al., Biochem. Pharmacol. 37: 1145-1151, 1988）に従ってラット皮質膜において行った。手短には、体重250〜350 gの雄性Sprague-Dawleyラットの首を切断し、かつそれらの脳を迅速に取り出した。大脳皮質を氷上で解剖し、重さを量り、かつおよそ30 mlの50 mM Tris-HCl, pH 7.8を含有する50 ml試験管へ速やかに移した（室温で）。組織をポリトロンでホモジナイズし、かつ4℃において20,000×gで12分間遠心分離した。ペレットを、同一の様式で再び洗浄し、かつアッセイ緩衝液（20 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、1 mM EDTA、0.1 mMアスコルビン酸、pH 7.8）中において1 ml当たり20 mg（元の湿った重量）の濃度で再懸濁させた。皮質膜調製物中に存在するβ₂部位を遮断するために、30 nM ICI 118-551もまたアッセイ緩衝液へ添加した。100μlの試験薬物および100μlの[³H]CGP-12177（1.4 nM最終濃度）を含有するウエルへ、0.8 mlの組織ホモジネートを添加した。25℃で2時間後、インキュベーションを急速濾過によって終了させた。非特異的結合を10μMプロプラノロールによって測定した。

ヒトβ₂-ARをコードするcDNAが安定にトランスフェクトされたHEK 293細胞（Dr. Brian Kobilka, Stanford Medical Center, Palo Alto, CAによって提供）を、以前に記載されたように（Pauwels et al., Biochem. Pharmacol. 42: 1683-1689, 1991）、10％ウシ胎仔血清（FBS）、0.05％ペニシリン-ストレプトマイシン、および400μg／ml G418を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において増殖させた。細胞を150×25 mmプレートからこすり落とし、かつ500×gで5分間遠心分離した。ペレットを、Polytronで50 mM Tris-HCl, pH 7.7中においてホモジナイズし、27,000×gで遠心分離し、かつ同一の緩衝液に再懸濁させた。後者のプロセスを繰り返し、かつペレットを、120 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、0.8 mM MgCl₂、および5 mMグルコースを含有する25 mM Tris-HCl（pH 7.4）に再懸濁させた。結合アッセイ法は、1.0 mlの量で0.3 nM [³H]CGP-12177を含有した。非特異的結合を1μMプロプラノロールによって測定した。

上述の方法に従って、K_i値として表される結合親和性を、マーカーリガンドとして[³H]CGP-12177を用い、ヒトβ₂-ARをコードするcDNAが安定にトランスフェクトされたHEK 293細胞系（Pauwels et al., Biochem. Pharmacol. 42: 1683-1689, 1991）から得られた膜を使用して測定した。得られたIC₅₀値およびHill係数を、GraphPad Prism（登録商標）ソフトウェアを使用して各試験化合物について算出し、かつK_i値を、Cheng-Prusoff変換（Biochem Pharmacol 22: 3099-3108, 1973）を使用して算出した。
K_i＝IC₅₀／（1＋L／K_d）＋Eqn.1.
式中、Lは[³H]CGP-12177の濃度であり、K_dは[³H]CGP-12177の結合親和性である。各試験化合物を3回アッセイした。

化合物1〜4および6の立体異性体についてのβ₂-ARに対する相対的結合親和性は、

であった（図5；下記表1）。この立体選択性は、ホルモテロール立体異性体の以前に報告された効力（Trofast et al., Chiralty 3: 443-450, 1991）およびイソプロテレノール誘導体PTFAM（化合物48、図6）での結合研究からの結果（Eimerl et al., Biochem. Pharmacol. 36: 3523-3527, 1987）と一致している。化合物5で、R,RおよびR,S異性体のK_i値の間で有意な差異は見られず、従って、順序は、R,R＝R,S＞S,R＞S,Sであった。(R)-7についてのK_i値は(S)-7よりも大きく、これは、β-OH部分を含む立体中心でR立体配置を有するβ₂-ARについての確立されたエナンチオ選択的結合選好と一致している（Eimerl et al., Biochem. Pharmacol. 36: 3523-3527, 1987；Wieland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9276-9281, 1996；Kikkawa et al., Mol. Pharmacol. 53: 128-134, 1998；およびZuurmond et al., Mol. Pharmacol. 56: 909-916, 1999を参照のこと）。

（表１）K_i±SEM（nM）、n＝3として算出された、この研究において合成した化合物のβ₂-ARへの結合親和性。フェノテロール異性体のβ₁およびβ₂アドレナリン作動性結合親和性の比較。

R,R異性体のみを比較した場合、(R,R)-5は、試験した化合物のうち最も高い相対親和性を有したが、(R,R)-5および(R,R)-1間の差異は統計的有意性に達しなかった（表1）。サブマイクロモル親和性を有する唯一の他の(R,R)立体異性体は、(R,R)-2であり、これは、(R,R)-5（p＝0.0051）および(R,R)-1（p＝0.0291）よりも有意により低い結合親和性を有し、しかし、(R,R)-2についての平均K_i値は、(R,R)-1のそれよりも23％だけ高い。p-OH部分をメチルエーテルへ変換する最小効果は、Schirrmacherら（Bioorg. Med. Chem. Lett. 13: 2687-92, 2003）からの以前のデータと一致している。以前の研究において、rac-1は、インビトロ活性の有意な損失なしに[¹⁸F]-フルオロエトキシエーテルへ変換され、かつ実験測定値の精度の内では、誘導体化は、β₂-ARへのrac-1の結合親和性を変化させないと結論付けられた。

β₁-ARについての、K_i値として表される、結合親和性を、マーカーリガンドとして[³H]-CGP-12177を用いてラット皮質膜を使用して測定した（Beer et al., Biochem. Pharmacol. 37: 1145-1151, 1988）。(R,R)-5についての算出されたK_iは3,349 nMであり、残りの試験化合物の全てについての結合親和性は＞10,000 nMであった（表1）。β₂-AR結合研究からのデータとは異なり、前記化合物の立体化学と関連し得る明確な傾向はなかった。

β₂-ARおよびβ₁-ARについての前記化合物の相対的選択性を、比率K_iβ₁／K_iβ₂を使用して測定した（表1）。特に興味深いのは、β₂-ARについてのサブマイクロモル親和性を有する4つの化合物、(R,R)-1、(R,R)-2、(R,R)-5および(R,S)-5についての比率であり、これらは、ぞれぞれ、46、43、14および46であった。(R,R)-1および(R,R)-2についての結果は、β₂-AR選択的アゴニスト(R,R)-TA-2005（化合物49、図6）についての53という以前報告されたK_iβ₁／K_iβ₂比率と一致している。

選択性の3倍増加が(R,R)-5に比べて(R,S)-5によって示されたので、(R,R)-5についての観察されたβ₂-AR選択性減少は予想外であった。47の立体異性体での以前の研究は、(R,R)-および(R,S)-異性体は両方とも、β₁-ARに比べてβ₂-ARについて高度の選択性を有し、(R,R)-異性体の選択性は(R,S)-異性体のそれよりも大きいことを示した（Trofast et al., Chirality 3: 443-450, 1991）。これは、化合物1および2について当てはまるが、5については逆である。(S,R)-5が同様の選択性を有し（19倍）、β₂-ARについてのその親和性は(R,R)-5よりも7倍だけより弱く、それぞれ、1783 nMおよび241 nMであることに注目することもまた興味深い。

これらの研究は、(R,R)-または(R,S)-ナフチルフェノテロール類似体が、フェノテロールの任意のアイソフォームよりも、β2アドレナリン作動性受容体についてより高い結合親和性を有することを実証している。(R,R)-メトキシフェノテロール類似体は、(R,R)-フェノテロールと同様の、β2アドレナリン作動性受容体についてのK_iを有する。従って、このような類似体は、β2アドレナリン作動性受容体アゴニストの成功の見込みのある候補物であり、市販の(±)-フェノテロールで現在治療されている障害を治療するために恐らく使用され得る。

実施例7
フェノテロール類似体を用いた心筋細胞収縮性研究
この実施例は、β₂-ARについてサブマイクロモル親和性を有する化合物ならびに(R,S)-1および(S,S)-1の薬理学的活性を示す。

これらの研究では、細胞長の電気的ペーシング誘発短縮によって指標付けられる収縮幅を、単回用量の試験化合物への曝露の前および後で単一心室筋細胞において測定した。前記アゴニストに対する収縮反応を、基礎収縮性のパーセンテージとして表し、β₂アドレナリン作動性受容体への前記アゴニストの特異性を、選択的β₂-ARアンタゴニストであるICI 118,551（10^-7 mol/L；Tocris Cookson Ltd., Bristol, U.K.）の阻害効果によって測定した。

(S,S)-1を除く試験した全ての化合物は、ICI 118,551によって遮断された顕著な収縮反応を生じさせ、一方、(S,S)-1については、薬理学的効果が観察されなかった（図7）。これらの結果は、以前の研究からの結果と一致し（Beigi et al., Chirality, 18: 822-827, 2006）、かつ、β₂-ARでのアゴニスト活性について、R-立体配置が、β-OH部分を含む立体中心では好ましいという観察と一致した（Eimerl et al., Biochem. Pharmacol. 36: 3523-3527, 1987；Wieland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9276-9281, 1996；Kikkawa et al., Mol. Pharmacol. 53: 128-134, 1998；およびZuurmond et al., Mol. Pharmacol. 56: 909-916, 1999を参照のこと）。0.1μM (R,R)-5および(R,S)-5で最大効果が誘発され、一方、他の活性化合物は0.5μM濃度を必要としたことに注目することは興味深い。さらに、(R,R)-5および(R,S)-5の等しい活性が結合データによって示唆された一方、47（Trofast et al., Chiralty 3: 443-450, 1991）および48（Eimerl et al., Biochem. Pharmacol. 36: 3523-3527, 1987）の立体異性体の以前の研究は、(R,R)-異性体のアゴニスト活性が対応する(R,S)-異性体の活性よりも顕著に高いことを示したため、(R,S)-1の観察された活性は予想外であった。

実施例8
比較分子場解析
この実施例は、開示される化合物を分析するための比較分子場解析（CoMFA）の使用を示す。

開示される化合物を、選択された標的での立体異性体および／またはエナンチオマーの相対的活性の分析に適用可能な3D QSAR技術である、比較分子場解析を使用して分析した。

CoMFAをSYBYL 7.2.（TRIPOS Inc., St. Louis, MO）において実施されるように行った。全ての誘導体の分子モデルを、足場の同一の立体配座を確実にするためにModelBuild手順を使用してHyperChem v.6.03（HyperCube Inc., Gainesville, FL）において作製した。モデルをSYBYLへ抽出し、かつ部分原子電荷（Gasteiger-Huckel型）が算出された。フェノテロール分子のコアにおける2つの不斉炭素原子（-C*-CH₂-NH-C*-CH₂-）を共通構造として使用して、リガンドモデルを並べた。2つのタイプの分子場（立体的および静電気的）を、各構造を囲むグリッド（2Å間隔）格子において標本化した。距離依存誘電率を静電気算出に使用し、立体エネルギーおよび静電エネルギーの両方について30 kcal／molのエネルギーカットオフを設定した。

得られたデータベースに適用した部分最小二乗相関手順によって、4つの統計的に有意な成分が抽出され、かつ以下の検定パラメータを最善の解決法のために得た：R²＝0.920、F（4,21）＝60.380、推定値の標準誤差＝0.223、交差検定された（リーブ・ワン・アウト（leave-one-out））R²＝0.847。一般的に、静電場は、解釈される分散の48.1％を占め、立体場は51.9％を占める。得られた3D QSARモデルは、実験データ（R²＝0.920およびF＝60.380）と十分な統計的相関を示し、かつ、交差検定されたR²値（Q²）＝0.847および予測値の標準誤差（SEP）＝0.309によって示されるように十分な予測力を示す（表2）。

（表２）CoMFAモデルによって予測されたpK_d

第1段階において、前記モデルを、立体異性体間の識別の原因となる領域を同定するために使用した。CoMFA手順は、各キラル中心に接近して配置されたいくつかの異なる不斉領域を作製した。第1キラル中心（βヒドロキシル基を有する）は、分子の後ろの電気陽性領域によって囲まれている。電気陽性領域は、水素結合形成と関連し得、偽受容体（pseudoreceptor）の好ましいドナー特性または好ましくないアクセプター特性を示す。この場合、電気陽性場の位置は、モデルの面の後ろのβ-OH部分の配向（キラル中心でS立体配置）が、受容体とのH結合形成を妨害すること示している。電気陽性領域は、第1キラル中心の後ろの立体的に好ましくない領域と密接に関連している。これは、前記モデルが、R立体配置にあるβ-ヒドロキシル基についての選好を実証するというさらなる表示である。この中心でのR立体配置についての選好は、以前のモデルおよび実験データと一致しており、これらは、R立体配置がβ-AR受容体での機能活性のために好ましいことを実証した（Eimerl et al., Biochem. Pharmacol. 36: 3523-3527, 1987；Wieland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9276-9281, 1996；Kikkawa et al., Mol. Pharmacol. 53: 128-134, 1998；およびZuurmond et al., Mol. Pharmacol. 56: 909-916, 1999を参照のこと）。

CoMFAモデルはまた、第2キラル中心の効果も実証した。好ましい立体配置が結合データから誘導され得、ここで、化合物1〜4および6については、(R,R)-異性体が、それらのそれぞれの(R,S)-異性体と比較してより高い親和性を有し、一方、(R,R)-5および(R,S)-5についてのK_i値は等しかった（表1）。従って、このモデルにおいて、より活性な異性体は、CoMFAモデルの図の面外に向いている、分子のアミノアルキル部分における立体中心にメチル部分を有するものである。これは、分子の第2のキラル中心の後ろの立体不利領域によって描写され、この部位でのR立体配置についての選好を示す。

この研究において、フェノテロール分子のアミノアルキル部分のみを変更し、それにより、重要なCoMFA領域が、該分子のこの局面と関連している。得られた分析において、全ての4つの相互作用領域が芳香族部分の近くにおいて同定され、全てが、研究した誘導体の結合作用様式に関する仮説を作成するために使用され得る。

前記モデルにおいて、-OHまたはOCH₃置換基に近い領域を包囲する大きな電気陽性領域は、これらの部分への偽受容体のH結合ドナー特性を示す。これらの相互作用は、O-誘導体である化合物1および2の結合親和性が化合物3および4と比べて相対的に高い原因となり、後者の化合物において、p-アミノ置換基は、実験条件下で正に帯電されるべきである。

両方とも芳香族系の2つの側面において平行に配置された、大きな電気陰性領域および別の電気陽性領域は、恐らく、例えば、ナフチル環のような、β₂-ARと電子が豊富な芳香族部分との間のπ−πまたはπ−水素結合相互作用を示す。これは、この研究において試験された他の化合物と比べて化合物1、2および5の増加された親和性と一致している。この相互作用の規則は、(R,R)-5および(R,S)-5についてのK_i値が(R,R)-1および(R,R)-2と等しかったという観察によって示唆される（表1）。

2つの立体領域は静電気領域の近くに配置され、それぞれの領域における嵩高さを一方は好みかつ他方は好まない。このことは、前記分子のアミノアルキル部分の結合も立体的に制限されることを示している。

β₂-ARへのアゴニストおよびアンタゴニストの結合が、部位特異的変異誘発技術および分子モデリング技術を使用して研究された（Eimerl et al., Biochem. Pharmacol. 36: 3523-3527, 1987；Wieland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9276-9281, 1996；Kikkawa et al., Mol. Pharmacol. 53: 128-134, 1998；Zuurmond et al., Mol. Pharmacol. 56: 909-916, 1999；Kontoyianni et al., J. Med. Chem. 39: 4406-4420, 1996；Furse et al., J. Med. Chem. 46: 4450-4462, 2003；およびSwaminath et al. J. Biol. Chem. 279: 686-691, 2004）。アゴニストの「カテコール」部分の結合は、TM3、TM5およびTM6と同定された膜貫通（TM）ヘリックスによって作製される結合領域内で生じるという一般的な合意が存在する。結合プロセスは、Gタンパク質活性化へ至る立体配座変化を生じさせる連続する事象である（Furse et al., J. Med. Chem. 46: 4450-4462, 2003）。このプロセスにおける重要な局面は、アゴニストのキラル炭素におけるヒドロキシル部分とTM6におけるAsn-293残基との相互作用であり、この相互作用について、R立体配置がキラル炭素で好ましい（Eimerl et al. , Biochem. Pharmacol. 36: 3523-3527, 1987；Kikkawa et al., Mol. Pharmacol. 53: 128-134, 1998；およびSwaminath et al. J. Biol. Chem. 279: 686-691, 2004）。フェノテロール分子の「カテコール」部分はこの研究において変化させなかったので、CoMFAモデルにおいて、第1立体中心でのR立体配置が最も安定な複合体において好ましいということになる。

β₂-ARアゴニストの結合および機能研究の大多数は、小さなN-アルキル置換基、例えば、メチル、イソプロピルおよびt-ブチルを用いて行われた（Kontoyianni et al., J. Med. Chem. 39: 4406-4420, 1996を参照のこと）。しかし、これらの化合物はβ₂-ARで活性である一方、それらはサブタイプ選択的ではない。これは、化合物49、50および51（図6）について測定されたK_iβ₁／K_iβ₂比率によって示され、それぞれ、53、1.7および1.3であった（Kikkawa, et al. Mol. Pharmacol. 53: 128-134, 1998）。p-メトキシフェニル部分の除去は、選択性を低下させただけでなく、それぞれのβ₂K_i値が12 nM、170 nMおよび6300 nMであったので、親和性も低下させた（Kikkawa, et al. Mol. Pharmacol. 53: 128-134, 1998）。

アミノアルキル置換基がβ₂-AR選択性において果たす役割が、部位特異的変異誘発技術および分子モデリング技術を使用して研究された（Kikkawa, et al. Mol. Pharmacol. 53: 128-134, 1998；Furse et al., J. Med. Chem. 46: 4450-4462, 2003；およびSwaminath et al. J. Biol. Chem. 279: 686-691, 2004）。モデルリガンドとして(R,R)-49を使用して、Kikkawaらは、化合物49のp-メトキシ酸素とTM7の細胞外末端に配置されたチロシン308（Y308）のヒドロキシル基との間の水素結合形成がβ₂-AR選択性の原因であると決定した（Mol. Pharmacol. 53: 128-134, 1998）。

FurseおよびLybrandは、β₂-ARのデノボモデルを開発し、かつこのサブタイプといくつかのリガンド（アゴニストおよびアンタゴニスト）との分子複合体を調べた（J. Med. Chem. 46: 4450-4462, 2003）。調べられた構造の中で、(R,R)-49は、化合物2と同一のアミノアルキル置換基を有した。(R,R)-49／β₂-AR複合体の試験によって、(R,R)-49のp-メトキシ基酸素が、Y308のヒドロキシ基と水素結合を形成することが明らかとなり、これは、Kikkawaら（Mol. Pharmacol. 53: 128-134, 1998）によって提案されたモデルを支持している。モデルにおいて結合された2つの酸素原子間の距離は、3.22 Åであった。しかし、リガンドのメトキシ部分はまた、3つの他の極性残基、TM6中のヒスチジン296（H296）、TM3中のトリプトファン109（W109）およびTM7中のアスパラギン312（N312）に接近して配置され、これらの各々は、(R,R)-49のアミノアルキル部分における芳香族基と相互作用し得る。

FurseおよびLybrandモデルにおいて、リガンドの酸素原子とH296の水素原子との間の距離は5.88Åであり、H296が、(R,R)-49のメトキシ基との相互作用についての代替の水素結合ドナーとして提案された。Y308およびH296はβ₂-ARにおいてのみ見られ、β₁-ARにおいて見られる対応する残基は、それぞれF359およびK347であるので、H296およびY308の相互作用は、β₁／β₂選択性の原因として提案された（Furse et al., J. Med. Chem. 46: 4450-4462, 2003）。

β₁／β₂選択についての以前の研究が(R,R)-49を使用したので、本発明者の研究において合成した化合物の(R,R)-立体異性体のサブタイプ選択性を、(R,R)-49のサブタイプ選択性と比較した。この研究からのデータは、Y308および／またはH296とアゴニストのp-置換基上の酸素原子との間の水素結合形成がβ₂-AR選択性に関与することを示唆している。相互作用は、(R,R)-1および(R,R)-2で可能であり、これらの化合物についてのK_iβ₁／K_iβ₂比率はそれぞれ43および46であり、これらは、(R,R)-49について測定された53というK_iβ₁／K_iβ₂比率に匹敵する。化合物3、4、6および7についてのK_iβ₁／K_iβ₂比率は＜10であり、それらがY308またはH296と水素結合を形成する能力を有しないという事実を反映している。水素結合相互作用はまた、-OHまたは-OCH₃置換基に近い領域を囲む大きな電気陽性領域を同定するCoMFAモデルによって示唆され、偽受容体の水素結合ドナー特性を示している。

この研究からのデータはまた、化合物のアミノアルキル部分における芳香族部分は、該芳香族部分が受容体と水素結合を形成することができない場合であっても、K_iおよびサブタイプ選択性に寄与することを示唆している。これは、＜3,000 nMであった化合物1〜5の(R,R)-異性体についてのK_iβ₂値と、9,000 nMであった(R,R)-6のK_iβ₂値との比較によって、ならびに、化合物6がサブタイプ選択性を示さなかったが、1〜5については≧9であったK_iβ₁／K_iβ₂比率によって実証される（表1）。前記データを説明する1つの可能性のある機構は、π−水素結合形成である。芳香族環のπ電子雲は、水素結合アクセプターとして機能し得、しかし相互作用は通常の水素結合の約半分の強さであると推定された（Levitt and Perutz J. Mol. Biol. 201: 751-754, 1998）。(R,R)-3および(R,R)-4または(R)-7と比べて(R,R)-5についてのより高い親和性およびサブタイプ選択性は、他の芳香族環と比べてのナフチル環におけるより大きなπ電子分布と一致している。

CoMFAモデルはまた、両方とも芳香族環に平行に配置された、大きな電気陰性領域および別の電気陽性領域を同定し、これらは、恐らく、例えば、ナフチル環のような、β₂-ARと電子が豊富な芳香族部分との間のπ−πまたはπ−水素結合相互作用と関連している。相互作用リガンドとして(R,R)-49を用いてFurseおよびLybrandによって開発されたモデルを使用して、Y308、H296、W109およびN312を、π−πおよび／またはπ−水素結合相互作用の可能性のある原因と同定した。β₂-ARモデルにおいて、(R,R)-49におけるp-メトキシ部分とW109およびN312との推定される距離は、それぞれ、4.80Åおよび3.45Åであった。W109およびN312は全てのβ-ARサブタイプにおいて完全に保存されているので、CoMFAモデルによって示唆された相互作用は、観察されたβ₁／β₂選択性ではなく、他の(R,R)-異性体と比べて(R,R)-1、(R,R)-2および(R,R)-5について増加された親和性の原因を示し得る。

この研究および得られたCoMFAモデルからのデータは、β₂-ARとの試験した化合物の結合プロセスは、アゴニストのアミノアルキル部分におけるキラル中心と受容体における立体的に制限された部位との相互作用を含むことを示している。立体的に制限された部位の存在は、β₂-ARとのアゴニストおよびアンタゴニスト複合体についての3Dモデルの開発において得られたデータから以前示唆された（Kobilka, Mol. Pharm. 65: 1060-1062, 2004）。例えば、(R,R)-49、およびアミノアルキル部分における立体中心でメチル基よりも大きな置換基を有する同様の化合物は、リガンド−受容体複合体に不利に影響する顕著な立体的相互作用を生じさせると示唆された。

β₂-ARへのアゴニストの結合は、アゴニストと受容体との間の連続的な相互作用が対応する立体配座変化を生じさせる、多段階の相互に関連するプロセスと記載された（Kobilka, Mol. Pharm. 65: 1060-1062, 2004）。CoMFAモデルは最終のアゴニスト／β₂-AR複合体を反映しており、立体的制限部位の効果を理解するために、この部位との相互作用が結合プロセスの結果に対して有する効果を考慮する必要がある。本CoMFAモデルの詳細な説明は、Jozwiakら（J. Med. Chem., 50 (12): 2903 -2915, 2007）に開示されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

アゴニストの「カテコール」部分とTM3、TM5およびTM6によって作製される結合領域（第1結合領域）との相互作用を仮定すると、これらの相互作用は、立体的制限部位に対してアゴニストのアミノアルキル部分の位置を固定し、かつ恐らくこの部位を作製さえする。CoMFAモデルにおいて、前記部位での立体制限は、アミノアルキル部分のキラル中心のメチル部分に、該モデルの面外へ向くことを強いる。

N原子周りの自由回転のために、メチル部分を有するキラル中心での立体配置は、恐らく、立体制限部位との相互作用を最小化する該分子の能力に影響を与えない可能性がある。しかし、例えば、CoMFAモデルの面外に向いているメチル基との、最小エネルギー立体配座において、第2結合領域に対するアミノアルキル部分の残りのセグメントの配向は、立体化学によって影響される。実際、RおよびS立体配置は、第2結合領域に対して鏡像関係を生じさせる。この状況は図5に示されており、ここで、(R,R)-5および(R,S)-5の、カテコール、第1キラル中心およびメチル部分が、互いの上に重ねられている。

β₂-AR選択性の原因を解明する研究は、主として(R,R)-49を使用し、サブタイプ選択性に対するキラリティーの効果の1つの以前の研究は、(R,R)-47が(R,S)-47よりも高いβ₂-AR選択性を有することを報告した（Trofast et al., Chiralty 3: 443-450, 1991）。従って、β₂-ARでの(R,R)-5および(R,S)-5の観察された等しい親和性および機能活性ならびに(R,S)-5の3倍増加されたβ₂-AR選択性は、予想外の結果であった。これらの結果の1つの可能性のある説明は、(R,S)-5のナフチル部分が、Y308およびH296によって規定される部分と相互作用せず、β₂-AR上の別の部位へ指向し、かつ結合するということである。この相互作用はまた、サブタイプ選択性ならびに増加された結合親和性およびアゴニスト活性を伝達するかまたはこれらに関与する。β₂-AR選択性の以前のモデルは(R,R)-異性体のみを使用したので、この部位が見落とされていた可能性がある。

前記データの別の説明は、SokolovおよびZefirovによって提案された「ロッキング・テトラヘドロン（rocking tetrahedron）」キラル認識機構によって示唆される（Doklady Akademii Nauk SSSR 319: 1382-1383, 1991）。分子キラル認識へのこのアプローチにおいて、エナンチオマーリガンドは、2つの結合相互作用によってキラルセレクターへ固定される。前記相互作用は、1配向だけが可能となるように、非等価かつ指向性でなければならない。拘束されたエナンチオマーは、依然として、立体配座可動性を有し、キラル中心における残りの部分は、同一ではなく重複する立体体積を排除する。どこでおよびどの程度キラルセレクターがこれらの立体体積と相互作用するかが、プロセスのエナンチオ選択性を決定する。キラルセレクターのキラリティーがリガンドの面に対して垂直な相互作用を配置する場合、エナンチオ選択性は観察されない。垂直からの逸脱が増加するにつれ、RまたはS立体配置に対するエナンチオ選択性が増加する。

(R,R)-5および(R,S)-5は、CoMFAモデルの立体制限部位および第1結合領域との相互作用が、第2キラル中心における残りの構成要素を第2結合領域に対して、鏡像でありながら、同一の配向に配置する2つの非等価かつ指向性である相互作用である。上述したように、化合物5の1-ナフチル部分とY308およびH296との相互作用は、観察されたβ₂-AR選択性の原因であると考えられる。1-ナフチル環が同一ではなく重複する立体体積を排除する場合、観察されるK_iβ₂値およびサブタイプ選択性は、以下を示す：1）K_iβ₂-AR値は、1-ナフチル部分とY308およびH296との間のπ−水素結合およびπ−π相互作用、ならびに他の残基、例えば、W109およびN312とのさらなる非β₂-AR特異的相互作用の、総計を示すこと；2）(R,S)-5によって排除された立体体積は、(R,R)-5に比べて、Y308およびH296とナフチル部分のπ雲との相互作用の可能性を増大させること；ならびに3）(R,R)-5によって排除された立体体積は、(R,S)-5と比べて、非β₂-AR特異的部位との相互作用の可能性を増大させること。

第2キラル中心での立体配置および立体配座に基づくキラル選択性の効果はまた、(R,R)-3、(R,S)-3および(R)-7の親和性およびサブタイプ選択性によって示される（表1）。RからSへの第2キラル炭素でのキラリティーの反転によって、(R,R)-3／β₂-AR複合体に比べて(R,S)-3／β₂-AR複合体のK_iβ₂値が約3倍低下されたが、それらのK_iβ₁値間に有意差は存在しなかった。(R,S)-3に対する(R,R)-3について観察された、増加されたサブタイプ選択性（それぞれ、(R,S)-3が4に対して(R,R)-3が9）は、K_iβ₂値の差異を本質的に反映しており、これは、アミノアルキル鎖の芳香族部分を、第2結合領域を含む電気陽性および電気陰性領域と接触させるために必要とされる増加された立体配座エネルギーの反映、またはこの相互作用が生じる可能性の低下であり得る。

第2キラル中心におけるメチル部分の除去、およびその結果としてこの部位でのキラリティーの除去（(R)-7）は、RからSへこの部位でのキラリティーを反転させるのと同様の効果を有した。(R)-7についてのK_iβ₂値は(R,S)-3よりも32％高く、β₂-AR選択性における差異はなかった（表1）。これらの結果は、化合物3について、第2キラル部位でのR立体配置の主な効果が、アミノアルキル鎖を第2結合領域へ指向させることであったことを示唆し、これは、この部位と相互作用する可能性を増加させ、かつこの相互作用を達成するために必要とされる立体配座エネルギーを低下させる。

化合物3と5との差異は、芳香族置換基によって排除された立体領域である。化合物3の場合、フェニル環は、より小さくより線形的な領域を生じさせ、一方、化合物5では、1-ナフチル環系は、相対的により大きくより幅広い領域を生じさせる。これらの差異は、さらなる誘導体の合成を導くために使用され得る。

1つの例において、(R,R)-2および(R,S)-5は、新規の選択的β₂-ARアゴニストの開発についての可能性のある候補として選択される。これらの化合物は、分子疎水性、代謝プロファイルおよび輸送体相互作用の変化に起因して、市販のrac-1と比べて増加されかつ延長された全身曝露を有し得る。

本実施例は、ファルマコフォアモデルを提供し、このモデルは、うっ血性心不全を含む所望の状態の治療における使用を試験され得るβ₂-AR選択性を有する新規の化合物の設計についての構造ガイドとして、使用され得る。

実施例9
(R,R)-フェノテロール、(R,R)-メトキシフェノテロールおよび(R,S)-ナフチルフェノテロールの薬物動態研究
この実施例は、雄性Sprague-Dawleyラットへの静脈内（IV）ボーラスとして投与される(R,R)-フェノテロール、(R,R)-メトキシフェノテロールおよび(R,S)-ナフチルフェノテロールの血漿濃度を実証する。

(R,R)-フェノテロール、(R,R)-メトキシフェノテロールおよび(R,S)-ナフチルフェノテロールを、静脈内に5 mg／mlの単回投薬量で、頸静脈カニューレ挿入された（JVC）ラットへ投与した（表3を参照のこと）。用量算出（mg／kg）は、治療日に測定した個々の体重に基づいた。薬物動態研究についての研究時間は、6時間であった。血漿試料を、6時間にわたって以下の9つの時点で回収した：所望の用量の投与前；用量の5.00〜5.30分後；用量の15.00〜16.30分後；用量の30.00〜33.00分後；用量の60〜65分後；用量の120〜125分後；用量の240〜245分後；用量の300〜305分後；および用量の360〜365分後。尿を、各治療群において3匹のラットから0〜6時間および6〜24時間回収した。

（表３）(R,R)-フェノテロール、(R,R)-メトキシフェノテロールおよび(R,S)-ナフチルフェノテロールの血漿濃度を測定するための研究条件

ラットへの静脈内投与（5 mg／kg）後の(R,R)-フェノテロール、(R,R)-メトキシフェノテロールおよび(R,S)-ナフチルフェノテロールについての薬物動態パラメータを、2コンパートメント（compartment)オープンモデルに従って分析した（表4を参照のこと）。2コンパートメントモデルの薬物動態学に従う薬物は、1コンパートメントモデルについて仮定されるようには、身体中に迅速に平衡化しない。2コンパートメントモデルにおいて、薬物は、2つのコンパートメント、セントラルコンパートメントおよび組織、または末梢コンパートメント中へ分布する。セントラルコンパートメントは、血液、細胞外液、および高度に灌流された組織を示す。薬物は、セントラルコンパートメントに迅速かつ均一に分布する。組織または末梢コンパートメントとして公知の、第2コンパートメントは、薬物がより徐々に平衡化する組織を含有する。2つのコンパートメント間の薬物移動は、一次プロセスによって起こると仮定される。

以下の略語を、下記表4において使用する：α−分布相と関連するマクロ速度定数；β−排出相と関連するマクロ速度定数；A、B−α相およびβ相それぞれと関連するゼロタイムインターセプト；AUC−曲線下面積；T1/2 (K10)−速度定数K10と関連する半減期；K10−排出速度−薬物がセントラルコンパートメントから系を出る速度；K12−薬物がセントラルコンパートメントから組織コンパートメントへ入る速度；K21−薬物が組織コンパートメントからセントラルコンパートメントへ入る速度；V1−セントラルコンパートメントの分布量；V2−組織コンパートメントの分布量；Vss−定常状態での分布量；およびCl−クリアランス。

（表４）ラットへの静脈内投与（5 mg／kg）後の(R,R)-フェノテロール、(R,R)-メトキシフェノテロールおよび(R,S)-ナフチルフェノテロールについての薬物動態パラメータ。

表5〜7および図8は、ラットへのIV投与（5 mg／kg）後の(R,R)-フェノテロール、(R,R)-メトキシフェノテロールおよび(R,S)-ナフチルフェノテロールの個々の血漿濃度を示す。血漿中の(R,R)-フェノテロールの平均濃度は、(R,R)-メトキシフェノテロール（2.12μg/ml）または(R,S)-ナフチルフェノテロール（2.11μg/ml）の平均濃度と比較して、ラットへのIV投与（5 mg／kg）の5分後では、劇的に低かった（1.34μg/ml）。

（表５）静脈投与（5 mg／kg）後の(R,R)-フェノテロールの個々の血漿濃度。

（表６）静脈投与（5 mg／kg）後の(R,R)-メトキシフェノテロールの個々の血漿濃度。

（表７）静脈投与（5 mg／kg）後の(R,S)-ナフチルフェノテロールの個々の血漿濃度。

データは、2つの誘導体である(R,R)-メトキシフェノテロールおよび(R,S)-ナフチルフェノテロールが、(R,R)-フェノテロールと比べて顕著により高い全身曝露（AUC）およびより長いクリアランスを有することを実証しており、このため、より長く作用する薬物が作製され得る。より長いクリアランス時間が、グルクロン酸化を阻害することの結果であり得ることが示唆される。

実施例10
(R,R)-フェノテロールまたはフェノテロール類似体を用いた心臓障害の治療
本明細書に開示される技術に基づいて、うっ血性心不全などの心臓障害を、治療有効量の(R,R)-フェノテロールまたは1つもしくは複数の上記に開示されるフェノテロール類似体（セクションIIIおよびIVを参照のこと）を投与することによって治療する。1つの例において、うっ血性心不全と診断された被験体を同定する。被験体選択に続いて、治療有効量の(R,R)-フェノテロールまたはそれぞれのフェノテロール類似体を被験体へ投与する。例えば、治療有効量の、OCH₃基またはナフチル誘導体を含む(R,R)-フェノテロール類似体を被験体へ投与する。さらなる例において、治療有効量の、ナフチル誘導体を含む(R,S)-フェノテロール類似体を被験体へ投与する。フェノテロール類似体は、セクションIII.Bおよび実施例5に記載されるように、作製し、かつ精製する。うっ血性心不全を緩和、抑制、および／または治療するために投与される(R,R)-フェノテロールもしくはフェノテロール類似体またはその薬学的組成物の量は、治療される被験体、障害の重篤度、および治療組成物の投与様式に依存する（セクションVを参照のこと）。理想的には、薬剤の治療有効量は、被験体において実質的な細胞傷害効果を生じさせることなしに、被験体において心臓障害（例えば、うっ血性心不全）を予防、緩和、および／または抑制、および／または治療するに十分な量である。

1つの例において、(R,R)-フェノテロール、開示されるフェノテロール類似体（例えば、OCH₃基もしくはナフチル誘導体を含む(R,R)-フェノテロール類似体、またはナフチル誘導体を含む(R,S)-フェノテロール類似体）または薬学的組成物は、単回または分割用量で経口的に約0.001〜約10 mg／kg体重の投薬量範囲で提供される。特定の例において、投薬量範囲は、単回または分割用量で経口的に約0.005〜約5 mg／kg体重である（およそ70 kgの平均体重を想定；平均を超えるかまたは平均未満の体重の個人については、値は適宜調節される）。

ある例において、開示されるフェノテロール化合物または薬学的組成物は、治療される被験体への投薬量の症状調節のために、有効成分を約1.0〜約50 mg、特定的には有効成分を約2.0 mg〜約10 mg、より特定的には約2.5 mg、約5 mg、または約10 mg含有する錠剤の形態での経口投与によって提供される。1つの例示的な経口投薬計画において、有効成分を約1 mg〜約50 mg含有する錠剤が、1日2〜4回投与される。例えば、有効成分を約1 mg〜約10 mg含有する錠剤が、1日2回投与される。

実施例11
フェノテロール類似体を用いた肺障害の治療
本明細書に開示される技術に従って、喘息または慢性閉塞性肺疾患などの肺障害を、治療有効量の上記に開示されるフェノテロール類似体（セクションIII〜Vを参照のこと）を投与することによって治療する。1つの例において、喘息または慢性閉塞性肺疾患と診断されたかまたはこれらに関連する症状の1つを示した被験体を同定する。被験体選択に続いて、治療有効量の所望のフェノテロール類似体を被験体へ投与する。例えば、治療有効量の、OCH₃基またはナフチル誘導体を含む(R,R)-フェノテロール類似体を被験体へ投与する。さらなる例において、治療有効量の、ナフチル誘導体を含む(R,S)-フェノテロール類似体を被験体へ投与する。フェノテロール類似体は、セクションIII.Bおよび実施例5に記載されるように、作製し、かつ精製する。肺障害を予防、緩和、抑制、および／または治療するために投与されるフェノテロール類似体の量は、治療される被験体、障害の重篤度、および治療組成物の投与様式に依存する。理想的には、薬剤の治療有効量は、被験体において実質的な細胞傷害効果を生じさせることなしに、被験体において肺障害を予防、緩和、および／または抑制、および／または治療するに十分な量である。

開示される発明の原理が適用され得る多くの可能な態様を考慮して、示される態様は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、かつ、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでないことが理解される。むしろ、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。従って、本発明者は、本発明として、この特許請求の範囲の範囲および精神内にある全てを特許請求する。

Claims

以下の式：

を有する化合物：
式中、R₁〜R₃が、独立して、水素、アシル、アルコキシカルボニルまたはそれらの組み合わせであり；
R₄が、Hまたは低級アルキルであり；
R₅が、低級アルキル、

または

であり、式中、Y¹、Y²およびY³が、独立して、水素、低級-OR₆および-NR₇R₈であり；式中、XおよびYが、独立して、H、-OR₆および-NR₇R₈より選択され；
R₆が、Hまたは低級アルキルであり；かつ
R₇およびR₈が、独立して、水素、低級アルキル、アルコキシカルボニル、アシルまたはアミノカルボニルである。
R₄が低級アルキルであり、かつR₅が、

または

であり、式中、Xが、H、-OR₆または-NR₇R₈であり；
R₆が、低級アルキルであり；かつ
R₇およびR₈が、独立して、水素または低級アルキルである、
請求項1記載の化合物。
R₄が、メチル、エチル、n-プロピル、およびイソプロピルより選択される、請求項2記載の化合物。
R₄がメチルである、請求項3記載の化合物。
R₅が、以下の式：

を有し、式中、Xが、H、-OR₆または-NR₇R₈である、
請求項4記載の化合物。
R₆がメチルである、請求項5記載の化合物。
(R,R)-化合物である、請求項6記載の化合物。
R₅が、

のうちの1つである、請求項1記載の化合物。
R₅が、

である、請求項1記載の化合物。
R₇およびR₈が水素である、請求項5記載の化合物。
R₅が、以下の式：

を有する、請求項4記載の化合物。
R₁〜R₃が水素である、請求項11記載の化合物。
(R,R)-化合物である、請求項11記載の化合物。
(R,S)-化合物である、請求項11記載の化合物。
請求項2記載の化合物および少なくとも1つの薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
R₄がメチルである、請求項15記載の薬学的組成物。
R₁〜R₃が水素である、請求項16記載の薬学的組成物。
R₅が、以下の式：

を有し、式中、Xが、H、-OR₆または-NR₇R₈である、
請求項16記載の薬学的組成物。
R₆がメチルである、請求項18記載の薬学的組成物。
化合物が(R,R)-化合物である、請求項19記載の薬学的組成物。
R₇およびR₈が水素である、請求項18記載の薬学的組成物。
R₅が、以下の式：

を有する、請求項17記載の薬学的組成物。
化合物が(R,R)-化合物である、請求項22記載の薬学的組成物。
化合物が(R,S)化合物である、請求項23記載の薬学的組成物。
治療有効量の請求項2記載の化合物を、肺または心臓血管の障害を有する被験体へ投与する段階を含む、被験体の肺または心臓血管の障害を治療するための方法。
障害が心臓血管障害である、請求項25記載の方法。
心臓血管障害がうっ血性心不全である、請求項26記載の方法。
障害が肺障害である、請求項25記載の方法。
肺障害が、喘息または慢性閉塞性肺疾患の少なくとも1つである、請求項28記載の方法。
治療有効量の請求項11記載の化合物を、肺または心臓血管障害を有する被験体へ投与する段階を含む、被験体の肺または心臓血管の障害を治療するための方法。
障害が心臓血管障害である、請求項30記載の方法。
心臓血管障害がうっ血性心不全である、請求項30記載の方法。
障害が肺障害である、請求項30記載の方法。
肺障害が、喘息または慢性閉塞性肺疾患の少なくとも1つである、請求項33記載の方法。
治療有効量の請求項12記載の化合物を、肺または心臓血管の障害を有する被験体へ投与する段階を含む、被験体の肺または心臓血管の障害を治療するための方法。
障害が心臓血管障害である、請求項36記載の方法。
心臓血管障害がうっ血性心不全である、請求項36記載の方法。
障害が肺障害である、請求項35記載の方法。
肺障害が、喘息または慢性閉塞性肺疾患の少なくとも1つである、請求項38記載の方法。
治療有効量の請求項15記載の薬学的組成物を、肺または心臓血管の障害を有する被験体へ投与する段階を含む、被験体の肺または心臓血管の障害を治療するための方法。
障害が心臓血管障害である、請求項40記載の方法。
心臓血管障害がうっ血性心不全である、請求項41記載の方法。
障害が肺障害である、請求項40記載の方法。
肺障害が、喘息または慢性閉塞性肺疾患の少なくとも1つである、請求項43記載の方法。
治療有効量の請求項20記載の薬学的組成物を、肺または心臓血管の障害を有する被験体へ投与する段階を含む、被験体の肺または心臓血管の障害を治療するための方法。
障害が心臓血管障害である、請求項45記載の方法。
心臓血管障害がうっ血性心不全である、請求項44記載の方法。
障害が肺障害である、請求項45記載の方法。
肺障害が、喘息または慢性閉塞性肺疾患の少なくとも1つである、請求項48記載の方法。
治療有効量の請求項21記載の薬学的組成物を、肺または心臓血管の障害を有する被験体へ投与する段階を含む、被験体の肺または心臓血管の障害を治療するための方法。
障害が心臓血管障害である、請求項50記載の方法。
心臓血管障害がうっ血性心不全である、請求項51記載の方法。
障害が肺障害である、請求項50記載の方法。
肺障害が、喘息または慢性閉塞性肺疾患の少なくとも1つである、請求項53記載の方法。
有効量の実質的に光学的に純粋な(R,R)-フェノテロールを、心臓血管障害を有する被験体へ投与する段階を含む、被験体の心臓血管障害を治療するための方法。
心臓血管障害がうっ血性心不全である、請求項55記載の方法。