JP2010287448A - 試料保持体及び試料検査装置 - Google Patents

Abstract

【課題】試料保持用の膜により覆われた基板の開口部を、光学顕微鏡により効率良く探し出すことのできる試料保持体を提供する。
【解決手段】試料を保持するための膜１０により覆われた開口部２０を有する基板を備え、開口部２０を覆っている膜の部分１０ａに保持された試料のＳＥＭ観察・検査ができるように構成された試料保持体において、該基板上には、開口部２０の位置する方向を識別するためのパターン５０１，５０２が形成されている。
【選択図】図３

Description

本発明は、培養された細胞等からなる検査対象試料の観察や検査を良好に行うことができる試料保持体及び試料検査装置に関する。

生命科学や、製薬分野では、細胞に刺激（電気、化学物質、薬等）を与え、その反応を観察することが重要となっている。従来、このような観察には光学顕微鏡が、細胞の刺激にはマニピュレータが用いられていたが、観察すべき重要な箇所は光学顕微鏡では観察不可能な０．１μｍ以下の微小領域であることも多い。例えば、細胞間の物質のやり取りが正常に行えなくなることに起因する病気に高血圧症、尿崩症、不整脈、筋肉疾患、糖尿病、うつ病等がある。この細胞間の物質のやり取りは細胞膜にある１０ｎｍ程度の大きさのイオンチャンネルにより行われる。このようなイオンチャンネルは、光学顕微鏡では観察困難である為、分解能の高い走査型電子顕微鏡（以下、「ＳＥＭ」（Scanning Electron Microscope）という）を用いた観察が望まれていた。

しかし、ＳＥＭの構成を備える検査装置において、検査対象となる試料は、通常、真空引きにより減圧された試料室内に配置される。そして、このように減圧雰囲気とされた試料室内に配置された試料に電子線（荷電粒子線）が照射され、当該照射により試料から発生する二次電子や反射電子（後方散乱電子）等の二次的信号が検出される。このようなＳＥＭによる試料検査では、試料が減圧雰囲気に晒されることとなる。よって、試料から水分が蒸発して細胞が死んでしまい、生きた状態の細胞における刺激に対する反応を観察することは不可能であった。

従って、試料に水分が含まれた状態で検査を行う際には、試料から水分が蒸発しないように、試料を減圧雰囲気に晒されることがないようにする必要がある。このように試料が減圧雰囲気に晒されることなくＳＥＭを用いて検査を行う例の一つとして、膜により開口（アパーチャ）が密封された試料容器（サンプルカプセル）の内部に試料を配置し、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内に、このサンプルカプセルを設置する手法が考えられている。

ここで、試料が配置されるサンプルカプセルの内部は減圧されない。そして、サンプルカプセルに形成された当該開口を覆う膜は、ＳＥＭの試料室内の減圧雰囲気とサンプルカプセル内の減圧されていない雰囲気（例えば、大気圧雰囲気）との間の圧力差に耐えられるとともに、電子線が透過するものとなっている（特許文献１参照）。

試料検査を行う際には、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内に配置されたサンプルカプセルの当該膜を介して、サンプルカプセルの外部からサンプルカプセル内の試料に電子線が照射される。電子線が照射された試料からは反射電子が発生し、この反射電子はサンプルカプセルの当該膜を通過して、ＳＥＭの試料室内に設けられた反射電子検出器によって検出される。これにより、ＳＥＭによる像（ＳＥＭ画像）が取得されることとなる。

しかしながら、上記発明では試料は閉じた空間内に封入されているので、マニピュレータを用いて細胞に刺激を与えることは不可能であった。さらに、検査対象試料である細胞をこのサンプルカプセルに封入した後に、その細胞を生きた状態で観察・検査をする場合には問題があった。

すなわち、細胞は、予めシャーレ（皿）上に吸着させてその上に培養液を満たし、温度３６〜３８℃（通常３７℃）、二酸化炭素濃度３〜１０％（通常５％）の雰囲気下に置いて培養させている。細胞の観察の際には、この細胞をシャーレから剥がし、このサンプルカプセルに入れることになる。しかし、サンプルカプセル内の環境がシャーレ内とは異なるため、試料容器内で細胞が生存する確率が低かった。また、特許文献１に記載のサンプルカプセルでは、溶液を１５μｌ程度しかその内部に入れることができず、短時間で環境雰囲気（ｐＨ、浸透圧等）が変化する為、細胞培養は困難であった。

なお、このように真空と大気圧との圧力差に耐えられる膜を介して試料に電子線を照射し、試料から発生する反射電子を検出してＳＥＭ画像を取得する例は、非特許文献１（当該文献のChapter1 Introduction）にも記載されている。

また、このような膜を対向して設置して一対の膜を構成し、該一対の膜の間に試料を配置して透過型電子顕微鏡による像を取得する例は、特許文献２及び特許文献３に記載されている。特に、特許文献２には、このような一対の膜を利用して、その間に配置された試料のＳＥＭ画像を取得する場合についても述べられている。

そして、上述のごとく、試料が閉じられた空間内に封入されていると、検査対象試料である細胞に対してマニピュレータによるマニピュレーションを行うことや、その細胞を生きた状態で観察・検査することが困難であるという問題がある。そのため、試料を開放状態の常圧雰囲気に配置するとともに、その開放されている側に、電子線鏡筒と光軸を同軸とする光学顕微鏡を設置して、光学像の取得も可能な試料検査装置も検討されている（特許文献４〜７参照）。

特表２００４−５１５０４９号公報 特開昭４７−２４９６１号公報 特開平６−３１８４４５号公報 特開２００７−２９２７０２号公報 特開２００８−１５３０８６号公報 特開２００８−１８０５２１号公報 特開２００８−２１０７６５号公報

「Atmospheric scanning electron microscopy」 Green, Evan Drake Harriman, Ph.D., Stanford University, 1993

上述した特許文献４〜７に記載された試料検査装置においては、液体を含む試料を開放状態の常圧雰囲気に配置するとともに、その開放されている側に、電子線鏡筒と光軸が同軸とする光学顕微鏡が設置された構成となっている。この光学顕微鏡は、該光学顕微鏡側から試料に光を照射し、これによる反射光を検出して画像を取得するものである。

特に、特許文献７に記載された試料検査装置において、その実施例で試料検査の際に使用される試料保持体は、シャーレ形状を有しており、その開放された試料保持面の一部が膜（試料保持膜）により構成されている。シャーレ形状の本体部には孔が形成されており、該孔には膜保持体（基板）が配置されている。膜保持体には開口部が形成されており、該開口部は該膜により覆われている。

このような試料保持体の試料保持面における該膜（試料保持膜）の部分に保持されている試料の電子線によるＳＥＭ観察・検査を行う際には、まず該膜により覆われている上記開口部の部分を光学顕微鏡により探し出す必要がある。これは、該開口部を介して、該膜を通過した電子線が該膜上の試料に到達することにより、ＳＥＭ観察・検査が可能となるからである。

すなわち、該開口部を覆う該膜上には、ＳＥＭ観察・検査の対象となる試料が配置されており、該膜を介して電子線を該試料に照射することにより、電子線によるＳＥＭ観察・検査を行うことができる。ここで、電子線を放出する電子線鏡筒の光軸と光学顕微鏡の光軸とが一致しているので、光学顕微鏡の視野中央に該開口部が位置する状態とすれば、電子線鏡筒から放出される電子線の走査領域（ＳＥＭ観察・検査時での視野）を、該開口部に位置する（すなわち、該開口部を覆っている）該膜の部分とすることができる。

その結果、この状態における電子線の照射時には、電子線が該開口部及び該膜を通過して、該膜上の試料に到達することが可能となり、試料からの二次的信号の検出を行うことが可能となる。

ここで、上記開口部の寸法は、該開口部を覆う膜の耐圧力の関係から、例えば、０．２５ｍｍ角程度となっており、非常に小さい寸法となっている。従って、光学顕微鏡で該開口部を探し出して、光学顕微鏡の視野内に該開口部を位置させることは困難であった。

すなわち、上記光学顕微鏡では、試料及びその下に位置する該膜に光を照射し、これにより試料及び該膜から反射される反射光をＣＣＤ等の撮像素子により検出して画像を取得している。このとき、上記開口部を覆っている膜から生じる反射光の輝度と、該開口部以外に位置する膜から生じる反射光の輝度とではあまり大きな差異がないため、該開口部を明瞭に認識することが難しかった。これは、該開口部の寸法が小さくなれば、なおさら困難となる。

そして、試料保持体を構成する本体部に形成される上記孔の加工精度が、現在のところあまり良くないので、完成された試料保持体を試料検査装置の所定箇所に配置しても、該孔内に位置する上記膜保持体の該開口部の箇所が、光学顕微鏡の所定視野内に入る可能性は小さくなり、光学顕微鏡により短時間で効率良く該開口部を探し出すことは難しかった。

本発明は、このような点に鑑みて成されたものであり、試料保持体における試料保持用の膜により覆われた基板の開口部を、光学顕微鏡により効率良く探し出すことのできる試料保持体及び該試料保持体を備える試料検査装置を提供することを目的とする。

本発明に基づく試料保持体は、試料を保持するための膜により覆われた開口部を有する基板を備えた試料保持体において、該基板上には、該開口部の位置する方向を識別するためのパターンが形成されていることを特徴とする。

本発明に基づく試料検査装置は、上記試料保持体と、該試料保持体の膜に保持された試料に対して、該膜を介して一次線を照射するための一次線照射手段と、該一次線の照射に応じて試料から発生する二次的信号を検出するための信号検出手段と、該検出結果に基づいて試料像の取得を行うための試料像取得手段と、試料に対して、該一次線照射手段が位置する側とは反対の側から光を照射し、これによる試料の光学像を取得するための光学像取得手段とを具備することを特徴とする。

本発明においては、試料保持体を構成する基板上には、試料保持用の膜により覆われた開口部の位置する方向を識別するためのパターンが形成されている。

従って、光学顕微鏡からなる光学像取得手段により基板上の該パターンを取り込むことによって、そのときの光学顕微鏡の視野に対する該開口部が位置する方向を識別することができる。

これにより、その識別された方向に沿って光学顕微鏡の視野を相対的に移動すれば、光学顕微鏡による該開口部の探し出しを効率良く行うことができる。

本発明における試料検査装置及び試料保持体を示す概略構成図である。 試料保持体に備えられる試料保持用基板を示す斜視図である。 識別用パターンの一例を示す図である。 試料保持用基板の一例を示す平面図である。 試料保持用基板の作成方法を示す図である。 複数個の開口部が基板に形成された例を示す図である。 識別用パターンの別の例を示す図である。 識別用パターンの他の例を示す図である。

以下、図面を参照して、本発明における実施の形態について説明する。図１は、本発明における試料検査装置及び試料保持体を示す概略構成図である。

図１（Ａ）において、試料保持体を構成するディッシュ８内には、液状の試料２１が保持されている。試料２１内には、観察・検査対象とされた細胞等及び培養液等の液体が含まれている。

ここで、ディッシュ（試料保持体）８の拡大断面図を図１（Ｂ）に示す。ディッシュ８の底部２９の中央には、孔２８が形成されている。この孔２８は、該底部２９の内側底面と外側底面とを連通するように形成されている。ここで、該内側底面は、図１（Ｂ）におけるディッシュ８の底部２９の上面となっており、該外側底部は、同図におけるディッシュ８の底部２９の下面となっている。なお、ディッシュ８の底部２９の周囲には、側壁部３０が設けられている。

ディッシュ８の内側底面における孔２８が設けられている箇所には、シリコン基板９が配置されている。シリコン基板９には、その中央に開口部２０が形成されている。これにより、シリコン基板９は、枠状の形状となっている。シリコン基板９の上面には、試料保持膜を構成する膜（窒化シリコン膜）１０が被膜（堆積）されている。この膜（試料保持膜）１０は、シリコン基板９の開口部２０を覆っている。シリコン基板９と試料保持膜１０とにより、試料保持用基板１８が構成される。

ディッシュ８の内部である内側底面には、試料２１が保持される。これにより、ディッシュ８の内側底面において、シリコン基板９の開口部２０を覆う膜１０の表面に、試料２１中に含まれた細胞等の検査対象物が配置される。

この状態で、ディッシュ８は、ディッシュホルダ７に載置される。その後、ディッシュホルダ７は、ディッシュ８を載置した状態で、本装置（試料検査装置）のステージ４上に搭載される。

ステージ４は、本装置を構成する真空室２の上部に設置されており、Ｘ方向及びＹ方向に移動可能となっている。ここで、Ｘ−Ｙ平面は水平面となっている。なお、ステージ４は、垂直方向に沿うＺ方向にも移動可能となっていてもよい。

ステージ４の上方には、ディッシュ８内の試料２１の光学像を取得するための光学顕微鏡５が設置されている。光学顕微鏡５の先端部は、ディッシュ８内の液状の試料２１に接触することができる。光学像の取得時には、当該先端部が試料２１に接した状態で、光学顕微鏡５から試料２１に光（照射光）が照射される。

また、光学顕微鏡５の基端側には、撮像手段であるＣＣＤカメラ６が配置されている。ＣＣＤカメラ６は、該光の試料２１への照射時に、試料２１から反射される反射光を検出する。これにより、該反射光に基づく画像がＣＣＤカメラ６によって取り込まれる。該画像には、試料２１内の細胞等の検査対象物の像が含まれている。

このＣＣＤカメラ６により取り込まれた画像のデータは、本装置を構成する図示しないコンピュータに送られる。コンピュータは、表示手段（図示せず）によって、該画像の表示を行う。本装置のオペレータは、表示された画像によって、試料２１に含まれた該検査対象物の像を目視にて確認することができる。

真空室２の下部には、電子線鏡筒１が設置されている、電子線鏡筒１の内部は、電子線鏡筒１の先端部を介して、真空室２内部と連通している。電子線鏡筒１の基端側には、電子銃２２が設置されている。電子銃２２は、所定の加速電圧により加速された電子線２３を放出する。これにより放出された電子線２３は、電子線鏡筒１の先端部から真空室２内部に放出される。

真空室２内には、反射電子検出器３が配置されている。反射電子検出器３には、電子線鏡筒１から放出された電子線２３が通過可能とされた通過孔２６が形成されている。

さらに、真空室２の上部壁及び該上部壁の上面に配置されたステージ４にも、電子線２３が通過可能とされた開口がそれぞれ形成されている。そして、ステージ４上に配置されるディッシュホルダ７にも同様に、電子線２３が通過可能とされた開口が形成されている。

ここで、電子線鏡筒１内部及び真空室２内部の各真空排気動作、真空排気時における電子線鏡筒１の駆動動作並びにステージ４の移動動作等は、上記コンピュータにより制御される。

試料２１に含まれた細胞等の検査対象物のＳＥＭ観察・検査の際には、電子線鏡筒１から真空室２内部に向けて電子線（一次線）２３が放出される。電子線鏡筒１から放出された電子線２３は、真空室２内において反射電子検出器３の通過光２６を通過した後、真空室２の上部壁の開口及びステージ４の開口を介して、ディッシュホルダ７の開口を通過する。

このようにして、ディッシュホルダ７の開口を通過した電子線２３は、ディッシュ８の孔２８及びシリコン基板９の開口部２０を介して、該開口部２０を覆っている膜１０に到達する。膜１０に到達した電子線２３は、さらに該膜１０を通過し、該膜１０上に配置された試料２１内の検査対象物に到達する。

このとき、電子線２３は、電子線鏡筒１に配置された対物レンズ（集束レンズ）の励磁によって細く集束している。これにより、集束された電子線２３が、膜１０を介して、該膜１０上の試料２１を照射することとなる。

さらに、この状態で、電子線鏡筒１に配置された図示しない偏向器の動作により、電子線２３が走査される。この結果、膜１０を通過した電子線２３は、試料２１の所定領域（検査対象物が含まれた領域）を走査する。当該所定領域は、電子線２３による走査領域となる。

このようにして電子線２３が走査された試料２１の領域（走査領域）からは、反射電子（二次線）が発生する。この反射電子は、膜１０を通過して真空室２内に入り、反射電子検出器３により検出される。

反射電子検出器３は、検出される反射電子の検出強度に基づく検出信号を出力する。この検出信号は、図示しない増幅器によって増幅された後、デジタルデータに変換される。なお、本実施の形態において図示されている反射電子検出器３は、複数の半導体素子（フォトダイオード）を検出面に備える半導体検出器となっている。

デジタルデータに変換された該検出信号は、上記コンピュータに送られる。コンピュータは、該検出信号に基づく画像データ（走査像データ）を形成する。このようにして形成された画像データは、表示手段に送られる。表示手段は、該画像データに基づく画像（走査像）の表示を行う。オペレータは、表示された走査像を見ることにより、試料２１中の検査対象物の観察ないし検査を行うことができる。

ここで、光学顕微鏡５の光軸と電子線鏡筒１の光軸とは合わされており、同軸となるように構成されている。これにより、光学顕微鏡５により取得される光学像の中心と、電子線鏡筒１からの電子線２３の走査により得られる走査像（試料２１からの上記反射電子の検出に基づく像）の中心とが一致することとなる。そして、該光学像の倍率と該走査像の倍率とが同じであるときには、双方の像の視野が互いに一致することとなる。

なお、真空室２とステージ４との間、ステージ４とディッシュホルダ７との間、及びディッシュホルダ７とディッシュ８との間には、それぞれ図示しないＯリングが配置されている。これらＯリングによって、各間隙において真空シールが施されている。

ここで、上述した試料保持用基板１８の拡大図を図２に示す。なお、説明上、図２に示す試料保持用基板１８は、図１（Ｂ）に示されている試料保持用基板１８を上下反転させて図示している。

すなわち、図１（Ｂ）に示す試料保持用基板１８の試料保持膜（窒化シリコン膜）１０は、シリコン基板９の上面側に位置した状態で、開口部２０を覆っている。これに対して、図２に示す試料保持用基板１８の試料保持膜１０は、シリコン基板９の下面側に位置した状態で、開口部２０を覆っている。試料保持用基板１８は、図２に示す状態に対して、上下反転させた状態で、ディッシュ８の底部２９における上面（内側底面）に配置される（図１（Ｂ）参照）。

そして、本発明における試料保持用基板１８を構成するシリコン基板１０上には、開口部２０の位置する方向を識別するための複数のパターン（識別用パターン）が形成されている。

図３に、識別用パターンの一例を示す。図３は、シリコン基板９において、試料保持膜１０が被膜されている側から見た図であり、識別用パターンとして、ガイド主線５０１及びガイド副線５０２が形成されている。これらガイド主線５０１及びガイド副線５０２は、シリコン基板９における試料保持膜１０の被膜面側に設けられている。なお、図中の１００は、光学顕微鏡５における視野の一例である。この視野１００の範囲（大きさ）は、光学顕微鏡５の倍率に依存する。

ガイド主線５０１及びガイド副線５０２は、直線形状となっており、開口部２０を中心とする放射状に形成されている。すなわち、開口部２０の周辺には、１６本のガイド主線５０１が設けられており、これらガイド主線５０１の間には、ガイド副線５０２が設けられている。ガイド副線５０２は各ガイド主線５０１の間隙に配置されるので、該ガイド副線５０２の本数も１６本となる（図３では、２本のみ図示されている）。

このようなガイド主線５０１及びガイド副線５０２からなる識別用パターンは、図４に示すように、シリコン基板９上に被膜された試料保持膜１０の除去パターン（部分的に除去されてスペースとなっているパターン）５０１ａにより形成される。ここで、除去パターン５０１ａは、シリコン基板９上に成膜された試料保持膜１０がその後エッチング加工されることにより形成され、試料保持膜１０のうちで、部分的にエッチングされて取り除かれた部分のパターンである。この除去パターン５０１の部分では、試料保持膜１０が取り除かれているので、シリコン基板９（図４では、５０１として図示）が露出されることとなる。なお、図４では、試料保持用基板１８における開口部２０を含む要部を示しており、ガイド主線５０１の図示はあるが、ガイド副線５０２は図示されていない。

開口部２０の周辺に形成されたガイド主線５０１は、開口部２０の輪郭から０．１５ｍｍ以上離れた位置から放射状に伸長するように形成されている。これにより、ガイド主線５０１が試料保持膜１０の除去パターンにより形成されても、シリコン基板９の開口部２０を覆う部分の試料保持膜１０の支持に支障は生じない。

また、各ガイド主線５０１の中間に設けられたガイド副線５０２は、開口部２０の中心から０．８ｍｍ離れた位置から放射状に伸長するように形成されている。

なお、ガイド主線５０１及びガイド副線５０２の本数は、一例として、それぞれ１６本とした。これらの本数は、光学顕微鏡５の倍率に依存し、光学顕微鏡５の視野１００内にガイド主線５０１又はガイド副線５０２のうちの少なくとも２本以上が常に入るように各本数の設定を行なう。

ここで、ディッシュ８内におけるシリコン基板９の開口部２０の中心位置誤差を±０．３ｍｍ、所定の基準位置に位置するディッシュホルダ７内に配置された状態でのディッシュ８の機械的な位置誤差を±０．１ｍｍとすると、光学顕微鏡５の視野１００の中心位置（光学顕微鏡５の光軸位置に対応）が、当該開口部２０の中心位置から０．４ｍｍの距離以上に離れることは無い。

しかしながら、試料保持膜１０のうち、開口部２０を覆っている部分（以下、「開口被膜部１０ａ」という）以外の箇所に位置する観察・検査対象物（細胞等）の光学顕微鏡５による観察を行った後、開口被膜部１０ａ上に位置する観察・検査対象物の観察・検査を行う際には、光学顕微鏡５の視野１００内において、オペレータにより目視される少なくとも２本のガイド主線５０１又はガイド副線５０２を確認することにより、当該視野１００の位置に対して開口被膜部１０ａが位置する方向を識別することが可能となる。

すなわち、ガイド主線５０１及びガイド副線５０２は、開口部２０を中心とする放射状に形成されているので、そのときの視野１００内において見えているガイド主線５０１又はガイド副線５０２の間隙が狭くなる方向に開口被膜部１０ａが位置することがわかる。

例えば、図３に示す状態においては、視野１００内には３本のガイド主線５０１が含まれているが、当該３本のガイド主線５０１の各間隙が狭くなる方向（図中の矢印Ａの方向）に、視野１００が移動するように、試料保持膜１０と視野１００とを相対的に移動させるようにすればよい。このように移動させるには、オペレータが光学像の確認を行いながら、ステージ４の移動動作を行い、ステージ４に載置されているディッシュホルダ７及びその上のディッシュ８を移動させることとなる。

このようにして、光学顕微鏡５の視野１００を開口被膜部１０ａの位置する方向に相対移動させ、該視野１００内に開口被膜部１０ａが入るようにする。ここで、光学顕微鏡５の光軸と電子線鏡筒１の光軸は同軸となっている。

よって、光学顕微鏡５の視野１００内に開口被膜部１０ａが入っており、該視野１００の中心（光学顕微鏡５及び電子線鏡筒１の双方の光軸に対応）が開口被膜部１０ａの領域内に位置していれば、開口被膜部１０ａの領域上にある細胞等の観察・検査対象物（検査対象試料）への電子線鏡筒１からの集束された電子線２３の照射が可能となる。当該電子線照射においては、電子線鏡筒１からの電子線２３は、開口部２０及び開口被膜部１０ａを通過し、該開口被膜部１０ａ上の検査対象試料に到達する。

電子線２３が照射された検査対象試料からは、二次線としての反射電子が発生し、該反射電子は反射電子検出器３により検出される。この結果、検査対象試料の走査像を取得することができる。

ここで、ディッシュ８の底部２９に配置される試料保持用基板１８の作成方法について、図５を参照して説明する。図５において、シリコン基板５０１（上述のシリコン基板９に対応）の上下面に、ＣＶＤ（Ｃｈｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法により、窒化シリコン層５０２，５０３を形成する［図５（ａ）］。窒化シリコン層５０２，５０３の厚さは、３０ｎｍ程度である。

次に、窒化シリコン層５０２，５０３の表面に、レジスト膜５０４，５０５を塗布する［図５（ｂ）］。レジスト膜５０４，５０５をフォトリソグラフィーによりパターニングし、所定形状のレジストパターン５０４ａ，５０５ａを形成する［図５（ｃ）］。

その後、レジストパターン５０４ａ，５０５ａをマスクとしてドライエッチングを施し、窒化シリコン層５０２，５０３のエッチング加工を行う。これにより、所定のパターニングが施された窒化シリコン膜５０２ａ，５０３ａが形成される［図５（ｄ）］。この窒化シリコン膜５０２ａ，５０３ａのうち、窒化シリコン膜５０２ａが試料保持膜１０となる。

そして、シリコン基板５０１の上下面のうち、窒化シリコン膜５０２ａが形成されている側の面全体（当該窒化シリコン膜５０２ａを含む）にレジスト膜５０４ｃを塗布する［図５（ｅ）］。次いで、レジスト膜５０４ｃ，５０５ａをマスクとして、ＫＯＨを用いたウエットエッチングにより、シリコン基板５０１のエッチング加工を行う。これにより、開口部２０がシリコン基板５０１に形成される［図５（ｆ）］。その後、アッシング処理により、レジスト膜５０４ｃ，５０５ａの除去を行う［図５（ｇ）］。

以上により、試料保持基板１８が作成される。試料保持基板１８を構成するシリコン基板５０１（シリコン基板９）における窒化シリコン膜５０２ａ（窒化シリコン膜１０）が設けられている側の面において、窒化シリコン膜５０２ａのパターンの部分５０１ａでは、シリコン基板５０１の面が露出されている。この所定形状の露出面が、当該パターンに対応し、上述した識別用パターン（ガイド主線５０１及びガイド副線５０２）となる。

なお、図５（ｇ）の状態を上側（窒化シリコン膜５０２ａが設けられた側）から見た平面図が、図４となる。また、図４におけるＢ−Ｂ断面図が図５（ｇ）に相当する。このようにして作成された試料保持用基板１８を、ディッシュ８の底部２９形成された孔２８を覆うように、該底部２９の上面側に固着する。このとき、試料保持基板１８における試料保持膜１０が上側に位置するようにする。これにより、ディッシュ８からなる試料保持体が作成される。

上記の固着には、エポキシ系もしくはシリコーン系の接着剤による接着、または熱、超音波もしくはレーザによる融着により行うことができる。これにより、試料保持用基板１８は、ディッシュ８の底部２９における孔２８の対応する位置に固着される。

なお、上記例では、試料保持膜１０が形成された試料保持用基板１８とディッシュ８の本体とを組み合わせて試料保持体を作成したが、ディッシュ８の底部２９上面に試料保持膜１０を成膜するようにしてもよい。この場合、ディッシュ８の底部２９に形成された孔２８の大きさは、上記例におけるシリコン基板９に形成された開口部２０の寸法と同様に設定しておき、該孔２８が試料保持膜１０により覆われる。この場合、ディッシュ８の底部２９が、基板に相当する。また、上記何れの例においても、試料保持膜１０の試料保持面に、試料付着用分子としての細胞接着分子を塗布しておくことができる。

上記の各例において、試料保持膜１０を構成する窒化シリコン膜の膜厚は、１０〜１０００ｎｍの範囲に設定される。また、試料保持膜１０としては、窒化シリコン膜の他に、酸化シリコン、窒化ボロン、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、もしくはカーボンからなる膜を用いることもできる。これらの膜を用いた場合においても、その膜厚は、１０〜１０００ｎｍに設定される。

上述した素材からなる試料保持膜１０は、電子線は通過するが、気体や液体は透過しないものとなる。さらに、膜の上下面（両面）での圧力差として、少なくとも一気圧の圧力差に耐えることのできる膜である必要がある。

なお、このような試料保持膜１０は、その膜厚が薄ければ電子線の散乱が少なくなるので分解能が向上するが、圧力差により破損しやすくなる。また、該膜の膜厚が厚くなれば、電子線７の散乱が増加して分解能が低下するが、圧力差により破損しにくくなる。好適な膜厚としては、２０〜２００ｎｍとなる。

次に、図６を参照して、本発明の第２の実施例について説明する。上記の例においては、窒化シリコン基板（基板）９に形成される開口部２０の個数は１個であった。これに対して、この第２の実施例においては、複数個の開口部（この例では、４個の開口部８１〜８４）をシリコン基板１０に設けたものとなっている。

これらの開口部８１〜８４において、隣り合う開口部の間における中間の位置に、中間線６００を仮想的に設定する。各中間線を境界として、各開口部８１〜８４ごとに、それぞれ対応する放射状のガイド主線５０１及びガイド副線５０２をシリコン基板９上に形成する。各ガイド主線５０１及びガイド副線５０２の形成方法は、上記と同様である。

このようなガイド主線５０１及びガイド副線５０２を各開口部８１〜８４ごとに設けておくことにより、光学顕微鏡５での光学像の取得時において、所定の開口部８１〜８４の位置する方向を識別することができ、視野１００を当該開口部８１〜８４に誘導することが容易となる。

なお、上記各例において、識別用パターンは、放射状に形成されたガイド主線５０１及びガイド副線５０２からなるものであったが、このような直線形状のパターンに限定される必要はない。

上記例以外に、例えば図７に示すように、開口部の方向を示す目印としての三角形状のパターン［図７（ａ）参照］もしくは矢印形状のパターン［図７（ｂ）参照］を用いることもできる。このような形状を備えるパターン（識別用パターン）を、シリコン基板９上に、開口部を中心として放射状に複数配置すればよい。このときの該パターンの基板上での配置間隔は、光学顕微鏡５の倍率が４００倍程度の場合には、０．１５ｍｍ程度とするのがよい。

また、上述のように直線形状または三角形状もしくは矢印形状の識別用パターンを放射状に形成する代わりに、それぞれ直径の異なる円形状の複数の識別用パターンを設けるようにしてもよい。この場合、上記開口部内の位置を中心とした同心円状に、各識別用パターンを配置する。このときの該パターンの基板上での配置間隔も、光学顕微鏡の倍率が４００倍程度の場合に、０．１５ｍｍ程度とするのがよい。

なお、上述した各例において、光学顕微鏡５の視野１００内での識別用パターンを取り込んだ後に、コンピュータが、当該画像から開口部の位置を検出し、それに基づいてステージ４を自動的に移動させるようにすることも可能である。

このように、本発明における試料保持体（ディッシュ）は、試料２１を保持するための膜（試料保持膜）１０により覆われた開口部２０を有する基板９を備えた試料保持体であって、該基板９上には、該開口部２０の位置する方向を識別するための複数のパターン（識別用パターン）が形成されている。

ここで、識別用パターンを直線形状とし、開口部２０を中心とした放射状に形成することができる。

また、識別用パターンを三角形状若しくは矢印形状とし、開口部２０を中心とした放射状に分散するように形成することもできる。

さらに、識別用パターンを円形状とし、開口部２０を中心とした同心円状に形成することもできる。

そして、基板９に、上記開口部を複数個設け、各開口部のそれぞれに対応して、識別用パターンを形成することも可能である。

ここで、識別用パターンは、基板９上に設けられた膜１０のパターンによって形成することができる。このように、試料２１を保持するための膜のパターンにより識別用パターンを構成することにより、識別用パターンを形成するための薄膜を基板９上に別途形成（成膜）する必要がなく、低コストで効率良く識別用パターンの形成を行うことができる。

上記において、基板９はシリコン基板から構成し、膜１０を、窒化シリコン、酸化シリコン、窒化ボロン、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、若しくはカーボンから構成することができる。

また、本発明における試料検査装置は、上記何れかの試料保持体８と、該試料保持体８の膜１０に保持された試料２１に対して、該膜１０を介して一次線を照射するための一次線照射手段（電子線鏡筒）１と、一次線の照射に応じて試料２１から発生する二次的信号を検出するための信号検出手段と、該検出結果に基づいて試料像の取得を行うための試料像取得手段と、試料２１に対して、一次線照射手段１が位置する側とは反対の側から光を照射し、これによる試料の光学像を取得するための光学像取得手段５とを具備している。

ここで、一次線としては電子線若しくは荷電粒子線を使用し、二次的信号としては、反射電子、２次電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つでを用いることができる。

本発明においては、試料保持膜により覆われた開口部の周囲に識別用パターンを配置することにより、電子線の照射を行うことなく、光学顕微鏡により取得された光学像をオペレータが目視にて確認することによって、電子線による観察・検査対象領域に対応する開口被膜部１０ａの位置する方向を即座に把握することができる。

すなわち、光学顕微鏡による視野内に少なくとも２つの識別パターンの部分が入るようになるので、オペレータが当該識別パターンを目視することにより、該視野に対する開口被膜部１０ａの位置する方向を認識することが可能となる。

これにより、該開口部を介して試料保持膜に余計な電子線を照射する必要がなくなるので、試料保持膜の電子線照射による不要な劣化を防止することができる。この結果、開口被膜部１０ａ上のＳＥＭ観察・検査を長時間行うことが可能となる。

また、光学顕微鏡による光学像をコンピュータが取り込んで、光学像内に含まれている当該識別パターンを認識し、これにより開口被膜部１０ａの位置情報を検出することができれば、該位置情報に基づいてコンピュータがステージ移動を行うことにより、自動的に開口被膜部１０ａの位置合わせを行なうことができる。

１…電子線鏡筒、２…真空室、３…反射電子検出器、４…ステージ、５…光学顕微鏡、６…ＣＣＤカメラ、７…ディッシュホルダ、８…ディッシュ、９…シリコン基板、１０…窒化シリコン膜、１０ａ…開口被膜部、１８…試料保持用基板、２０…開口部、２１…試料、２２…電子銃、２３…電子線、２６…通過孔、２８…孔、２９…底部、３０…側壁部、５０１，５０２…識別用パターン

Claims (9)

1. 試料を保持するための膜により覆われた開口部を有する基板を備えた試料保持体であって、該基板上には、該開口部の位置する方向を識別するためのパターンが形成されていることを特徴とする試料保持体。
2. 前記パターンは、直線形状となっており、前記開口部を中心とした放射状に形成されていることを特徴とする請求項１記載の試料保持体。
3. 前記パターンは、三角形状若しくは矢印形状となっており、前記開口部を中心とした放射状に分散するように形成されていることを特徴とする請求項１記載の試料保持体。
4. 前記パターンは、円形状となっており、前記開口部を中心とした同心円状に形成されていることを特徴とする請求項１記載の試料保持体。
5. 前記基板には、前記開口部が複数設けられており、各開口部のそれぞれに対応して、前記パターンが形成されていることを特徴とする請求項１乃至４何れか記載の試料保持体。
6. 前記パターンは、前記基板上に設けられた前記膜を部分的に取り除くことによって形成されていることを特徴とする請求項１乃至５何れか記載の試料保持体。
7. 前記基板はシリコン基板からなり、前記膜は、窒化シリコン、酸化シリコン、窒化ボロン、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、若しくはカーボンからなることを特徴とする請求項１乃至６何れか記載の試料保持体。
8. 請求項１乃至７何れか記載の試料保持体と、該試料保持体の膜に保持された試料に対して、該膜を介して一次線を照射するための一次線照射手段と、該一次線の照射に応じて試料から発生する二次的信号を検出するための信号検出手段と、該検出結果に基づいて試料像の取得を行うための試料像取得手段と、試料に対して、該一次線照射手段が位置する側とは反対の側から光を照射し、これによる試料の光学像を取得するための光学像取得手段とを具備する試料検査装置。
9. 前記一次線は電子線若しくは荷電粒子線であり、前記二次的信号は、反射電子、２次電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項８記載の試料検査装置。

Images